CN102089276A - 酶结构、活性和/或表达水平的调节 - Google Patents

酶结构、活性和/或表达水平的调节 Download PDF

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Abstract

包括人的温血动物线粒体中酶复合物，如丙酮酸脱氢酶(PD)复合物的结构、活性或表达水平的药学可接受的调节剂及其使用方法，含有有效量的至少一种硫辛酸衍生物及至少一种其药学可接受的载体。通过抑制PD复合物E1α亚基的活性来阻止无氧酵解的毒性代谢物的解毒，所述调节剂增强PD激酶的活性并同时降低PD磷酸酶活性，帮助线粒体中增加的氧化磷酸化活性。由于所述调节剂抑制PD复合物E2亚基作用的作用，致使特征为过度增殖的细胞，如肿瘤细胞也不能产生乙酰辅酶A和NADH，从而导致线粒体膜极化消失，促进细胞死亡。

Description

酶结构、活性和/或表达水平的调节
发明领域
本发明涉及治疗和诊断组合物，尤其是药物组合物及其使用方法，其表现为选择性摄入至包括肿瘤细胞的特征为过度增殖的细胞，且其调节酶的结构、活性和/或表达水平，从而有利于破坏这些细胞，尤其靶向与绝大数癌症相关的改变的线粒体丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物。
发明背景
绝大多数快速生长的肿瘤细胞与未转化细胞相比，出现遗传学、生物化学和组织学的巨大差异，包括与来源组织相比显著改变的能量代谢。肿瘤细胞中最臭名昭著和最著名的能量代谢改变是一种被称为Warburg效应的现象，即使在高O2浓度存在下仍然出现糖酵解能力的增加。
Warburg最早指出，肿瘤细胞糖酵解增强的驱动力是线粒体功能不可逆损伤所致的能量缺乏，其中类似于无氧的肌肉，葡萄糖经糖酵解转化为乳酸，乳酸随后被分泌。已指出，肿瘤细胞这种糖酵解流量的增加是低O2浓度的环境下，如产氧很少的实体瘤观察到的部分缺氧，为保证存活和生长的代谢策略。尤其，由于很多含氧低的人肿瘤的O2浓度低于20μM，因此其中氧化磷酸化是有限的。于是，糖酵解就似乎成为实体瘤(如生长缓慢的黑色素瘤和乳腺癌)主要的能量途径。
在快速生长的肿瘤细胞中已经证实细胞增殖速率与ATP供应速率成比例关系。一些学者曾指出糖酵解活性与肿瘤恶性程度相关，因此，高度去分化和快速生长的肿瘤比生长缓慢的肿瘤或正常细胞的糖酵解速率更高。事实上，乳酸的高水平已成为恶性的预测物。
如图1所示，许多年以来，仅由于三羧酸循环(TCA)在生成ATP作为生物体能量来源中的作用，TCA被认为仅在生物学上具有重要意义。然而，近期研究已显示TCA循环活性也影响包括决定细胞生长和凋亡的信号转导途径的功能，并且相关的糖酵解和TCA循环酶能被上调或下调。肿瘤的进展也与糖酵解酶己糖激酶和磷酸果糖激酶(PFK)1的活性直接相关，这两种酶在快速生长的肿瘤细胞中显著增加。据此推断，存在氧化能力缺陷的肿瘤细胞的恶性程度高于氧化磷酸化活跃的肿瘤细胞。因此，无论在低氧还是有氧状态下，肿癌组织对糖酵解的依赖与增加的恶性相关。
PDH复合物中硫辛酸的作用已被深入研究。PDH复合物有3个中心亚基：E1、E2、E3(分别是丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶)。这些复合物具有中心的E2核心，其他亚基围绕该核心构成PDH复合物。亚基两两间的空隙中，活性位点由硫辛酰结构域过渡连接。硫辛酰结构域自身是由柔性接头连接至E2核心。在丙酮酸和焦磷酸硫胺反应生成硫代半缩醛后，该阴离子攻击连接于赖氨酸残基的被氧化的硫辛酸类的S1。因此，硫辛酸S2被硫化物或巯基部分所替代，接着四面体硫代半缩醛分解产生噻唑，释放TPP因子，并在硫辛酸S1上生成硫代乙酸根。在此时，硫辛酸-硫酯官能团易位于E2活性位点，在此，转酰基反应将乙酰基从硫辛酸的“摇臂”转移到辅酶A的硫醇基。这生成了乙酰辅酶A，乙酰辅酶A从酶复合物释放并随后进入TCA循环。仍然结合于复合物赖氨酸残基的二氢硫辛酸随后移至E3活性位点，并在此经由黄素介导的氧化作用返回至它的硫辛酸静止状态，生成FADH2(最终是NADH)，然后重新生成硫辛酸，返回至有活性的酰基受体。如果，这种硫辛酸类被打断，便不会出现流向FADH2的电子流也不会生成乙酰辅酶A，导致细胞内丙酮酸的毒性累积。
