KR20110014595A - 단일 염기 다형성（ｓｎｐ） 및 면역 관용 유도에 대한 저항과의 관련 - Google Patents

단일 염기 다형성（ｓｎｐ） 및 면역 관용 유도에 대한 저항과의 관련 Download PDF

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KR1020107025767A
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아놀드 이. 포스틀스웨이트
웨이콴 구
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유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션
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Abstract

본 출원은 군집내의 어떤 핵산 서열의 존재 또는 부재를 같은 군집내에서 면역 관용을 조장하는 능력과 상호 관련시키는 방법, 시스템 및 키트를 개시한다. 관용은 정맥내 또는 설하 중 하나에 투여되는 가용성 항원을 포함하는 항원의 단독 또는 반복된 투여에 의해 유도할 수 있다. 본 출원은 변이체를 검출하는 방법을 또한 개시한다. 게다가 본 출원은 치료에서 비스테로이드성 항염증 약물의 사용 또는 회피를 설명한다.

Description

단일 염기 다형성（ＳＮＰ） 및 면역 관용 유도에 대한 저항과의 관련{SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS(SNP) AND ASSOCIATION WITH RESISTANCE TO IMMUNE TOLERANCE INDUCTION}
본 발명은 면역계 및 치료의 분야에 있다. 특히, 본 발명은 인간 게놈에서의 특정 핵산 서열 그리고, 그것들의 질병 및 병리뿐만 아니라 면역 관용 유도와의 관련에 관한 것이다. 정상 개체에 대한 환자 군집에서의 대립 유전자 빈도의 차이에 기반하여, 본 발명에서 개시한 자연-발생 핵산 서열은 진단 시약의 설계 및 치료제의 개발에 대해서뿐만 아니라 질병 관련 및 연계 분석에 대한 표적으로서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 핵산 서열은 질병 또는 병리가 발달할 위험이 증가하거나 감소한 개체(예를 들어, 환자)의 확인 및 질병 또는 병리의 조기 검출, 질병 또는 병리의 예방 및/또는 치료에 대한 임상적으로 중요한 정보의 제공, 및 치료제의 스크리닝 및 선별에 유용하다. 나아가, 하나 이상의 핵산 서열의 존재 또는 부재는 면역 관용을 유도하기 위해 주어진 항원의 유형 및 투여량을 결정하기 위해 사용할 수 있다. 항원이 환자에서 면역 관용을 유도할 때, 하나 이상의 항원을 특정 핵산 서열을 갖거나 갖지 않는 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명에 개시된 핵산 서열은 인간 확인 용도에서 또한 유용하다. 이들 다형성 및 이들이 암호화하는 산물의 존재를 검출하기 위한 방법, 분석, 키트 및 시약을 또한 제공한다. 게다가, 본 발명은 치료에서 비-스테로이드성 항-염증 약물의 사용 또는 회피를 설명한다.
모든 생물의 유전체는 그들의 계속되는 진화 동안 선조 유전 서열의 변이체 형태를 생성시키는 자발적인 돌연변이를 겪는다. 변이체 형태는 선조 형태에 대하여 진화적 유리함 또는 불리함을 부여할 수 있거나, 어느 것도 아닐 수 있다. 어떤 경우에는, 변이체 형태는 종에 대하여 진화적 유리함을 부여하고, 종의 많은 또는 대부분의 일원의 DNA에 마침내 포함되어, 실제로 선조 형태가 된다. 추가로, 변이체 형태의 효과는 상황에 따라 유리할 수도, 불리할 수도 있다. 예를 들면, 이형접합체 낫형 적혈구 돌연변이는 말라리아에 대한 저항성을 부여하지만, 동형접합체 낫형 적혈구는 일반적으로 치명적이다. 많은 경우에서, 선조 및 변이체 형태 모두 종 군집에서 살아남아 공존한다. 유전 서열의 복합적 형태의 공존은 다르게는 "SNP"로 알려진, 단일 염기 다형성을 포함하는 유전적 다형성을 발생시킨다. SNP는 또한 명백한 기능 없이 유전체 영역에 생기지만, SNP는 유전체에서 변이체 서열과 유전적으로 연결될 수 있다. 따라서 유전적 연계가 얼마나 가까운지에 따라, SNP를 유전체의 변이체 서열과 가까이 상호 관련시킬 수 있다.
인간 유전체의 모든 다형성의 대략 90%는 SNP이다. SNP는 군집에 존재하는 다른 대립유전자의 DNA에서 단일 염기 위치 또는 선택적 뉴클레오티드이다. SNP 위치(본 발명에서 SNP, SNP 부위, 또는 SNP 유전자 좌와 상호 교환적으로 지칭함)는 보통 대립유전자의 고도로 보존된 서열(예를 들어, 군집의 1/100 또는 1/1000 멤버 미만으로 다양한 서열)보다 앞서서 그리고, 이후에 일어난다. 개체는 각 SNP 위치에서 대립유전자에 대하여 동형접합체 또는 이형접합체일 수 있다.
임상시험은 의약품을 사용한 치료에 대한 환자의 반응이 종종 이질적인 것을 보여주었다. 어떤 사람들은 환자의 반응이 수용체, 효소, 또는 세포 생리학적인 어떤 변화가 변경되어 야기된, 그들의 유전적 구성에 기인한다고 믿는다. 따라서, 유전적 구성의 차이는 군집의 다른 이로부터 다른 반응을 야기한다. 이와 같이, 연구자들은 환자의 핵산 서열이 약물 개발 및 선별 과정을 돕기 위한 약학적 연구에서 사용될 수 있다는 희망을 표현해왔다. 이때까지, 의약품에서 환자의 핵산 서열의 사용이 면역 관용에 적용되지 않았다는 것이 우리의 믿음이다.
면역 또는 면역학적 관용은 면역계가 다른 면역성 항원에 대한 면역 반응을 개시하지 않거나, 억제 방법에서 방향을 바꾼 그것의 면역 반응을 갖는 과정이다. 요구된 또는 유도된 관용은 다른 상황에서는 세포-매개 또는 체액성 면역을 유도하는, 주어진 항원에 대한 림프 조직의 특이적 비-반응성으로 특징짓는 외부 항원에 대한 면역계의 적응을 지칭한다. 태아 및 태반은 모체의 면역계에서 관용을 가져야만 하는데, 요구된 관용의 가장 중요한 자연적 종류 중 하나는 임신 동안에 일어난다. 진수류(眞獸類) 태아 배아 방어계(eutherian fetoembryonic defence system)의 사용을 포함하는 관용의 유도 및 조절 T 세포의 관여를 우선적으로 요구하는 관용의 유도에 대한 다수의 모델이 있다.
면역 관용의 한 특이적 유형인 경구 관용은 경구 루트에 의한 항원의 선행 투여에 의해 항원에 대한 세포 및/또는 체액성 면역 반응성의 특이적 억제이고, 바람직하게는 식품 단백질 및 점액 세균군에 존재하는 박테리아 항원에 대한 과민증 반응을 막기 위해 발전하였다. 이것이 외인성 항원에 의해 이끌린 연속적인 자연 면역 이벤트인 것으로부터, 이것은 거대한 면역학적 중요성이 있다. 그들의 특권이 있는 내부 환경으로의 접근 동안, 항원은 외부 및 자가 구성요소 사이의 경계에 나타난 점막에 연속적으로 접근한다. 경구 관용은 위험 신호가 없는 내부 구성요소와 같이 자신의 일부로서 받아들이게 되는, 자연적 루트를 통해 신체에 접근할 수 있는 외부 제제를 처치하기 위해 발전하였다. 경구 관용의 실패는 염증성 장질환(크론병 및 궤양성 대장염)을 포함하는 몇몇의 면역학적 기반 질병의 발달 및 병인의 원인으로 추정된다. 본 발명에서 고려한 관용 유도의 다른 공통 형태는 코안(internasel) 및 IV 관용 유도를 포함한다.
유전체 및 SNP에 대한 대량의 연구에도, 오늘날 유전체학은 우리의 의료 관리를 개선하는데 아직 사용되지 않는다. 이와 같이, 유전된 감수성, 유전자 발현 및 예측된 유전체 약학적 반응을 찾기 위해 개체의 유전체를 시험하는 믿을 만한 광-범위 분석, 키트 및 방법이 매우 적다. 더욱 특이적으로, 면역 관용의 분야에서 유전체학을 사용하지 않는다.
본 발명자들은 유전체학을 면역 관용과 융합하는 방법, 시약, 키트 및 분석을 제공할 수 있다고 믿는다. 이와 같이, 본 발명자들은 핵산 서열의 존재 및/또는 부재에 기반하여 핵산 서열을 검출할 수 있고; 면역 관용의 유도를 원하는 환자의 치료 방법을 재단할 수 있다. 하나의 특정 구체예에서, 관심의 핵산 서열은 SNP이다.
발명의 개요
본 발명은 군집 내의 어떤 핵산 서열의 존재 또는 부재를 같은 군집 내에서 면역 관용을 조장하는 능력과 상호 관련시키는 것에 대한 것이다. 이 상호 관련은 면역 관용의 유도를 돕는데 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 면역 반응의 자극에 요구되는 역치 이하인 항원의 매우 많은 투여량 또는 적은 투여량의 반복된 투여에 의해 유도된 관용과 관계 있다. 어떤 구체예에서, 관용은 정맥주사 또는 설하주사 중 하나를 통해 투여된 가용성 항원에 의해 대부분 용이하게 유도한다. 게다가, 또한 면역억제는 관용의 유도를 용이하게 하도록 고려된다. 특정 질병 또는 장애와 관련된 어떤 핵산 서열의 존재 또는 부재의 상호 관련에 기반하여, 본 발명은 또한 변이체의 검출 방법을 제공한다. 하나의 특정 구체예에서, 관심의 핵산 서열은 SNP이다. 게다가 본 발명의 구체예는 치료에서 비-스테로이드성 항염증 약물의 사용 또는 회피를 설명한다.
본 발명은 적어도 하나의 SNP에 대한 스크리닝을 포함하는 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법을 포함한다. 스크리닝 방법은 FISH, DNA 어레이의 사용, 및/또는 폴리뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 포함할 수 있다.
본 발명은 대립유전자-특이적 프로브 혼성화, 대립유전자-특이적 프라이머 신장, 대립유전자-특이적 증폭, 서열분석, 5' 뉴클레아제 효소적 분해, 분자 지표 분석, 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 크기 분석, 및/또는 단일-사슬 배좌 다형성의 사용을 포함하는 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법을 포함한다.
본 발명은 숙주에 하나 이상의 항원 또는 치료제를 투여한 결과로서 면역 관용의 발달에 대한 숙주의 능력을 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 상호 관련시키는 것을 포함하는, 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법을 포함한다. 항원은 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII 및 XXVIII로 구성되는 그룹 유형에서 선택되는 콜라겐을 포함하는 콜라겐일 수 있다.
본 발명은 핵산을 포함하는 상기 숙주로부터 표본을 수득하는 단계; 상기 표본에서 핵산을 분리하는 단계; 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재가 면역 관용의 발달에 대한 증가한 감수성을 가리키는 경우, 상기 표본에서 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재를 분석하는 단계를 포함하는, 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법을 포함한다. 표본은 전혈, 혈장, 소변, 눈물, 정액, 타액, 구강 점막, 간질액, 림프액, 뇌막액, 양막액, 샘 유동액, 가래, 대변, 발한, 점액, 질 분비물, 뇌척수액, 체모, 피부, 배설물, 상처 삼출액, 상처 호모지네이트, 및 상처액일 수 있다. 나아가, 방법은 숙주에 적어도 하나의 항원의 투여에 의한 면역 관용의 유도를 포함할 수 있고, 항원은 콜라겐의 유형일 수 있다.
면역 관용은 전신성 경화증과 같은 경화성 질병과 같은 임의의 자가면역 질환일 수 있다.
본 발명은 컴퓨터 프로그램이 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재의 확인을 돕기 위한 적어도 하나의 작동명령; 적어도 하나의 질병 상태를 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 관련시키기 위한 적어도 하나의 작동명령; 및 면역 관용의 발달에 대한 숙주의 감수성을 가리키는 점수를 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 상호 관련시키는 적어도 하나의 작동명령을 포함하는 복수의 작동명령을 포함할 때, 적어도 하나의 컴퓨터 시스템으로 사용하기 위한, 하나 이상의 컴퓨터 프로그램의 사용을 포함하는 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법을 포함한다. 보고서를 네트워크, 온-라인 포탈을 통해, 지면 또는 e-메일을 통해 안전한 또는 비-안전한 방법으로 전송시킬 수 있을 때, 컴퓨터는 다수의 작동명령의 결과를 포함하는 보고서를 또한 생성할 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 치료제의 투여 방법을 포함하고, 방법은 숙주의 핵산에서 하나 이상의 SNP를 유전자형 분석하는 단계, 하나 이상의 질병 또는 장애에 하나 이상의 SNP를 상호 관련시키는 단계를 포함한다. 상기 숙주가 적어도 하나의 치료제의 투여에 의해 긍정으로 또는 부정적으로 반응할 것인지에 대한 확률을 결정하기 위하여 수학적 알고리즘을 사용하는 단계, 및 상기 수학적 알고리즘의 결과에 기반하여 숙주에 치료제를 투여하거나 투여하지 않는 단계를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 SNP를 유전자형 분석하는 단계; 유전자형 분석 결과를 분석하는 단계; 개체가 상기 하나 이상의 항원에 대해 반응할 것 같음을 가리키는 상기 유전자형 분석의 결과에 기반하여, 상기 행동 방침이 임상시험에서 개체를 포함하는 것, 및/또는 개체가 상기 하나 이상의 항원에 대해 반응하지 않을 것 같음을 가리키는 상기 유전자형 분석의 결과에 기반하여, 임상시험에 참가한 개체를 제외하는 것을 포함할 때, 상기 유전자형 분석 결과에 기반하여 행동 방침을 결정하는 단계를 포함하는 하나 이상의 항원을 평가하는 임상시험의 수행 방법을 포함한다.
SNP의 존재가 자가면역 질환에 대한 변경된 위험과 상호 관련될 때, 본 발명은 개체의 핵산에서 서열번호 1의 단일 염기 다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하고, 자가면역 질환이 발달하는 것에 대한 변경된 위험을 갖는 개체의 확인 방법을 포함한다.
도 1은 하나 이상의 핵산이 면역 관용의 유도와 상호 관련되는지 여부의 결정 과정을 설명하는, 본 발명의 어떤 구체예에 따른 작업 공정도를 보여준다.
도 2는 하나 이상의 핵산의 부재의 존재에 의한 개체의 치료 지시의 결정 과정을 설명하는, 본 발명의 어떤 구체예에 따른 작업 공정도를 보여준다.
도 3은 하나 이상의 핵산의 부재의 존재에 의한 개체의 치료 지시의 결정 과정을 설명하는, 본 발명의 어떤 구체예에 따른 작업 공정도를 보여준다.
도 4는 하나 이상의 핵산의 부재의 존재에 의한 개체의 치료 지시의 결정 과정을 설명하는, 본 발명의 어떤 구체예에 따른 작업 공정도를 보여준다.
도 5는 하나 이상의 폴리펩티드의 부재의 존재에 의한 개체의 치료 지시의 결정 과정을 설명하는, 본 발명의 어떤 구체예에 따른 작업 공정도를 보여준다.
도 6은 마우스에 위관영양에 의해 주어진 콜라겐 II의 양과 상호 관련된 관절염의 퍼센트를 보여주는 도표이다.
도 7은 피록시캄에 의한 경구 관용의 특정 형태의 폐지를 보여주는 도표이다.
도 8은 α1(II)로 자극된 비장 세포에 의한 IFN-γ 생산을 보여주는 도표이다.
도 9는 COX-2 억제자 SC'236이 경구 관용 유도를 폐지하는 것을 보여주는 도표이다.
도 10은 피록시캄에 의해 경구 관용의 지속적인 폐지를 보여주는 도표이다.
도 11은 파이어스 패치 비장 공동-배양에서 피록시캄 또는 CII의 효과를 보여주는 도표이다.
도 12는 장간막 림프절 세포 증식에서 피록시캄 또는 CII의 효과를 보여주는 도표이다.
도 13은 류머티즘 관절염 환자의 경구 콜라겐 II 치료의 효과 및 그것이 PBMC에 의한 PBMC IFN 생산을 어떻게 조절하는지 보여주는 도표이다.
도 14는 류머티즘 관절염인 사람의 유전자형 분석 및 면역 관용 유도에 대한 그들의 능력의 도표이다.
도 15는 관심 있는 잠재적 SNP를 함유하는 마커 및 유전자를 보여주는 도표이다.
도 16은 위약 환자와 대비하여 12달째에서 MRSS에서 유의한 감소를 보여주는 도표이다.
정의
하기 논의에서 여하의 물건 및 방법이 배경기술 및 소개의 목적을 위하여 설명될 것이다. 본 발명에 포함된 것을 종래 기술의 "승인"이라고 해석되지 않는다. 출원인은 적절한 경우, 본 발명에 참고된 물건 및 방법이 종래 기술을 구성하지 않는다는 것을 적용 가능한 법적 조항 하에서 설명할 권리를 명백히 남겨두었다. 본 발명을 설명하는 것을 돕기 위해, 하기 정의를 제공한다.
용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-사슬 형태 중 어느 하나의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 당업자는 한 가닥이 나타내는 특정 부위뿐 아니라 상보 가닥에서의 대응하는 부위에 대한 언급도 용이하게 인지할 것이다. 특별히 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산 같은 유사한 결합 특성을 갖고, 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방법으로 신진 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 가리키지 않는 한, 특정 핵산 서열은 보존적으로 변이된 이의 변이체(예를 들어, 변질된 코돈 치환), 대립유전자, 오르쏘로그, SNP, 및 상보 서열뿐만 아니라 명백히 지적한 서열 또한 함축하여 포함한다. 특이적으로, 변질된 코돈 치환은 서열을 생성하는 것에 의해 달성될 수 있고, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치는 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환한다. 용어 핵산은 유전자에 의해 암호화되는 "핵산 서열" "유전자" "cDNA" 및 "mRNA"와 상호 교환적으로 사용하였다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방법으로 기능 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 미메틱스를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 것들뿐만 아니라, 이들 아미노산은 예를 들어, 하이드록시프롤린, α-카르복시글루탐산, O-포스포세린과 같이 이후에 변형된 것이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합한 α탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 뼈대를 갖지만, 자연 발생 아미노산 같은 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. "아미노산 미메틱스"는 아미노산의 일반적 화학 구조와 다른 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방법으로 기능 하는 화합물을 지칭한다. 아미노산은 본 발명에서 일반적으로 알려진 세 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에서 추천한 단일-문자 기호 중 하나로 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드도 마찬가지로 그들의 일반적으로 용인된 단일-문자 코드로 지칭할 수 있다.
본 발명에서 널리 사용한바, 용어 "유전자형"은 예를 들면, 배수염색체 생물이 관심의 대립유전자의 하나 이상의 변이체에 대하여 이형접합체인지 또는 동형접합체인지 여부를 포함하는, 생물의 유전적 구성물을 지칭한다.
본 발명에서 사용한바, "SNP" 및 "SNP 유전자형"에 대한 언급은 개체 SNP 및/또는 일반적으로 같이 유전되는 SNP의 그룹인 일배체형을 포함한다. 일배체형은 질병 또는 다른 표현형 효과에서 개별 SNP와 비교하여 더욱 강력한 상호 관련을 가질 수 있고, 따라서 어떤 경우에 있어서 증가된 진단 정확성을 제공할 수 있다.
본 발명의 SNP는 다형성 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 다른 것으로 치환함으로써 발생할 수 있다. 치환은 전이(transition) 또는 전좌(transversion)일 수 있다. 전이는 다른 퓨린 뉴클레오티드에 의한 하나의 퓨린 뉴클레오티드, 또는 다른 피리미딘에 의한 하나의 피리미딘의 교체이다. 전좌는 피리미딘에 의한 퓨린의 교체, 또는 그 반대이다. SNP는 또한 단일 염기 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다.
