CN102093461B - 高速逆流色谱纯化茶皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，属于高速逆流色谱分离纯化方法。其包括：1）茶皂素粗品的制备；2）溶剂的配置；3）样品制备；4）分离纯化。上述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，设计合理，本发明对油茶饼粕进行预处理，并选择了正确的溶剂系统乙酸乙酯、正丁醇和水，使茶皂素在溶液系统中的分配系数K在0.5～2，最后通过对高速逆流色谱仪的控制调节，使得分离的茶皂素纯度可达95%以上，并且本发明具有重现性好及操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明属于高速逆流色谱分离纯化方法，具体涉及高速逆流色谱纯化茶皂素的方法。
背景技术
茶皂素（Tea saponin），又名茶皂甙、茶皂苷，1931年，日本学者青山新次郎首次从茶叶中分离得到茶皂素，随后几十年，Masayuki Yoshikawa等从茶树的根、叶、花和种子中分离纯化出56种茶皂苷单体，并对茶皂苷的化学结构和物理化学性质进行了深入的研究。茶皂素是一类结构复杂的糖苷化合物，基本结构包括皂苷元、糖体、有机酸三部分。茶皂素具有许多优良的特性，是一种天然的表面活性剂，在民间有使用茶饼粕洗衣、洗发的习惯，茶皂素可以形成持久的泡沫，并且起泡能力不受水硬度的影响，可制成优良且环保的洗涤剂。茶皂素还具有很多生物学活性，其对白色念珠菌、大肠杆菌有抑菌作用，对浅表真菌感染具有治疗效果。茶皂素可作为乳化剂制得稳定的乳液，开发茶皂甙在高档日用护肤品等日用化工行业的应用，不但利用了它的表面活性作用 ,也充分发挥了它的生物学功能 ,有着广阔的应用前景。
高速逆流色谱（High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC）是美国国立卫生院Ito博士研制开发一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系。HSCCC不使用固相载体作为固定相，而是使用液相载体作为固定相，利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相为固定相，利用恒流泵连续泵入流动相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小被依次洗脱，它克服了使用固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点，适用于天然产物的分离。
传统的纯化茶皂素的方法主要有沉淀法、絮凝剂法、大孔吸附树脂法、滤膜法等，但都有其缺点。近年来，应用HSCCC法对皂苷类成分的分离取得了较大的进展，窦德强等用乙酸乙酯-正丁醇-水（4:1:5）体系一次性分离得到人参皂苷Re与Rg1各25mg和18mg，但HSCCC用于纯化茶皂素还尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种高速逆流色谱纯化茶皂素的技术方案，该方法具有重现性好、分离度高、操作简便等优点。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）茶皂素粗品的制备：取经脱脂后的油茶饼粕加入极性溶剂进行回流浸提，浸提液经抽滤得清液，清液除去极性溶剂后，进行冷冻干燥，即得到茶皂素粗品；
2）溶剂的配置：将乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比0.8～1.2: 0.8～1.2:1.8～2.2混合，剧烈振摇5～15min，超声波脱气15～20min，静置过夜，使溶液分为上下两相，分层后下相作为固定相，上相作为流动相；
3）样品制备：取步骤1）得到的茶皂素粗品溶解于20～30倍体积的流动相中，得到样品溶液；
4）分离纯化：将固定相以最大流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到500～600rpm时，以6～10ml/min的流速泵入流动相，待流动相流出两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡时，取样品溶液通过进样六通阀进样，然后根据紫外色谱图，分别收集与第一个峰保留时间对应的流出液，流出液进行浓缩、冷冻干燥后，即得到高纯度的茶皂素。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤1）中油茶饼粕采用石油醚或正己烷抽提除去残留油脂。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤1）中脱脂后的油茶饼粕加入8～12倍体积的60%乙醇进行回流浸提1～3小时得清液。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤2）乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比1:1:2混合。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤2）中溶剂体系剧烈振摇7～13min,超声波脱气16～18min。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤3）中当主机速度达到520～580rpm时，以7～9ml/min的流速泵入流动相。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤3）中紫外检测波长为215nm。
所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤3）中流出液在旋转蒸发器上45～55℃减压浓缩除去乙醇，冷却至温度15～25℃ ，再在冷阱温度-65--55℃，真空度1Pa下进行冷冻干燥。
上述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，设计合理，本发明对油茶饼粕进行预处理，并选择了正确的溶剂系统乙酸乙酯、正丁醇和水，使茶皂素在溶液系统中的分配系数K在0.5～2，最后通过对高速逆流色谱仪的控制调节，使得分离的茶皂素纯度可达95%以上，并且本发明具有重现性好及操作简便等优点。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
TBE-1000A高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）；UV-500紫外检测器（上海同田生物技术有限公司）；N2010色谱数据工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；R-3 BUCHI旋转蒸发仪（瑞士步琪有限公司）；LGJ-18C型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；所有应用于HSCCC的有机溶剂均为化学纯；应用于HPLC的有机溶剂为色谱纯。
