CN102089655A - 单核苷酸多态性(snp)及其与针对免疫耐受诱导的抗性的关联 - Google Patents
单核苷酸多态性(snp)及其与针对免疫耐受诱导的抗性的关联 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了使群体内某些核酸序列的存在或者不存在与在该群体内产生免疫耐受的能力相关的方法、系统和试剂盒。耐受可以通过经静脉内或者舌下单独或者重复给予抗原而诱导，所述抗原包括可溶抗原。本申请还公开了检测变体的方法。此外，本申请还解决在治疗中应用或者避免应用非甾类抗炎药物的问题。
Description
技术领域
本发明涉及免疫系统及治疗领域。特别是，本发明涉及人基因组中特异核酸序列，及它们与疾病和病理学以及免疫耐受诱导的关联。基于患者群体相对于正常个体中等位基因频率中的差异，本文公开的天然存在的核酸序列可以用作靶以设计诊断试剂和开发治疗剂，以及用于疾病关联和连锁分析。具体地，本发明的核酸序列可用于鉴别发生疾病或病理学的风险增加或降低的个体(例如患者)，用于早期检测疾病或病理学，用于提供对于预防和/或治疗疾病或病理学临床重要的信息，以及用于筛选和选择治疗剂。另外，一或多种核酸序列的存在可以用于确定给予用于诱导免疫耐受的抗原的类型和剂量。一或多种抗原可以给予具有或不具有特定核酸序列的患者，其中抗原可以在患者中诱导免疫耐受。本文公开的核酸序列也用于人类鉴别应用。本发明还提供了检测这些多态性的存在及其编码的产物的方法、测定、试剂盒及试剂。另外，本发明还解决在治疗中应用或避免应用非甾类抗炎药的问题。
背景技术
所有生物的基因组在它们持续进化过程中均经历自发突变，产生祖先遗传序列的变体形式。变体形式相对于祖先形式可以赋予进化优势或劣势或者可以是中性的。在一些情况中，变体形式赋予物种进化优势，最终掺入物种的许多或大多数成员的DNA中并且有效变成祖先形式。另外，变体形式的作用可以是有利的和破坏性的，这依赖于环境。例如，杂合镰刀细胞突变通常是致死的。在许多情况中，祖先和变体形式均存活并且共存于物种群体中。遗传序列多个形式的共存引起遗传多态性，包括单核苷酸多态性，也已知为“SNP”。SNP也可以在基因组区域中产生，没有明显功能，但是SNP可以与基因组中变体序列遗传连锁。因此，根据遗传连锁如何密切，SNP可以与基因组的变体序列密切相关。
人类基因组中所有多态性的大约90％是SNP。SNP是DNA中单碱基位置，群体中在该位置存在不同的等位基因或者可变核苷酸。SNP位置(本文可互换称为SNP、SNP位点或SNP基因座)之前或之后通常是等位基因的高度保守序列(例如序列在群体成员中的变化在1/100或1/1000个以下)。个体在每个SNP位置的等位基因可以是纯合的或杂合的。
临床试验已示出患者对药物治疗的应答经常是异质性的。一些人相信患者应答是由于他们的遗传组成，其导致具有改变的受体、酶或细胞生理学中的一些变化。因此，遗传组成中的差异导致与群体中其它人不同的应答。因此，研究者希望患者的核酸序列可以用于药物研究中以帮助药物开发及选择方法。目前，我们相信在药物中使用患者的核酸序列未被应用于免疫耐受。
免疫耐受或免疫学耐受是一种过程，通过其免疫系统不产生对否则是免疫原性抗原的免疫应答，或者以抑制方式改变其免疫应答的方向。获得的或诱导的耐受是指免疫系统适应外部抗原，特征在于淋巴组织对给定抗原的特异性不反应性，其在其它情况中可能诱导细胞介导的或体液免疫。一种最重要的天然的获得性耐受发生在怀孕期间，其中胎儿和胎盘必须被母亲免疫系统耐受。有许多诱导耐受的模型，包括使用有胎盘哺乳类胚胎(eutherian fetoembryonic)防御系统，耐受诱导主要需要调节T细胞的参与。
一种特异类型免疫耐受，口服耐受(oral tolerance)是通过先前经口服途径给予抗原而对该抗原的细胞和/或体液免疫反应性的特异性抑制，可能进化以防止对食物蛋白质和存在于粘膜菌群中的细菌抗原的超敏反应。其具有巨大的免疫学重要性，因为其是由外源抗原驱动的持续的天然免疫学事件。由于它们对内环境的优先可及，持续接触粘膜的抗原代表了外来和自身成分之间的边界。口服耐受进化以将经天然途径进入身体的外部物质对待为内部成分而没有危险信号，其然后变成自身部分。口服耐受的失败引起严重的基于免疫学的疾病的发生和发病机制，包括炎症性肠病(节段性回肠炎(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎)。本发明包括的其它常见形式的耐受诱导包括鼻内(internasel)和IV耐受诱导。
尽管有大量研究针对基因组和SNP，当今的基因组学仍然未用于改进我们的医疗管理。因此，很少有可靠的宽范围的测定、试剂盒和方法，来检查个体基因组以发现遗传易感性、基因表达及预测的药物基因组学应答。更特异地，基因组学没有应用在免疫耐受领域。
本发明人提供了将基因组学与免疫耐受融合的方法、试剂、试剂盒和测定。因此，本发明人能够检测核酸序列，基于核酸序列的存在和/或不存在；定制希望诱导免疫耐受的患者的护理方法。在一个具体实施方案中，感兴趣的核酸序列是SNP。
发明内容
本发明涉及将某些核酸序列在群体内的存在或不存在与在该相同群体中产生免疫耐受的能力相关联。这种关联可以用于辅助诱导免疫耐受。在一些实施方案中，本发明涉及由重复给予非常大剂量抗原或者重复给予低于刺激免疫应答所需阈值的小剂量而诱导的耐受。在一些实施方案中，耐受最容易由静脉内或舌下给予的可溶性抗原诱导。另外，预期免疫抑制也促进耐受的诱导。基于与具体疾病或失调相关的某些核酸序列的存在或不存在的关联，本发明还提供检测变体的方法。在一个具体实施方案中，感兴趣的核酸序列是SNP。另外，本发明的实施方案还解决在治疗中应用或避免应用非甾类抗炎药的问题。
本发明包括筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括筛查至少一种SNP。筛查方法可包括FISH，使用DNA阵列，和/或杂交多核苷酸探针。
本发明包括筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括使用等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、测序、5′-核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和/或单链构象多态性。
本发明包括筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括将至少一种SNP的存在或不存在与作为将一或多种抗原或治疗剂给予宿主的结果宿主产生免疫耐受的能力相关联。抗原可以是胶原蛋白，包括选自如下组类型的胶原蛋白：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII和XXVIII型。
本发明包括筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括从所述宿主获得包含核酸的样品；从所述样品分离核酸；测定所述样品中至少一种SNP的存在或不存在，其中所述至少一种SNP的存在或不存在是对发生免疫耐受的易感性增加的指征。所述样品可以是全血、血浆、尿液、泪、精液、唾液、口腔黏膜、组织液、淋巴液、脑膜液、羊水、腺体液(glandular fluid)、痰、粪便、汗、粘液、阴道分泌物、脑脊液、毛发、皮肤、排泄物、伤口渗出物、伤口匀浆(wound homogenate)及伤口液(wound fluid)。另外，所述方法可包括通过给予宿主至少一种抗原而诱导免疫耐受，其中抗原可以是一种类型的胶原蛋白。
免疫耐受可以针对任何自身免疫病，如硬化性疾病如系统性硬化病。
本发明包括筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括使用一或多种计算机程序，与至少一种计算机系统一起使用，其中计算机程序包括多个指令，包括至少一种指令用于辅助鉴别所述至少一种SNP的存在或不存在；至少一种指令用于将所述至少一种SNP的存在或不存在与至少一种疾病状态相关联；及至少一种指令用于将所述至少一种SNP的存在或不存在与指示宿主对产生免疫耐受的易感性的评分相关联。计算机还可产生报告，包括多个指令的结果，其中所述报告可以以保密(secure)或不保密(non-secure)方式在网络、在线端口、经纸件或email传递。
本发明包括给予至少一种治疗剂的方法，所述方法包括对宿主核酸中的一或多种SNP进行基因分型，将所述一或多种SNP与一或多种疾病或失调相关联，使用数学算法确定所述宿主对给予至少一种治疗剂发生阳性或阴性应答的概率，及基于所述数学算法将治疗剂给予或不给予宿主。
本发明包括进行临床试验的方法，其中评价一或多种抗原，包括基因分型与一或多种疾病或失调相关的一或多种SNP；分析基因分型结果；基于所述基因分型结果确定动作程序，其中所述动作程序包括基于所述基因分型结果指示个体可能应答所述一或多种抗原而将所述个体纳入临床试验中，和/或基于所述基因分型结果指示个体不太可能应答所述一或多种抗原而排除所述个体参与临床试验。
本发明包括鉴别具有发生自身免疫病的改变的风险的个体的方法，包括在所述个体的核酸中检测SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述SNP的存在与自身免疫病的改变的风险相关。
附图说明
图1示出本发明一些实施方案的流程图，举例说明确定一或多种核酸是否与免疫耐受诱导相关的方法。
图2示出本发明一些实施方案的流程图，举例说明通过一或多种核酸的存在或不存在而确定个体治疗方案的方法。
图3示出本发明一些实施方案的流程图，举例说明通过一或多种核酸的存在或不存在而确定个体治疗方案的方法。
图4示出本发明一些实施方案的流程图，举例说明通过一或多种核酸的存在或不存在而确定个体治疗方案的方法。
图5示出本发明一些实施方案的流程图，举例说明通过一或多种多肽的存在或不存在而确定个体治疗方案的方法。
图6是示出与经管饲给予小鼠的胶原蛋白II数量相关的关节炎关节的百分比的图。
图7是示出通过吡罗昔康消除某些形式的口服耐受的图。
图8是示出由α1(II)刺激的脾细胞产生的IFN-γ的图。
图9是示出COX-2抑制剂SC’236消除口服耐受诱导的图。
图10是示出通过吡罗昔康永久消除口服耐受的图。
图11是示出吡罗昔康或CII对集合淋巴结(Peyer’s patch)脾共培养的作用的图。
图12是示出吡罗昔康或CII对肠系膜淋巴结细胞增殖的作用的图。
图13是示出口服胶原蛋白II治疗类风湿性关节炎患者的作用及其如何调节PBMC的PBMC IFN产生的图。
图14是基因分型患有类风湿性关节炎的人及其诱导免疫耐受的能力的图。
图15是示出标记和基因含有潜在感兴趣SNP的图。
图16是示出相对于安慰剂患者，12个月时的MRSS显著降低的图。
定义
在下述讨论中一些文章和方法为背景和介绍目的描述。本文内容不应被理解“承认”现有技术。申请人明确保留权利证明当合适时所述文章和方法在适用的法律规定下不构成现有技术。为帮助描述本发明，提供以下定义。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。本领域技术人员容易认识到对一条链上特定位点的提及也指互补链上的相应位点。除非明确限制，该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质并且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另有说明，则特定核酸序列也暗含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列及明确指示的序列。特异地，简并密码子取代可以通过产生这样的序列而实现，在所述序列中一或多个选择的(或全部的)密码子的第三个位置用混合碱基和/或脱氧肌苷取代。术语核酸与“核酸序列”、“基因”、“cDNA”和由基因编码的“mRNA”互换使用。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式有功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即结合于氢的α碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这种类似物具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构但是以类似于天然存在的氨基酸的方式有功能的结构的化合物。氨基酸可以在本文中以常规已知的三字母符号或者IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号表示。相似地，核苷酸可以用通常接受的单字母密码表示。