동일한 의미의 코돈 변화, 또는 침묵 돌연변이/SNP("SNP", "다형성", "돌연변이", "돌연변이체", "변종", 및 "변이체"와 같은 용어는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용됨)로부터 일어날 수 있는 본 발명의 SNP는 유전자 코드의 축퇴동안 아미노산의 변화를 야기하지 않는 것이다. 하나의 아미노산을 암호화하는 코돈에서 다른 아미노산을 암호화하는 코돈으로의 치환(즉, 동일하지 않은 의미의 코돈 변화)은 미스센스 돌연변이라고 지칭한다. 미스센스 돌연변이는 정지 코돈이 형성되고, 그것에 의하여 폴리펩티드 사슬의 조숙한 종결 및 결절된 단백질을 야기하는 동일하지 않은 의미의 코돈 변화의 유형을 야기한다. 통독(read-through) 돌연변이는 정지 코돈의 파괴를 초래하고, 그것에 의하여 연장된 폴리펩티드 산물을 야기하는, 동일하지 않은 의미의 코돈 변화의 다른 유형이다. SNP는 이중-, 삼중-, 또는 사중-대립유전자를 포함하는 모든 대립유전자를 포함할 수 있다.
SNP 위치, SNP 대립유전자, 또는 뉴클레오티드 서열을 정의하는 것에서, 핵산 분자의 하나의 가닥 위의 특정 부위에서 아데닌, 티민(유리딘), 시토신 또는 구아닌에 대한 언급은 또한 핵산 분자의 상보 가닥의 대응하는 부위에서 티민(유리딘), 아데닌, 구아닌, 또는 시토신(각각)으로 정의를 내린다. 따라서, 언급을 특정 SNP 위치, SNP 대립유전자, 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 두 가닥 중 어느 하나의 가닥에 만들 수 있다. 둘 중 하나의 가닥에 혼성화시키기 위해 설계할 수 있는 프로브 및 프라이머 및 본 발명에서 논의된 SNP 유전자형 분석 방법은 일반적으로 둘 중 하나의 가닥을 표적할 수 있다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"을 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 발명에서 상호 교환적으로 사용하였다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 미메틱스인 아미노산 중합체뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용한다. 본 발명에서 사용한바, 용어는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하는, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다. 본 발명에서 "폴리펩티드," "펩티드" 또는 "단백질"에 대한 언급은 당업계에 알려진 펩티드/폴리펩티드/단백질(단백질은 "야생형", "언급" 또는 "정상" 단백질이라고 상호 교환적으로 언급할 수 있음)에 대응하는 아미노산 서열과 다른 아미노산 잔기를 적어도 하나 함유하는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 이러한 변이체 펩티드/폴리펩티드/단백질은 본 발명에서 개시한 단백질-암호화 위치의 동일하지 않은 의미의 뉴클레오티드 치환(즉, 미스센스 돌연변이)에 의해 야기되는 코돈 변화로부터 기인할 수 있다. 본 발명의 변이체 펩티드/ 폴리펩티드/ 단백질은 즉, 조숙한 정지 코돈을 만들어내는 SNP, 정지 코돈을 폐지함으로써 통독 돌연변이를 생성하는 SNP 또는 조절 영역의 SNP 또는, 인트론에 있는 SNP 또는 엑손/인트론 경계의 SNP와 같은 선택적 스플라이싱 또는 불완전한 스플라이싱을 일으키는 SNP와 같은 단백질의 구조, 기능/활성, 또는 발현을 다르게 바꾸는, 본 발명에서 개시된 임의의 SNP에 기인하는 난센스 돌연변이로부터 또한 기인할 수 있다. 본 발명에서 사용한바, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용하였다.
모든 구체예에 있어서, 용어 "개체" 및 "숙주"는 상호 교환적으로 사용하였고, 인간에 한정되지 않는다. 본 발명의 한 측면에 따라서, "개체"는 인간을 포함하는 영장류, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 양 및 원숭이와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물일 수 있다. 따라서, 개시된 발명은 예를 들면, 동물용 물, 동물용 사료, 동물용 의약품 등을 통한 동물의 치료에 응용할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 따라서, 개체는 건강하거나, 질병을 앓고 있을 수 있다. 그러나 일반적으로, 본 발명의 방법은 자가-면역 질병 또는 병원성 미생물 및 개체의 어떤 핵산 서열의 유형에 의해 유발되는 질병을 앓는 인간에 적용시킬 때, 효과적으로 사용할 수 있다.
용어 "변경된"은 본 발명에서 증가된 또는 감소된 위험/가능성 중 어느 하나를 포함하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어 "특정 질병," "질병" 또는 "장애"는 자가 항체 질병뿐만 아니라 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 효모 또는 마이코플라즈마와 같은 병원성 미생물과 관련된 질환뿐만 아니라 종양 질환을 포함한다. 그러나 질병은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용한 용어 "의사" 또는 "개업의"는 의학, 생명공학 또는 제약업을 포함하는, 전문직으로서 의학에 종사하거나, 의학 분야에 전문가로서 관련된 임의의 사람을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 핵산 서열의 변경된 발현(더 높은 또는 더 낮은 발현 중 하나) 또는 핵산 서열의 유일한 발현뿐만 아니라 개체의 유전자 서열이 발현되지 않거나, 단지 일시적으로 발현되는 것을 검출하는 것에 의해, 개체가 면역 관용을 발달시킬 것 같은지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 어떤 구체예는 면역 관용을 발달시키기 위한 능력을 갖는 개체가 면역 관용을 발달시키기 위한 능력을 갖지 않는 개체로부터 알려진, 그리고 알려지지 않은 핵산 서열의 특이한, 그리고 독특한 발현을 갖는지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 핵산 서열은 SNP이다.
본 발명은 또한 핵산 서열의 검출에 대한 핵산 서열, 방법 및 시약, 면역 관용을 유도의 진보된 용도를 위한 키트 또는 분석에서 핵산 서열의 용도를 제공한다.
본 발명은 면역 관용을 갖는 것 또는 발달하는 것의 증가된 위험, 또는 면역 관용을 갖는 것 또는 발달하는 것의 감소된 위험 중 하나와 관련된 핵산 서열의 용도를 고려한다. 개체가 면역 관용을 갖는 것 또는 발달하는 것의 증가된 위험, 또는 면역 관용을 갖는 것 또는 발달하는 것의 감소된 위험을 나타내는 핵산 서열을 소유하는지 여부를 결정하기 위해 어떤 핵산 서열(또는 그들의 mRNA 또는 단백질을 암호화하는 산물)의 존재를 분석할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 핵산 서열은 특정 치료 또는 항원에 반응할 증가된 또는 감소된 가능성, 또는 특정 치료 또는 항원에 대한 면역 관용이 발달할 증가된 또는 감소된 가능성 중 하나와 관련시킬 수 있다.
어떤 구체예에서, 핵산 서열은 SNP이다. 이러한 핵산 변종은 PCR, RFLP, 혼성화 및 직접 서열분석을 포함하는 당업자에게 잘 알려진 다수의 다른 방법으로 분석할 수 있다.
면역 관용에 걸리기 쉬운 개체에서 핵산의 존재/부재의 결정
하나의 구체예는 적어도 하나의 핵산 서열에 대한 스크리닝을 포함하는 면역 관용 발달에 걸리기 쉬운 개체에서 존재하거나 존재하지 않는 핵산 서열을 결정하기 위한, 도 1에서 나타낸바에 대한 방법이다. 이 방법에서, 개업의는 면역 관용을 유도하기 위해 환자에게 경구 항원을 첫 번째로 투여한다(101).
본 발명에서 사용하는데 적합한 항원은 합성 또는 자연적으로 유래한 단백질 및 펩티드, 그리고 특별히 그들에 의해 경구 관용을 유도하기 위하여 높은 투여량을 요구하는 것들; 폴리사카라이드 및 리포폴리사카라이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 탄수화물; 및 예를 들면, 자가-면역 질병, 임상적(알레르기성) 과민증 및 동종이식 거부반응의 유도와 관련되거나 이를 초래하는 것들과 같은 생물학적 출처로부터 분리된 항원 및 서브유니트 또는 이들의 추출물; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
나아가, 항원은 자가-면역 질병의 유도, 임상적(알레르기성) 과민증 및 동종이식 거부반응과 관련되거나, 이를 초래하는 임의의 것, 및 서브유니트 또는 이들의 추출물; 재조합되어 생성된 전체 단백질, 서브유니트 또는 이들의 단편; 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
관련 질병을 치료하기 위하여 투여된 항원은 표 12의 항원 전체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 표 12에 기재된 관련 질병 또는 장애는 예시를 위한 것을 뿐, 포괄적인 것이 아니다. 하나의 특정 구체예에서, 적어도 하나의 항원은 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, 및 이들의 혼합물의 그룹으로부터 선택되는 콜라겐이다. 콜라겐은 또한 이들의 단편일 수 있다. 예를 들면, 콜라겐은 8개 CB 단편을 산출하는 a1 (I)의 CNBr 절단에 의해 생산되는 하나 이상의 단편일 수 있다: CB0 , CB1 , CB2 , CB4 , CB5 , CB8 , CB3 , CB7 및 CB6. 콜라겐은 6개 CB 단편을 산출하는 a2 (I)의 cCNBr 절단에 의해 생산되는 하나 이상의 단편일 수 있다: CB1 , CB0 , CB4 , CB2 , CB3 및 CB5 .
나아가, 하나의 구체예에서, 질병은 경화성 질병이다. 다른 구체예에서 질병은 다발성 경화증이다.
표 12는 본 발명의 다수의 구체예를 보여준다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, 콜라겐은 특발성 폐섬유증 질병에 대한 면역 관용을 유도하는데 사용한 항원이다. 다른 구체예에서, α-엔도라아제는 천식 질병에 대한 면역 관용을 유도하는데 사용한 항원이다.
게다가, 개체 투여량 크기, 투여량의 수, 투여량의 투여 빈도 및 투여 방법은 다양할 수 있다. 이런 프로토콜의 결정은 당업자에 의해 성취될 수 있다. 적합한 단일 투여량은 적합한 시간 기간 동안(예를 들어, 몇 분에서 몇 주를 넘는 날까지)에 한번 이상 투여하였을 때, 동물에서 생물학적 반응을 변화시키는데 충분한 투여량이다. 바람직하게는 투여량은 체중의 킬로그램 당 항원 약 1 ng(ng/kg) 내지 체중 킬로그램 당 항원 약 1 그램까지(gm/kg), 더욱 바람직하게는 100 ng/kg 내지 약 100 밀리그램/킬로그램(mg/kg), 및 한층 더 바람직하게는 체중 킬로그램 당 항원 약 10 마이크로그램(μg/kg) 내지 약 10 mg/kg을 포함한다.
선택적으로, 항원의 투여량은 환자의 체중에 의해 결정되지 않을 수 있다. 이 구체예에서, 투여량은 적어도 항원 1 ng/일일 것이다. 바람직하게는 항원의 10 μg/일 내지 항원의 5000 μg/일의 투여량 범위이다. 다른 구체예에서, 투여량은 항원의 10 μg/일 내지 500 μg/일의 투여량 범위이다. 다른 구체예에서, 투여량은 항원의 30 μg/일 내지 200 μg/일의 투여량 범위이다.
하나의 선택적인 구체예에서, 항원의 투여량은 면역 반응의 자극에 요구되는 역치보다 아래이다. 다른 구체예에서, 항원의 투여량은 그에 의해 면역 반응이 자극되는 상기 역치이다.
투여 방법은 에어로졸, 피하, 직장, 피내, 정맥내, 코, 경구, 경피 및 근육내 경로를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 바람직한 구체예에서, 항원은 경구로 주어진다. 다른 바람직한 구체예에서, 항원은 정맥내 또는 설하로 주어진다.
게다가, 항원은 개체에 투여하기 전에 약학적으로 허용 가능한 첨가제 및/또는 담체와 같은 다른 구성요소와 조합시킬 수 있다. 다른 구성요소는 투여 방법, 저장 필요성, 등에 의존할 것이다.
이런 첨가제의 예시는 물, 식염수, 링거액, 포도당 용액, 행크 용액, 및 다른 수성 생리학적으로 안정된 염분 용액을 포함한다. 고정유, 참기름, 에틸 올레산염, 또는 트리글리세리드와 같은 비수성 부형제 또한 사용할 수 있다. 다른 유용한 제형은 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 점도-증강제를 함유하는 부유물을 포함한다. 첨가제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 높이는 물질과 같은, 미량의 첨가물을 함유할 수 있다. 버퍼의 예시는 인산염 버퍼, 중탄산소다 버퍼 및 트리스 버퍼를 포함하지만 이에 제한되지 않는 한편, 방부제의 예시는 티메로살, m- 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
표준 제형은 부유물 또는 주사를 위한 용액으로서 주사에 적합한 액체에 들어있을 수 있는 액체 주입 가능 의약품 또는 고체 중 어느 하나일 수 있다. 담체는 전형적으로 처치된 개체에서 항원의 수명을 증가시키는 화합물이다. 적합한 담체는 중합체 조절된 분비 부형제, 생물분해성 이식물, 리포좀, 박테리아, 바이러스, 오일, 에스테르, 및 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 조절된 분비 제형은 개체에 본 발명의 항원을 천천히 분비할 수 있는 능력을 갖는다. 적합한 조절된 분비 부형제는 생체 적합성 중합체, 다른 중합체 주형, 캡슐, 미소캡슐, 극미립자, 환약 제조, 삼투 펌프, 확산 장치, 리포좀, 리포스피어, 및 경피 전달 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 조절된 분비 부형제는 개체의 투여에 있어서, 원위치(in situ)에서 고체 또는 겔을 형성하는 액체를 포함한다. 바람직한 조절된 분비 부형제는 생물분해성이다(즉, 생물침습성).
또한, "표본"이라고도 지칭되는, 생물학적 표본은 개체의 면역 반응을 결정하는데 사용하기 위해 개체로부터 얻는다(102). 이런 표본 준비 구성요소를 임의의 체액(피, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 점액, 위액, 정액, 눈물, 땀, 등), 피부, 체모, 세포(특히 핵이 있는 세포), 생검, 구강점막세포 채집 또는 조직 견본으로부터 핵산 추출물(DNA 및/또는 RNA 포함), 단백질 또는 막 추출물을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 표본을 얻는 빈도, 및 그의 용도는 점수를 매기는 방법, 분석 형식, 검출 방법의 특성, 및 분석할 실험 표본으로서 사용한 특이적 조직, 세포 또는 추출물 같은 이런 인자들에 기반하여 다양할 것이다. 생물학적 표본으로부터 핵산, 단백질, 및 세포 추출물을 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 사용한 시스템과 양립 가능한 표본을 얻는데 용이하게 적응할 수 있다.
생물학적 표본으로부터, 항원에 대한 개체의 면역계 반응을 결정하고, 개체는 그들의 반응을 토대로 하여 점수를 얻는다(103). 점수를 매기는 방법은 의사에 의존적이고, 항원에 대한 그들의 면역반응에 기반하여 환자를 분리시키는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들면, 환자는 항원 특이적 및 항원 비-특이적 분석에 기반하여 점수를 얻을 수 있다. 항원 특이적 분석은 특이적 항원에 대한 T 및 B 세포의 반응을 측정하는데 반해, 항원 비-특이적 분석은 표면 마커의 표현형 및 특정 임상 단계와 관련된 패턴에 대한 세포의 기능 상태를 측정한다.
특이적으로, 의사는 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA), ELISA/ACT® 림프구 반응 분석(LRA), 항체 생산의 시험관내 측정, 혼합 백혈구 반응, 세포독성 T 림프구 분석, 유세포분석, 웨스턴 블롯, 한계 희석 분석, 질량 분석법, 면역 침강법 및 면역형광법을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 면역계 반응을 결정하는데 편리한 임의의 수단을 사용할 수 있다.
예를 들면, 하나의 구체예에서, ELISPOT 분석은 개별 면역 반응을 결정하는데 사용할 수 있다. 전형적으로, ELISPOT 분석은 관심의 사이토카인에 대한 포획 항체로 코팅된 플레이트에서 면역 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이후, 세포막에서 분비된 사이토카인은 배양기간 동안 포획 항체에 의해 포획되었다. 세포를 제거하고, 결합한 사이토카인은 예를 들면, 동일한 사이토카인의 다른 에피토프에 대한 표지된 이차 항체와 같은 표지 시스템을 이용하여 검출한다. 이 분석은 단일 세포의 사이토카인 풋프린트를 만든다.
다른 구체예에서, 트랜스비보(transvivo) DTH 분석은 개별 면역 반응을 결정하는데 사용할 수 있다. 이 분석에서, 개체로부터 얻은 세포를 항원과 함께 면역-결핍 마우스의 발바닥에 주사한다. 이후, 항원에 대한 T 세포의 반응성의 지표를 결과적인 발바닥의 팽창의 정량에 의해 측정한다.
다른 구체예에서, 사량체 분석을 사용한다. 여기서, T 세포의 빈도는 유세포분석을 사용한 특이적 펩티드 MHC 복합체에 대한 그들의 결합으로써 측정한다.
선택적인 구체예에서 CFSE 분석은 분열하는 세포에서 CFSE 다이의 희석에 의해 T 세포의 증식을 측정한다. 이 분석은 유세포분석의 사용을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, T 세포의 세포내 염색은 예를 들면, 유세포분석에 의해 사이토카인-생산 T 세포의 빈도를 결정하는데 사용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 환자는 항원을 받기 전, 받는 동안 및/또는 받은 후 각자의 IFN-γ 생산 수준 및/또는 변화에 기반하여 점수를 얻는다. 선택적으로, 다른 사이토카인을 개체 점수를 결정하기 위해 측정할 수 있다. 예를 들면, α1(I)- 및 α2(I)-자극 PBMC 배양 상청액에서 L-10 및/또는 sIL-2R의 수준을 환자의 점수를 매기는데 사용할 수 있다.
면역계 반응을 결정하는 다른 수단은 TCR 레퍼토리의 특성화를 포함할 수 있다. 이 분석은 Vβ 유전자 산물에 따른 CFR3 길이 분포를 결정하는데 Vβ 사슬을 사용하는 T 세포의 비율을 결정하기 위해 정량적 PCR, 겔 전기영동 및 DNA 서열분석의 사용을 포함할 수 있다.
면역계 반응을 결정하는 다른 수단은 다클론항체, 비-항원-특이적 자극에 대한 T 세포 반응을 포함할 수 있다. 여기서, 전혈을 시간의 기간 동안 피토헤마글루티닌으로 자극시키고, 이후 CD4+T 세포를 분리하며, 초기 CD4+T 세포 활성화의 범위를 세포 용해 후 측정된 세포 내 ATP의 합성 및 축적으로써 측정한다.
면역계 반응을 결정하는 다른 수단은 핵산의 존재의 검출을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. PCR, LCR 및 혼성화 기술을 포함하는 몇몇의 핵산 검출 방법이 사용가능하다. 혼성화 기술은 두 개 이상의 핵산 분자의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하고, 검출은 핵산 분자를 표지하는 단계 및 이런 표지로부터 생성되는 신호를 관찰하는 단계를 포함하는 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 혼성화 기술은 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 노던 및 서던 블로팅, 순환 프로브 반응, 가지화 DNA, Invader™ 분석 및 하이브리드 포획. 혼성화 기술은 또한 표본을 규명할 수 있는 알려진 핵산 서열의 마이크로어레이(또는 "바이오어레이")의 사용에 의해 표본에 존재하는 핵산의 특이적 서열을 확인하는데 사용할 수 있다. 바이오어레이 기술은 일반적으로 공지의 단일 사슬 핵산에 사용하고, 각각의 독특한 짧은 사슬은 특이적인 공지 위치에 부착시키고, 이후 표본 핵산을 첨가하고, 고정시킨 가닥에 혼성화시키기 위해 표본에 존재하는 서열을 허용한다. 이 혼성화의 검출은 이후 혼성화 전에 검출하기 위해 표본의 단편의 표지, 전형적으로는 말단 표지에 의해 수행된다. 나아가, 혼성화는 형광 원위치 혼성화 기술의 사용에 의해 결정할 수 있다.