1.2 方法
1.2.1 茶皂素粗品的制备
油茶饼粕经石油醚抽提至提取液无色，除去残留油脂。称取20g脱脂的饼粕置于磨口烧瓶中，加入10倍体积60%乙醇进行回流浸提2h，提取液经抽滤得清液，然后进行旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥即得待分离纯化的茶皂素粗品。
1.2.2 溶剂系统的准备
高速逆流色谱溶剂体系的选择主要根据以往实际累积的经验，还没有一套完整的理论依据。利用HSCCC分离的关键就是如何快速有效地找到合适的溶剂系统使欲分离的物质在两相中的分配系数K在0.5～2，而欲分离成分的分配系数与其极性以及溶剂系统的极性有关，参考文献中常用的分离皂苷化合物的溶剂体系以及实际操作对溶剂系统的筛选，选择乙酸乙酯：正丁醇：水（1:1:2）的体系进行分离。
1.2.3 高速逆流色谱法
1.2.3.1 溶剂系统的准备
将配好的溶剂体系剧烈震荡摇匀10min，静置，溶剂体系在30S之内分层完毕，然后将溶剂体系超声脱气20min后静置过夜备用。
1.2.3.2 高速逆流色谱条件
茶皂素纯化采用的仪器为总体积1000ml的逆流色谱仪。首先将乙酸乙酯、正丁醇、水按1:1:2（V/V）混合，总体积5000ml,剧烈振摇10min, 超声波脱气20min，静止过夜，使溶液分为上下两相。将上相作为固定相，以最大流速（50ml/min）装满色谱分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转。当速度达到560rpm时以8ml/min的流速泵入流动相（下相），直至流动相流出两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡，即无固定流出。将800mg茶皂素粗提物溶于20ml流动相，通过六通阀注入系统中，开启紫外检测器，在215nm波长下检测分离情况，收集第95～106min的流分（即与第一个峰保留时间对应的流出液），在旋转蒸发器50℃减压浓缩除去乙醇，再冷却至20℃，然后在冷阱温度-60℃，真空度1Pa下进行冷冻干燥，得到纯度为95%以上的茶皂素。
实施例2
1）茶皂素粗品的制备：油茶饼粕用石油醚或正己烷抽提进行脱脂，取经脱脂后的油茶饼粕加入加入8倍体积的60%乙醇进行回流浸提3小时，浸提液经抽滤得清液，清液中蒸发除去极性溶剂后，进行冷冻干燥，即得到茶皂素粗品；
2）溶剂的配置：将乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比0.8: 0.8:1.8混合，剧烈振摇5min，超声波脱气15min，静止过夜，使溶液分为上下两相，分层后下相作为固定相，上相作为流动相；
3）样品制备：取步骤1）得到的茶皂素粗品溶解于20倍体积的流动相中，得到样品溶液；
4）分离纯化：将固定相以最大流速（50ml/min）装满色谱分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到500rpm时，以6ml/min的流速泵入流动相，待流动相流出两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡时，取样品溶液通过进样六通阀进样，然后根据紫外色谱图，在215nm波长下检测分离情况，收集与第一个峰保留时间对应的流出液，流出液在旋转蒸发器45℃减压浓缩除去乙醇，再冷却至15℃，然后在冷阱温度-55℃ ，真空度1Pa下进行冷冻干燥，即得到纯度为98%的茶皂素。
实施例3
1）茶皂素粗品的制备：油茶饼粕用石油醚或正己烷抽提进行脱脂，取经脱脂后的油茶饼粕加入加入12倍体积的60%乙醇进行回流浸提1小时，浸提液经抽滤得清液，清液中蒸发除去极性溶剂后，进行冷冻干燥，即得到茶皂素粗品；
2）溶剂的配置：将乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比1.2: 1.2:2.2混合，剧烈振摇15min,超声波脱气25min，静止过夜，使溶液分为上下两相，分层后下相作为固定相，上相作为流动相；
3）样品制备：取步骤1）得到的茶皂素粗品溶解于30倍体积的流动相中，得到样品溶液；
4）分离纯化：将固定相以最大流速（50ml/min）装满色谱分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到580rpm时，以10ml/min的流速泵入流动相，待流动相流出两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡时，取样品溶液通过进样六通阀进样，然后根据紫外色谱图，在215nm波长下检测分离情况，收集与第一个峰保留时间对应的流出液，流出液在旋转蒸发器55℃减压浓缩除去乙醇，再冷却至25℃，然后在冷阱温度-65℃ ，真空度1Pa下进行冷冻干燥，即得到纯度为97%的茶素。
Claims (4)
1.高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于由以下工艺步骤组成：
1）茶皂素粗品的制备：取经脱脂后的油茶饼粕加入极性溶剂进行回流浸提，浸提液经抽滤得清液，清液除去极性溶剂后，进行冷冻干燥，即得到茶皂素粗品；
2）溶剂的配置：将乙酸乙酯、正丁醇、水按体积比1:1:2混合，剧烈振摇5～15min，超声波脱气15～20min，静置过夜，使溶液分为上下两相，分层后下相作为固定相，上相作为流动相；
3）样品制备：取步骤1）得到的茶皂素粗品溶解于20～30倍体积的流动相中，得到样品溶液；
4）分离纯化：将固定相以最大流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到520～580rpm时，以7～9mL/min的流速泵入流动相，待流动相流出两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡时，取样品溶液通过进样六通阀进样，然后根据紫外色谱图，在215nm波长下，分别收集与第一个峰保留时间对应的流出液，流出液在旋转蒸发器上45～55℃减压浓缩除去乙醇，冷却至温度15～25℃ ，再在冷阱温度-65--55℃，真空度1Pa下进行冷冻干燥，即得到高纯度的茶皂素。
2.如权利要求1所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤1）中油茶饼粕采用石油醚或正己烷抽提除去残留油脂。
3.如权利要求1所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤1）中脱脂后的油茶饼粕加入8～12倍体积的60%乙醇进行回流浸提1～3小时得清液。
4.如权利要求1所述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其特征在于所述的步骤2）中溶剂体系剧烈振摇7～13min,超声波脱气16～18min。
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