本文所用术语“基因型”广义指生物的遗传组成，包括例如二倍体生物对于一或多个感兴趣变体等位基因是杂合或是纯合的。
如本文所用，“SNP”和“SNP基因型”包括个体SNP和/或单元型，单元型是通常一起遗传的SNP的集合。单元型与个体SNP相比可以具有与疾病或其它表型作用更强的相关，因此可以在一些情况中提供增加的诊断精确性。
本发明的SNP可以产生自在多态性位点的一或多个核苷酸被另一个取代。取代可以是转换或者颠换。转换是一种嘌呤核苷酸被另一种嘌呤核苷酸置换，或者一种嘧啶被另一种嘧啶置换。颠换是嘌呤被嘧啶置换或者反之。SNP也可以是单碱基插入或者缺失变体。
本发明的SNP可以产生自同义密码子变化，或者沉默突变/SNP(术语如“SNP”、“多态性”、“突变”、“突变体”、“变异”和“变体”在本文可互换使用)由于遗传密码简并性不导致氨基酸变化。将编码一个氨基酸的密码子变化为编码不同氨基酸的密码子的取代(即非同义密码子变化)被称为错义突变。无义突变导致非同义类型密码子变化，其中形成终止密码子，由此导致多肽链过早终止和截短的蛋白质。连读突变是另一类型非同义密码子变化，其导致终止密码子破坏，由此导致延伸的多肽产物。SNP可以包括所有等位基因(allelics)，包括二-、三-或四等位基因(bi-，tri-，or tetra-allelics)。
在定义SNP位置、SNP等位基因或者核苷酸序列时，对核酸分子一条链上特定位点的腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、胞嘧啶或鸟嘌呤的提及也定义所述核酸分子互补链上相应位置的(分别为)胸腺嘧啶(尿嘧啶)、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。因此，可以提及任一链以指特定SNP位置、SNP等位基因或者核苷酸序列。可以设计探针和引物以与任一链杂交，本文公开的SNP基因分型方法可以一般地靶向任一链。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖通过共价肽键连接的氨基酸残基。本发明提及“多肽”、“肽”或“蛋白质”包括含有不同于本领域已知肽/多肽/蛋白质(所述蛋白质可以可互换地称为“野生型”、“参考”或“正常”蛋白质)的相应氨基酸序列的至少一个氨基酸残基的肽、多肽、蛋白质或其片段。这种变体肽/多肽/蛋白质可以得自密码子变化，所述密码子变化由在本发明公开的蛋白质编码位置的非同义核苷酸取代(即错义突变)导致。本发明的变体肽/多肽/蛋白质也可以得自无义突变，即产生过早终止密码子的SNP、通过消除终止密码子产生连读突变的SNP、或者由于本发明公开的另外改变蛋白质的结构、功能/活性或表达的任何SNP导致，如在调节区(例如启动子或增强子)的SNP或者导致可变或缺陷剪接的SNP，如在内含子中的SNP或者在外显子/内含子边界的SNP。如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。
对于所有实施方案，术语“个体”和“宿主”可互换使用，并且不限于人类。根据本发明一个方面，“个体”可以是任何脊椎动物，包括哺乳动物如灵长类并且包括人、狗、猫、牛、山羊、猪、绵羊和猴。因此，本发明可以适用于通过例如动物饮水、动物饲料、兽药等治疗动物。根据本发明一个方面，个体可以是健康的或者患有疾病。通常，如果本发明方法应用于患有自身免疫病或者由病原微生物和个体中某一核酸序列类型导致的疾病，则其可以有效应用。
术语“改变”可用于本文中涵盖增加或降低的风险/可能性。
本文所用术语“具体疾病”、“疾病”或“失调”包括自身抗体疾病以及与病原微生物例如病毒、细菌、酵母或支原体相关的疾病以及肿瘤学疾病。但是疾病不受特别限制。
本文所用术语“从业者”或“医学从业者”包括以医学或相关医学领域作为职业的任何人，包括医学、生物技术或药学产业。
发明详述
本发明提供了确定个体是否可能产生免疫耐受的方法，其如下进行：检测核酸序列的改变的表达(更高或更低的表达)或者独特表达以及个体中的基因序列，即使其不表达或者仅瞬时表达。因此，一些实施方案提供了确定具有产生免疫耐受能力的个体是否具有相比于不具有产生免疫耐受能力的那些个体差异和独特的已知和未知核酸序列的表达。在一些实施方案中，核酸序列是SNP。
本发明还提供了核酸序列、用于检测所述核酸序列的方法和试剂以及核酸序列在用于诱导免疫耐受试剂盒或测定中的用途。
本发明包括与具有或产生免疫耐受的增加风险或者具有或产生免疫耐受的降低风险相关的核酸序列的用途。可以测定一些核酸序列(或它们的mRNA或蛋白质编码产物)的存在以确定个体是否具有是具有或产生免疫耐受的增加风险或者具有或产生免疫耐受的降低风险的指征的核酸序列。
相似地，本发明的核酸序列可以与应答特定治疗或抗原的增加或降低的可能性或者产生对特定治疗或抗原的免疫耐受的增加或降低的可能性相关。
在一些实施方案中，核酸序列是SNP。这种核酸变异可以在本领域技术人员公知的许多不同方法中测定，包括PCR、RFLP、杂交和直接测序。
确定在易感于免疫耐受的个体中核酸存在/不存在
一个实施方案是确定存在或不存在于易感于免疫耐受产生的个体中的核酸序列的方法，包括筛查至少一种核酸序列，如图1所示。在这个方法中，医学从业者首先给予患者口服抗原以诱导免疫耐受(101)。
适用于本发明的抗原包括但不限于合成或天然衍生的蛋白质和肽，特别是本身需要高剂量以诱导口服耐受的那些；碳水化合物，包括但不限于多糖和脂多糖；及分离自生物来源的抗原，例如与诱导自身免疫病、临床(变应性)超敏反应和同种异基因移植排斥相关或者导致诱导自身免疫病、临床(变应性)超敏反应和同种异基因移植排斥的那些抗原及其亚基或提取物；或其任意组合。
另外，抗原可以是任何与诱导自身免疫病、临床(变应性)超敏反应和同种异基因移植排斥相关或者导致诱导自身免疫病、临床(变应性)超敏反应和同种异基因移植排斥的抗原，及其亚基或提取物；或者重组产生的全蛋白、其亚基或片段；或其任意组合。
给予的抗原可以包括但不限于表1的所有抗原，以治疗相关疾病。表1列出的相关疾病或失调是举例而非限制性的。在一个具体实施方案中，所述至少一种抗原是选自下组的胶原蛋白：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII、XXVIII、及其混合物。胶原蛋白也可以是其片段。例如，胶原蛋白可以是α1(I)的 CNBr裂解产生的一或多种片段，其产生8个CB片段：CB0，CB1， CB2，CB4，CB5，CB8，CB3，CB7和CB6。胶原蛋白可以是由α2(I)的 cCNBr裂解产生的一或多种片段，其产生6个CB片段：CB1，CB0， CB4，CB2，CB3和CB5。
另外，在一个实施方案中，疾病是硬化性疾病。在另一个实施方案中，疾病是多发性硬化症。
表1显示本发明多个实施方案。例如，在一个实施方案中，胶原蛋白是用于诱导对疾病特发性肺纤维化的免疫耐受的抗原。在另一个实施方案中，α-烯醇化酶是用于诱导对疾病哮喘的免疫耐受的抗原。
另外，个体剂量大小、剂量数、剂量给予频率及给予模式可以变化。这种方案的确定可以由本领域技术人员完成。合适的单剂量是当在合适时间期间(例如从几分钟到几天到几周)给予一或多次能改变动物中的生物学应答的剂量。优选地，剂量包含从大约1ng抗原/千克体重(ng/kg)至大约1克抗原/千克体重(g/kg)，更优选100ng/kg至大约100毫克/千克(mg/kg)，还更优选从大约1微克抗原/千克体重(μg/kg)至大约10mg/kg。
或者，剂量可以不基于患者体重确定。在这个实施方案中，剂量可以是至少1ng/天抗原。优选地，剂量范围从10μg/天抗原至5000μg/天。在另一个实施方案中，剂量范围从10μg/天抗原至500μg/天。在另一个实施方案中，剂量范围从30μg/天抗原至200μg/天。
在一个替代实施方案中，抗原剂量低于刺激免疫应答所需的阈值。在另一个实施方案中，抗原剂量高于所述阈值，由此刺激免疫应答。
给予模式可以包括但不限于气雾剂、皮下、直肠、真皮内、静脉内、鼻内、口服、经皮和肌肉内途径。在一个优选的实施方案中，抗原是口服给予。在另一个优选实施方案中，抗原是静脉内或舌下给予。
另外，在给予个体之前，抗原可以与其它成分如药物学可接受赋形剂和/或载体联合。所述其它成分依赖于给予模式、储存需要等。
这种赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、右旋糖溶液、Hank溶液剂其它水性生理学平衡盐溶液。也可以使用非水性运载体如不挥发油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的配制品包括含有粘度增强剂如羧甲基纤维素、山梨糖醇或葡聚糖的悬液。赋形剂也可以含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括但不限于磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的例子包括但不限于硫柳汞、间-或邻-甲酚、福尔马林和苯甲醇。
标准配制品可以是液体注射剂或者可在合适液体中制成用于注射的悬液或溶液的固体。载体典型地是增加抗原在治疗个体中的半衰期的化合物。合适的载体包括但不限于聚合物控制释放运载体、可生物降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、油、酯和二醇。优选的控制释放配制品能够将本发明抗原缓慢释放进个体。合适的控制释放运载体包括但不限于生物相容性聚合物、其它聚合物基质、包囊、微囊、微粒、推注制备物、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球(lipospheres)及经皮输送系统。本发明的其它控制释放运载体包括在给予个体时原位形成固体或凝胶的液体。优选的控制释放运载体是可生物降解的(即可生物消化的)。
生物学样品、也称为“样品”取自个体，用于确定个体的免疫应答(102)。这种样品制备成分可以用于从任何体液(如血液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、胃液、精液、泪液、汗液等)、皮肤、毛发、细胞(特别是有核细胞)、生物活检、口腔拭子或组织样品中产生核酸提取物(包括DNA和/或RNA)、蛋白质或者膜提取物。提取样品的频率及其应用依赖于这样的因素，如评分方法、测定形式、检测方法的性质、以及用作待测定的测试样品的特异组织、细胞或提取物。从生物学样品制备核酸、蛋白质和细胞提取物的方法是本领域公知的，并且可以易于适应以获得与所用系统相容的样品。
从生物学样品确定个体对抗原的免疫系统应答，个体基于他们的应答而评分(103)。评分方法基于从业者，包括任何基于其对抗原的免疫应答而区分患者的方法。例如，患者可以基于抗原特异性和抗原非特异性测定而评分。抗原特异性测定测量T和B细胞对特异抗原的应答，而抗原非特异性测定确定表面标记的表型或者细胞的功能状态以获得与特定临床状态相关的模式。
具体地，从业者可使用任何方便手段以确定免疫系统应答，包括但不限于使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISA/ACT