게다가, 하나의 구체예에서, 단백질체학적 접근법을 사용할 수 있다. 여기서, 단백질 마이크로어레이 또는 질량 분석기를 개체의 표본에 존재하는 단백질 단편의 존재를 결정하고 정량하는데 사용할 수 있다. 게다가, 하나 이상의 단백질을 분석하는 것에 의해, 의사는 개체에서 단백질 발현의 특이한 패턴으로써 면역 반응을 결정할 수 있다.
면역계 반응에 기반하여 환자를 점수매기기 위해, 의사는 항원을 받기 전, 받는 동안 및/또는 받은 후 면역 반응을 비교하여 측정할 수 있다. 언제 면역 반응을 측정할 것인지, 어떤 방법을 사용할 것인지에 대한 결정은 의사의 필요에 따른다. 나아가, 의사는 다른 사이토카인, T 세포, NK 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 서브군집, 산화 라디칼, 결합 조직 성장 인자, 산화질소, 면역학적 분석에 의해 결정된 흉선 형태학, 다이어트, 성별, 연령, 비타민 A 수준, 아연 수준 및 환자의 면역 반응을 점수매기는 것을 도와주는 환경적 고려와 같이 개체의 다른 생리학적 인자에 대한 고려를 더 넣을 수 있음을 고려한다. 환자의 다른 유전자 또는 유전체 영역에서의 돌연변이, 인종 및 성별 차이와 같은 유전학적 배경을 또한 고려할 수 있다.
일단 개체가 항원 반응에 기초하여 점수가 매겨지면, 의사는 개체가 하나 이상의 핵산 서열이 있거나 결핍되고, 그로 인해 유전자 발현의 수준 또는 패턴이 바뀌는지 여부를 결정하기 위해 개체의 유전자형을 분석할 것이다(104). 유전자형은 나중에 단계의 면역 반응 점수와 하나 이상의 핵산의 존재 또는 부재를 상호 관련시키는데 사용할 것이다(105).
의사는 다르거나 독특한 핵산 또는 핵산 패턴의 존재 또는 부재를 찾기 위해 관심있는 특정 공지 핵산을 시험하거나, 전체 유전체의 부분 또는 전부를 시험할 수 있고, 개체의 면역 반응 점수와 하나 이상의 핵산의 존재/부재를 상호 관련시킬 수 있다. 특히 관심 있는 핵산은 표본에서 mRNA 또는 단백질의 농도에 영향을 미치는 것들, 핵산 및/또는 단백질 발현에 영향을 미치는 것으로 알려진 핵산, 핵산 및/또는 단백질 분해의 속도에 영향을 미치는 핵산, 및 단백질 안정화 프로파일, Km, 또는 Vmax에 영향을 미치는 핵산을 포함한다.
나아가, 의사는 핵산에 대하여 분석하기 위해 단계(102)의 생물학적 표본의 일부를 사용하거나, 의사는 분석을 위해 개체로부터 다른 생물학적 표본을 얻을 수 있다. 핵산은 의사에게 편리한 임의의 수단에 의해 표본으로부터 정제하거나, 분리할 수 있으나, 이런 분리는 검출의 어떤 형태에서는 필요하지 않을 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, 의사는 임의의 주어진 유전적 영역에 대립 유전자가 존재하는 것을 결정하기 위하여 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 개체의 유전자형을 분석할 것이다. 이웃 서열은 키트 형식에서 선택적으로 충족될 수 있는, 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 핵산 검출 시약을 설계하는데 사용할 수 있다.
보통의 유전자형 분석 방법은 TaqMan 분석, 분자 지표 분석, 핵산 어레이, 대립유전자-특이적 프라이머 신장, 대립유전자-특이적 PCR, 정렬된 프라이머 신장, 동종 프라이머 신장분석, 질량분석기로 검출하는 프라이머 신장, 파이로서열분석, 유전자어레이에 분류된 멀티플렉스 프라이머 신장, 롤링 사이클 증폭을 포함하는 리게이션, 동종 리게이션, OLA, 유전자어레이에 분류된 멀티플렉스 리게이션 반응, 제한효소-단편 길이 다형성, 단일 염기 신장-표지 분석, 및 침략자(Invader) 분석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이런 방법은 예를 들면, 발광 또는 화학 검출, 형광 검출, 시간-분해 형광 검출, 형광 공명 에너지 전이, 형광 분극화, 질량분석기, 및 전기적 검출과 같은 검출기작과 함께 조합하여 사용할 수 있다.
다형성을 검출하는 다양한 방법은 절단제로부터의 방어로 RNA/RNA 또는 RNA/DNA의 미스 매치된 염기를 검출, 변이체 및 야생형 핵산 분자의 전기영동 이동성의 비교, 및 변성 기울기 겔 전기영동을 사용한 변성제의 기울기를 함유하는 폴리아크릴아마이드 겔에서 다형성 또는 야생형 단편의 이동을 분석하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특이적 위치에서의 서열 변종은 RNase 및 SI 보호 또는 화학적 절단 방법과 같은 뉴클레아제 보호 분석에 의해 또한 평가할 수 있다.
하나의 구체예에서, 유전자형 분석은 5' 뉴클레아제 분석이라고도 알려진 TaqMan 분석을 사용하여 수행하였다. TaqMan 분석은 PCR 동안에 특이적으로 증폭된 산물의 축적을 검출한다. TaqMan 분석은 형광 리포터 다이 및 quencher 다이로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 리포터 다이는 특유의 파장에서 방사함으로써 여기상태가 되고, 이는 형광 공명 에너지 전이(FRET)이라고 불리는 단계를 통해 동일한 프로브의 quencher 다이로 에너지를 전달한다. 프로브에 부착되었을 때, 여기된 리포터 다이는 신호를 방사하지 않는다. 완전한 프로브에서 quencher 다이의 리포터 다이로의 접근은 리포터에 대한 감소된 형광을 유지한다. 리포터 다이 및 quencher 다이는 각각 5' 맨 끝 및 3' 맨 끝 또는 그 반대로 위치할 수 있다. 리포터 다이 및 quencher 다이는 선택적으로, quencher 다이가 내부 뉴클레오티드에 부착되었을 때, 리포터 다이는 5' 또는 3' 맨 끝에 있거나, 그 반대일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 리포터 및 quencher 둘 다 리포터의 형광이 감소되어서, 서로 떨어져 내부 뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
PCR 동안, DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성이 프로브를 절단하고, 이로 인해 리포터 다이 및 quencher 다이가 분리되어 리포터의 증가된 형광을 야기한다. PCR 산물의 축적은 리포터 다이의 증가를 조사함으로써 직접 검출한다. DNA 중합효소는 오직 PCR 동안 증가된 표적 SNP-함유 주형에 프로브가 혼성화될 경우에 리포터 다이 및 quencher 다이 사이에서 프로브를 절단하고, 프로브는 오직 특정 SNP 대립 유전자가 존재하는 경우에만 표적 SNP 부위에 혼성화되도록 설계한다.
바람직한 TaqMan 프라이머 및 프로브 서열은 SNP를 사용하여 용이하게 결정할 수 있고, 관련된 핵산 서열 정보를 본 발명에서 제공한다. 프라이머 Express(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)와 같은, 다수의 컴퓨터 프로그램을 최적 프라이머/프로브 세트를 빠르게 얻기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산을 검출하기 위한 이런 프라이머 및 프로브가 협착 및 관련된 병리에 대한 진단 분석에 유용하고, 키트 형식에 용이하게 포함될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 또한 분자 지표 프로브 및 다른 변이체 형식과 같은 당업계에 잘 알려진 TaqMan 분석의 변형을 포함한다.
본 발명의 핵산을 유전자형 분석하기 위한 다른 방법은 OLA에서 두 개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이다. 이 방법에서, 하나의 프로브를 핵산 부위와 정렬된 그의 3' 맨 끝으로 표적 핵산의 절편에 혼성화시킨다. 첫번째 프로브에 대하여 표적 핵산 분자의 인접한 절편의 3'에 두 번째 프로브를 직접적으로 혼성화시킨다. 두 개의 병렬된 프로브를 표적 핵산 분자에 혼성화시키고, 핵산 부위와 첫 번째 프로브의 3' 끝 뉴클레오티드 사이가 완벽히 상보적일 때, 리가아제와 같은 연결제의 존재 하에서 리게이션 시킨다. 만약 미스매치가 있다면, 효율적인 리게이션은 일어날 수 없다. 반응 후, 리게이션된 프로브는 표적 핵산 분자로부터 분리시키고, 핵산 서열의 존재의 지시자로서 검출한다. OLA는 또한 보편적 어레이를 사용한 핵산 검출을 수행하는데 사용할 수 있고, 집코드 서열은 혼성화 프로브 중 하나, 및 결과적 산물, 또는 증폭된 산물에 도입되어 보편적 집코드 어레이 혼성화시킬 수 있다. 선택적으로 OLA를 OLA 프로브, 및 증폭된 PCR 산물로 통합시키고, 전기영동 또는 보편적 집코드 어레이 해독으로 결정한다.
선택적으로 하나는 SNPlex 방법 및 PCR의 뒤를 이어 OLA을 사용한 멀티플렉스 SNP 검출을 위한 소프트웨어를 사용할 수 있고, 집코드는 OLA 프로브로 통합하고, 증폭된 PCR 산물은 집츄트(zipchute) 시약과 혼성화시키고, SNP의 확인은 집츄트의 전기영동 해독으로부터 결정한다. 어떤 구체예에서, OLA은 PCR(또는 핵산 증폭의 다른 방법) 전에 수행한다. 다른 구체예에서, PCR(또는 핵산 증폭의 다른 방법)은 OLA 전에 수행한다.
유전자형 분석을 위한 다른 방법은 질량 분석기에 기반한다. 질량 분석기는 DNA의 네 개의 뉴클레오티드 각각의 독특한 질량을 이용한다. 핵산은 선택적인 핵산 대립유전자를 갖는 핵산의 질량에서 차이를 측정함으로써 질량 분석기에 의해 명백하게 유전자형 분석할 수 있다. MALDI-TOF(매트릭스 연관 레이저 제거 이온화-비행시간) 질량 분석기 기술이 SNP에 대한 것과 같은 분자 질량의 매우 정확한 결정에 바람직하다. 유전자형 분석에 대한 다수의 접근법이 질량 분석기에 기반하여 개발되고 있다. 핵산 유전자형 분석의 바람직한 질량 분석기-기반 방법은 또한 고전적 겔-기반 형식 및 마이크로어레이와 같은 다른 접근법과 조합하여 사용할 수 있는, 프라이머 신장 분석을 포함한다.
전형적으로, 프라이머 신장 분석은 표적 핵산 위치로부터 상류(5')에 주형 PCR 앰플리콘에 대한 프라이머를 설계하고, 어닐링 시키는 것을 포함한다. 다이디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(ddNTP) 및/또는 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)의 혼합을 주형을 함유하는 반응 혼합물에 첨가한다. 예를 들면, 어떤 구체예에서 이것은 PCR에 의해서와 같이 전형적으로 증폭되는 SNP-함유 핵산 분자이다. 프라이머 및 DNA 중합효소를 추가로 첨가할 수 있다. 혼합이 일어나는 곳에서 ddNTP의 하나에 대하여 뉴클레오티드가 상보적일 때, 프라이머의 신장은 주형의 첫 번째 위치에서 종결된다. 프라이머는 핵산 위치로부터 바로 인접한 것 또는(즉, 프라이머의 3' 말단의 뉴클레오티드는 표적 SNP 부위의 다음의 뉴클레오티드에 혼성화함) 두 개 이상의 뉴클레오티드를 핵산 위치로부터 제거할 수 있다. 만약 프라이머가 표적 핵산 위치로부터 몇몇의 뉴클레오티드를 제거한다면, 유일한 제한은 프라이머의 3' 말단 및 핵산 위치 사이의 주형 서열은 검출될 수 있는 하나로서 동일한 유형의 뉴클레오티드를 함유할 수 없다는 것 또는 이것이 신장 프라이머의 조숙한 종결을 야기할 것이라는 것이다.
선택적으로, 만약 dNTP가 없이, 모든 네 개의 ddNTP가 단독으로 반응 혼합물에 첨가된다면, 프라이머는 항상 표적 SNP 위치에 대응하는 단지 하나의 뉴클레오티드만 신장시킬 것이다. 이 경우에, 프라이머를 SNP 위치로부터 상류에서 하나의 뉴클레오티드에 결합하도록 설계한다(즉, 프라이머의 3' 말단의 뉴클레오티드는 표적 SNP 부위의 5' 옆에 표적 SNP 부위에 바로 인접한 뉴클레오티드에 혼성화한다). 이는 신장된 프라이머의 전체 질량을 최소화하고, 그에 의해 선택적인 SNP 뉴클레오티드 사이의 질량 차이의 최소 한계를 증가시키는 바, 단지 하나의 뉴클레오티드에 의한 신장이 바람직하다. 게다가, 질량-표지된 ddNTP를 비변형된 ddNTP 대신에 프라이머 신장 반응에 사용할 수 있다. 이것은 이들 ddNTP로 신장된 프라이머 사이의 질량 차이를 증가시키고, 그로 인해 증가된 민감도 및 정확도를 제공하여, 이형접합체 염기 위치를 유형화하는데 특별히 유용하다. 질량-표지화는 또한 집중적인 표본-준비 절차에 대한 필요를 경감시키고, 질량 분광계의 필요한 분해능을 감소시킨다.
이후 신장된 프라이머를 정제하고, 표적 SNP 위치에 존재하는 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위하여 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 분석할 수 있다. 하나의 분석 방법에서, 프라이머 신장 반응의 산물을 매트릭스를 형성하는 빛 흡수 결정과 조합할 수 있다. 매트릭스는 이후 이온화시키기 위한 레이저와 같은 에너지 공급원으로 명중시키고, 기체-상으로 핵산 분자를 탈착시킬 수 있다. 이후 이온화된 분자를 비행 튜브로부터 제거하고, 검출기 쪽으로 튜브를 가속시킨다. 레이저 펄스와 같은 이온화 이벤트 및 검출기와 분자의 충돌 사이의 시간이 그 분자의 비행시간이다. 비행시간은 이온화된 분자의 질량-대-전하 비(m/z)와 정확히 상관한다. 더 작은 m/z의 이온은 더 큰 m/z의 이온보다 튜브 아래로 더 빨리 움직이고, 따라서 가벼운 이온이 무거운 이온 전에 검출기에 도달한다. 이후 비행시간은 대응하는, 그리고 고도로 정확한 m/z로 변환시킨다. 이 방법에서, SNP는 단일 염기 위치에서 다른 뉴클레오티드를 갖는 고유한 핵산 분자의 질량의 근소한 차이, 및 대응하는 비행시간의 차이에 기반하여 확인할 수 있다.
또한 핵산은 직접적인 DNA 서열분석에 의해 점수매길 수 있다. 질량 분석기에 의한 서열분석을 포함하는 다양한 자동화된 서열분석 절차를 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 당업자에게 이런 자동화된 서열 분석 절차에 대한 서열분석 프라이머를 용이하게 설계할 수 있게 한다. 당업계에서 자동화된 서열분석에 Applied Biosystems 377, 3100, 3700, 3730, 및 3730x1 DNA Analyzers(Foster City, Calif.)와 같은 시판되는 수단을 이용하고 있다. 핵산 서열은 또한 SpectruMedix system과 같은 고처치율 돌연변이 스크리닝 시스템을 사용하는 것에 의해 결정할 수 있다.
본 발명의 핵산을 유전자형 분석하기 위해 사용할 수 있는 다른 방법은 단일-사슬 배좌 다형성(SSCP), 및 변성 기울기 겔 전기영동(DGGE)을 포함한다. SSCP는 단일 사슬 PCR 산물의 전기영동 이동에 있어서의 변화에 의해 염기 차이를 확인한다. 단일-사슬 PCR 산물은 이중 사슬 PCR 산물을 가열하거나 달리 변성시켜 생성할 수 있다. 단일-사슬 핵산은 염기 서열에 의존적으로 재접합하거나, 이차 구조를 형성할 수 있다. 단일-사슬 증폭 산물의 다른 전기영동 이동성은 핵산 위치의 염기-서열 차이와 관련이 있다. DGGE는 서열-의존적 안정성의 차이, 다형성 DNA에 고유한 해리 특성 및 변성 기울기 겔에서의 전기영동 이동 패턴에서 대응하는 차이에 기반하여 핵산 대립유전자를 식별한다.
서열-특이적 리보자임은 또한 리보자임 절단 부위의 발생 또는 손실에 기반하여, 핵산, 특히 SNP의 점수를 매기는데 사용할 수 있다. 완벽히 매치하는 서열은 뉴클레아제 절단 효소적 분해 분석 또는 해리 온도에서의 차이에 의해 미스 매치된 서열로부터 구별할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 만약 SNP가 제한효소 절단 부위에 영향을 미친다면, SNP는 제한효소 효소적 분해 패턴에 있어서의 변화 및 겔 전기영동에 의해 결정된 핵산 단편 길이에서 대응하는 변화에 의해 확인할 수 있다.
유전자형 분석은 예를 들면, 인간 피검체로부터 생물학적 표본을 수집하는 단계(예를 들어, 조직 표본, 세포, 체액, 분비물, 등), 표본의 세포로부터 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, mRNA 또는 둘 다)을 분리하는 단계, 관심의 표적 핵산 영역을 함유하는 분리된 핵산의 영역에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머에 표적 핵산 영역의 혼성화 및 증폭이 일어나는 것과 같은 조건 하에서 핵산을 접촉시키는 단계, 및 관심 있는 핵산 위치에 존재하는 뉴클레오티드를 결정하는 단계, 또는 어떤 분석에서, 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계(분석은 혼성화 및/또는 증폭이 특정 핵산 서열 대립유전자가 존재 또는 부재하는 경우에만 일어나도록 하기 위하여 설계할 수 있다)를 포함할 수 있다. 어떤 분석에서, 증폭 산물의 크기를 검출하고, 대조군 표본의 길이와 비교한다; 예를 들면, 정상 유전자형과 비교하여 증폭된 산물의 크기의 변화에 의해 결실 및 삽입이 검출될 수 있다.
게다가, 핵산, 또는 특히 SNP를 이후 면역 반응을 유도하기 위하여 또한 항원을 받은 다른 개체의 핵산과 비교할 수 있다. 두 개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1(Genetics Computer Group, Madison, Wis., 미국)에서 사용할 수 있는 프로그램을 포함하여, 임의의 적당한 수단에 의해 수행할 수 있다. "국소 상동성"을 찾기 위하여 BESTFIT과 같은 다른 프로그램은 Smith 및 Waterman의 알고리즘을 사용할 수 있고, 두 서열 사이의 유사성이 가장 일치하는 영역을 찾는다. 나아가, 두 개 서열을 정렬하여 "최대 유사성"을 찾는 GAP과 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 비교할 두 서열이 최적으로 정렬되었을 때 바람직한 % 동일성 및 유사성이 결정된다. 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 다른 프로그램, 예를 들면 국립생물기술정보센터(NCBI)(Bethesda, Md., 미국)에서 이용 가능한 BLAST 패밀리 프로그램 및 위스콘신 서열 분석 패키지의 일부로서 사용가능한 FASTA가 또한 당업계에 알려져 있다.
일단 개체에 존재하는 핵산의 존재 또는 부재 또는 패턴이 결정되면, 면역 반응 점수는 핵산 결과와 관련된다. 의사는 이후 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 SNP가 변경된 면역 관용에 포함된 항원에 반응하거나 반응하지 않는 개체와 관련되는 경우인지 결정할 수 있다.
면역 관용의 유도의 기작이 다른 질병 및 장애에 따라 다양할 수 있음이 고려된다. 예를 들면, 전신성 홍반성 낭창의 유도에 포함된 SNP는 자가면역 뇌질환과 같은 다른 질병에 포함된 SNP와 다를 수 있다. 이와 같이, 의사는 의사가 면역 관용을 유발하고자 하는 각 질병 및 장애에 대하여 도 1의 과정을 반복할 수 있다.
개체의 유전자형 분석에 기초한 치료의 결정
도 1의 방법은 의사가 SNP를 포함하는 어떤 핵산 서열이 면역 관용의 유도와 관련된 것인지 결정하도록 하기 때문에 특별히 유익하다. 더욱 중요하게, 일단 도 1의 방법이 종료되면, 도 2의 개요와 같이, 의사는 관심의 핵산 서열 또는 SNP에 대하여 새로운 개체를 간단히 시험할 수 있다.