LymphocyteResponse Assay(LRA)、体外测量抗体产生、混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞测定、流式细胞术、Western印迹、有限稀释测定、质谱、免疫沉淀和免疫荧光。
例如，在一个实施方案中，ELISPOT测定用于确定个体免疫应答。典型地，ELISPOT测定包括在用抗感兴趣细胞因子的捕获抗体包被的平板中保温免疫细胞。然后在保温期间由捕获抗体捕获细胞膜释放的细胞因子。除去细胞并用标记系统如抗相同细胞因子的不同表位的标记的第二抗体检测结合的细胞因子。这个测定产生单细胞的细胞因子足迹。
在另一个实施方案中，使用transvivo DTH测定确定个体免疫应答。在这个测定中，来自个体的细胞与抗原一起被注射进免疫缺陷小鼠的足垫中。然后通过定量足垫中产生的肿胀而测量T细胞对抗原的反应性指数。
在另一个实施方案中，使用四聚体测定。在此，T细胞频率用流式细胞术测量它们与特异肽-MHC复合物的结合而测量。
在替代实施方案中，CFSE测定通过在分裂细胞中稀释CFSE染料而测量T细胞增殖。这个测定可包括使用流式细胞术。
在另一个实施方案中，可使用T细胞的胞内染色经例如流式细胞术确定产生细胞因子的T细胞的频率。
在另一个实施方案中，患者基于在接受抗原之前、期间和/或之后在IFN-γ产生中的相应水平和/或变化而评分。或者，可以测量其它细胞因子以确定个体评分。例如，可以使用在α1(I)-和α2(I)-刺激的PBMC培养上清中的IL-10水平和/或sIL-2R的水平以评分患者。
确定免疫系统应答的其它手段可包括鉴定TCR库。这个测定可包括使用定量PCR、凝胶电泳和DNA测序以确定使用Vβ链确定沿Vβ基因产物的CFR3长度分布的T细胞的比例。
确定免疫系统应答的另一个手段可包括对多克隆非抗原特异性刺激的T细胞应答。在此，全血用植物血凝素刺激一段时间，然后分离CD4+T细胞，通过在细胞裂解后测量的胞内ATP的合成和积累测量早期CD4+T细胞激活的程度。
确定免疫系统应答的其它手段可包括但不限于检测核酸的存在。有一些检测核酸的方法可利用，包括PCR、LCR和杂交技术。杂交技术包括杂交两或多种核酸分子，其中检测以各种方式实现，包括标记核酸分子并观察从这种标记产生的信号。杂交技术可包括下述任一：Northern和Southern印迹、循环探针反应、分支DNA、InvaderTM测定及杂交捕获。杂交技术也可以用于通过使用已知核酸序列的微阵列(或“生物阵列”)探查样品而鉴别样品中的特异核酸序列。生物阵列技术通常使用已知的单链核酸，其中每个独特的短链附着于特异的已知位置，然后加入样品核酸并且使存在于样品中的序列与固定化的链杂交。这种杂交的检测然后通过在杂交前待检测样品片段的标记、典型地末端标记而进行。另外，杂交可以用荧光原位杂交技术确定。
另外，在一个实施方案中，可以使用蛋白质组学途径。在此，可以使用蛋白质微阵列或者质谱确定存在于个体样品中的蛋白质片段的存在和定量。另外，通过分析一种以上蛋白质，从业者可以通过个体中独特的蛋白质表达模式确定免疫应答。
为基于免疫系统应答对患者评分，从业者可以测量比较接受抗原之前、期间和/或之后的免疫应答。何时测量免疫应答及使用何种方法基于从业者需求。另外，从业者可以进一步考虑个体的其它生理学因素，如其它细胞因子、T细胞百分比、NK细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、亚群、氧化自由基、结缔组织生长因子、氧化一氮、由成像技术确定的胸腺形态学、患者身高、营养状态、体重、健康、由免疫学测定确定的胸腺功能、饮食、性别、年龄、维生素A水平、锌水平及环境考虑，以辅助评分患者的免疫应答。也可以考虑患者的基因组背景如其它基因或者基因组区域中的突变、种族和性别差异。
一旦基于抗原应答对个体进行评分，从业者将分析个体的基因型以确定个体是否具有或者缺乏一或多种核酸序列，由此改变基因表达水平或模式(104)。基因型后来用于将一或多种核酸的存在或不存在于步骤(103)的免疫应答评分相关联。
从业者可以检查特异的已知的感兴趣核酸或者检查完整基因组的部分或全部以寻找差异或独特核酸或核酸模式的存在或不存在，并将一或多种核酸存在/不存在与个体的免疫应答评分相关联。特别感兴趣的核酸包括已知影响样品中mRNA或蛋白质浓度的那些，已知影响核酸和/或蛋白质表达的动力学的核酸，影响核酸和/或蛋白质分解速率的核酸，以及影响蛋白质稳定性谱、Km或Vmax的核酸。
另外，从业者可以使用步骤(102)的部分生物学样品分析核酸，或者从业者可以从个体取另一生物学样品用于分析。核酸可以通过从业者方便的任何手段从样品中纯化或分离，但是这种分离在一些检测形式中可能是不需要的。
在一个优选的实施方案中，从业者分析个体基因型以通过本领域公知方法确定哪个/哪些等位基因存在于任何给定的感兴趣遗传区域。相邻序列可以用于设计核酸检测试剂如寡核苷酸探针，其可以任选地以试剂盒形式实施。
常用基因分型方法包括但不限于TaqMan测定、分子信标测定、核酸阵列、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性PCR、阵列引物延伸、均相(homogenous)引物延伸测定、具有质谱检测的引物延伸、焦磷酸测序、在遗传阵列上分选的多重引物延伸、具有滚环扩增的连接(ligation with rolling circle amplification)、均相连接、OLA、在遗传阵列上分选的多重连接反应、限制片段长度多态性、单碱基延伸-标记测定以及Invader测定。这种方法可与检测机制组合应用，所述检测机制例如发光或化学发光检测、荧光检测、时间分辨荧光检测、荧光共振能量转移、荧光偏振、质谱和电学检测。
检测多态性的各种方法包括但不限于使用裂解剂保护以检测RNA/RNA或RNA/DNA中的错配碱基的方法，比较变体和野生型核酸分子的电泳移动性，以及使用变性梯度凝胶电泳测定多态性或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动。在特异位置的序列差异也可以用核酸酶保护测定如Rnase和SI保护或者化学裂解方法评估。
在一个实施方案中，用TaqMan测定进行基因分型，其也已知为5’核酸酶测定。TaqMan测定检测PCR期间特异扩增产物的积累。TaqMan测定使用用荧光报道染料和猝灭剂染料标记的寡核苷酸探针。报道染料通过在合适波长照射而激发，其通过称为荧光共振能量转移(FRET)的过程将能量转移到同一探针中的猝灭剂染料。当附着于探针时，激发的报道染料不发射信号。在完整探针中猝灭剂染料与报道染料的接近维持报道分子的降低的荧光。报道染料和猝灭剂染料可以分别在最5’末端和最3’末端，或者反之。或者，报道染料可以在最5’或3’末端，而猝灭剂染料附着于内部核苷酸，或者反之。在另一个实施方案中，报道分子和猝灭剂均可附着于内部核苷酸，彼此距离是使得报道分子的荧光是降低的。
在PCR期间，DNA聚合酶的5’核酸酶活性裂解探针，由此分开报道染料和猝灭剂染料，导致报道分子增加的荧光。PCR产物的积累通过监测报道染料荧光的增加而直接检测。只有当探针与在PCR期间扩增的含有靶SNP的模板杂交时，DNA聚合酶才裂解报道染料和猝灭剂染料之间的探针，探针设计得仅当特定SNP等位基因存在时才与靶SNP位点杂交。
优选的TaqMan引物和探针序列可以用本文提供的SNP和相关核酸序列信息容易地确定。可以使用一些计算机程序如Primer Express(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)以快速获得最佳引物/探针组。本领域技术人员明白这种用于检测本发明的核酸的引物和探针可用于狭窄和相关病理学的诊断测定中，并且可以容易地掺入试剂盒形式。本发明还包括本领域公知的TaqMan测定的修改，如使用分子信标探针和其它变体形式。
基因分型本发明核酸的另一种方法是在OLA中使用两个寡核苷酸探针。在这个方法中，一个探针与靶核酸的节段杂交，其3’最末端与核酸位点排列对比。第二个探针在第一个探针的3’直接与靶核酸分子的相邻节段杂交。这两个并置探针与靶核酸分子杂交，并且如果第一个探针的3’最末端核苷酸与核酸位点直接有完全互补性则在连接剂如连接酶的存在下连接。如果有错配，则不能发生有效连接。在反应后，连接的探针与靶核酸分子分离，并且被检测作为核酸序列存在的指示。OLA还可用于用通用阵列进行核酸检测，其中zipcode序列被引入一个杂交探针中，所得产物或者扩增产物与通用的zip code阵列杂交。或者，当zipcode被掺入OLA探针时可以使用OLA，扩增的PCR产物通过电泳或者通用zipcode阵列读出而确定。
或者，人们可以使用SNPlex方法和软件，用于使用OLA随后PCR进行多重SNP检测，其中zipcode被掺入OLA探针中，扩增的PCR产物与zipchute试剂杂交，SNP的性质从zipchute的电泳读出而确定。在一些实施方案中，OLA在PCR(或者另一种核酸扩增方法)之前进行。在其它实施方案中，PCR(或另一种核酸扩增方法)在OLA之前进行。
另一种基因分型方法基于质谱。质谱利用DNA的4种核苷酸的每一种的独特质量。核酸可以通过测量具有不同核酸等位基因的核酸的质量的差异而经质谱无疑义基因分型。MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization--Time of Flight)质谱技术对于分子质量的极度精确确定是优选的，如用于SNP。基于质谱已开发了许多基因型分析方法。优选的基于质谱的核酸基因分型方法包括引物延伸测定，其也可以与其它方法组合使用，如传统的基于凝胶的形式和微阵列。
典型地，引物延伸测定涉及设计引物并使其与靶核酸位置上游(5’)的模板PCR扩增子退火。向含有模板的反应混合物中加入二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)和/或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的混合物。例如，在一些实施方案中，这是含有SNP的核酸分子，其典型已通过例如PCR扩增。可进一步加入引物和DNA聚合酶。引物延伸终止在模板的第一位置，在此存在与混合物中的ddNTP之一互补的核苷酸。引物可以与所述核酸位置紧密相邻(即引物3’末端的花果山与靶SNP位点下一个核苷酸杂交)或者与所述核酸位置隔开2或多个核苷酸。如果引物与靶核酸位置隔开几个核苷酸，唯一的限制是引物3’末端与所述核酸位置之间的模板序列不能含有与待检测的核苷酸相同类型的核苷酸，否则这将导致延伸引物的过早终止。
或者，如果所有4种ddNTP单独而不包括dNTP被加入反应混合物中，引物总是由仅一个核苷酸延伸，相应于靶SNP位置。在这种情况中，引物设计用于结合SNP位置上游的一个核苷酸(即在引物3’末端的核苷酸与在靶SNP位点的5’侧的靶SNP位点紧密相邻的核苷酸杂交)。仅延伸一个核苷酸是优选的，因为其使延伸引物的总质量最小化，由此增加可变SNP核苷酸之间质量差异的分辨。另外，质量标记的(mass-tagged)ddNTP可以采用在引物延伸反应中以代替未修饰的ddNTP。这增加了用这些ddNTP延伸的引物之间的质量差异，由此提供增加的灵敏性和精确性，并且特别有用于分型杂合碱基位置。质量标记(mass-tagging)也缓和了对深入的样品-制备程序的需要及降低了质谱仪的必需分辨能力。
然后可以纯化延伸的引物并用MALDI-TOF质谱分析确定在靶SNP位置存在的核苷酸的性质。在一种分析方法中，来自引物延伸反应的产物与形成基质的光吸收晶体组合。基质然后用能量源如激光碰撞(hit)，以电离和释放核酸分子进入气相。电离的分子然后射入飞行试管(flight tube)并在试管向下朝向检测仪加速。电离事件如激光脉冲与分子与检测仪碰撞之间的时间是该分子飞行时间。飞行时间与电离分子的质量电荷比(m/z)精确相关。具有较小m/z的离子从试管向下旅行比具有较大m/z的离子更快，因此较轻离子在较重离子之前到达检测仪。飞行时间然后转换为相应的高度精确的m/z。以这种方式，可以基于在单碱基位置具有不同核苷酸的核酸分子中固有的质量中的轻微差异及相应的飞行时间差异而鉴别SNP。
核酸也可以通过直接DNA测序而评分。可以使用各种自动化测序程序，包括经质谱测序。本发明的核酸序列能使本领域技术人员容易设计测序引物用于这种自动化测序程序中。商业仪器如Applied Biosystems 377，3100，3700，3730和3730x1 DNA Analyzers(Foster City，Calif.)常用于本领域用于自动化测序。核酸序列也可以通过采用高通量突变筛选系统如SpectruMedix系统而确定。
可以用于基因分型本发明核酸的其它方法包括单链构象多态性(SSCP)及变性梯度凝胶电泳(DGGE)。SSCP通过单链PCR产物的电泳迁移的改变鉴别碱基差异。单链PCR产物可以通过加热或者以其它方式变性双链PCR产物而产生。单链核酸可以重折叠或者形成部分依赖于碱基序列的二级结构。单链扩增产物的不同电泳移动性与在核酸位置的碱基序列差异相关。DGGE基于多态性DNA中固有的不同序列依赖性稳定性和熔融性质及相应的在变性梯度凝胶中的电泳迁移模式的差异而区分核酸等位基因。
序列特异性核酶也可以用于基于核酶裂解位点的产生或丧失而评分核酸特别是SNP。完全匹配的序列可以通过核酸酶裂解消化测定或者通过熔点差异而与错配序列区分开。因此，例如，如果SNP影响限制酶裂解位点，则该SNP可以通过限制酶消化模式的改变及通过凝胶电泳确定的核酸配对长度中的相应变化而鉴别。
基因分型可以包括如下步骤，例如从人类对象中收集生物学样品(例如组织、细胞、液体、分泌物样品等)，从样品细胞中分离核酸(例如基因组DNA、mRNA或两者)，将核酸与一或多种特异性杂交含有感兴趣的靶核酸区域的分离的核酸区域杂交的引物在发生靶核酸区域的杂交和扩增的条件下接触，以及确定在感兴趣核酸位置存在的核苷酸，或者在一些测定中，检测扩增产物的存在或不存在(测定可以被设计，由此杂交和/或扩增仅在特定核酸序列等位基因存在或不存在时才发生)。在一些测定中，扩增产物的大小被检测并且与对照样品长度比较；例如，缺失和插入可以通过与正常基因型相比的扩增产物大小的变化而检测。
另外，发现的核酸或者特别是SNP可以然后与也已接受抗原以诱导免疫应答的其他个体的核酸比较。可以以任何合理手段进行比较两个或多个序列的相同性的方法，包括在Wisconsin Sequence Analysis Package version9.1(Genetics Computer Group，Madison，Wis.，USA)中的可利用的程序。其他程序如BSTFIT可以用于发现Smith and Waterman的“局部同源性”算法，以及发现两个序列之间的最佳单一相似性区域。另外，可以使用如GAP程序，其对比两个序列以发现“最大相似性”。优选地，当被比较的两个序列是最佳排列时，％相同性和相似性被确定。确定序列之间的相同性和/或相似性的其它程序是本领域已知的，例如BLAST家族程序，得自National Center for Biotechnology Information(NCB)，Bethesda，Md.，USA)，以及FASTA，是Wisconsin Sequence Analysis Package的一部分。
一旦确定个体中存在的合适模式的存在或不存在，免疫应答评分与核酸结果相关。从业者可以然后确定一或多种核酸优选SNP是否与应答或不应答具有改变的免疫耐受的抗原的个体相关。
预期免疫耐受的诱导机制可根据不同疾病和失调变化。例如，涉及系统性红斑狼疮的诱导的SNP可以不同于涉及其他疾病如自身免疫脑病的SNP。因此，从业者可以针对从业者希望诱导免疫耐受的每种疾病和失调重复图1方法。
基于确定个体的基因型确定治疗方案
图1所示方法特别有益，因为其使从业者可以确定哪些核酸序列、包括SNP参与免疫耐受的诱导。更重要的是一旦完成图1所示方法，从业者可以简便地检测新个体的感兴趣的核酸序列或者SNP，如图2所述。
首先，从业者将患有疾病或者失调的患者归类或者加以诊断(201)。所述归类或者诊断可以基于目前或者之前的症状、病史、家族史、检测如化验或者医学扫描等进行。
一旦从业者已经对患者加以诊断，则从该患者取生物样品(202)。所述样品可以是便于从业者和患者的任何形式，包括但不限于全血、血浆、尿液、泪液、精液、唾液、口腔粘膜、细胞间液、淋巴液、脑膜液、羊水、腺体液、痰液、粪便、汗液、粘液、阴道分泌物、脑脊液、毛发、皮肤、排泄物、伤口分泌物、伤口匀浆，以及伤口渗液。
然后从样品中分离个体的核酸(203)。所述分离可以通过便于从业者的任何方式进行。例如，可以通过首先使用洗涤剂、酶消化或者物理破坏等方式使细胞裂解而分离核酸。然后从核酸中除去污染物，通过使用如酶消化、有机溶剂提取或者色谱分析方法进行。个体的核酸可以通过任何方式纯化和/或浓缩，包括用醇沉淀、离心和/或透析。
然后测定个体核酸中感兴趣的一或多种预定核酸的存在或者不存在(204)。所述感兴趣的一或多种预定核酸可以是从业者确信预任何疾病或失调的免疫耐受相关的任何核酸。举例的合适的疾病或失调在表1中列出。
确定感兴趣的一或多种预定核酸是否存在可以通过任何方式进行(205)。
在一个实施方案中，感兴趣的预定核酸是染色体12上的大约50KB非基因区，位于与染色体12的66,603,791至66,603,991bp之间的近端相距大约55.5Mbp，其中感兴趣的核酸是TTTTTTTTTTGTACCTAGTTCTATGGTTACCTT(SEQ ID NO：1)或者TTTTTTTTTTGTACCTGGTTCTATGGTTACCTT(SEQ ID NO：2)。A/G是多态性位点。因此，AA表示纯合AA，AB表示杂合A/G，BB表示GG基因型，A→G表示多态性位点。
或者，感兴趣的预定核酸可包括SNP A-1515737的5’侧大约265143bp的部分。或者，感兴趣的预定核酸可包括SNP-1515737的3’侧的大约231513bp。或者，感兴趣的预定核酸包括SEQ ID NO：3或者4的一部分或者全部。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸位于染色体12上66507155-66507464之间，在标记D12S1503附近。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸位于D12S1676附近，即感兴趣的预定核酸部分或全部位于染色体12上的66499298-66499423之间。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸位于D12S335附近，即感兴趣的预定核酸部分或全部位于染色体12上的66415802-66416056之间。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸位于D12S102附近，即感兴趣的预定核酸部分或全部位于染色体12上的66781046-66781298之间。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸位于D12S1506附近，即感兴趣的预定核酸部分或全部位于染色体12上的66785380-66785614之间。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1508498(TSC51977)，具有C或者T多态性。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1512645(TSC1720860)，具有C或者T多态性。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1512719(TSC1720861)，具有C或者T多态性。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1515330(TSC1244733)，具有C或者T多态性。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1518829(TSC51583)，具有A或者G多态性。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1518878(TSC51584)，具有C或者G多态性。此外，在一个特定的实施方案中，感兴趣的预定核酸位于30kbp的SNP_A-1515737内。这些其它标记和转录物也可用于确定患者具有耐受、特别是口服耐受的诱导能力。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是D12S1503(SEQ ID NO：5)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是D12S1676(SEQ ID NO：6)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是D12S335(SEQ ID NO：7)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是D12S102(SEQ ID NO：8)。
在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1508498，具有C或者T多态性(SEQ ID NO：9和10)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1512645，具有C或者T多态性(SEQ ID NO：11或者12)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1512719，具有C或者T多态性(SEQ ID NO：13或者14)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1515330，具有C或者T多态性(SEQ ID NO：15或者16)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1518829，具有A或者G多态性(SEQ ID NO：17或者18)。在另一实施方案中，感兴趣的预定核酸是SNP_A-1518878，具有C或者G多态性(SEQ ID NO：19或者20)。感兴趣的预定核酸也可以是在人染色体12上63.3mbp-69.4mbp之间的任何标记或者基因。见例如图15。
在一个实施方案中，从业者使用目测证实所述核酸特殊变体的存在或者不存在。
在另一实施方案中，所述方法提供了基于计算机的具有一或多个算法的系统，以确定感兴趣的一或多种预定核酸的存在和/或不存在，以及如果存在则量化个体核酸中存在的感兴趣的一或多种预定核酸的量。
在一个优选的实施方案中，感兴趣的预定核酸是一或多种SNP。此外，基于计算机的系统可包含关于观测的SNP等位基因、可变密码子、群、等位基因频率、SNP类型和/或受影响的蛋白质等信息。
基于计算机的系统包含如下至少一个部件：用于分析本发明信息的硬件、软件和数据存储器。本发明的基于计算机的系统的最小硬件典型包含中央处理器(CPU)、输入设备、输出设备和数据存储器。技术人员可易于意识到任一目前可用的基于计算机的系统均适于本发明。这种系统通过利用CD-R上提供的信息或者其子集(subset)而不用任何实验就可以改变为本发明的系统。
如上所述，本发明的基于计算机的系统包含其中贮存信息的数据存储器以及支持和执行搜索必备的硬件和软件。所述基于计算机的系统的搜索装置包括在基于计算机的系统上执行的一或多个软件程序或者算法，以基于在数据存储器中贮存的核酸信息鉴别或者分析核酸序列，包括靶序列中的SNP。搜索装置可用于确定核酸序列的存在或者不存在，和/或确定哪个核苷酸存在于核酸序列中特定SNP位置。
在这个实施方案的一个应用中，从业者可提供在计算机可读介质上具有关于感兴趣的核酸的信息的基于计算机的系统。计算机可读介质是可以通过计算机直接读取和访问的任何介质，包括但不限于：磁性存储介质如软盘、硬盘贮存介质和磁带；光学存储介质如CD-ROM；电子存储介质如RAM和ROM；以及这些存储介质的结合如磁性/光学存储介质。