첫 째, 의사는 질병 또는 장애를 갖는 것으로서 환자를 분류하거나 진단한다(201). 분류 또는 진단은 현재 또는 과거의 증상, 병력, 가족력, 분석 또는 의학적 정밀검사와 같은 시험, 등에 기반할 수 있다.
일단 의사가 환자를 진단하면, 의사는 환자로부터 생물학적 표본을 채취한다(202). 표본은 전혈, 혈장, 소변, 눈물, 정액, 타액, 구강 점막, 간질액, 림프액, 뇌막액, 양막액, 샘 유동액, 가래, 대변, 발한, 점액, 질 분비물, 뇌척수액, 체모, 피부, 배설물, 상처 삼출액, 상처 호모지네이트, 및 상처액을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 의사 및 환자에게 편리한 임의의 형태일 수 있다.
이후 개체의 핵산을 표본으로부터 분리한다(203). 분리는 의사에게 편리한 임의의 수단에 의해 일어날 수 있다. 예를 들면, 분리는 우선 세포를 계면활성제, 효소적 분해 또는 물리적 붕괴를 이용하여 용해시키는 것에 의해 일어날 수 있다. 이후 오염 물질을 예를 들면, 효소적 분해, 유기 용매 추출 또는 크로마토그래피 방법의 사용에 의해 핵산으로부터 제거한다. 개체의 핵산을 알코올 침전, 원심분리 및/또는 투석을 포함하는 임의의 수단에 의해 정제 및/또는 농축시킬 수 있다.
이후 개체의 핵산을 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 또는 부재에 대하여 분석한다(204). 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산은 의사가 임의의 질병 또는 장애에 대한 면역 관용과 관련될 것으로 믿는 임의의 핵산일 수 있다. 적당한 질병 또는 장애의 대표적인 예시는 표 12에 나열하였다.
하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 또는 부재 여부에 대한 결정은 임의의 의미에 의해 행해질 수 있다(205).
하나의 구체예에서, 관심 있는 핵산이 TTTTTTTTTTGTACC표지TTCTATGGTTACCTT(서열번호 1) 또는 TTTTTTTTTTGTACCTGGTTCTATGGTTACCTT(서열번호 2) 중 하나일 때, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 12번 염색체의 인접한 말단으로부터 대략 55.5 Mbp에 위치한 66,603,791 및 66,603,991 bp 사이의 12번 염색체의 대략 50 KB 길이의 비유전자 영역이다. A/G는 다형성 부위이다. 따라서 AA는 AA 동형접합체를 나타내고, 한편 AB는 A/G 이형접합체를 나타내고, BB는 GG 유전자형을 나타내고, A→G는 다형성 부위를 나타낸다.
선택적으로, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 SNP A-1515737의 5'쪽의 대략 265143 bp의 일부를 포함할 수 있다. 선택적으로, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 서열번호 3 또는 서열번호 4 모두의 일부를 포함한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S1503 마커에 근접한, 12번 염색체의 66507155 - 66507464 사이에 위치한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S1676의 근처에 위치, 즉, 미리 결정된 관심 있는 핵산의 일부 또는 전부가 12번 염색체의 66499298 - 66499423 사이에 위치한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S335의 근처에 위치, 즉, 미리 결정된 관심 있는 핵산의 일부 또는 전부가 12번 염색체의 66415802 - 66416056 사이에 위치한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S102의 근처에 위치, 즉, 미리 결정된 관심 있는 핵산의 일부 또는 전부가 12번 염색체의 66781046 - 667812986 사이에 위치한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S1506의 근처에 위치, 즉, 미리 결정된 관심 있는 핵산의 일부 또는 전부가 12번 염색체의 66785380 - 66785614 사이에 위치한다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_A-1508498(TSC51977)이다. 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_A-1512645(TSC1720860)이다. 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_A-1512719(TSC1720861)이다. 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_A-1515330(TSC1244733)이다. 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 A 또는 G의 다형성을 갖는 SNP_A-1518829(TSC51583)이다. 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 G의 다형성을 갖는 SNP_A-1518878(TSC51584)이다. 나아가, 하나의 특정 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 SNP_A-1515737의 30 kbp 내에 위치한다. 이들 다른 마커 및 전사체는 또한 유도된 관용, 특히 경구 관용을 갖는지에 대한 환자의 능력을 결정하는데 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S1503이다.(서열번호 5). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S1676이다.(서열번호 6). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S335이다.(서열번호 7). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 D12S102이다.(서열번호 8).
다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_A-1508498이다.(서열번호 9 및 서열번호 10). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_ A-1512645이다.(서열번호 11 또는 서열번호 12). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_ A-1512719이다.(서열번호 13 또는 서열번호 14). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 T의 다형성을 갖는 SNP_ A-1515330이다.(서열번호 15 또는 16). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 A 또는 G의 다형성을 갖는 SNP_ A-1518829이다.(서열번호 17 또는 서열번호 18). 다른 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 C 또는 G의 다형성을 갖는 SNP_ A-1518878이다.(서열번호 19 또는 서열번호 20) 미리 결정된 관심 있는 핵산은 또한 인간 12번 염색체의 63.3 mbp 및 69.4 mbp 사이의 임의의 마커 또는 유전자일 수 있다. 예를 들여, 도 15를 참조하라.
하나의 구체예에서, 의사는 핵산의 특정 변이체의 존재 또는 부재의 시각적 증거를 사용한다.
다른 구체예에서, 방법은 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 및/또는 부재를 결정하기 위하여 하나 이상의 알고리즘을 포함하는 컴퓨터 기반 시스템을 제공하고, 만약 존재한다면, 개체의 핵산에 존재하는 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 양을 정량한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 하나 이상의 SNP이다. 나아가, 컴퓨터 기반 시스템은 관찰된 SNP 대립유전자, 선택적인 코돈, 군집, 대립유전자 빈도, SNP 유형, 및/또는 영향을 미친 단백질 등에 대한 정보를 포함할 수 있다.
컴퓨터 기반 시스템은 하기 그룹에서 적어도 하나를 포함한다: 본 발명의 임의의 정보를 분석하는데 사용하는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단, 및 데이터 기억 장치 수단. 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템의 최소의 하드웨어 수단은 전형적으로 중앙 처치 장치(CPU), 입력 수단, 출력 수단, 및 데이터 기억 장치 수단을 포함한다. 당업자는 일반적으로 사용가능한 컴퓨터-기반 시스템 중 임의의 하나가 본 발명에서 사용하기 적합한지 용이하게 인식할 수 있다. 이런 시스템은 임의의 실험 없이 CD-R, 또는 이의 부분 집합에 제공된 정보를 사용함으로써 본 발명의 시스템으로 바뀔 수 있다.
앞에서 언급한 바, 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템은 검색 수단을 보조하고 실행하기 위한, 저장된 내부의 정보를 갖는 데이터 기억 장치 수단 및 필요한 하드웨어 수단 및 소프트웨어 수단을 포함한다. 컴퓨터-기반 시스템의 검색 수단은 데이터 기억 장치 수단에 저장된 핵산 정보에 기반하여, 표적 서열에서 SNP를 포함하는 핵산서열을 확인 또는 분석하기 위한 컴퓨터-기반 시스템에서 실행되는 하나 이상의 소프트웨어 프로그램 또는 알고리즘을 포함한다. 검색 수단은 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정하는데 사용할 수 있고, 및/또는 뉴클레오티드는 핵산 서열의 특정 SNP 위치에 존재한다.
이 구체예의 하나의 어플리케이션에서 의사는 컴퓨터로 해독 가능한 매체에 관심 있는 핵산에 관한 정보를 포함하는 컴퓨터-기반 시스템을 제공할 수 있다. 컴퓨터로 해독 가능한 매체는 컴퓨터에 의해 직접 해독하고 접근할 수 있는, 하기를 포함하는 임의의 매체이지만 이에 제한되지 않는다: 플로피 디스크, 하드 디스크 기억 장치 매체, 및 자기 테이프와 같은 자기 기억 장치 매체; CD-ROM과 같은 광학 저장 매체; RAM 및 ROM과 같은 전자 기억 장치 매체; 자기/광학 저장 매체와 같은 이들 종류의 하이브리드.
다양한 데이터 저장 구조가 당업자가 내부에 저장된 본 발명의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는 컴퓨터로 해독 가능한 매체를 만드는데 이용가능하다. 데이터 저장 구조의 선택은 저장된 정보에 접근하기 위해 선택된 수단에 일반적으로 기반을 둘이다. 게다가, 다양한 데이터 처치 프로그램 및 형식이 컴퓨터로 해독 가능한 매체에서 본 발명의 핵산 서열 정보를 저장하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 정보는 WordPerfect 및 Microsoft Word와 같은 시판되는 소프트웨어의 형식으로 제시하거나, ASCII의 형태로 제시하거나, 또는 OB2, Sybase, Oracle, 등과 같은 데이터베이스 어플리케이션에 저장한 워드 프로세싱 텍스트 파일로 제시할 수 있다. 당업자는 내부에 저장된 본 발명의 핵산 서열 정보를 갖는 컴퓨터로 해독 가능한 매체를 얻기 위하여 임의의 다수의 데이터 처치 구조화 형식 (예를 들어, 텍스트 파일 또는 데이터베이스)에 용이하게 적응할 수 있다.
컴퓨터로 해독 가능한 형태로 본 발명의 SNP를 포함하는 핵산 서열을 제공함으로써, 의사는 다양한 목적에 대해 핵산 서열 정보에 일상적으로 접근할 수 있다. 컴퓨터 소프트웨어는 당업자가 컴퓨터로 해독 가능한 매체로 제공된 서열 정보에 접근하여 공개적으로 이용할 수 있게 한다. 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어의 예시는 BLAST 및 BLAZE 검색 알고리즘을 포함한다.
본 발명은 나아가 본 발명에서 설명한 핵산 서열 정보를 함유하는 시스템, 특별히 컴퓨터-기반 시스템을 제공한다. 이런 시스템을 다수의 개체로부터 예를 들면, 다수의 SNP 위치에서의 정보, 또는 SNP 유전자형을 포함하는 유전자형에서의 정보를 저장 및/또는 분석하기 위해 설계할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 정보는 가치 있는 정보 공급원을 나타낸다. 본 발명의 핵산 서열 정보는 군집에서 핵산 대립유전자 빈도, 질병 유전자 맵핑, 유전자형-표현형 관련 연구, 일배체형으로 SNP를 그룹화, 특정 약물에 대한 반응과 SNP 일배체형의 상호 관련, 또는 다양한 다른 생명정보학적, 유전체 약학적, 약물 발달, 또는 인간의 신원확인/법의학적 용도를 결정 또는 분석함으로서 이런 컴퓨터-집약적 어플리케이션에서 사용할 수 있는 컴퓨터-기반 시스템에서 저장/분석한다.
이후 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 및/또는 부재에 기반하여 개체의 치료를 공식화한다(206). 치료는 이후 항원의 유형, 투여량, 투여 방법, 치료의 지시, 등의 여부에 따라 유도될 수 있는 면역 관용 유도 가능성의 결정을 포함하는, 의사의 모든 수단을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 또한 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)이 면역 관용의 생성을 방해하는 것을 발견하였다. 따라서, 하나의 선택적인 구체예에서, 의사는 치료를 원하는 개체에서 NSAID의 사용을 멈추게 하는 것 또는 예를 들면, 미소프로스톨과 같은, 면역 관용의 NSAID 억제를 역전시키기 위한 의약품을 투여하는 것 중 하나에 의해 면역 관용의 발생을 조절할 수 있다.
나아가, 하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 특발성 폐섬유증("IPF")을 치료하기 위해 사용할 수 있다. IPF는 치사, 만성, 악성, 간질성 폐 질환이고, 정상 폐 조직이 점차 섬유성 조직으로 대체되거나, 비정상 및 과다량의 섬유성 조직이 폐 간질에 침전된다. 이는 폐의 흉터로서 설명할 수 있다. IPF 환자의 대략 60%가 V형 콜라겐에 대하여 항원-특이적인 자가면역 반응을 갖는다. 특정 기작 또는 가설에 결합하길 바라는 것 없이, 이런 환자의 면역계가 폐의 V형 콜라겐을 공격하고, 이로 인해 섬유증을 유발한다고 믿는다.
V형 콜라겐에 대한 자가 면역 반응을 갖는 IPF 환자는 폐의 V형 콜라겐을 공격하는 면역 반응이 멈추거나 감소할 때 이로울 것이다. 이 면역 반응은 본 발명의 방법을 사용한 V형 콜라겐에 대한 면역 관용의 유도에 의해 멈추거나 감소할 수 있다. 관용은 본 발명의 방법에 따른 콜라겐 항원, 바람직하게는 V형 콜라겐 항원의 반복적인 투여에 의해 유도할 수 있다.
콜라겐 또는 콜라겐 항원, 바람직하게는 V형 콜라겐 또는 이의 항원의 투여는 V형 콜라겐에 대하여 항원-특이적 자가면역 반응을 갖는 IPF 환자를 치료하는데 가장 효과적일 것이다. 따라서, 이런 환자를 확인하는 시험이 바람직하다.
본 발명의 방법을 사용하여, V형 콜라겐에 대한 항원-특이적 자가면역 반응을 갖는 IPF 환자가 V형 콜라겐에 대한 항원-특이적 자가면역 반응을 갖지 않는 IPF 환자에서는 발견되지 않는 하나 이상의 SNP--또는 SNP와 연결된 어떤 방법에서 다른 핵산 서열--를 수반하는지 여부를 결정하기 위해 관련 연구를 수행할 수 있다. V형 콜라겐에 대한 항원-특이적 자가면역 반응과 관련된 하나 이상의 SNP 또는 연결된 핵산 서열의 존재를 이후 콜라겐 또는 콜라겐 항원, 바람직하게는 V형 콜라겐 또는 이의 항원의 투여에서 가장 이로울 수 있는 환자를 확인하는데 사용할 수 있다. V형 콜라겐에 대한 자가면역 반응은 또한 폐 이식의 거부 반응의 원인으로 생각된다. 따라서 V형 콜라겐에 대한 항원-특이적 자가면역 반응과 관련된 것으로 밝혀진 SNP 및/또는 핵산 서열을 또한 폐 또는 다른 이식을 성공적으로 견디는 것에 대한 환자의 성향에 접근하기 위해 사용할 수 있다.
면역 관용을 유발하는지 여부를 결정하기 위한 개체 유전자형의 용도
본 발명은 또한 의사가 개체에 대한 치료의 지시를 결정하는데 사용할 수 있다. 이는, 개체-특이적 정보에 기반하여, 본 발명은 면역 관용을 유도하는 것, 항원 유형, 투여량, 투여 방법, 치료 지시, 등 중 어느 하나와 같은 치료 지시를 의사에게 추천할 수 있다. 치료 지시의 추천은 개체가 갖는 질병 또는 장애의 기능뿐만 아니라 개체 특징의 기능일 수 있다.
이 구체예에서, 도 3에 위치한 방법에서 개체 특징이 하나 이상의 데이터베이스에 우선으로 위치한다(301). 개체 특징 정보는 한명 이상의 의사를 포함하는 통합 협의 과정, 개체가 작성한 질문서, 전자 데이터베이스, 진단 또는 전문가 패널 측정 도구, 의뢰인 요약 보고서 및 결과 측정 보고서를 이용하는 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 용인될 수 있다. 나아가, 개체 특징 정보는 네트워크, 구두 전달, 시각 전달, 문자 전달, 물리적 데이터 담체 및/또는 정보를 전달 할 수 있는 임의의 다른 수단 중 하나 이상에 의해 용인될 수 있다.
개체 특징은 연령, 성별, 키, 체중, 개체 병력, 가족력, 민족성, 알레르기 정보, 생활양식 정보, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이후 개체의 핵산을 모으고, 분석한다(302). 개체 핵산을 모으는 방법은 본 명세서에 언급된 것들을 포함하여 의사가 임의로 고려할 수 있다.
이후 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 또는 부재를 결정한다(303). 여기서, 어떤 핵산을 시험할 것인지에 대한 결정, 즉, 미리 결정된 관심 있는 핵산은 의사가 각각 개별적으로 결정할 수 있다. 선택적으로, 결정은 개체의 현재의 질병 또는 진단 사이의 관계를 반영하는 정보 또는, 의사가 현재의 질병 또는 진단인 것으로 믿는 어떤 것, 및, 질병 또는 진단에 관련된 관심 있는 핵산을 함유하는 데이터베이스에 접근하는 것을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 데이터베이스는 의사가 위치한 지역이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 데이터베이스는 원격조정, 동적 데이터베이스이다. 일반적으로, 동적 데이터베이스는 내부 데이터가 용이하게 변경되거나 업데이트될 수 있는 것이다. 예를 들면, 이것은 네트워크 또는 데이터베이스로부터 소프트웨어 시스템으로 정보를 업로드하는 것을 통해 동적 데이터베이스로부터 정보를 접근하기 위한 소프트웨어 시스템을 사용할 수 있다. 만약 데이터베이스에 저장된 정보가 변한다면, 데이터베이스에 결합된 소프트웨어 시스템도 인간의 개입 없이 자동화되어 변할 것이다. 소프트웨어 시스템은 이벤트가 발생했을 때, 매 분 마다, 매 시간마다, 매일, 또는 매주 기준을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 시간축에서 개체의 정보를 동적 데이터베이스에 업데이트 할 수 있다.
단계(303)의 결과, 즉, 하나 이상의 미리 결정된 관심 있는 핵산의 존재 또는 부재에 기반하여, 개체의 치료를 결정할 수 있다. 하나의 구체예에서, 의사는 치료 지시의 결정에 있어서 의학 분야의 그의 전문 지식에 의존한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 데이터베이스가 저장된 소프트웨어 시스템이 치료 지시를 추천한다. 추천된 치료 지시는 면역 관용을 유발하는지 여부, 항원 유형, 투여량, 투여 방법, 치료 지시, 일반 판매약 또는 처방약, 생활 습관, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
치료 지시의 추천은 개체가 갖는 질병 또는 장애의 기능뿐만 아니라, 개체 특징의 기능일 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 데이터베이스는 소프트웨어 시스템에 개체에 대한 정보, 치료할 질병 또는 장애, 치료의 결과, 및 다른 생체적합성 정보를 더 넣을 수 있게 한다. 다수의 개체에 대한 정보는 함께 풀을 형성할 수 있고, 따라서 하나 이상의 매개 변수에 대한 데이터의 수가 증가하는 바, 어떤 것이 개체의 상태의 표준에 가장 잘 맞는 치료/절차인지 계산하여 소프트웨어 시스템에서의 알고리즘은 더 확고하고 정확해지는 것으로 고려된다. 나아가, 데이터베이스는 의학 전문가의 심사원단에 의해 최적으로 판정된 특이적 치료 프로토콜인 "업무 처치 모범 관행"의 저장소를 추가로 포함할 수 있다.
이들 구체예는 의사가 개체의 치료를 더 잘 맞추게 하고, 불필요한 비용 및 불필요한 치료 시간을 회피하게 한다.
면역 관용과 관련된 핵산의 결정
어떤 핵산이 미리 결정된 관심 있는 핵산인지의 결정은 도 4의 방법에 의해 결정할 수 있다. 우선, 다수의 개체에서 질병 또는 장애에 대한 정보를 수집하고, 하나 이상의 데이터베이스에 저장한다(401). 정보는 적어도 개체의 질병 또는 장애, 항원의 투여 후 면역 관용을 발달시키는 개체의 능력 및 개체의 핵산 정보를 포함한다. 바람직하게는 핵산 정보는 하나 이상의 SNP의 존재 또는 부재이다.
특정 질병 또는 장애 조건에서 핵산의 증가된(또는 감소된) 존재를 결정하기 위해 하나 이상의 SNP의 부재의 존재 및 면역 관용을 발달시키는 개체의 능력을 비교한다(402). SNP 및 면역 관용을 발달시키는 능력의 비교는 수학적 알고리즘을 사용하여 성취할 수 있다.