技术人员可利用各种数据存储结构产生计算机可读介质，其上记录本发明的核苷酸或者氨基酸序列。数据存储结构的选择通常基于选择的用于访问贮存的信息的方式。此外，可以使用各种数据处理程序和格式将本发明的核酸序列信息贮存在计算机可读介质上。例如，序列信息可以在可商购的软件如WordPerfect和Microsoft Word中格式化，以word文本文件形式呈现，以ASCII文件形式呈现，或者贮存在数据库如OB2、Sybase、Oracle中等等。技术人员可易于改写任何数目的数据处理结构格式(例如文本文件或者数据库)，以获得在其上记录本发明核酸序列信息的计算机可读介质。
通过以计算机可读形式提供本发明的核酸序列、包括SNP，从业者可以各种目的常规地访问核酸序列信息。计算机软件是可公开获得的，使得技术人员可以访问计算机可读介质中提供的序列信息。举例的可公开获得的计算机软件包括BLAST和BLAZE搜索算法。
本发明进一步提供了系统，特别是基于计算机的系统，其含有本文描述的核酸序列信息。这种系统可以被设计为从大量个体中贮存和/或分析关于例如大量SNP位置信息，或者关于基因分型的信息，包括SNP基因分型。本发明的核酸序列信息代表一个有价值的信息源。在基于计算机的系统中贮存/分析的本发明的核酸序列信息可用于这种计算机密集型应用，如确定或者分析群体中核酸等位基因频率、作图疾病疾病、基因型-表型相关性研究、将SNP分组为单元型、使SNP单元型与应答特定药物相关，或者用于各种其它生物信息、药物基因组学、药物开发或者人鉴别/法医应用。
然后基于感兴趣的一或多种预定核酸的存在和/或不存在制定个体治疗方案(206)。所述治疗可包括从业者实施的任何措施，包括确定诱导免疫耐受的可能性，以及如果如此的话确定抗原的类型、剂量、给予方法、治疗方案等。
本发明人还发现非甾类抗炎药物(NSAIDS)可以干扰免疫耐受的产生。因此，在一个替代的实施方案中，从业者可以调节免疫耐受的产生，通过使用NSAIDS结束对个体进行的预期治疗，或者给予药物如米索前列醇以逆转NSAID的免疫耐受抑制作用。
此外，在一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于治疗特发性肺纤维化(IPF)。IPF是一种致命的慢性进展性肺间质疾病，其中正常肺组织逐步被纤维组织代替，或者异常及过量的纤维组织沉积在肺间质中。这可以被描述为肺的瘢痕(scarring)。大约60％的IPF患者对V型胶原蛋白具有抗原特异性自身免疫反应。不希望受到特殊机制或者理论的限制，确信这种患者的免疫系统攻击肺的V型胶原蛋白，从而导致纤维化。
如果攻击肺的V型胶原蛋白的免疫应答可以被停止或者减弱，则对V型胶原蛋白具有自身免疫反应的IPF患者将获益。这种免疫应答可以通过使用本发明的方法诱导对V型胶原蛋白的免疫耐受而停止或者减弱。根据本发明的方法，耐受可以通过重复给予胶原蛋白抗原、优选V型胶原蛋白抗原而诱导。
给予胶原蛋白或者胶原蛋白抗原、优选V型胶原蛋白或者其抗原，在治疗对V型胶原蛋白具有抗原特异性自身免疫反应的IPF患者中最有效。因此，希望存在鉴别这种患者的检测方法。
使用本发明的方法，可以进行相关性研究以确定具有V型胶原蛋白抗原特异性自身免疫反应的IPF患者是否具有一或多种SNP——或者以一些方式与SNP连接的其它核酸序列——其在不具有V型胶原蛋白抗原特异性自身免疫反应的IPF患者中未发现。与V型胶原蛋白的抗原特异性自身免疫反应相关的一或多种SNP或者连接的核酸序列可用于鉴别最可能得益于给予胶原蛋白或者胶原蛋白抗原、优选V型胶原蛋白或者其抗原的患者。也确信对V型胶原蛋白的自身免疫反应导致对肺移植的排斥反应。因此，发现与V型胶原蛋白的抗原特异性自身免疫反应相关的SNP和/或连接的核酸序列也可以用于评定患者成功经受肺移植或者其它移植的倾向性。
使用个体基因分型确定是否诱导免疫耐受
本发明还可由从业者用于确定个体的治疗方案。即基于个体特异性信息，本发明可为从业者推荐治疗方案，如是否诱导免疫耐受、抗原类型、剂量、给予方法、治疗方案等。治疗方案的推荐不仅是关于个体具有的疾病或者失调，也关于个体的特性。
在这个实施方案中，该方法在图3中示出，首先将个体特性置于一或多个数据库中(301)。个体特性信息可以通过任何方式收集，包括使用一或多个从业者的综合会诊信息、由个体填写的调查问卷、电子数据库、诊断或者专家组测量工具、委托人概要报告以及结果测量报告。此外，个体特性信息可以通过如下一或多种方式收集：网络、口头交流、视觉交流、书面交流、物理数据载体和/或能输送信息的任何其它方式。
个体特性可包括但不限于年龄、性别、身高、体重、个体病史、家族病史、种族特点、过敏信息、生活方式信息等。
然后收集并分析个体的核酸(302)。收集个体核酸的方法可以是从业者预期的任何方法，包括在本说明书中提及的那些方法。
然后确定感兴趣的一或多种预定核酸的存在或者不存在(303)。在此，确定哪种核酸即感兴趣的预定核酸将被检验，可以由从业者单独确定。或者，所述确定包括访问含有反映当前疾病或者个体诊断之间关系、或者从业者为何确信当前疾病或者诊断以及与所述疾病或者诊断感兴趣的核酸的信息的数据库。
在一些实施方案中，本发明的一或多个数据库位于从业者当地。在其它实施方案中，一或多个数据库是远距离动态数据库。通常地，动态数据库是其中数据可易于改变或者上传的数据库。例如，可以使用软件系统通过网络从动态数据库访问信息以及从数据库上传信息至软件系统。如果数据库中贮存的信息改变，与数据库连接的软件系统也将因此自动改变，不用人为干预。软件系统可以在任何时基更新动态数据库中的个体信息，包括但不限于事件驱动(event driven)、每分钟、每小时、每天或者每周。
基于步骤(303)的结果，即感兴趣的一或多种预定核酸的存在或者不存在，可以确定个体的治疗方案。在一个实施方案中，从业者基于其在医学领域的实践经验可以确定治疗方案。在另一实施方案中，在一或多个数据库中贮存的软件系统推荐一种治疗方案。该推荐的治疗方案可包括但不限于是否诱导免疫耐受、抗原的类型、剂量、给予方法、治疗方案、非处方或者处方药物、生活方式改变等。
治疗方案的推荐不仅与个体具有的疾病或者失调相关，也与个体的特性相关。正式如此，一或多个数据库可以使软件系统输入关于个体、待治疗的疾病或者失调、治疗结果的更多信息及其它相容信息。预期可以将多个个体的信息集合在一起，因此随着一或多个参数的数据量的增加，软件系统中的算法在计算何种治疗/程序最适合个体标准时更强大和精确。此外，数据库可进一步包括“最优方法(Best Practices)”库，即由医学专家组优化制定的特定治疗方案。
这些实施方案使得从业者可以更好地调整对个体的治疗，避免不必要的花费以及不必要的治疗时间。
确定与免疫耐受相关的核酸
可以通过图4所示方法确定哪些核酸是预定的感兴趣的核酸。首先，收集多个患病或者失调个体的信息并且贮存在一或多个数据库中(401)。信息包括至少个体的疾病或者失调，在给予抗原之后个体产生免疫耐受的能力，以及个体的核酸信息。优选地，核酸信息是一或多种SNP的存在或者不存在。
对比一或多种SNP的存在或者不存在与个体产生免疫耐受的能力，以确定特定疾病或者失调中所述核酸出现的增多(或者减少)(402)。SNP与产生免疫耐受的能力的对比可以通过使用数学算法实现。
一旦在一或多种SNP与诱导免疫耐受的能力之间确定统计学显著相关性，则可任选彻底筛查SNP周围的区域以鉴别导致影响诱导免疫耐受的能力的遗传基因座/序列(例如SNP/突变，基因，调节性，区域等)。
此外，可以进行SNP与特定疾病或失调的相关性研究，以确定具有感兴趣的失调或者疾病的个体的生物样品中SNP等位基因的存在或者频率，并将该信息与优选相似年龄和种族的对照信息(即不具有该失调的个体；对照者也可以称作“健康”或者“正常”个体)对比。患者与对照者在物理特性方面应尽可能相同，且非常希望的是具有经充分鉴定的表型的一群个体。此外，相关性研究也可以在一般群体中进行，非限于对受影响的家族的相关个体进行研究(连锁研究)。
然后将一或多种SNP的信息与关于其在个体中的存在或者不存在与诱导免疫耐受的能力的信息一起贮存在一或多个数据库中(403)。
然后收集希望治疗其疾病或者失调的个体的核酸并进行分析，以发现该个体是否具有与其它个体诱导免疫耐受的能力统计学显著相关的一或多种SNP(404)。然后医学从业者可以单独或者借助于包含一或多个数据库的软件系统确定哪种医疗方案是可行的以及确定那些医学治疗参数。
在免疫耐受易感的个体中确定改变的多肽的呈现
在另一实施方案中，首先使用一种方法确定对发生免疫耐受易感的个体中多肽的存在与否，所述方法包括筛查至少一种多肽，如图5所示。在这种方法中，医学从业者首先给予患者口服抗原以诱导免疫耐受(501)。
适用于本发明中的抗原包括先前揭示的那些抗原，且可包括与诱导自身免疫病、临床(过敏性)超敏反应以及同种异基因移植排斥相关或者应答的任何抗原及其亚基或者提取物；或者重组产生的完整蛋白质、其亚基或者片段；或者所述这些物质的任何组合。此外，所述抗原可包括但不限于表1列出的所有抗原，用以治疗相关疾病。所述抗原可进一步组合其它成分如药物可接受的赋形剂和/或载体，之后再给予个体。
给予个体的剂量、给予次数、给予频率以及给予模式可以不同，这些可以由本领域技术人员确定。抗原的合适剂量是先前论述的那些剂量。此外，给予模式可包括但不限于气雾剂、皮下、经直肠、皮内、静脉内、经鼻、口服、经皮和肌肉内途径给予。
生物样品取自个体用于确定个体的免疫应答(502)，从而基于其应答对个体免疫系统对抗原的应答评分(503)。
确定个体免疫应答的方法可包括先前论述的任何方法，包括但不限于使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISA/ACT
淋巴细胞应答测定(LRA)、体外测量抗体的产生、混合嗜中性粒细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞测定、流式细胞计量术、Western印迹、有限稀释测定、质谱分析、免疫沉淀、免疫荧光、ELISPOT、transvivo DTH测定、四聚体测定、CFSE测定、鉴定TCR所有组分、测量T细胞应答多克隆非抗原特异性刺激、核酸存在的检测包括PCR、LCR、杂交技术以及蛋白质组学。此外，在一个特定的实施方案中，基于在接受抗原之前、期间和/或之后细胞因子包括IL-17、IL-2或者IFN-γ的产生水平和/或改变对患者评分。此外，T调节细胞如Tr1细胞或者CD4+、CD25+、FoxP3+细胞的水平可用于对患者应答评分。或者，可以测量其它细胞因子以确定个体评分。例如，α1(I)-和α2(I)-刺激的PBMC培养上清和/或sIL-2R中IL-10、IL-4、IL-5或者TGF-β1、2或3可用于对患者评分。
评分方法取决于从业者，包括基于其对抗原的免疫应答分离患者的任何方法。为了基于免疫系统应答对患者评分，从业者可测量对比在接受抗原之前、期间和/或之后的免疫应答。何时测量免疫应答以及使用何种方法基于从业者的需要而决定。此外，预期从业者可进一步考虑到个体的其它生理因素如其它细胞因子、氧化自由基、结缔组织生长因子、氧化一氮、患者身高、体重、健康状况、饮食以及环境因素，以帮助对患者的免疫应答评分。
一旦基于抗原应答对个体进行评分，从业者将分析个体的多肽以确定个体是否具有一或多种多肽或者变体多肽(504)。
从业者可检验样品中特别已知的感兴趣的多肽或者检验样品中存在的蛋白质的一部分或者全部，以探寻不同的或者独特的多肽或者多肽模式的存在与否，并使多肽的存在/不存在于个体的免疫应答评分相关。
多肽可以通过本领域技术人员已知的各种方法检测。在多肽检测之前，可以将个体生物样品中的多肽通过标准技术纯化为基本纯度，所述标准技术包括但不限于用如硫酸铵这样的物质选择性沉淀、冷乙醇沉淀、超滤、柱层析、免疫纯化方法等。
多肽可以通过使用从业者便利的任何方法检测，包括但不限于夹心测定和竞争或者置换测定。典型地，夹心或者竞争/置换测定包括“捕获剂”，其特异性结合且通常固定待分析物(在这种情况中是样品中的一或多种多肽)。捕获剂是特异性结合待分析物的部分。