하나 이상의 SNP 및 면역 관용을 유도하는 능력 사이에 일단 통계학적으로 유의한 관련이 확립되면, 이후 면역 관용을 유도하는 능력에 영향을 미치는, 원인이 되는 유전적 위치/서열(예를 들어, 원인이 되는 SNP/돌연변이, 유전자, 조절, 영역, 등)을 확인하기 위해 선택적으로 SNP 주변의 영역을 철저하게 스크리닝할 수 있다.
게다가, 대조군(즉, 장애를 갖지 않는 개체; 대조군은 또한 "건강한" 또는 "정상" 개체라고도 지칭하였음), 바람직하게는 유사한 연령 및 인종의 정보와 비교하여 관심 있는 장애 또는 질병을 갖는 개체로부터의 생물학적 표본에서 SNP 대립유전자의 존재 또는 빈도를 결정하기 위해 SNP 및 특정 질병 또는 장애의 관련 연구를 수행할 수 있다. 환자 및 대조군은 생리학적 특성이 가능한 한 유사할 것이고, 잘-특성화된 표현형을 갖는 개체의 풀이 극히 바람직하다. 나아가, 또한 관련 연구를 일반적 군집에서 수행할 수 있고, 영향을 받은 패밀리에서 관련된 개체에서 수행되는 연구로 제한되지 않는다(연계 연구).
이후 하나 이상의 SNP의 정보를 면역 관용을 유도하는 능력이 있는 개체에서 그것의 존재 또는 부재와 함께 하나 이상의 데이터베이스에 저장한다(403).
이후 질병 또는 장애에 대한 치료를 원하는 개체의 핵산을 수집하고, 면역 관용을 유도하는 다른 개체의 능력과 통계학적으로 유의하게 관련된 하나 이상의 SNP를 갖는 개체인지 분석한다(404). 이후 개업의 혼자, 또는 하나 이상의 데이터베이스를 포함하는 소프트웨어 시스템의 도움과 함께, 어떤 의학적 지시를 사용할 것인지, 및 이들 의료 치료의 매개 변수를 결정할 수 있다.
면역 관용에 걸리기 쉬운 개체에서 변경된 폴리펩티드 제시의 결정
다른 구체예에서, 도 5에 나타낸바, 면역 관용 발달에 걸리기 쉬운 개체에서 존재하거나 부재하는 폴리펩티드를 결정하는데 적어도 하나의 폴리펩티드에 대한 스크리닝을 포함하는 방법을 우선 사용한다. 이 방법에서, 개업의는 면역 관용을 유도하기 위하여 환자에게 경구 항원을 우선 투여한다(501).
본 발명에서 사용하는데 적합한 항원은 이전에 논의된 것들을 포함하고, 자가-면역 질병의 유도, 만성(알레르기성) 과민증, 동종 이식 거부와 관련되거나 이를 유발하는 임의의 것, 및 그들의 서브유니트 또는 추출물; 또는 재조합적으로 생성된 전체 단백질, 이들의 서브유니트 또는 단편; 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 게다가, 항원은 관련 질병을 치료하기 위하여, 표 12의 항원 전체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항원은 나아가 개체로 투여하기 전에, 약학적으로 허용 가능한 첨가제 및/또는 담체와 같은 다른 구성요소와 결합시킬 수 있다.
개체 투여량 크기, 투여량 수, 투여량의 투여 빈도, 및 투여 방법은 당업자가 다양하게 결정할 수 있다. 항원의 적합한 투여량은 이전에 논의한 것들이다. 나아가, 투여 방법은 에어로졸, 피하, 직장, 피내, 정맥내, 코, 경구, 경피 및 근육내 경로를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
무엇에 의하여 항원에 대한 개체의 면역계 반응이 그들의 반응에 기반하여 점수 매겨지는지(503), 생물학적 표본은 개체의 면역 반응(502)을 결정하는데 사용하기 위해 개체로부터 얻는다.
개체 면역 반응을 결정하는 방법은 이전에 논의된 임의의 방법을 포함할 수 있고, 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA), ELISA/ACT® 림프구 반응 분석(LRA), 항체 생산의 시험관내 측정, 혼합 백혈구 반응, 세포독성 T 림프구 분석, 유세포분석, 웨스턴 블롯, 한계 희석 분석, 질량 분석법, 면역침강법, 면역형광법, ELISPOT, 트랜스비보 DTH 분석, 사량체 분석, CFSE 분석, TCR 레퍼토리의 특성화, 다클론항체에 대한 T 세포 반응의 측정, 비-항원-특이적 자극, PCR, LCR, 혼성화 기술을 포함하는 핵산의 존재의 검출 및 단백질체학을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 게다가, 하나의 특정 구체예에서, 환자는 항원을 받기 전, 받는 동안 및/또는 받은 후의 IL-17, IL-2 또는 IFN-γ 생산을 포함하는 사이토카인 생산의 각각의 수준 및/또는 변화에 기반하여 점수를 얻는다. 나아가, Tr1 세포 또는 CD4+, CD25+, FoxP3+와 같은 T 조절 세포의 수준을 환자 반응을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 선택적으로 다른 사이토카인을 개체 점수를 결정하기 위해 측정할 수 있다. 예를 들면, α1(I)- 및 α2(I)-자극 PBMC 배양 상청액 및/또는 sIL-2R에서 IL-10, IL-4, IL-5 또는 TGF-β1, 2 또는 3의 수준을 환자의 점수를 매기는데 사용할 수 있다.
점수를 매기는 방법은 의사에 의존하고, 항원에 대한 그들의 면역 반응에 기반하여 환자를 분리하는 임의의 방법을 포함한다. 면역계 반응에 기반하여 환자에게 점수를 매기기 위하여, 의사는 항원을 받기 전, 받는 동안 및/또는 받은 후의 면역 반응과 비교하여 측정할 수 있다. 언제 면역 반응을 측정할 것인지 및 어떤 방법을 사용할 것인지의 결정은 의사의 필요에 기반한다. 나아가, 의사는 다른 사이토카인, 산화 라디칼, 결합 조직 성장 인자, 산화질소, 환자 키, 체중, 건강, 식이요법, 및 환자의 면역 반응에 점수를 매기는 것을 도와주기 위한 환경적 고려와 같은 개체의 다른 생리학적 인자를 추가로 고려할 수 있음이 고려된다.
일단 개체가 항원 반응에 기반하여 점수매겨지면, 의사는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 변이체 폴리펩티드를 갖는 개체인지 여부를 결정하기 위해 개체의 폴리펩티드를 분석할 것이다(504).
의사는 다르거나 독특한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 패턴의 존재 또는 부재 및 개체의 면역 반응 점수와 관련된 폴리펩티드의 존재/부재를 찾기 위하여 관심있는 특정 공지 폴리펩티드를 시험하거나 표본에 존재하는 단백질의 일부 또는 전부를 시험할 수 있다.
폴리펩티드는 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 검출할 수 있다. 폴리펩티드 검출 전에, 개체의 생물학적 표본 내의 폴리펩티드를 황산암모늄 같은 이런 물질로 선택적 침전, 차가운 에탄올 침전, 한외여과(ultrafiltration), 컬럼 크로마토그래피, 면역정제 방법, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 상당한 순도로 정제할 수 있다.
폴리펩티드는 샌드위치 분석 및 경쟁 또는 여과 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 의사에게 편리한 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 전형적으로, 샌드위치 또는 경쟁/여과 분석은 분석물(이 경우에서 표본의 하나 이상의 폴리펩티드)에 특이적으로 결합하고, 종종 고정시키는 "포획제"를 포함한다. 포획제는 분석물에 특이적으로 결합하는 모이어티이다.
폴리펩티드의 존재 또는 부재는 전기화학적 수단 또는 표지의 이용을 포함하는 의사에게 편리한 임의의 수단으로 결정할 수 있다. 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 구성물이다. 본 발명에서 유용한 표지는 자기 비드, 형광 다이(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 등), 방사성동위원소 표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소(예를 들어, 서양고추냉이 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것들) 및 콜로이드 골드 또는 착색유리와 같은 비색 표지 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등) 비드를 포함한다. 표지는 당업계에 잘 알려진 방법에 따른 분석의 원하는 구성요소에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 항체는 당업자에게 잘 알려진 임의의 다수의 수단 및 상술한 바에 의해 생산할 수 있다. 나아가, 표지는 포획제/분석물 복합체에 결합하거나, 포획제/분석물과 구별된 모이어티에 2차로 결합하는 제 3의 모이어티에 있을 수 있다.
폴리펩티드를 검출 및/또는 정량하는데 사용할 수 있는 다른 기술은 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석, 리포좀 면역 분석(LIA), 단백질 마이크로어레이와 같은 단백질체학 또는 질량 분석기를 포함한다.
개체의 표본에서 발견한 관심 있는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정할 수 있고, 면역 관용을 유도하는 다른 개체의 능력과 통계학적으로 유의하게 관련된 폴리펩티드 아미노산 서열을 함유하는 하나 이상의 데이터베이스와 비교할 수 있다(404). 이후 개업의 혼자, 또는 하나 이상의 데이터베이스를 포함하는 소프트웨어 시스템의 도움과 함께, 어떤 의학적 지시를 사용할 것인지, 및 이들 의료 치료의 매개 변수를 결정할 수 있다.
본 발명에서 설명된 임의의 구체예에서 질병 또는 장애는 인종, 민족성 또는 성별과 연결될 수 있음이 인식된다. 예를 들면, 하나의 연구는 여성이 진단된 자가면역 질환의 78%를 포함하는 것을 발견하였다. 나아가, 여성은 남성보다 장애를 가질 가망이 더 높고, 흑인은 백인에 비해 장애를 가질 가망성이 더 높은 경우, 전신성 경화는 성별 및 인종 특이적 보급을 갖는다. 이와 같이, 관심 있는 핵산의 존재 또는 부재는 성별 및 또는 인종 사이에 다른 수준을 갖는 호르몬, X 염색체와, 또는 효소, 수용체와, 또는 다른 화합물과 관련될 수 있다.
SNP 검출 키트 및 시스템
본 발명에 개시된 SNP 및 관련된 서열 정보에 기반하여, 검출 시약은 본 발명의 임의의 SNP를 분석하기 위해 현상 및 사용할 수 있고, 이러한 검출 시약은 당업계에 잘 알려진, 확립된 키트 또는 시스템 형식 중 하나에 용이하게 통합될 수 있다. SNP 검출 시약의 문맥에서 사용된 키트는 다중 SNP 검출 시약의 조합, 또는 요소 또는 구성요소의 하나 이상의 다른 유형과 조합된 하나 이상의 SNP 검출 시약 같은 이런 것들을 지칭한다(예를 들어, 생화학 시약의 다른 유형, 용기, 상업적 판매를 위해 의도된 것과 같은 포장, SNP 검출 시약이 부착된 물질, 전자 하드웨어 구성요소, 등). 따라서, 본 발명은 포장된 프로브 및 프라이머 세트(예를 들어, TaqMan 프로브/프라이머 세트), 핵산 분자의 어레이/마이크로어레이, 및 하나 이상의 프로브, 프라이머, 또는 본 발명의 하나 이상의 SNP를 검출하기 위한 다른 검출하기 위한 다른 검출 시약을 함유하는 비드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 SNP 검출 키트 및 시스템을 제공한다. 키트/시스템은 다양한 전자 하드웨어 구성요소; 예를 들면, 다양한 제조업자가 하드웨어 구성요소를 전형적으로 포함하여 제공하는 어레이("DNA 칩") 및 미세유체 시스템("랩-온-어-칩" 시스템)을 추가로 포함할 수 있다.
다른 키트/시스템(예를 들어, 프로브/프라이머 세트)은 전자 하드웨어 구성요소를 포함하지 않을 수 있지만, 예를 들면, 하나 이상의 용기에 포장된 하나 이상의 SNP 검출 시약(선택적으로 다른 생화학 시약과 함께)을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, SNP 검출 키트는 하나 이상의 검출 시약 및 SNP-함유 핵산 분자의 증폭 및/또는 검출과 같은 분석 또는 반응을 수행하는데 필요한 다른 구성요소(예를 들어, 버퍼, DNA 중합효소 또는 리가아제와 같은 효소, 디옥시뉴클레오티드 트리포스파테이트와 같은 사슬 신장 뉴클레오티드, 및 생어-유형 DNA 서열분석 반응의 경우에서, 사슬 종결 뉴클레오티드, 양성 대조군 서열, 음성 대조군 서열)를 전형적으로 함유한다. 키트는 표적 핵산의 양을 결정하는 수단 및 표준과 양을 비교하는 수단을 추가로 함유할 수 있고, SNP-함유 관심 있는 핵산 분자를 검출하기 위한 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명에서 개시한 하나 이상의 SNP를 검출하기 위한 하나 이상의 분석을 수행하는데 필요한 시약을 함유하는 키트를 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, SNP 검출 키트/시스템은 핵산 어레이 또는 미세유체/랩-온-어-칩 시스템을 포함하는 구획화된 키트의 형태이다.
SNP 검출 키트/시스템은 핵산 분자에 또는 각 표적 SNP 위치 가까이에 혼성화하는 예를 들면, 하나 이상의 프로브, 또는 프로브의 쌍을 함유할 수 있다. 적어도 하나는 본 발명의 SNP인 다수의 SNP의 동시 분석을 위해 대립유전자-특이적 프로브의 다중 쌍을 키트/시스템에 포함할 수 있다. 어떤 키트/시스템에서, 대립유전자-특이적 프로브는 어레이 또는 비드와 같은 물질에 고정시킨다. 예를 들면, 동일한 물질은 적어도 1; 10; 100; 1000; 10,000; 100,000(또는 사이의 임의의 다른 수) 또는 실질적으로 표 1 및/또는 표 2에 나타낸 SNP 전부를 검출하기 위해 대립유전자-특이적 프로브를 포함할 수 있다.
용어 "어레이", "마이크로어레이", 및 "DNA 칩"은 유리, 플라스틱, 종이, 나일론 또는 막의 다른 유형, 필터, 칩, 또는 임의의 다른 적합한 고체 지지체과 같은 기질에 첨부한 개별 폴리뉴클레오티드의 어레이를 지칭하기 위해 본 발명에서 상호 교환적으로 사용하였다. 폴리뉴클레오티드는 기질위에서 직접 합성하거나, 기질과 분리하여 합성한 다음, 기질에 첨부할 수 있다. 마이크로어레이는 다수의 유일한, 보통 고체 지지체에 고정된 합성 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA의 단편 중 하나인 단일-사슬 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 어레이에 기반한 혼성화 분석은 완벽하게 매치되고 미스 매치된 표적 서열 변이체에 대한 프로브의 혼성화 안정성의 차이에 의존한다. SNP 유전자형 분석에 있어서, 혼성화 분석에서 사용한 긴축 조건은 다른 하나와 단일 SNP 위치를 구별할 수 있을 만큼 다른 이런 핵산 분자면 매우 충분하다(예를 들어, 고전적 SNP 혼성화 분석은 혼성화가 오직 하나의 특정 뉴클레오티드가 SNP 위치에 존재할 때만 일어날 것이고, 이 SNP 위치에 다른 뉴클레오티드가 존재하면 일어나지 않을 것으로 설계되었음). 이런 고도의 긴축 조건은 예를 들면 SNP 검출을 위한 대립유전자-특이적 핵산 어레이를 사용할 때 바람직할 수 있다.
다른 구체예에서, 어레이는 화학발광 검출 기술과 관련하여 사용한다.
본 발명의 SNP 검출 키트/시스템은 SNP-함유 핵산 분자의 이후의 증폭 및/또는 검출을 위해 시험 표본으로부터 핵산을 준비하는데 사용할 수 있는 구성요소를 포함할 수 있다. 이런 표본 준비 구성요소는 핵산(DNA 및/또는 RNA를 포함) 추출, 임의의 체액(혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 점액, 위액, 정액, 눈물, 땀, 등과 같은)으로부터 단백질 또는 막 추출, 피부, 체모, 세포(특히 핵이 있는 세포), 생검, 구강점막세포 또는 조직 표본을 생산하는데 사용할 수 있다. 상술된 방법에서 사용한 시험 표본은 분석 형식, 검출 방법의 특성, 및 분석할 시험 표본으로 사용한 특정 조직, 세포 또는 추출물과 같은 인자에 기반하여 다양할 것이다. 핵산, 단백질 및 세포 추출물을 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 사용할 시스템과 호환할 수 있는 표본을 얻는 것에 용이하게 적응할 것이다.
본 발명에 의해 고려된 키트의 다른 형태는 구획화된 키트이다. 구획화된 키트는 분리된 용기에 시약이 함유된 임의의 키트를 포함한다. 이런 용기는 예를 들면, 작은 유리 용기, 플라스틱 용기, 한 조각의 플라스틱, 유리 또는 종이 또는 실리카와 같은 어레이 물질을 포함한다. 이런 용기는 시험 표본 및 시약이 상호-오염되지 않게 한 구획에서 다른 구획으로 또는 하나의 용기에서 키트에 포함되지 않은 다른 도관으로 능률적으로 시약을 옮기게 하고, 및 각 용기의 제제 또는 용액을 한 구획으로부터 다른 구획 또는 다른 도관으로 정량적 방법으로 첨가할 수 있다. 이런 용기는 예를 들면, 시험 표본을 받을 하나 이상의 용기, 본 발명의 하나 이상의 SNP를 검출하기 위한 적어도 하나의 프로브 또는 다른 SNP 검출 시약을 함유하는 하나 이상의 용기, 세척 시약(인산염 버퍼 식염수, 트리스-버퍼, 등과 같은)을 함유하는 하나 이상의 용기, 및 결합한 프로브 또는 다른 SNP 검출 시약의 존재를 나타내는데 사용하는 시약을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 프라이머 신장 반응, 혼성화, 리게이션, 전기영동(바람직하게는 모세관 전기영동), 질량 분석기, 및/또는 레이저-유도 형광 검출과 같은 핵산 증폭 또는 다른 효소 반응을 위한 구획 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다.
또한 "랩-온-어-칩" 시스템, 생물의학 마이크로-기계 시스템(bioMEM), 또는 다중구성요소 집적 시스템으로도 지칭할 수 있는 미소유체 장치가 SNP를 분석하기 위한 본 발명의 대표적인 키트/시스템이다. 이런 시스템은 단일 기능 장치에 프로브/표적 혼성화, 핵산 증폭, 및 모세관 전기영동 반응과 같은 과정을 소형화 및 구획화한다. 이런 미소유체 장치는 전형적으로 시스템의 적어도 하나의 측면에서 검출 시약을 사용하고, 이런 검출 시약은 본 발명의 하나 이상의 SNP를 검출하는데 사용할 수 있다.
나아가, 키트는 또한 상술한 바의 하나 이상의 항원을 포함한다. 이와 같이, 의학 전문가는 환자로부터 SNP의 존재 또는 부재 여부를 우선 결정할 수 있다. 이후, 의학 전문가는 지시를 준비하거나, 어떤 항원, 얼마만큼의 투여량, 어떤 투여 방법에 의해 환자에게 줄 것인지를 찾는 것을 미리-결정된 지시 대신에 사용한다. 하나 이상의 항원을 키트와 함께 팔거나, 분리하여 팔 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 정보와 함께 본 출원에서 공개된 정보 공개를 감안할 때, 면역 관용을 생성할 수 있는 가능성 또는 곤란성과 상호 관련된 많은 SNP를 결정할 수 있다. 레폴리콘이 어디에 이들 SNP를 함유하거나 레플리콘이 유전체의 어디에서 그들과 가까이 연결될 때, 표본에서 PCR을 수행할 수 있다. 이런 기술은 특정 개체가 관용 유도 능력을 가질 가능성을 결정하는데 신속한 분석을 제공할 수 있다.
앞서 말한 것으로부터 유의한 이점을 갖는 발명을 제공하는 것이 명백할 것이다. 발명이 그의 형태의 극히 소수만을 나타내더라도, 이는 그대로 제한하려는 것이 아니며, 그의 정신을 위배하지 않고서 다양한 변화 및 변경에 대한 가능성이 있다.