多肽的存在与否可以由从业者通过任何便利的方式确定，包括电化学方式或者使用标记。标记是可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或者化学方式可检测的任何组合物。可用于本发明中的标记包括磁珠，荧光染料(例如异硫氰酸荧光素，Texas红，若丹明(rhodamine)等)，放射性标记(例如3H，125I，35S，14C或者32P)，酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及ELISA中其它常用酶)，以及比色标记如胶体金或者有色玻璃或者塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。所述标记可以根据本领域熟知的方法与测定的希望成分直接或者间接结合。抗体可以通过本领域技术人员熟知的及如上述的任何方式产生。此外，所述标记可以在第三部分上，其结合捕获剂/待分析物复合物，或者其次地结合与捕获剂/待分析物复合物不同的部分。
可用于检测和/或量化多肽的其它技术包括Western印迹(免疫印迹)分析、脂质体免疫测定(LIA)、蛋白质组学如微阵列或者质谱分析。
可以确定在固体样品中发现的感兴趣的多肽的氨基酸序列，并且与含有与其它个体诱导免疫耐受的能力统计学显著相关的多肽氨基酸序列的一或多个数据库对比(404)。医学从业者单独或者借助于包含一或多个数据库的软件系统可以确定哪种医疗方案是可行的以及确定那些医学治疗参数。
在本文描述的任何实施方案中，应意识到所述疾病或者失调可以与种族、种族属性或者性别相关。例如，一项研究发现女性包含78％的经诊断的自身免疫病。此外，系统性硬化症具有性别和种族特异性普遍性，其中女性比男性更可能患有该疾病，且非裔美国人比高加索人更可能患有该疾病。正如此，感兴趣的核酸的存在与否可受激素、X染色体的约束，或者受到在性别和/或种族之间具有不同水平的酶、受体或者其它化合物的约束。
SNP检测试剂盒和系统
基于本文揭示的SNP及相关序列信息，可以开发检测试剂并用于单独或者组合测定本发明的任何SNP，这种检测试剂可易于掺入本领域熟知的已确定的试剂盒或者系统之一中。用于SNP检测试剂中的试剂盒是指这样的试剂盒，如多种SNP检测试剂的组合，或者一或多种SNP检测试剂组合一或多种其它类型的元件或成分(例如其它类型的生物化学试剂、容器、包装如用于商业销售的包装、SNP检测试剂附着的基质、电子硬件成分等)。因此，本发明进一步提供了SNP检测试剂盒和系统，其包含但不限于包装的探针和引物系列(例如TaqMan探针/引物系列)、核酸分子的阵列/微阵列，以及含有一或多个探针、引物或者检测本发明的一或多种SNP的其它检测试剂的珠。所述试剂盒/系统可任选包含由不同厂商提供的各种电子硬件成分，例如阵列(DNA芯片)以及微流体系统(lab-on-a-chip系统)，典型包含硬件成分。
其它试剂盒/系统(例如探针/引物系列)可不包含电子硬件成分，但是可包含例如包装在一或多个容器中的一或多种SNP检测试剂(与任选其它生物化学试剂一起)。
在一些实施方案中，SNP检测试剂盒典型含有进行测定或者反应如扩增和/或检测含有SNP的核酸分子必需的一或多种检测试剂及其它成分(例如缓冲液，酶如DNA聚合酶或者连接酶，链延伸核苷酸如三磷酸脱氧核苷酸，以及在Sanger-型DNA测序反应情况中的链终止核苷酸，阳性对照序列，阴性对照序列等)。试剂盒可进一步含有确定靶核酸的量的方式，以及将该量与标准量对比的方式，且可包含使用该试剂盒检测感兴趣的含有SNP的核酸分子的说明书。在本发明的一个实施方案中，提供的试剂盒含有进行检测本文揭示的一或多种SNP的一或多项测定必需的试剂。在本发明的一个优选实施方案中，SNP检测试剂盒/系统是核酸阵列形式，或者区室化(compartmentalized)试剂盒，包括微流体/lab-on-a-chip系统。
SNP检测试剂盒/系统可含有例如一或多个探针，或者成对的探针，其与靶SNP位置或者附近的核酸分子杂交。多个成对的等位基因特异性探针可包含在所述试剂盒/系统中，以同时测定大量的SNP，其中至少一个SNP是本发明的SNP。在一些试剂盒/系统中，等位基因特异性探针固定在底物如阵列或者珠上。例如，所述底物可包含等位基因特异性探针以检测表1和/或表2中示出的至少1、10、100、1000、10,000、100,000(或者其间的任何其它数目)或者基本上所有的SNP。
术语“阵列”、“微阵列”和“DNA芯片”在本文可互换使用，是指固定在底物如玻璃、塑料、纸、尼龙或者其它类型膜、滤膜、芯片或者任何其它合适的固体支持物上的不同的多核苷酸阵列。所述多核苷酸可以在底物上直接合成，或者与底物分开合成然后固定在该底物上。微阵列可以包含固定于固体支持物上的大量独特的、单链多核苷酸，通常是合成的反义多核苷酸或者cDNA片段。
基于多核苷酸阵列的杂交测定依赖于探针与完全匹配的和错配的靶序列变体的杂交稳定性的差异。对于SNP基因分型，通常可优选在杂交测定中使用的严格条件足够高，由此可以区分与另一核酸分子只在一个SNP位置不同的核酸分子(例如设计典型的SNP杂交测定，由此杂交将只在SNP位置中存在的一个特定核苷酸发生，但是如果在该SNP位置存在另一核苷酸则不发生杂交)。当例如使用等位基因特异性探针的核酸阵列检测SNP时可优选这种高严格性条件。
在其它实施方案中，所述阵列与化学发光检测技术联合使用。
本发明的SNP检测试剂盒/系统可包含用于从检测样品中制备核酸的成分以进行随后的俺有SNP的核酸分子的扩增和/或检测。这种样品制备成分可用于从任何体液(如血液、血清、血浆、尿液、唾液、痰、胃液、精液、泪、汗液等)、皮肤、毛发、细胞(特别是有核细胞)、活检组织、口腔粘膜拭子或者组织样品中产生核酸提取物(包括DNA和/或RNA)、蛋白质或者膜提取物。用于上述方法中的检测样品基于这样的因素而有所不同，如测定形式、检测方法的性质，以及用于测定的检测样品的特定组织、细胞或者提取物。制备核酸、蛋白质以及细胞提取物的方法为本领域熟知，且可易于调试为适于获得与使用的系统相适合的样品。
本发明涵盖的另一形式的试剂盒是区室化(compartmentalized)试剂盒。区室化试剂盒包括其中试剂包含在单独的容器中的任何试剂盒。这种容器包括例如小玻璃容器，塑料容器，塑料、玻璃或者纸或者阵列材料如二氧化硅的条带。这种容器使得可以有效地将试剂从一个区室转移至另一区室，由此检测样品与试剂不交叉污染，或者从一个容器转移至该试剂盒中未包含的另一容器中，每个容器中的材料或者溶液均可以定量形式从一个区室加入另一区室中或者加入另一容器中。这种容器可包括例如接受检测样品的一或多个容器，含有至少一个探针或者其它SNP检测试剂以检测本发明的一或多种SNP的一或多个容器，含有洗涤试剂(如磷酸盐缓冲盐水，Tris-缓冲液等)的一或多个容器，以及含有用于除去结合的探针或者其它SNP检测试剂的一或多个容器。所述试剂盒可任选进一步包含进行例如核酸扩增或者其它酶促反应如引物延伸反应、杂交、连接、电泳(优选毛细管电泳)、质谱分析和/或激光诱导的荧光检测的区室和/或试剂。
微粒体装置，也可以称作“lab-on-a-chip”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEMs)或者多成分集成系统，是举例的本发明分析SNP的试剂盒/系统。这种系统使得如探针/靶杂交、核酸扩增以及毛细管电泳反应等过程在一个功能装置中小型化及区室化。这种微流体装置在该系统至少一方面中典型利用检测试剂，这种检测试剂可用于检测本发明的一或多种SNP。
此外，所述试剂盒也可包含如上述一或多种抗原。正是如此，医学专业人士可首先确定SNP在患者中存在与否。然后，医学专业人士制定方案或者代替预定方案，以发现哪种抗原、以何种剂量、通过哪种给予方法给予患者。所述一或多种抗原可以与试剂盒一起或者单独销售。
鉴于本申请中的揭示以及本领域技术人员熟知的信息，可以确定与具有产生免疫耐受的能力或者难以产生免疫耐受相关的许多SNP。可以对其中复制子含有这些SNP或者其中复制子与其在基因组上紧密连接的样品进行PCR。这种技术可提供快速测定法以确定在特定个体中诱导耐受的能力可能性。
从前文的描述中可以显而易见本发明的明显优势。虽然本发明仅以少数形式示出，但其非限于此，在不偏离本发明精神的前提下可以进行各种改变和修改。
在本说明书中，以范围形式是呈现了本发明的各个方面。应理解以范围形式描述只是为了方便和简洁起见，不应理解为本发明的范围仅限于此。因此，应考虑到描述的范围具有特别揭示的所有可能的亚范围以及该范围内的各个数值。例如，描述1-6的范围应理解为具有特别揭示的亚范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。以该范围的最广度应用。
实施例1：类风湿性关节炎(RA)患者
检测维持常规RA治疗的120名RA患者的周围血单个核细胞(PBMC)在与50μg/u的自身抗原、纯化的牛胶原蛋白II(CII)的α1链或者α1(II)培养6天时产生IFNγ的能力。收获培养上清，通过ELISA确定IFNγ水平。
如下表(表I)所示，76名患者与未刺激的或者(PBS)培养的PBMC相比增加两倍，或者63％RA患者普遍对CII免疫应答(称作应答者)。尽管存在具有CII自身免疫性的RA患者高度普遍性，但这是该疾病期间显现的一些可能的抗原之一。
实施例2：低剂量胶原蛋白II在DBA/1 Lac小鼠中诱导耐受
将12只一组的小鼠在2周内喂食8次指定剂量的CII，并用100μg在CFA中的牛CII免疫接种。休息4天后，用完全弗氏佐剂乳化的100μgCII在小鼠尾巴根部免疫接种。关节炎的程度由单盲观测者评定8周。
从图6中可以看出，口服10μg/天CII更有效地降低关节炎的发生，500μg/天也如此，但效率较低。具有3级或者4级关节炎的小鼠百分比在Y轴上表示。双期(biphasis)应答是由于低剂量和高剂量CII诱导的不同耐受机制所致。低剂量的CII(10μg)诱导调节性T细胞，而高剂量(500μg)诱导无反应性(anergy)或者克隆缺失。
实施例3：NSAID抑制在DBA/1小鼠中诱导对胶原蛋白II的免疫耐受
为了确定在DBA/1小鼠中喂食牛CII的耐受诱导是否由于喂食NSAID而消除，为3组20-22只DBA/1小鼠喂食(通过管饲)8剂(周一，周二，周四和周五，共2周)如下制剂：午前给予安慰剂(盐水)，午后给予安慰剂(0.1M HAc)；午前给予安慰剂(盐水)，午后给予10μg天然牛CII；或者午前给予吡罗昔康(piroxicam)(2.4μg/gm)，午后给予天然牛CII(10μg)。1周后，所有小鼠均免疫接种(在尾巴根部)100μg在完全弗氏佐剂中乳化的牛CII。将动物置于编号的笼子中，由单盲观测者每周两次对关节炎关节(关节肿胀，发红和/或变形)的数目评分。
如图7所示，与安慰剂+安慰剂喂食对照组对比，在安慰剂+CII组的小鼠中在观测期间关节炎关节的百分比较低(p＜0.03，Cochran-Mantel-Haenszel分析)。相反，在喂食吡罗昔康+CII组小鼠中在相同观测期间观测到明显增多的关节炎关节。在相似的研究中，我们发现萘丁美酮(Relafen)在DBA/1小鼠中也消除OT诱导(数据未示出)。
实施例4：脾细胞产生IFNγ
为了评定以与图7所示实验相似方式为喂食安慰剂或者CII的另一组小鼠喂食吡罗昔康对于脾细胞产生IFNγ的作用，在2周内为4组小鼠(4只小鼠/组)管饲8天如下制剂：午前给予吡罗昔康，午后给予CII；午前给予吡罗昔康，午后给予HAc；午前给予盐水，午后给予CII；或者午前给予盐水，午后给予HAc。在休息1周后，所有小鼠均在尾巴根部免疫接种CII-完全弗氏佐剂乳状液。14天后，处死小鼠，分离脾细胞，用PBS或者α1(II)CB肽混合物培养。培养72小时后，通过ELISA分析收获的上清的IFNγ水平。
当将小鼠脾细胞与α1(II)CB肽混合物在体外培养时，喂食CII+安慰剂或者吡罗昔康+安慰剂的小鼠产生的IFNγ降低。见图8所示。然而，当将吡罗昔康通过口服给予喂食CII的小鼠时，在体外用α1(II)CB肽混合物刺激的脾细胞产生IFNγ的水平显著增加。在其它实验中，发现COX-2抑制剂SC236在DBA/1小鼠中也阻断对CII的口服耐受诱导，通过脾细胞产生的IFNγ评定(数据未示出)。
实施例5：COX-2抑制剂SC’236抑制口服耐受诱导
为每组8只小鼠在午前管饲MTTHF×2周与PBS或者SC’236(5μg/gm在100μl PBS中)。SC’236(Searle)对于COX-2的抑制性比对于COX-1的抑制性高大约2000倍。
为在午前给予PBS的四只小鼠和在午前给予SC’236的4只小鼠在午后管饲10μg牛II型胶原蛋白(CII)。为在午前给予PBS组及在午前给予SC’236组的其它4只小鼠在午后管饲CII溶解于其中的运载体0.1M乙酸(HAc)。在这样喂食8天后，所有小鼠休息1周，然后用在完全弗氏佐剂中的100μg的CII免疫接种。10天后，处死所有小鼠，分离脾细胞(2×106/ml)，与PBS和α1(II)(50μg/ml)CB混合物培养。培养4天后，收获上清，通过ELISA(Endogen)确定IFNγ水平。由于PBS+所有小鼠脾细胞培养物产生1-12pg/ml IFNγ，因此仅绘图α1(II)数据。通过Student’s 2样本t检验对比所有实验组与安慰剂对照组。
如图9所示，为DBA/1小鼠喂食CII诱导口服耐受，通过α1(II)CB消化产物(digest)刺激的脾细胞产生IFNγ显著降低证实(p＜0.025)。相反，为小鼠喂食SC’236导致通过α1(II)CB消化产物产生较低IFNγ，但是当为小鼠喂食SC’236+CII时，与α1(II)CB消化产物培养的脾细胞产生IFNγ显著增加(p＜0.01)。鉴于SC’236也可抑制COX-1，但是较其抑制COX-2的程度低大约2000倍，这些数据提示COX-2是优化低剂量口服抗原耐受诱导必需的。
实施例6：NSAID对口服耐受的持续作用
为了确定在DBA/1小鼠中长期喂食吡罗昔康与CII对于CII耐受诱导是否具有持续作用，在2周内为三组的每组10-11只DBA/1小鼠喂食8剂CII(如上述)，进行两次，间隔6个月：午前给予吡罗昔康(2.4μg/gm)，午后给予安慰剂(0.1M HAc，100μl)；午前给予安慰剂(盐水)，午后给予天然牛CII(10μg)；或者午前给予吡罗昔康(2.4μg/gm)，午后给予天然牛CII(10μg)。在给予第二次8剂处理后3个月，使用在完全弗氏佐剂中乳化的100μg天然牛CII对每只小鼠进行免疫接种(在尾巴根部皮内注射)。将小鼠置于编号笼子中，由单盲观测者每周两次对关节炎关节的数目评分。如图10所示，在第7和8周，在用CII免疫接种后，在9和3个月之前喂食吡罗昔康+CII组的小鼠与喂食安慰剂+CII组的小鼠相比具有明显更多的关节炎关节(8周，p＜0.04，通过卡方分析)。
实施例7：喂食吡罗昔康+CII的小鼠的GALT
为了评定这三组小鼠的GALT状态，从每只动物中分离集合淋巴结细胞，一式四份与正常DBA/1脾细胞(2×106/ml)加上重组鼠IL2(10U/ml)共培养(2.5×105/ml)。在96孔圆底平板的一式四份孔中加入PBS(作为对照)或者50μg/ml牛α1(II)CB肽混合物。3天后，将培养物用3H胸苷脉冲，24小时后收获在滤纸上。通过α1(II)CB肽混合物培养的cpm除以PBS对照培养的cpm计算每只小鼠的“刺激指数”。如图11所示，与单独CII或者单独吡罗昔康喂食的小鼠的集合淋巴结细胞的共培养物相比，喂食吡罗昔康+CII的小鼠的细胞明显受α1(II)CB肽混合物刺激(p＜0.03)。此外，我们一致地发现来自DBA/1小鼠或者Balb/c小鼠的与正常同基因脾细胞(2×106/ml)共培养集合淋巴结细胞(2.5×105/ml)，当用鼠IL-2刺激时，导致所述脾细胞无超过背景cpm的刺激。因此，用DBA/1脾细胞在存在α1(II)CB肽混合物条件下集合淋巴结细胞的刺激指数显著增加是非常优异且未曾预料的。每只小鼠的肠系膜淋巴结细胞(2×106/ml)与α1(II)CB肽混合物的培养显示相似模式(图12)。来自喂食CII或者吡罗昔康的小鼠的肠系膜淋巴结应答α1(II)CB肽混合物无增殖。相反，来自喂食吡罗昔康+CII的小鼠的肠系膜淋巴结细胞明显受α1(II)CB肽混合物刺激(图12)。
使用在BALB/c小鼠中喂服OVA(1mg/天×5天)及在DBA/1 lac J小鼠中喂服牛CII(在14天内给予10μg×8剂)进一步进行研究以检测常用的免疫调节药物对于免疫诱导的作用(强的松≤7.5mg/天，羟化氯喹400mg/天，氨甲喋呤17.5mg/周，来氟米特(leflunomide)在给予100mg/天×3负荷剂量之后给予20mg/天，柳氮磺胺吡啶2.5gm/天，D-青霉胺750mg/天，IM金和依那西普(etanercept)25mg每周两次)。这些免疫调节药物不完全抑制耐受，且其在服用这些免疫调节药物的RA患者中仍可诱导CII耐受。在DBA/1 lac J小鼠中给予强的松≥10mg/天和金诺芬(auranofin)确实阻碍对CII的OT诱导。
实施例9：给予RA患者口服胶原蛋白II降低患者自身免疫性
在患者中检测免疫耐受，定义为与II型胶原蛋白α1(II)培养的PBMC产生IFN-γ降低≥30％。给予服用缓解疾病的抗风湿药物、抗TNF制剂和/或非甾类抗炎剂的患者每日两次米索前列醇100μg，以逆转口服耐受的非甾类抗炎抑制作用。患者随机接受“低剂量”或者“高剂量”CII。低剂量组(n＝38)每日服用30μg/天牛CII共10周，然后服用50μg/天共10周，然后服用70μg/天共10周。高剂量组(n＝41)服用90μg/天共10周，110μg/天共10周以及130μg/天共10周。
获得基础水平以及每个10周处理期之后的肝素化血液。将血液在收集后1-4小时内用含有青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640稀释1∶3，包在纸中，置于含有“冰袋”的聚苯乙烯泡沫箱中并shipped过夜。从血液样品中分离PBMC，与牛α1(II)25μg/ml、PHA 10μg/ml或者与50ul PBS培养。培养6天后，收集无细胞上清，在-70°贮存直至7个月，在此时通过商购ELISA(R&D Systems)测定指定患者所有样品的IFNγ。结果示于图13。
IFNγ刺激指数(SI)如下式计算：
接受每种低剂量(30μg、50μg和70μg/天)的患者的SI与在每个10周处理期之前的基础水平对比，相似地接受每种高剂量(90μg、110μg和130μg/天)的患者的SI与在每个10周处理期之前的基础水平对比.
存在IFNγSI的明显抑制。在服用30μg、50μg、110μg和130μg/天CII处理10周后，≥62-69％的患者呈现出α1(II)IFNγSI降低≥50％。70μg和90μg/天的剂量不降低IFNγSI，70μg/天低剂量与基础水平相比显著增加IFNγSI。
此外，数据示出如果给予低剂量米索前列醇，在服用DMARD、抗-TNF制剂和NSAIDS的患者中可以诱导以对给予的抗原(CII)免疫应答降低而定义的CII的口服耐受。30和50μg/天的剂量在更多的生物类别中具有更高的降低。
剂量应答示出口服30μg、50μg和110μg/天CII对于IFNγ产生的最大抑制作用。α1(II)刺激的PBMC产生的IFNγ降低≥50％，大多数患者在这些剂量可以耐受(69％口服CII患者α1(II)刺激的IFNγ产生降低≥50％)。
对患者进行的进一步分析表明口服30-50μg/天剂量的CII存在30％无应答者，口服110-130μg/天剂量的CII存在28％无应答者(图13)。
实施例10：口服CII耐受与应答和无应答相关
为了研究是否任何特定基因型均与口服CII应答或者无应答相关联，从实施例9选择24名患者。
在口服给予RA患者牛CII之前从患者获得血液，所述患者与PBS对照PBMC培养相比产生α1(II)刺激的IFNγ增加≥2倍。将分离的(10μg/mL)、牛α1(II)(50μg/mL)、牛α1(II)CB11(50μg/mL)或者25μlPBS以2×106/500μl密度加入补加青霉素(100μg/mL)、链霉素(100μg/mL)和9％胎牛血清的48孔Dulbecos MEM组织培养平板中培养。6天后，收获上清，在2000×G离心5分钟，IFNγ水平通过商购ELISA(R&DSystems)量化。使用Mann-Whitney秩和检验分析应答者与无应答者之间对于PHA、α1(II)和α1(II)CB11的IFNγ水平和SI中的差异。
在这24名患者中，16名患者应答口服CII，α1(II)和α1(II)CB11刺激PBMC产生的IFNγ降低，8名患者的与这些抗原培养的PBMC不降低IFNγ产生。对于PBS、α1(II)50μg/ml、α1(II)CB1150μg/ml和PHA 10μg/ml的16名应答者和8名无应答者在6天PBMC培养中产生的基础IFNγ水平在表I中示出。如下计算IFNγ刺激指数(S.I.)：
对于PHA，如下式计算：
对于α1(II)，如下式计算：
对于α1(II)CB11，如下式计算：
如表II所示，CII口服耐受无应答者与CII口服耐受应答者相比具有较低的平均基础水平IFNγα1(II)S.I.(190±40对应1800±520，p＝0.002)。CII口服耐受无应答者与CII口服耐受应答者相比具有较低的平均基础水平IFNγα1(II)CB 11S.I.(1060±197对应210±90，p＝0.003)。基础水平的IFNγPHA S.I.在CII口服耐受应答者与无应答者之间无差异。
实施例11：微阵列评定产生精确数据以分析RA患者的基因型
对口服CII的16名应答者和8名无应答者进行SNP分析，以发现染色体上与已知对于口服耐受诱导重要的一些细胞因子和趋化因子紧密相关的SNP的频率。所述16名患者是给予30μg/天、50μg/天、110μg/天或者130μg/天的CII，其IFNγα1刺激指数基础水平降低≥50％的那些患者(OT应答者)。选择口服30μg/天、50μg/天、110μg/天或者130μg/天CII，IFNγα1S.I.增加的8名患者(OT无应答者)。
商购的全基因组作图芯片用于以及时和经济的方式对潜在的基因座作图。使用商购DNA提取试剂盒-Qiagen试剂盒(Qiagen Inc.，Alameda，CA)根据厂商指导，通过DNA提取分析实施例2的两组基因组。在Eppendorf光度计(Eppendorf Scientific Inc.，Westbury，NY)中及通过电泳定性和定量确定DNA之后，使用OD260/280比率＞1及高度完整性的DNA基因分型。对于每个样品，使用250ng的DNA基因分型，使用Affy GeneChip
Mapping 10K 2.0 Array，这是基于SNP的遗传作图工具。所述10K 2.0Array在一个阵列上含有大于10,000个人单核苷酸多态性(SNP)的基因型。该工具用于鉴别与特定性状或者表型联系或者相关的及基因组区域，在我们的情况中是CII口服耐受抗性。
所述方案包括四个主要程序：in silico分级分离，在微阵列上预示片段的合成，生物化学分级分离，以及等位基因特异性杂交和Genotype Calling。产生两个不同信号，表示10,000个单核苷酸的两个多态性的每一个。软件产生10,000个单核苷酸的多态性或者基因型。每个样品的10,000个SNP的每一个SNP的多态性基因型分为三个类型：纯合型I，AA；纯合型，BB；以及杂合型AB。如表III所示。
| 154-347 | F | 96.89％ | 99.95％ | 33.06％ | 34.18％ | 32.76％ |
表III是15名患者(9名男性，6名女性)的基因型。在大多数样品中SNP的检测信号均超过99％，表示高质量的检测。SNP call表示在10,000个SNP中可以识别并给出数据的那些SNP的百分比。这些样品中90％以上的SNP通过实验检测。三种基因型AA、AB和BB的分布均为大约三分之一(33％)。
实施例12：SNP A-1515737与口服CII应答者和非应答者之间的相关性