본 명세서의 처음부터 끝까지, 본 발명의 다양한 측면이 정렬 형식으로 나타날 수 있다. 정렬 형식에서의 설명이 다만 편리하고 짧으며, 본 발명의 범주에 불변의 제한으로서 해석되지 않을 것임이 용인될 것이다. 따라서, 범위의 설명은 특이적으로 개시된 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 모든 개별 수치를 갖는 것으로 고려될 것이다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6 등뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6과 같은 특이적으로 개시된 하위범위를 갖는 것으로 고려될 것이다. 이는 범위의 폭에 개의치 않고 적용된다.
실시예 1: 류머티즘 관절염( RA ) 환자
그들의 RA에 대한 고전적 치료를 유지하는 120명의 RA 환자에서 50 μg/u의 정제된 소 콜라겐 II(CII)의 α1 사슬 또는 α1(II)인 자가 항원으로 6일 간 배양하였을 때, IFNγ를 생산하기 위한 그들의 말초 혈액 단핵구(PBMC)의 능력에 대하여 시험하였다. 배양 상청액을 회수하였고, ELISA에 의해 IFNγ 수준을 결정하였다.
Figure pct00001
. 아래에 나타낸바(표 1), 76명의 환자가 그들의 비자극된(PBS) 또는 배양된 PBMC가 2-배 넘게 증가하거나, CII에 대한 면역 반응이 있는 RA 환자("응답자"로 언급함)의 63%의 보급을 가졌다. CII 자가면역이 있는 RA 환자의 높은 보급이 있음에도 불구하고, 그것이 질병 중 몇 가지 가능한 항원 중 하나인 것이 명백하다.
CII *에 대한 배양 PBMC 에 의한 면역 반응이 있는 RA 환자의 백분율
환자 수 % 평균 IFN γ α1( II ) SI ± SEM
응답자 76 63 1494±313
비-응답자 44 37 20.6±6.5
전체 120 100 p=<0.001**
** 맨-휘트니 순위합 검정
실시예 2: DBA /1 Lac 마우스에서 관용을 유도하는 낮은 투여량의 콜라겐 II
12개의 마우스 그룹을 2주 동안 8 회 지시된 투여량의 CII를 경구로 공급하였고, CFA에서 100 mg의 소 CII로 면역화시켰다. 4일 간의 휴식 후에, 마우스를 완전 후룬즈 아주번트와 함께 유상화시킨 100 mg의 CII로 꼬리의 근저에 면역화시켰다. 관절염의 정도를 블라인드 관찰자에 의해 8 주 동안 평가하였다.
도 6에서 볼 수 있는 바, CII의 10 mg/일 경구 투여량은 관절염의 발생을 감소시키는데 가장 효과적이었고, 500 mg/일은 덜하지만 역시 효과적이었다. 3 또는 4 등급의 관절염인 마우스의 백분율은 X-축이 나타낸다. 이중상(象) 반응은 낮은 투여량 대 높은 투여량에 따른 다른 관용 기작의 유도에 기인한다. 높은 투여량(500 μg)이 면역성 결여 또는 클론 결실을 유도하는데 반해, 낮은 투여량 CII(10 μg)은 조절 T 세포를 유도한다.
실시예 3: DBA /1 마우스에서 콜라겐 II 에 대한 면역 관용의 유도의 NSAID 억제
DBA/1 마우스에서 경구로 먹인 소 CII에 대한 관용 유도가 경구로 공급한 NSAID에 의해 폐지되는지 여부를 결정하기 위하여, 20-22 마리의 DBA/1 마우스의 3 그룹을 하기 8회의 투여량(2 주 동안 월요일, 화요일, 목요일 및 금요일)으로 공급하였다(위관영양에 의해): 오전에 위약(식염수) 및 오후에 위약(0.1 M HAc); 오전에 위약(식염수) 및 오후에 10 μg의 천연 소 CII; 또는 오전에 피록시캄(2.4 μg/gm) 및 오후에 천연 소 CII(10 μg). 1주 후, 모든 마우스를 완전 후룬즈 아주번트와 함께 유상화시킨 100 μg의 소 CII로 면역화시켰다(꼬리의 기저에 피내주사). 동물을 암호화된 케이지에 두었고, 일주일에 두 번 블라인드 관찰자에 의해 관절염의 수에 대하여 점수를 매겼다(부은, 붉은 및/또는 변형된 관절).
도 7에서 나타낸바, 관찰 기간 동안 위약+위약 공급 대조군과 비교하여, 관절염의 백분율이 위약+CII 공급 마우스 그룹에서 적었다(코흐란-멘텔-헥젤 분석에서 p < 0.03). 대조적으로, 같은 관찰 기간 동안 피록시캄+CII 공급 마우스에서는 관절염이 유의하게 더 많았다. 유사한 연구에서, 본 발명자들은 나부마톤(Relafen)이 DBA/1 마우스에서 또한 OT(oral tolerance) 유도를 폐지한 것을 발견하였다(데이터 보여주지 않음).
실시예 4: 비장 세포에 의한 IFN γ 생산
도 7의 실험과 유사한 방법으로 비장 세포 IFNγ 생산에서 위약 또는 CII를 공급한 마우스의 다른 그룹에 대한 피록시캄의 경구 공급 효과를 평가하기 위하여, 마우스의 4 그룹(그룹 당 마우스 4 마리)을 2주에 걸쳐 8일간 하기와 같이 위관영양 공급하였다: 오전 피록시캄-오후 CII; 오전 피록시캄-오후 HAc; 오전 식염수-오후 CII; 또는 오전 식염수-오후 HAc. 1주 휴식 후, 모든 마우스는 CII-완전 후룬즈 아주번트 유제로 꼬리의 기저에 면역화시켰다. 14일 후, 마우스를 희생시켰고, 비장세포를 분리한 다음 PBS 또는 α1(II)CB 펩티드 혼합물과 배양하였다. 72 시간 배양 후, 회수한 상청액을 ELISA에 의해 IFNγ의 수준을 분석하였다.
CII+위약 또는 피록시캄+위약을 공급한 마우스는 그들의 비장 세포를 α1(II) CB 펩티드 혼합물과 시험관에서 배양하였을 때 IFNγ 생산이 감소되었다. 도 8을 참조하라. 한편, CII를 경구로 공급할 마우스에 피록시캄을 경구로 공급시켰을 때, α1(II)CB 펩티드 혼합물로 시험관에서 자극시킨 비장 세포에 의한 IFNγ 수준에서 극적인 증가가 있었다. 다른 실험에서, 비장세포에 의한 IFNγ 생산으로써 평가된 바, COX-2 억제자 SC'236이 또한 DBA/1 마우스에서 CII에 대한 경구 관용 유도를 막는다는 것을 발견하였다(데이터 보여주지 않음).
실시예 5: 경구 관용 유도를 억제하는 COX -2 억제자 SC'236
8개의 마우스 그룹 각각은 MTTHE×2 주, 오전에 PBS 또는 SC'236(100 ml PBS중 5 mg/gm)을 위관영양 공급하였다. SC'236(Searle)은 COX-1에 대한 것보다 COX-2를 ~2000배 더 억제한다.
오전에 PBS를 공급한 마우스 중 4마리 및 오전에 SC'236을 공급한 마우스 4 마리에게 10 mg의 소 II형 콜라겐(CII)을 오후에 위관영양 공급하였다. 오전 PBS 및 오전 SC'236 그룹에서 다른 마우스 4 마리에게 CII가 용해된 부형제인 0.1 M 아세트산(HAc)을 오후에 위관영양 공급하였다. 이런 8 일의 공급 후에, 모든 마우스를 1 주일 간 휴식시켰고, 이후 완전 후룬즈 아주번트에 있는 CII 100 mg으로 면역화시켰다. 10일 후, 모든 마우스를 희생시켰고, 비장 세포(2×106/ml)를 분리하여 PBS 및 소 α1(II)(50 μg/ml) CB 혼합물에서 배양하였다. 4 일의 배양 후에, 상청액을 회수하였고, IFNγ 수준을 ELISA(Endogen)로 결정하였다. 모든 마우스로부터 나온 PBS+비장 세포 배양은 1-12 pg/ml 사이로 IFNγ를 생산하였으므로, α1(II) 데이터만을 그래프화하였다. 모든 그룹은 스튜던트 2 표본 t 검정에 의해 위약 대조군과 비교하였다.
도 9에서 나타낸바, DBA/1 마우스에 CII를 공급하는 것은 α1(II) CB 소화에 의해 자극된 비장 세포에 의한 IFNγ의 유의한 감소로 명시된 경구 관용을 유도하였다(p < 0.025). 대조적으로, 주어진 경고는 마우스에 SC'236을 공급하는 것은 α1(II) CB 소화에 의한 낮은 IFNγ 생산을 야기하였으나, 마우스에게 SC'236+CII를 공급하였을 때, α1(II) CB 소화와 함께 배양된 비장 세포에 의한 IFNγ 생산이 유의하게 증가하였다(p <0.01). SC'236이 또한 COS-1을 억제할 수 있으나, 그것이 COS-2를 억제하는 것보다 ~2000배 적은 정도라는 주어진 경고는, 이들 데이터가 COX-2가 낮은 투여량의 경구 항원에 대한 최적 관용 유도에 중요할 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 경구 관용에서 지속되는 NSAID 효과
CII와 함께 피록시캄을 만성적으로 투여하는 것이 DBA/1 마우스에서 CII에 대한 관용 유도에 지속적인 효과를 가질 것인지 여부를 결정하기 위하여, 10-11 마리의 DBA/1 마우스 3 그룹을 6개월의 분리된 두 번의 기회에 2주 동안(위와 같이) 8번의 CII 투여량을 공급하였다: 오전에 피록시캄(2.4 μg/gm) 및 오후에 위약(0.1M HAc, 100 μl); 오전에 위약(식염수) 및 오후에 천연 소 CII(10 μg); 또는 오전에 피록시캄(2.4 μg/gm) 및 오후에 천연 소 CII(10 μg). 두 번째로 8번의 투여량을 공급하고 3개월 후, 각 마우스를 완전 후룬즈 아주번트에 있는, 유제화시킨 천연 소 CII 100 μg으로 면역화시켰다(꼬리의 기저에 피내주사). 마우스를 암호화된 케이지에 두었고, 블라인드 관찰자에 의해 관절염의 수에 대하여 일주일에 두 번 점수를 매겼다. 도 10에 나타낸바, CII로 면역화시킨지 7 및 8주째에 9 및 3 개월 전 피록시캄에 CII를 더하여 공급한 마우스 그룹이 위약에 CII를 더하여 공급한 마우스 그룹과 비교하여, 유의하게 높은 관절염을 가졌다(카이 스퀘어 분석에서 p < 0.04).
실시예 7: CII 를 더한 피록시캄을 공급한 마우스의 GALT
이들 세 그룹의 마우스에서 GALT의 상태를 평가하기 위하여, 파이어스 패치 세포를 각 동물에서 분리하였고, 재조합 쥣과 IL2(10 U/ml)를 첨가한 정상 DBA/1 비장 세포(2×106/ml)와 공동-배양을 4배의 세트로 수행하였다(2.5×105/ml). PBS(대조군으로서) 또는 50 μg/ml 소 α1(II) CB 펩티드 혼합물을 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 4배수의 웰에 첨가하였다. 3일 후, 배양에 3H 티미딘으로 펄스를 주었고, 24 시간 후 종이 필터로 회수하였다. 각 마우스에 대한 PBS 대조군 배양의 cpm으로 α1(II) CB 펩티드 혼합물 배양의 cpm을 나누어 각 마우스에 대한 "자극 지표"를 계산하였다. 도 11에 나타낸바, CII 단독 또는 피록시캄 단독으로 처치한 마우스로부터 얻은 파이어스 패치 세포(2.5×105/ml)의 공동-배양과 비교하여, CII를 더한 피록시캄을 공급한 마우스로부터 얻은 세포의 α1(II) CB 펩티드 혼합물(p < 0.03)에 의한 자극이 두드러졌다. 게다가, 본 발명자들은 쥣과 IL-2로 자극시켰을 때, 정상 선천성 비장 세포(2×106/ml)와의 공동-배양에서 DBA/1 마우스 또는 Balb/c 마우스로부터 파이어스 패치 세포(2.5×105/ml)에서 기저수준의 cpm을 넘는 비장세포의 자극을 유발하지 않는 것을 지속적으로 발견하였다. 따라서, α1(II) CB 펩티드 혼합물이 존재할 때 DBA/1 비장 세포와의 파이어스 패치 세포의 자극 지표에서 두드러진 증가는 꽤 이례적이고 예기치 않은 것이다. α1(II) CB 펩티드 혼합물과의 각 마우스에서 나온 장간막 림프절 세포(2×106/ml)의 배양이 유사한 패턴으로 나타났다(도 12). CII 또는 피록시캄 중 하나를 공급한 마우스로부터 나온 장간막 림프절 세포는 α1(II) CB 펩티드 혼합물에 대한 반응에서 증식하지 않았다. 대조적으로 CII를 더한 피록시캄을 공급한 마우스에서 나온 장간막 림프절 세포는 α1(II) CB 펩티드 혼합물에 의한 자극이 두드러졌다(도 12).
나아가, 면역 유도에서 공통적으로 사용한 면역조절 약물의 효과를 시험하기 위하여 BALB/c 마우스에서 경구 OVA(1 mg/일×5 일) 및 DBA/1 lac J 마우스에서 소 CII의 경구 투여(14일 동안 10 μg×8 투여량)를 사용하여 연구를 수행하였다(100 mg/일×3 투여량 로딩 후 프레드니손≤7.5 mg/일, 파이드록시클로로퀸 400 mg/일, 메토트렉사트 17.5 mg/주, 레플루노미드 20 mg/일, 일주일에 두 번 설프아자라진 2.5 gm/일, D-페니실라민 750 mg/일, IM 금, 및 에타네르셉트 25 mg). 이들 면역조절 약물은 관용을 완전히 억제시키지 않았고, 이는 이들 면역조절 약물을 복용하는 CII에 대한 RA 환자의 관용을 유도하는데 여전히 알맞을 수 있다. DBA/1 lac J 마우스에서와 동일한 프레드니손≥10 mg/일 및 오라노핀은 CII에 대한 OT 유도를 막았다.
실시예 9: RA 가 있는 환자에서 자가면역을 감소시키는 콜라겐 II 의 경구 투여
II형 콜라겐의 α1(II)와 배양된 PBMC에 의한 IFN-γ 생산의 30% 이상의 감소로서 정의되는, 면역학적 관용을 환자에서 시험하였다. 질병-변형 항류마티스 약물, 항-TNF 제제를 복용 및/또는 비스테로이드성 염증을 갖는 환자는 경구 관용의 비스테로이드성 항염증 억제를 역전시키게 하는 100 μg의 미소프로스톨을 투여하였다. 환자는 CII의 "낮은" 또는 "높은" 투여량을 받기 위해 무작위 추출하였다. 낮은 투여량 그룹(n=38)은 10 주간 소 CII를 매일 30 μg/일, 이후 10 주간 50 μg/일 및 이후 10 주간 70 μg/일로 받았다. 높은 투여량 그룹(n=41)은 10 주간 90 μg/일, 10 주간 110 μg/일 및 이후 10 주간 130 μg/일로 받았다.
헤파린을 처치한 혈액을 각각의 10 주 치료 기간 후에 베이스라인에서 얻었다. 혈액을 수집 후 1-4 시간 내에 페니실린(100 u/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)을 함유하는 RPMI 1640에 1:3으로 희석하였고, 종이로 봉하였고, "차가운 팩"을 함유하는 스티로폼 박스에 두고 밤새 보관하였다. PBMC를 혈액 표본으로부터 분리하였고, 소 α1(II) 25 μg/ml, PHA 10 μg/ml 또는 50 ㎕ PBS와 함께 배양하였다. 배양한지 6일 후, 무세포 상청액을 회수하였고, 주어진 환자로부터의 모든 표본에서 시판하는 ELISA(R & D Systems)에 의해 IFNγ에 대하여 분석한 시간인 최대 7개월 까지 -70℃에서 보관하였다. 결과를 도 13에서와 같이 나타내었다.
IFNγ 자극 지표(SI)는
Figure pct00002
로서 계산하였다. 높은 투여량 CII 그룹(90 μg, 110 μg 및 130 μg/일)에서 그들의 SI와 각각의 10 주 치료 전에 베이스라인과 유사하게, 각각의 낮은 투여량(30 μg, 50 μg 및 70 μg/일)을 받은 환자에 대한 SI는 각각의 10 주 치료 전에 베이스라인에서의 그들의 SI와 비교하였다.
IFNγ SI의 두드러진 억제가 있었다. 30 μg, 50 μg, 110 μg 및 130 μg/일 경구 CII로 10 주 동안 치료한 후, 환자의 62 내지 69% 이상이 α1(II) IFNγ SI에서 50% 감소를 나타내었다. 70 μg 및 90 μg/일 투여량에서는 IFNγ SI이 감소하지 않았고, 70 μg/일 투여량에서는 베이스라인 값과 비교하여 IFNγ SI이 유의하게 증가하였다.
나아가, 데이터는, 공급한 항원(CII)에 대한 감소된 면역 반응으로서 정의된, 낮은 투여량의 미소프로스톨을 주었을 때, 환자가 DMARD, 항-TNF-제제 및 NSAIDS를 투여하는 동안 유도할 수 있는 CII에 대한 경구 관용을 보여주었다. 30 μg 및 50 μg/일의 투여량은 더 많은 범주에서 더 큰 감소를 가졌다.
투여량 반응은 경구 CII의 30 μg, 50 μg 및 110 μg/일에서 IFNγ 생산의 최대 억제를 나타내었다. α1(II)-자극 PBMC에 의한 IFNγ의 생산에서 50% 이상의 감소를 갖는 환자의 백분율에 대하여, 대부분의 환자는 이들 투여량에서 관용화시킬 수 있다(경구 투여한 CII에 대하여 α1(II) 자극된 IFNγ 생산에서 50% 이상의 감소를 갖는 69%).
환자의 나아간 분석은 CII의 30-50 μg/일 투여량에 대한 경구 CII에 대한 30%의 비-응답자 및 110-130 μg/일 투여량에 대한 28%의 비-응답자를 나타내었다(도 13).
실시예 10: 경구 CII 관용은 반응 및 반응 없음과 관련된다.
이 집단에서 임의의 특정 유전자형이 경구 CII에 대한 반응 또는 반응 없음과 관련되어 있는지 여부를 조사하기 위하여 실시예 9에서 24명의 환자를 선별하였다.
PBC 대조군 PBMC 배양과 비교하여 자극된 α1(II)에 의한 IFNγ 생산이 2배 이상인 RA 환자에게 소 CII를 경구로 투여하기 전에 환자로부터 혈액을 얻었다. 페니실린(100 μg/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 9% 태아 소 혈청으로 보충한 둘베코 MEM의 500 μl당 2×106 48웰 조직 배양 플레이트에서 배양하기 위하여 분리물(10 μg/mL), 소 α1(II)(50 μg/mL), 소 α1(II) CB11(50 μg/mL) 또는 25 μl의 PBS를 첨가하였다. 6일 후, 상청액을 회수하였고, 2000×G에서 5분 동안 원심 분리하였고, 시판되는 ELISA(R & D Systems)에 의해 IFNγ의 수준을 정량하였다. 응답자 및 비-응답자 사이에서 IFNγ 수준에서 및 PHA, α1(II) 및 α1(II)에 대한 SI에서의 차이를 맨-휘트니 순위합 검정을 사용하여 유의성에 대하여 분석하였다.
24명의 환자 중에서, 16명의 환자는 PBMC 배양에 의한 α1(II) 및 α1(II) CB11 자극 IFNγ 생산이 감소하여 경구 CII에 대하여 반응하였고, 8명의 환자는 이들 항원에서 PBMC 배양에 의한 IFNγ가 감소하지 않았다. 6일의 PBMC 배양에서 PBS, α1(II) 50 μg/ml α1(II) CB11 50 μg/ml 및 PHA 10 μg/ml에 대한 16명의 응답자 및 8명의 비-응답자의 베이스라인 IFNγ 수준을 표 2에 작성하였다.
IFNγ 자극 지표(S.I.)는 하기와 같이 계산하였다: PHA에 대하여:
Figure pct00003
; α1(II)에 대하여:
Figure pct00004
; α1(II) CB11에 대하여:
Figure pct00005
.
표 2에 나타낸바, CII 경구 관용 비-응답자는 CII 경구 관용 응답자보다 낮은 평균 베이스라인 IFNγ α1(II) S.I.를 가졌다(190±40 vs 1800±520, p=0.002). CII 경구 관용 비-응답자는 CII 경구 관용 응답자보다 낮은 평균 베이스라인 IFNγ α1(II) CB 11 S.I.를 가졌다(1060±197 vs 210±90, p=0.003). 베이스라인에서의 IFNγ PHA S.I.는 CII 경구 관용 응답자 및 비-응답자 사이에 차이가 없었다.
CII OT 응답자 및 비-응답자 사이의 베이스라인에서의 IFN γ 생산의 비교
CII OT 응답자(N=16) CII OT 비-응답자(N=8)
배양 첨가물 IFN γ PG / mL IFN γ S.I. IFN γ PG / mL IFN γ S.I.
PBS 142±41 -------- 203±159(p=0.395) --------
α1(II) 1774±501 1800±520 581±183(p=0.150) 190±40(p=0.002)
α1(II) CB11 1391±295 1060±197 523±167(p=0.06) 210±90= 0.003)
PHA 6979±2291 6400±3100 3150±1278(p=0.520) 4200±3200(p=0.349)
실시예 11: RA 환자의 유전자형의 분석에 대한 정확한 데이터를 생산하는 마이크로어레이 평가.
경구 관용 유도에 중요한 것으로 알려진 몇몇의 사이토카인 및 케모카인 옆의 염색체와 가까이 관련된 SNP의 빈도를 찾기 위해 16명의 응답자 및 8명의 비-응답자의 것에서 경구 CII에 대한 SNP 분석을 수행하였다. 16명의 환자는 30 μg/일, 50 μg/일, 110 μg/일 또는 130 μg/일 투여량 각각에 대한 베이스라인으로부터 IFNγ α1 자극 지표에서 50% 이상의 감소를 갖는 이들이다("OT 응답자"). 경구 CII의 30 μg/일, 50 μg/일, 110 μg/일 또는 130 μg/일 투여량에서 IFNγ α1S.I에서 증가한 8명의 환자를 선별하였다("OT 비-응답자").
시판되는 전체 유전체 매핑 칩을 시기적절하고 경제적인 방법으로 잠재적인 유전자 위치를 매핑하는데 사용하였다. 실시예 2의 두 그룹의 유전체를 시판되는 DNA 추출 키트인, Qiagen 키트(Qiagen Inc., Alameda, CA)를 사용하여 제조사의 지침서에 따른 DNA 추출에 의해 분석하였다. Eppendorf 광도계(Eppendorf Scientific Inc., Westbury, NY)에서, 그리고, 전기영동에 의해서 DNA의 질 및 양을 결정한 후에, OD260/280 비가 1 이상의 비율 및 높은 안정성의 DNA를 유전자형 분석에 사용하였다. 각 표본에 대하여 DNA의 250 ng을 Affy GeneChip® Mapping 10K 2.0 어레이, SNP-기반 유전자 매핑 도구를 사용한 유전자형 분석에 사용하였다. 10K 2.0 어레이는 단일 어레이에서 10,000개의 인간 단일 염기 다형성(SNP)보다 많은 유전자형을 함유한다. 도구는 특정 형질 또는 표현형, 이 경우에서, CII 경구 관용 저항과 연결되거나 관련된 유전체의 영역을 확인하는데 사용할 수 있다.
프로토콜은 네 개의 주요한 절차를 포함한다: 인 실리코 분류, 마이크로어레이 위에 미리 결정된 단편의 합성, 생화학 분류 및 대립유전자 특이적 혼성화 및 유전자형을 판정하는 단계. 10,000개의 단일 뉴클레오티드의 두 개 플로몰피즘 각각에 나타나는 두 개의 다른 신호가 생성된다. 소프트웨어가 모든 10.000개의 단일 뉴클레오티드의 다형성 또는 유전자형을 생성한다. 모든 표본의 10,000개 SNP의 각각의 다형성의 유전자형은 표 3에서 나타낸바, 동형접합체 유형 I, AA; 동형접합체 II형, BB; 및 이형접합체, AB의 세 유형으로 판정하였다.
15명의 환자의 유전자형 분석
환자 # 판정된 성별 SNP 판정 신호 검출 AA 판정 AB 판정 BB 판정
001-101 M 94.41% 99.67% 33.27% 32.90% 33.83%
023-117re M 93.70% 99.59% 33.54% 32.89% 33.56%
046-123 F 78.89% 99.25% 32.53% 35.37% 32.10%
073-127 M 93.57% 99.40% 34.21% 31.30% 34.49%
090-323 F 95.87% 99.89% 32.21% 33.99% 33.80%
095--325 F 94.57% 99.05% 32.66% 33.82% 33.51%
109-319 F 85.35% 97.53% 34.89% 30.66% 34.45%
121-329 M 93.44% 99.55% 33.70% 32.28% 34.02%
127-137 M 93.82% 99.57% 33.35% 33.30% 33.34%
142-343 M 94.93% 99.80% 34.12% 31.86% 34.02%
143-339 M 96.28% 99.92% 32.76% 34.00% 33.25%
146-139 M 92.07% 99.05% 33.45% 32.09% 34.45%
148-341 F 91.31% 99.18% 33.38% 33.21% 33.41%
154-347 F 96.89% 99.95% 33.06% 34.18% 32.76%
표 3은 15명의 환자의 유전자형 분석이다(남성 9명, 여성 6명). 검출의 높은 질을 가리키는 대부분의 표본에서 검출가능한 단일 SNP가 99% 이상이었다. SNP 판정은 SNP의 10,000개 중 인식할 수 있는 것의 백분율 및 어떤 데이터가 주어졌는지를 가리킨다. 이들 표본에서 SNP의 90% 이상을 실험에서 검출하였다. 세 가지 유전자형, AA, AB, 및 BB의 분포는 그들 각각에 대하여 대략 1/3(33%)이었다.
실시예 12: SNP A-1515737 및 경구 CII 응답자 및 비- 응답자사이의 관련.
CII 치료에 대한 비-관용적 반응과 연결된 가능성 있는 다형성을 찾기 위하여, 실시예 3의 환자의 유전자형을 경구 CII 응답자 및 비-응답자 그룹으로 분류하였다. 각 그룹에 대하여, 세 유전자형, AA, AB, 및 BB의 세 유전자형의 전체 숫자를 칩상에서 각 SNP에 대하여 계산하였다. 표 4는 이들 후보 유전자의 각각에서 SNP의 유전자형 비율을 나타낸다.
후보 유전자의 다형성.
후보 유전자 명칭 서열번호 AA - AB - BB (응답자/비-응답자)
TGF 베타 1,2 3 SNP_A-1511117 3--46/3--2--4
SNP_A-1515879 8--60/9--1--0
ICOS SNP_A-1509114 3--45/0--8--2
SNP_A-1509255 6--71/2--6--2
SNP_A-1513931 1310/9--1--0
SNP_A-1515899 0--014/0--0--10
SNP_A-1519289 2--17/2--4--4
IL -4R SNP_A-1509275 3--91/7--3--0
IL -10R SNP_A-1518241 2--37/4--3--2
CCL2 SNP_A-1514598 1--58/3--4--3
IFN 감마 SNP_A-1508498 8--51/8--2--0
SNP_A-1512645 311-2/0--4--4
SNP_A-1512719 2102/5--5--0
SNP_A-1515330 3--92/5--4--0
SNP_A-1515737 1--96/6--1--1
SNP_A-1518829 2104/0--2--6
SNP_A-1518878 3101/7--2--1
글루탐산 탈탄소효소 SNP_A-1513856 1400/10--00
SNP_A-1509772 2--84/1--63
IL -1 ra SNP_A-1511280 2--57/0--3--7
표 4에서 나타낸바, 8개 후보 유전자의 20개 SNP에서 응답자 및 비-응답자 사이에서 대부분의 유전자형 패턴은 같거나 유사하다. 글루탐산 탈탄소효소의 첫 번째 SNP의 패턴은 14-0-0(AA-AB-BB에 대하여) 및 10-0-0이고; 두 번째 SNP는 2-8-4 및 1-6-3이다. 그러나 반응 및 비-반응 그룹 사이에서, 응답자 및 비-응답자에 대하여 각각 1-9-6 및 6-1-1이 되는, SNP_A-1515737의 유전자형 분포에서 큰 차이가 있었다. 반응 환자의 대부분이 이형접합체(따라서, AG) 또는 BB의 동형접합체(따라서, GG 유전자형)를 가지는데 반해, 비-반응 그룹의 환자의 과반수는 AA 유전자형을 가졌다. 분석은 나아가 SNP_A-1515737에 초점을 맞췄다.
SNP_A-1515737의 서열은 하기와 같다: TTTTTTTTTTGTACCT[A/G]GTTCTATGGTTACCTT(서열번호 1 및 2). A/G는 다형성 부위이다. 따라서, AB는 A/G 이형접합체를 나타내고, BB는 GG 유전자형을 나타내고, A→G는 다형성 부위를 나타낼 때, AA는 AA 동형접합체를 나타낸다.
실시예 13: CII 경구 관용 응답자 및 비-응답자 환자 중에서 SNP _A-1515737의 분포
응답자 및 비-응답자의 유전자형 패턴을 비교하였고, 유전자형 분포에서 유의한 차이를 찾았다. 도 14를 참조하라. P값을 계산하기 위해, 수를 세 가지 유전자형에 대하여 배정하였다. AA 유전자형은 1로 배정하였고, AB(따라서, AG)는 2로 배정하였고, 그리고 BB(따라서 GG 유전자형)는 3으로 배정하였다. 이들 배정에 따라서, SNP A-1515737의 P값은 0.052가 되었다.
24명의 환자를 SNP A-1515737의 AA 유전자형(또는 A→G)을 갖는 이들 및 AA 유전자형을 갖지 않는 이들(즉 AB 또는 BB임)로 그룹화시켰다. 표 5 및 표 6은 두 그룹에 기반하여 데이터를 요약한다. 표 5는 PHA, α1(II), α1(II) CB11 또는 첨가 없음(PBS)으로 6일 동안 자극시킨 PBMC의 상청액에서 6일 째의 베이스라인 IFNγ 수준을 나열한다. SNP A-1515737 AA인 환자(평균 270±90)는 세 개의 SNP A-1515737 AA(평균 1674±505, p=0.028 by 맨-휘트니 순위합 검정)를 갖지 않는 환자와 비교하여 유의하게 낮은 IFNγ α1(II) S.I.값을 가졌다. SNP A-1515737 AA인 7명의 환자 중 오직 한명이 CII 경구 관용 반응을 가졌고, SNP A-1515737 GG를 갖는 17명의 환자 중에서 단지 2명 이상이 CII 경구 관용 응답자가 아니었다.
6 일 PBMC 배양 상청액에서 베이스라인 IFNγ(PG/ML)
비 SNP A-1515737 AA 유전자형
환자 # 유전자형 PHA PHA SI Α1(II) α1(II) SI α1(II) CB11 α1(II) CB11 SI PBS OT 응답자
073-127 BB 16278 2533 3937 6052 4574 7047 234 있음
001-101 AB 486 817 1348 2443 292 451 53 있음
023-117 AB 14638 47119 256 726 389 1155 31 있음
039-303 AB 446 1012 98.5 146 51 27 40.1 없음
046-123 BB 7679 1474 1474 203 486 -0.4 488 없음
090-323 BB 1163 2054 1483 2646 1451 2587 54 있음
109-319 BB 4444 11443 61 58 123 219 38.5 있음
121-329 AB 6983 3017 1728 671 2243 901 224 있음
127-137 BB 618 301 505 228 500 225 154 있음
143-339 AB 1056 1752 4188 7247 1273 2133 57 있음
142-343 AB 189 133 325 301 383 373 81 있음
148-341 BB 23427 8876 1019 290 1523 484 261 있음
146-139 AB 1431 3821 630 1626 1271 3382 36.5 있음
154-347 AB 3774 6521 284 398 843 1379 57 있음
072-128 BB 2755 300 7688 1017 2205 220 688 있음
113-332 AB 245 113 2641 2197 1865 1522 115 있음
040-302 AB 29527 64089 1058 2200 433 841 46 있음
6723±2165 9140±4373 1690±481 1674±505 1171±274 1350±425 146±94
SNP A-1515737 AA 유전자형
환자 # 유전자형 PHA PHA SI α1(II) α1(II) SI α1(II) CB11 α1(II) CB11 SI PBS OT 응답자
097-320 AA 273 82 1208 265 1268 280 331 없음
050-308 AA 707 1314 90 80 120 140 50 없음
058-309 AA 2093 776 455 90 294 23 239 없음
061-311 AA 3173 1256 671 187 1240 430 234 없음
095-325 AA 1744 1103 1228 747 2894 1896 145 있음
155-348 AA 1050 405 461 122 428 106 208 없음
014-109 AA 9777 26686 182 399 293 703 36.5 없음
2688±1236 4517±3699 614±172 270±90 934±371 511±247 245±40
p=0.546 p=0.240 p=0.172 p=0.028 p=0.391 p=0.153 p=0.070
표 6에서, 동일한 환자를 배열하였고, 베이스라인 및 경구 CII 투여 후(10 주 동안 30 μg, 50 μg 또는 110 μg/일)에서의 그들의 IFNγ α1(II) S.I.를 비교하였다. 표 6에서 나타낸바, SNP A-1515737 AA(ROT1 AA) 유전자형이 없는 환자는 베이스라인 값과 비교하여 경구 CII 이후 IFNγ α1(II) S.I.에서 유의한 감소가 있었다(윌콕슨 순위합 검정에 의해 p < 0.001). 대조적으로, SNP A-1515737 AA를 가진 환자는 경구 CII 치료 후에 IFNγ α1(II) S.I.에서 유의한 변화가 없었다(윌콕슨 순위합 검정에 의해 p=0.230). 데이터가 경구 CII 이후/베이스라인의 IFNγ α1(II) S.I.의 비율로서 나타났을 때에도, 이는 또한 반영되었다(p=0.011).
RA 환자에서 경구 CII 후 α1( II ) SI 감소
비 SNP A-1515737 AA 유전자형
환자 # 유전자형 α1( II ) SI 베이스라인 경구 CII 이후 OT 응답자 비율: 이후/베이스라인
073-127 BB 6065 18 있음 0.0030
001-101 AB 2443 246 있음 0.1008
023-117 AB 726 360 있음 0.4932
039-303 AB 146 280 없음 1.9178
046-123 BB 203 590 없음 2.9064
090-323 BB 2646 152 있음 0.0573
109-319 BB 58 6 있음 0.1034
121-329 AB 671 276 있음 0.4119
127-137 BB 228 18 있음 0.0789
143-339 AB 7247 503 있음 0.0694
142-343 AB 301 19 있음 0.0631
148-341 BB 290 0 있음 0
146-139 AB 1626 3 있음 0.0018
154-347 AB 398 7 있음 0.0176
072-128 BB 1017 358 있음 0.3520
113-332 AB 2197 93 있음 0.0423
040-302 AB 2200 540 있음 0.2454
2081±505 175±46 0.427±0.217 p=0.011
p ≤ 0.001
SNP A-1515737 AA 유전자형
환자 # 유전자형 α1( II ) SI 베이스라인 경구 CII 이후 OT 응답자 비율: 이후/베이스라인
097-320 AA 265 630 없음 2.3774
050-308 AA 80 404 없음 5.0500
058-309 AA 90 268 없음 2.9778
061-311 AA 187 2020 없음 10.8021
095-325 AA 747 3 있음 0.0040
155-348 AA 122 167 없음 1.3688
014-109 AA 399 800 없음 2.0050
270±90 613±256 3.512±1.347
p=0.230
데이터를 피셔의 정확 검정으로 카이 스퀘어를 사용함으로써 분석하였고, SNP A-1515737 AA 유전자형이 있는 환자 및 이 유전자형이 없는 환자에서 경구 CII 응답자 및 비-응답자 사이에서 매우 유의한 차이(p=0.0017)가 있었다(표 7).
실시예 14: 응답자 및 비-응답자 SNP 사이의 차이
A-1515737과 가까운 거리 내에 있는 다른 SNP의 유전자형 패턴을 또한 시험하였다. 게다가 A-1515737에 대하여, 같은 유전체 영역 내에서 6개의 다른 SNP가 있다. 그들 중 무엇도 CII 치료에 대하여 반응 또는 비-반응과 유의한 관련을 갖지 않았다. 예를 들면, DYRK2의 5' 쪽에서 146068 bp 및 IFNγ의 3' 쪽에서 350588 bp인 SNP A-1508498은 DYRK2의 5' 쪽에서 265143 bp 및 IFNγ의 3' 쪽에서 231513 bp인 A-1515737과 매우 가까이 위치한다. 응답자 및 비-응답자의 유전자형 패턴은 각각 8--5--1 및 8--2--0의 AA, AB, 및 BB로 유사하다.
각 염색체에 따라 10개 SNP의 분리된 패턴의 평균을 실험하였으나, CII 반응과 임의의 분리된 패턴의 관련된 증거는 없었다.
비-반응 조직 적합성 복합체(HLA 클래스 II 조직 적합성)와 관련된 8개의 SNP를 시험하였으나, CII 반응과 분리된 밴드의 관련의 증거는 없었다.
실시예 15: SNP A-1515737 및 다른 자가면역 질환에서 경구 관용 저항에 대한 연계
12달 동안 500 μg/일 CI를 투여한 미만성 전신성 경화(SSc) 환자에서 경구 유형 I 콜라겐(CI)의 시험에서 26명의 환자에서 얻은 표본을 수집하였다. 26명 중 6명이 A-1515737 AA 유전자형을 가졌다(표 7). DMARD, 생물학, NSAID 또는 프레드니손에 있는 환자는 없었다.
PBMC를 환자로부터 수집하였고, 천연 소 CI 및 α2(I) CB 혼합물과 배양하였고, IL-10 생산에 결함이 있는 경향의 PBMC를 α1(I) CB 혼합물과 배양하였다.
경구 CI에 의해 관용화시킨 환자는 CI, 또는 α1(I) 또는 α2(I)로 자극된 PBMC에 의해, Th2 사이토카인, IL-10의 상향조절을 가졌다. 표 7에서 나타낸바, ROT1AA 유전자형인 SSc 환자는 경구 CI로 12개월간 치료한 후 α2(I) 또는 CI로 자극된 PBMC에 의한 IL-10 생산이 상향조절되지 않았다. SNP A-1515737은 또한 53명의 추가적인 SSc 환자에서 시험하였고, AA는 32%, 35%는 GG 및 30%는 GA의 전반적 보급을 찾았다. RA 환자에서와 같이, AA인 SSc 환자는 α2(I)-자극 PBMC에 의한 IFNγ 생산의 낮은 상향조절을 나타냈다(표 7 및 8).
SNP A-1515737 AA 유전자형 vs 비 SNP A-1515737 AA 유전자형의 카이 스퀘어
AA 비- AA
CII OT 비-응답자 7 2
CII OT 응답자 1 15
SSc 환자로부터 Hα1(I)-자극 PBMC 에 의한 베이스라인에서의 IFN γ 생산
환자의 수 IFN γ pg / ml
ROT1AA+ 25 16±134
ROT1GG 또는 GA 54 3146±2574
맨 휘트니 순위합 검정 p=0.036
*제 2상 CI/SSc 연구에 등록된 환자의 PBMC를 25 μg/ml의 인간 α1(I)과 6일동안 배양한 후, 배양 상청액을 회수하였고, ELISA로 IFNγ 수준을 결정하였다.
실시예 16: 경구 CI 12개월 및 RPT1 AA 가 있거나 없는 SSc 환자에 대한 12개월 후 IL -10 생산
ROT1 AA, GG 또는 GA 유전자형을 갖는 환자는 SSc 환자에게 경구 CI를 투여하기 전에 베이스라인에서 동일한 항원으로 자극시킨 PBMC 배양의 상청액에서 IL-10의 값을 뺀, 12달 동안 경구 CI를 받은 후 α1(I) CB 혼합물, α2(I) CB 혼합물, 또는 천연 CI에 의해 자극된 IL-PBMC 배양의 측정된 IL-10을 가졌다.