为了发现CII处理非耐受应答相关的可能的多态性，将实施例3的患者的基因型分选为口服CII应答者和非应答者组。对于每个组，对于芯片上每个SNP计算三个基因型AA、AB和BB的总数。表IV示出每个候选基因中SNP的基因型比率。
表IV：候选基因的多态性
| SNP_A-1518878 | 3-10-1/7--2--1 | |
| 谷氨酸脱羧酶 | SNP_A-1513856 | 14-0-0/10--0-0 |
| SNP_A-1509772 | 2--8-4/1--6-3 | |
| IL-1ra | SNP_A-1511280 | 2--5-7/0--3--7 |
如表IV所示，在8个候选基因的20个SNP中，应答者与无应答者之间大多数基因型模式相同或相似。谷氨酸脱羧酶的第一个SNP模式是14-0-0(AA-AB-BB)和10-0-0；第二个SNP是2-8-4和1-6-3。然而，在应答和无应答组之间存在SNP_A-1515737基因型分布的巨大差异，应答者与无应答者分别为1-9-6和6-1-1。虽然大多数应答患者具有杂合(AG)或者纯合(GG)BB基因型，但是无应答组中大多数患者具有AA基因型。进一步分析针对于SNP_A-1515737。
SNP_A-1515737的序列如下：TTTTTTTTTTGTACCT[A/G]GTTCTATGGTTACCTT(SEQ ID NO：1和2)。A/G是多态性位点。因此，AA表示AA纯合，而AB表示A/G杂合，BB表示GG基因型，A→G表示多态性位点。
实施例13：SNP_A-1515737在CII口服耐受应答者与无应答者中的分布
对比应答者与无应答者的基因型模式，发现基因型分布中的显著差异。见图14。为了计算p值，对这三个基因型编号。AA基因型编号为1，AB(因此的AG)编号为2，BB(因此的GG基因型)编号为3。根据那些推断，SNP A-1515737的p值达到0.052。
将24名患者分为具有SNP A-1515737 AA基因型(或者A→G)组及不具有AA基因型(即为AB或者BB)组。表V和VI概括了基于这两组的数据。表V列出了在用PHA、α1(II)、α1(II)CB11或者无添加(PBS)刺激的培养6天的PBMC上清中IFNγ基础水平。具有SNP A-1515737 AA的患者与不具有三种SNP A-1515737 AA的患者(平均1674±505，p＝0.028，Mann-Whitney秩和检验)相比具有显著较低的IFNγα1(II)S.I.值(平均270±90)。具有SNP A-1515737 AA的7名患者中，仅1名患者具有CII口服耐受应答；具有SNP A-1515737 GG的17名患者中，仅2名患者是非CII口服耐受应答者。
在表VI中，安排相同患者，对比其基础水平和口服CII(30μg、50μg或者110μg/天，共10周)之后的IFNγα1(II)S.I.。如表VI所示，不具有SNP A-1515737AA(ROT1AA)基因型的患者在口服CII之后与基础水平值相比IFNγα1(II)S.I.明显降低(p＜0.001，Wilxocon秩和检验)。相反，具有SNP A-1515737AA的患者在口服CII处理之后IFNγα1(II)S.I.无明显改变(p＝0.230，Wilcoxon秩和检验)。当数据以在口服CII之后/基础水平的IFNγα1(II)S.I.比率表示也也反映出这个结果(p＝0.011)。
使用卡方检验和Fisher’s exact test分析数据，在具有SNP A-1515737 AA基因型与不具有这个基因型的患者中口服CII应答者与无应答者之间有高度显著差异(p＝0.0017)(表VII)。
实施例14：应答者与无应答者SNP之间的差异
也检验了A-1515737近距离内其它SNP的基因型模式。除了A-1515737之外，在相同基因组区域中有6个其它SNP。无一具有CII处理应答或者无应答显著相关性。例如，SNP A-1508498，其在DYRK2的5’侧为146068bp，在3’侧为350588bp：IFNγ离A-1515737非常近，其在DYRK2的5’侧为265143bp，在IFNγ的3’侧为231513bp。应答者和无应答者的基因型模式相似，AA、AB和BB分别为8--5-1和8--2-0。
检验平均10个SNP沿着每条染色体的分离模式，但是没有任何分离模式与CII应答相关的迹象。
检验无应答组织相容性复合物(HLA II型组织相容性复合物)相关的8个SNP，但是没有分离带与CII应答相关的迹象。
实施例15：SNP A-1515737及与其它自身免疫性疾病中口服耐受抗性的联系
从服用12个月500μg/天CI的弥漫性系统性硬化症(SSc)患者的口服I型胶原蛋白(CI)实验的26名患者中收集样品。这26名患者中有6名具有A-1515737AA基因型(表VII)。没有患者服用DMARDs、生物制剂、NSAIDS或者强的松。
从患者中收集PBMC，并与天然牛CI与α2(I)CB的混合物培养，与α1(I)CB混合物培养的PBMC趋于IL-10产生不足。
耐受口服CI的患者具有用CI或者α1(I)或者α2(I)刺激的PBMC正调节Th2细胞因子、IL-10。如表VII所示，SSc患者具有ROT1AA基因型且在用口服CI处理12个月后在SSc患者中不正调节α2(I)或者CI刺激的PBMC产生IL-10。SNP A-1515737也在53名其它SSc患者中检验，发现AA的总体普遍性为32％，35％是GG，30％是GA。与在RA患者中一样，具有AA的SSc患者呈现出α2(I)刺激的PBMC的较低IFNγ产生正调节(表VII和VIII)。
实施例16：具有或者不具有ROT1AA的SSc患者在口服CI之后12个月后IL-10产生的改变
具有ROT1AA、GG或者GA基因型的患者具有在接受口服CI 12个月后由α1(I)CB混合物、α2(I)CB混合物或者天然CI刺激的IL-PBMC培养物的测量的IL-10值，减去在给予SSc患者口服CI之前在基础水平用相同抗原刺激的PBMC培养上清中IL-10值。
接受口服牛CI 500ug/天12个月的具有ROT1 AA基因型的患者当其PBMC与天然牛CI和α2(I)CB混合物培养时具有不足的正调节IL-10产生，以及当PBMC与α1(I)CB混合物培养时具有趋于不足的IL-10产生，表明ROT1 AA与蛋白质抗原的削弱的口服耐受相关。见表IX。
实施例17：节段性肠炎患者和家族成员中的ROT1基因型
我们评定了在节段性肠炎和/或溃疡性结肠炎患者和/或家族成员及无IBD或者其它已知自身免疫病的健康对照者中SNP A-1515737(ROT1)基因型。表X概括了使用得自口腔粘膜拭子的DNA在节段性肠炎中的基因分型结果，示出ROT1 AA分布于91.67％的节段性肠炎患者中。
对所有节段性肠炎患者及其一级亲属基因分型，91.67％具有ROT1AA。这表明ROT1AA与节段性肠炎的口服耐受抗性相关。
ROT1AA在12名节段性肠炎患者及其以及亲属中的普遍性(91.6％)高于患有SSc的79名患者(31.6％)、患有RA的54名患者(38.9％)以及健康对照者(35.7％)(见表XI)。
实施例18：ROT1基因型存在于31％弥散性SSc患者中
检测所有弥散性SSc患者的堆积的PMBC细胞沉淀，发现其中32％与ROT1 AA是纯合的，35％是ROT1 GG是纯合的，30％与ROT1 GA是杂合的。
具有ROT1 AA的SSc患者呈现出较低的正调节α1(I)刺激PMBC产生IFNγ。在12个月的II期口服CI耐受临床试验中，对加入该临床试验中的168名患者确定79名SSc患者基因型。ROT1AA基因型中的7个为晚期类型，从结果中删去。完整的再分析示出当使用Wilcoxon秩和检验与安慰剂处理的患者对比时，CI处理的患者在12个月中MRSS从基础值改变的明显差异(见图16)。
表1
Claims (28)
1.筛查对发生免疫耐受的易感性的方法，包括筛查至少一种SNP。
2.权利要求1的方法，其中所述筛查方法包括FISH。
3.权利要求1的方法，其中所述筛查方法包括使用DNA阵列。
4.权利要求1的方法，其中所述筛查方法包括杂交多核苷酸探针。
5.权利要求4的方法，其中所述方法选自：等位基因特异性探针杂交，等位基因特异性引物延伸，等位基因特异性扩增，测序，5’核酸酶消化，分子信标测定，寡核苷酸连接测定，大小分析，以及单链构象多态性。
6.权利要求1的方法，其中所述方法包括使至少一种SNP的存在或者不存在与给予宿主一或多种抗原导致宿主产生免疫耐受的能力相关联。
7.权利要求6的方法，其中所述宿主是人。
8.权利要求6的方法，其中所述至少一或多种治疗剂包含至少一种抗原。
9.权利要求8的方法，其中所述至少一种抗原是胶原蛋白。
10.权利要求8的方法，其中所述胶原蛋白选自：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII和XXVIII型胶原蛋白。
11.筛查宿主对发生免疫耐受的易感性的方法，所述方法包括：
a.从所述宿主中获得包含核酸的样品；
b.从所述样品中分离核酸；
c.测定所述样品中至少一种SNP的存在或者不存在，其中至少一种SNP的存在或者不存在是对发生免疫耐受的易感性增加的指示。
12.权利要求11的方法，其中所述宿主是人。
13.权利要求11的方法，其中所述样品选自：全血，血浆，尿液，泪液，精液，唾液，口腔粘膜，肠液，淋巴液，脑膜液，羊水，腺体液，痰，粪便，汗液，粘液，阴道分泌物，脑脊液，毛发，皮肤，排泄物，伤口渗出物，伤口匀浆和伤口液。
14.权利要求11的方法，其中所述免疫耐受通过给予宿主至少一种抗原而诱导。
15.权利要求14的方法，其中所述至少一或多种抗原是胶原蛋白。
16.权利要求15的方法，其中所述胶原蛋白选自：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII和XXVIII型胶原蛋白。
17.权利要求11的方法，其中所发生的免疫耐受针对的是硬化性疾病。
18.权利要求17的方法，其中所述硬化性疾病是系统性硬化病。
19.权利要求11的方法，其中所述方法进一步包括与至少一种计算机系统一起使用的至少一个计算机程序，其中所述计算机程序包括多个指令，所述指令包括：
a.有助于鉴别所述至少一种SNP存在或者不存在的至少一个指令；
b.使所述至少一种SNP的存在或者不存在与至少一种疾病状态相关联的至少一个指令；以及
c.使所述至少一种SNP的存在或者不存在与表示宿主对发生免疫耐受的易感性的评分相关联的至少一个指令。
20.权利要求19的方法，其中所述计算机程序进一步产生包含所述多个指令的结果的报告。
21.权利要求20的方法，其中所述报告通过网络传输。
22.权利要求20的方法，其中所述报告通过在线端口传输。
23.权利要求20的方法，其中所述报告通过纸件或者电子邮件传输。
24.权利要求20的方法，其中所述报告以保密方式传输。
25.权利要求20的方法，其中所述报告贮存在数据库中。
26.给予至少一种治疗剂的方法，所述方法包括：
a.对宿主核酸中的一或多种SNP进行基因分型，
b.使所述一或多种SNP与一或多种疾病或者失调相关联，
c.使用数学算法确定所述宿主对给予至少一种治疗剂发生阳性或者阴性应答的可能性，和
d.基于所述数学算法的结果给予或者不给予宿主治疗剂。
27.进行评估一或多种抗原的临床试验的方法，所述方法包括：
a.对与一或多种疾病或失调相关的一或多种SNP进行基因分型；
b.分析基因分型结果；
c.基于所述基因分型结果确定作用进程，其中所述作用进程包括：
i.基于所述基因分型的结果将个体纳入所述临床试验中，其中所述结果指示所述个体可能对所述一或多种抗原发生应答，和/或
ii.基于所述基因分型结果排除个体参与所述临床试验，其中所述结果指示所述个体不太可能对所述一或多种抗原发生应答。
28.鉴别发生自身免疫病的风险发生改变的个体的方法，包括检测所述个体的核酸中的SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性(SNP)，其中SNP的存在与自身免疫病的风险发生改变相关。
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