500 ㎍/일의 경구 소 CI를 12개월간 받은 ROT1 AA 유전자형인 환자는 천연 소 CI 및 α2(I) CB 혼합물과 배양하였을 때, 그들의 PBMC에 의한 IL-10 생산의 상향조절이 결핍되었고, α1(I) CB 혼합물과 배양한 PBMC의 IL-10 생산의 결핍에 대한 경향이 있었는데, 이는 ROT1 AA는 단백질 항원에 대한 약화된 경구 관용과 관련된 것을 설명하고 있다. 표 9를 참조하라.
경구 CI 의 12개월 및 ROT1AA 가 있거나 없는 경화 환자에 대한 12개월 후 IL -10 생산*
유전자형 AA
환자 # 		소 α1(I) CB 혼합
IL -10 pg / ml 		소 α2(I) CB 혼합
IL -10 pg / ml 		소 천연 CI
IL -10 pg / ml
071109 -342 -1692 -1726
130403 -19 +28 +70
061009 -611 -494 -920
060507 -112 +490 -233
060403 -2942 -3736 -1886
040104 +295 -448 -253
-622±480 -975±627 -825±338
유전자형 GG 또는 GA
환자 # 		소 α1(I) CB 혼합
IL -10 pg / ml 		소 α2(I) CB 혼합
IL -10 pg / ml 		소 천연 CI
IL -10 pg / ml
020705 -314 -388 -135
030504 +410 +203 +566
070101 -104 -86 -334
080101 -391 -180 +192
011008 +529 +859 +103
021308 +216 +546 +386
040806 -968 -1000 -1564
020906 +347 +261 +233
021411 -397 -2021 +21
041308 +1364 +1460 +237
072317 +108 +145 +150
061211 -205 -113 -94
072014 -81 +141 +32
090605 -561 -509 -282
091310 +582 +5 +232
030103 -46 +381 +192
030201 -538 +252 -52
050303 -227 -115 +43
072418 +663 -415 +269
080403 +221 +141 +341
맨 휘트니 30±119 22±156 27±97
순위합 검정 p=0.062 p=0.039 p=0.008
피셔의 정확 검정 NS NS p=0.014
실시예 17: 크론병을 앓는 환자 및 가족에서 ROT1 유전자형
본 발명자들은 크론병 및/또는 궤양성 대장염인 환자 또는 가족, 및 IBD 또는 다른 알려진 자가면역 질환이 없는 건강한 대조군에서 SNP A-1515737(ROT1) 유전자형을 평가하였다. 표 10은 크론병이 있는 환자에 대하여 ROT1 AA 분포가 91.67%임을 보여주는, 구강 상피세포로부터 나온 DNA를 사용하여 크론병에서의 유전자형 결과를 요약한다.
명확한 크론병을 앓는 환자에서 ROT1 유전자형의 분포
ROT1 유전자형 전체 (%)
AA 8
AG 0
GG 0
크론병 또는 크론병에 궤양성 대장염까지 앓는 환자의 일차친족에서 ROT1 유전자형의 분포
ROT1 유전자형 전체 (%)
AA* 9
AG 0
GG 0
* 친족은 CD 또는 CD 및 UC를 갖는다.
유전자형 분석한 크론병 환자 및 그의 일차 친족 전체 중에서, 91.67%가 ROT1AA를 가졌다. 이 증거는 ROT1AA가 크론병에서 경구 관용 저항과 관련된다는 것이다.
12명의 크론병 환자 및 일차친족(91.6%)에서 ROT1AA의 분포가 79명의 SSc 환자(31.6%), 54명의 RA 환자(38.9%) 및 건강한 대조군(35.7%)에서보다 더 높았다(표 11 참조).
전신성 경화, 류머티즘 관절염이 있는 환자 및 건강한 대조군에서 ROT1 유전자형의 분포
전신성 경화 류머티즘 관절염 정상 대조군
ROT1 유전자형 전체 백분율 전체 백분율 전체 백분율
AA 25 31.6% 21 38.9% 5 35.7%
AG 24 30.3% 17 31.5% 6 42.86%
GG 30 38% 16 29.6% 3 21.43%
실시예 18: ROT1 유전자형은 미만성 SSc 를 앓는 환자의 31%에서 존재한다.
저장된 PBMC 세포 펠렛을 전체 미만성 SSc 환자에 대하여 조사하였으며, 32%가 ROT1 AA에 대한 동형접합체이고, 35%가 RTO1 GG에 대한 동형접합체, 및 30%가 ROT1 GA에 대한 이형접합체인 것을 찾았다.
ROT1 AA인 SSc 환자는 α1(I)-자극 PBMC에 의한 IFNγ 생산의 적은 상향조절을 나타냈다. 제 2상 경구 CI 관용 임상시험에서 12개월째에, 임상시험에 등록한 168명의 환자 중 79명의 SSc 환자를 유전자형 분석하였다. 23명의 ROT1AA 유전자형 중에서 7명이 말기 분류에 있어서, 결과로부터 삭제하였다. 정리된 것의 재분석은 윌콕슨 순위합 검정을 사용하여 위약을 투여한 환자와 비교하였을 때, CI 치료 환자에서 12 개월째의 MRSS에서의 변화에서 베이스라인 값으로부터 유의한 차이를 보였다(도 16 참조).
1D 단백질 내분비 눈확병증
59- kD 신장 항원 악성 사구체신염
아세틸콜린 수용체 서브유니트 근무력증
아그레칸 , 피브릴린 및 메탈로프로테아제 -3 소아특발성관절염
알파3 ( IV ) NI1 항-GBM 질환
알파- 엔도라아제 천식
알파- 태아단백질 청소년 바텐병
아넥신 A6 신생아 홍반성 낭창
아폽토시스 세포-결합 단백질 전신성 홍반성 낭창
AUF1 전신성 류머티즘 질환
자가 조직 결장 추출 단백질 크론병
베타2 -당단백질-I 항인지질항체 증후군
혈구 세포 자가 항원 자가면역 용혈성 빈혈
보렐리아 부르그도르페리 리신-풍부 단백질 라임 뇌염
보렐리아 T 세포 에피토프 라임 관절염
BP180 수포성 유사천포창
BPAg2 IgA 질환
C1D 다발성 근염-피부경화증 중복 증후군
콜라겐, 바람직하게는 V형 콜라겐 특발성 폐섬유증
사이토크롬 P450 1A2 간염 이식편대 숙주병
사이토케라틴 -10 라임 관절염
탈아미드화된 글리아딘 펩티드 셀리악병
데스모콜린 1 수포창
데스모글린 1 수포창 천포창
데스모글린 1 및 3 수포창
데스모글린 1 및 3 보통 수포창
데스모글린 1 및 3 농포피부병(스네든-윌킨슨병)
데스모글린 3 엑토도메인 보통 수포창
데스모글린 -3 펩티드 보통 수포창
엔도라아제 및 어레스틴 다발성 경화증
GAD65 1형 당뇨
글라티라머 아세테이트 다발성 경화증
인간 C1q 의 구형 도메인 전신성 홍반성 낭창
글루타티온 S-전이효소 세타 1 경화성 담관염
GPI -항- oxLDL / 베타2GPI SLE
열충격 단백질 경동맥 죽상경화증
헤파린 저혈소판증
히스티딘-전이 RNA 합성효소 Jo-1 자가 항체-관련 근염
hnRNP A/B 단백질 전신성 류머티즘 질환 및 hnRNP L
hnRNP -A2( RA33 ) 프리스테인-유도 관절염
HRES -1 내재성 레트로바이러스 전신성 홍반성 낭창
Hsp60 청소년 피부근육염
hsp60 , -65 및 -70 소아특발성관절염
인간 인슐린 I형 진성 당뇨병
인간 장 항원s 크론병
내재성 요인 자가면역 위염
Jo -1 또는 Ro -52/ Ro 60 근염 환자
Ku 결합 조직
수정체 단백질 포도막염
MBL RA
메갈린 도나이-바로우 및 안면-눈-귀-신장 신드롬
마이엘린 기반 단백질 펩티드 다발성 경화증
뉴로파신 자가 항체-매개 축색 손상
신경세포-특이적 엔도라아제 급성 후천성 막막변성
VII 형 콜라겐의 비콜라겐성 1 및 2 도메인 어린이 후천성 표피 수포증
VII 형 콜라겐의 비콜라겐성 도메인 임신 포진
핵단백질 A2( hnRNP -A2) 전신성 홍반성 낭창
뉴클레오좀 항원 홍반성 낭창
뉴클레오좀 루퍼스 신염
p200 유사천포창
p200 유사천포창 항원 후천성 표피 수포증
이하선 항원 쇼그렌 증후군
보통 수포창 IgG 극세포 분리
페닐알라닌 전이 RNA 합성효소 다발성 근염
원형질막 자가 항원 자가면역 간염
폴리 ( ADP -리보오스) 폴리머라아제 1 전신성 홍반성 낭창
신규 자가 항원서 라밥틴 5 알츠하이머병
RAP 및 메갈린 하이만스 신염
재조합 70 kDa 리보뉴클레오단백질 혼합된 결합 조직 질병
모델 항원으로서 적혈구 자가면역
망막 항원 시력 감퇴
망막 가용성 항원 포도막염
리보좀 P 단백질 전신성 홍반성 낭창
리보좀 P 단백질 PO 혼합된 결합 조직
RNA 헬리카아제 A 전신성 홍반성 낭창
셀레늄 결합 단백질 베체트병
Sm 전신성 홍반성 낭창
Smd 183-119-자가 항원 SLE
척추 세포 근위축 측삭경화(ALS)
편평상피세포암 항원 단백질 Family 건선
SSA / SSB 항체 전신성 홍반성 낭창
RLIP76 의 서브유니트 면역-매개 혈관 질환 및 죽상경화증
정소-발현 단백질 TSGA10 I형 다선 증후군
TG3 셀리악병
갑상선 호르몬 자가면역 뇌질환
갑상선 페록시다아제 1형 당뇨
글루타민전이효소 포진상 피부염 및 복강 증후군
TRIM 단백질 쇼그렌 증후군
유형 I 콜라겐 전신성 경화(피부경화증)
유형 I 콜라겐 특발성 폐섬유증
II 형 콜라겐 RA
II 형I 콜라겐 전신성 경화(피부경화증)
II 형I 콜라겐 특발성 폐섬유증
V형 콜라겐 특발성 폐섬유증
비멘틴 RA
ZnT8( Slc30A8 ) 인간 1형 당뇨
<110> THE UNIVERSITY OF TENNESSEE RESEARCH FOUNDATION <120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND ASSOCIATION WITH RESISTANCE TO IMMUNE TOLERANCE INDUCTION <130> US10P1012 <150> 61/071264 <151> 2008-04-18 <150> 61/080012 <151> 2008-07-11 <150> 61/104504 <151> 2008-10-10 <150> PCT/US2009/41134 <151> 2009-04-20 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttttttttt gtacctagtt ctatggttac ctt 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tttttttttt gtacctggtt ctatggttac ctt 33 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaaggcacct catggagaaa gacctctgcc tacctcccca ggcttgcctg acttcatcct 60 catatactag ccacctgcac cccaccaaat aattaacttc tgctagtttc ctggacaccc 120 caagccattg tgtgccttgt tcccttgcta tgatatttcc cctttctgga acacctccat 180 caatgttcca gctcaattat cacctcctac aggaagcctt ccctcatttc ctcctatgcc 240 tatcactcaa gaagtattaa ccacactttt ctctgtgctg tagctttttt ttttgtacct 300 agttctatgg ttacctttac actgcattgt aacctggtat tcatgggctt atctgtgtcc 360 cctgtggagc tgtcagtctc tgaaaggcca gtgcctactt tatttcctct ctagattcca 420 gcactgagat gatgccaggt gtcagccctc cttggaagcc ttaggaaggt ctctccaatt 480 gccctacccc aaccacaata tagaggacta taaaatgagc acatagtggg aggagacaga 540 gtggttccct gattacatgt atgaacgcag ctagagagag aatatgtcct tccaatgtgg 600 g 601 <210> 4 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaaggcacct catggagaaa gacctctgcc tacctcccca ggcttgcctg acttcatcct 60 catatactag ccacctgcac cccaccaaat aattaacttc tgctagtttc ctggacaccc 120 caagccattg tgtgccttgt tcccttgcta tgatatttcc cctttctgga acacctccat 180 caatgttcca gctcaattat cacctcctac aggaagcctt ccctcatttc ctcctatgcc 240 tatcactcaa gaagtattaa ccacactttt ctctgtgctg tagctttttt ttttgtacct 300 ggttctatgg ttacctttac actgcattgt aacctggtat tcatgggctt atctgtgtcc 360 cctgtggagc tgtcagtctc tgaaaggcca gtgcctactt tatttcctct ctagattcca 420 gcactgagat gatgccaggt gtcagccctc cttggaagcc ttaggaaggt ctctccaatt 480 gccctacccc aaccacaata tagaggacta taaaatgagc acatagtggg aggagacaga 540 gtggttccct gattacatgt atgaacgcag ctagagagag aatatgtcct tccaatgtgg 600 g 601 <210> 5 <211> 310 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcaaacccag ctttgactcc agagcctgca ctcttcccat tagatcattc tacatccttt 60 tttgggatgg tttagttgcc aactggggat aaaataaatg gtcttttgaa attctttcca 120 ttgcctggat tctattctcc cttatttgat cccaatattg gccttaacac tgtttagcaa 180 tttgttatac tgagaacatg ggttaggaaa caatacaatt tgatgagttt aatgtaaatt 240 gttttcaaac ttaagttctc actcttacta ggtcacaaaa tctcagtgag aaggcacctc 300 agagttcatc 310 <210> 6 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gatcccacaa tcgcataaag tcaagtactt gggaccaatt gctccttttc aacacacaca 60 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca gtttctgctt ctctgatgga 120 atgctg 126 <210> 7 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tggcaaggac agacacaatt aattaattat atatttttag atatagtgta gttgtgtgtg 60 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgga gagagagaca gaaagaaaga ataattataa 120 gtagttgtaa aaggtatgag gaaaagttca gtagagaagg agatagaaag tgatgtgggc 180 attattttaa agagggctct tggagacagc ctctctgggc gaggttggga ggtatttgag 240 gtgaagcctg gatga 255 <210> 8 <211> 253 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ctttgcagaa cccatgatta tgacagttgt ctctactctc agttaccaaa tgccctgata 60 tttataggct ctctctacag acacaactgc aactgtcctt ctaagagtgg ctacaataaa 120 tcctaaagtc ctgcagcctc agggagggca ggaaaatggt gggggctggc tcaaattcct 180 aaacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacgc 240 cctctaagac aat 253 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 agaccctaat tttaagcgat ctacagtctg gtg 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agaccctaat tttaagtgat ctacagtctg gtg 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agagggacaa tgggaccaca taattgaagt tgg 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 agagggacaa tgggactaca taattgaagt tgg 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ttctcactct attgcacgga atatatagta ttt 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ttctcactct attgcatgga atatatagta ttt 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cctcacagaa tttacactgg agcctaagta aca 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cctcacagaa tttacattgg agcctaagta aca 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gcaaagccaa ggtacaaact cacgtgcatt aaa 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gcaaagccaa ggtacagact cacgtgcatt aaa 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tatcatggca ctcagtctgg tgggtattac tgt 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tatcatggca ctcagtgtgg tgggtattac tgt 33

Claims (28)

  1. 적어도 하나의 SNP을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 면역 관용 발달에 대한 감수성의 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 FISH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 DNA 어레이의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 폴리뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 방법은 대립유전자-특이적 프로브 혼성화, 대립유전자-특이적 프라이머 신장, 대립유전자-특이적 증폭, 서열분석, 5' 뉴클레아제 효소적 분해, 분자 지표 분석, 올리고뉴클레오티드 리게이션 분석, 크기 분석, 및 단일-가닥 배좌 다형성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 숙주에 하나 이상의 항원을 투여한 결과로서 면역 관용의 발달에 대한 숙주의 능력을 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 상호 관련시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 숙주는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 치료제는 적어도 하나의 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원은 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 콜라겐은 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII 및 XXVIII로 구성되는 그룹 유형으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 면역 관용 발달에 대한 숙주의 감수성의 스크리닝 방법으로서, 이 방법은
    a. 핵산을 포함하는 상기 숙주로부터 표본을 수득하는 단계;
    b. 상기 표본으로부터 핵산을 분리하는 단계;
    c. 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재는 면역 관용의 발달에 대한 증가된 감수성을 가리키는, 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재에 대하여 상기 표본을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 숙주는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 표본은 전혈, 혈장, 소변, 눈물, 정액, 타액, 구강 점막, 간질액, 림프액, 뇌막액, 양막액, 샘 유동액, 가래, 대변, 발한, 점액, 질 분비물, 뇌척수액, 체모, 피부, 배설물, 상처 삼출액, 상처 호모지네이트, 및 상처액으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 면역 관용은 숙주에 적어도 하나의 항원을 투여하는 것에 의해 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 항원은 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 콜라겐은 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII 및 XXVIII로 구성되는 그룹 유형으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11항에 있어서, 상기 면역 관용 발달은 경화성 질병에 대한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 경화성 질병은 전신성 경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 컴퓨터 시스템에서 사용하기 위한 적어도 하나의 컴퓨터 프로그램을 더 포함하고, 상기 컴퓨터 프로그램은 하기를 포함하는 다수의 작동명령을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a.상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재의 확인을 돕기 위한 적어도 하나의 작동명령;
    b.적어도 하나의 질병 상태를 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 관련시키는 적어도 하나의 작동명령, 및
    c.면역 관용의 발달에 대한 숙주의 감수성을 가리키는 점수를 상기 적어도 하나의 SNP의 존재 또는 부재와 상호 관련시키는 적어도 하나의 작동명령.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 컴퓨터 프로그램은 추가로 다수의 작동명령의 결과를 포함하는 보고서를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 보고서는 네트워크를 통해 전송되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 보고서는 온-라인 포탈을 통해 전송되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 상기 보고서는 지면 또는 e-메일을 통해 전송되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 상기 보고서는 안전한 방법으로 전송되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20항에 있어서, 상기 보고서는 데이터베이스에 저장시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 적어도 하나의 치료제의 투여 방법으로서
    a. 숙주의 핵산에서 하나 이상의 SNP를 유전자형 분석하는 단계,
    b. 하나 이상의 SNP를 하나 이상의 질병 또는 장애와 상호 관련시키는 단계,
    c. 상기 숙주가 적어도 하나의 치료제의 투여에 의해 긍정으로 또는 부정적으로 반응할 것인지에 대한 확률을 결정하기 위하여 수학적 알고리즘을 사용하는 단계, 및
    d. 상기 수학적 알고리즘의 결과에 기반하여 숙주에 치료제를 투여하거나 투여하지 않는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 하나 이상의 항원을 평가하는 임상시험의 수행 방법으로서
    a. 하나 이상의 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 SNP를 유전자형 분석하는 단계;
    b. 유전자형 분석 결과를 분석하는 단계;
    c.상기 유전자형 분석 결과에 기반하여 행동 방침을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 행동 방침은
    i. 개체가 상기 하나 이상의 항원에 대해 반응할 것 같음을 가리키는 상기 유전자형 분석의 결과에 기반하여 개체를 임상시험에 포함시키는 단계, 및/또는
    ii. 개체가 상기 하나 이상의 항원에 대해 반응하지 않을 것 같음을 가리키는 상기 유전자형 분석의 결과에 기반하여 개체를 임상시험에서 제외시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 개체의 핵산에서 서열번호 1의 단일 염기 다형성(SNP)을 검출하는 단계를 포함하고, SNP의 존재는 자가면역 질환에 대한 변경된 위험과 상호 관련되는, 자가면역 질환이 발달하는 것에 대한 변경된 위험을 갖는 개체의 확인 방법.
KR1020107025767A 2008-04-18 2009-04-20 단일 염기 다형성（ｓｎｐ） 및 면역 관용 유도에 대한 저항과의 관련 KR20110014595A (ko)

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