线粒体内PDH复合物的活性被多种变构效应物和共价修饰高度调节。PDH的磷酸化状态调节PDH的活性，在去磷酸化状态时最有活性。PDH的磷酸化是由PDH激酶(PDK)催化的。在ATP、NADH和乙酰辅酶A水平增高时，PDK活性增加。PDK的负效应物是ADP、NAD+、CoA-SH和丙酮酸，当ATP水平下降时，它们的水平升高。PDH磷酸酶(PDP)通过脱磷酸作用激活PDH，虽然PDP的调节未完全明确，但已知Mg+2、Ca+2激活PDP。
复合物的两个产物NADH和乙酰辅酶A是PDH-a(PDH的去磷酸化活性形式)的负变构效应物。这些效应物降低酶对丙酮酸的亲和力，因此限制经过PDH复合物的碳流。另外，NADH和乙酰辅酶A还是PDK强有力的正效应物，PDK是通过将PDH转变为磷酸化的PDH-b形式而使PDH失活的酶。由于当细胞能荷高时NADH和乙酰辅酶A累积，毫不奇怪的是，高ATP水平也上调PDK的活性，这加强了能量富集细胞PDH活性的下调。然而，由于丙酮酸是PDK强大的负效应物，当丙酮酸水平升高时，即使NADH和乙酰辅酶A水平较高，PDH-a也是占优势的。
维持PDH-a的丙酮酸浓度足够高，以致于在ATP富集细胞中，变构下调的、高Km形式的PDH仍然能够将丙酮酸转变为乙酰辅酶A。含有高水平的ATP和NADH的细胞内含大量丙酮酸，丙酮酸的碳可直接转变为两种主要的碳储存形式(经由糖异生生成的肝糖和经由脂肪酸合成的脂肪产生)，其中，乙酰辅酶A是主要的碳源。尽管，PDP-b的调节未完全知晓，PDP-b极有可能被调节为在低ATP浓度时使丙酮酸氧化最大化和在高ATP浓度时将PDH的活性降至最低。
肿瘤细胞不能无限制地累积丙酮酸及相关醛和自由基如乙醛、过氧化物、过氧化氢和羟氢氧自由基，因为这些分子在高水平时有细胞毒性，其原理如显著降低细胞内pH。因此，已表明，对于AS-30D和Ehrlich肝细胞瘤而言，线粒体丙酮酸的重要部分经由结合的焦磷酸β-羟乙基硫胺被PDH复合物的E1组分脱羧基而释放活性乙醛。该活性乙醛反过来与第二乙醛缩合，最终通过使用氨基酸谷氨酸或硫辛酸使最初的丙酮酸脱酸或还原而生成乙偶姻(3-羟基丁酮)，乙偶姻是一种竞争性抑制PDH并且细胞毒性低于其丙酮酸前体的化合物(如，通过维持细胞内pH稳态)。尽管乙偶姻在肿瘤细胞解毒途径中的重要性归因于丙酮酸的累积，丙酮酸的累积是由于肿瘤细胞对糖酵解作为ATP生成来源的依赖，然而现有技术很少涉及阻断乙偶姻生成对肿瘤细胞生存力的影响。
近期研究表明，促使癌细胞进入更有氧的代谢抑制肿瘤生长。因此，转变到Warburg代谢就需要关闭PDH复合物。在这种转变中，癌细胞中缺氧诱导因子(HIF)的信号传导增强，因此不奇怪给定HIF在葡萄糖代谢中的重要作用，如图2所示。事实上，直接或间接增强HIF信号传导的突变似乎是癌症进展的常见机制。HIF诱导PDK1过表达，后者作用以降低PDH复合物的活性。PDK1的磷酸化作用可能对于维持失活的PDH复合物非常有效，因为该同种型独特地使PDH复合物的第一个亚基E1的α亚基上的三个丝氨酸残基磷酸化。E1的再活化需要所有的三个磷酸基团的去除。另外，PDH复合物的活化可能导致活性氧类生成的增加，这可以转而导致凋亡。然而，即使不同肿瘤类型、不同患者之间，癌症中观察到的PDK1的改变可能不但归因于其浓度的改变而且归因于其活性的改变以及可能其氨基酸序列的改变。而且，根据肿瘤类型，PDK1可与肿瘤相关的多种分子构成不同的复合物。因此，抑制PDK可能是肿瘤中产生凋亡的潜在靶点。然而，迄今为止，已知的PDK1抑制剂最多只能引发该同功酶60％的抑制。
虽然传统的化学疗法靶向分裂、增殖细胞，但所有临床上接受的化疗治疗使用大药物剂量，同时导致对正常的增殖的宿主细胞的严重损伤。因此，对于癌症的治疗需要更具选择性的靶向。与化学疗法相关的另一个问题是：许多肿瘤类型中存在对抗肿瘤药物固有或获得性抵抗。总之，对绝大多数恶性肿瘤而言，传统的化学疗法目前很少提供长期益处，并且常伴随降低生命长度或质量的副反应。因此，需要能在保证良好的生命质量的同时提供长期肿瘤控制的全新方法。
当然，在研发新的化学疗法时需解决药物效力、递送及副反应问题。在实体瘤中，当药物不容易穿透不同细胞层时，递送至含氧量低的区域可能比较困难。为消除这些不确定因素，宜设计具有至少亚微摩尔水平的代谢抑制常数的抗癌剂。可能争论癌细胞是遗传性的并且在细胞系之间表型异质性的。但是，所有的肿瘤细胞系均依赖于糖酵解和氧化磷酸化获得ATP供应。着眼于Warburg效应允许基于肿瘤细胞和正常细胞间在生理的和生化的能量的不同而设计药物以利于设计选择性影响仅肿瘤代谢和生长而不影响健康的宿主组织和器官的功能性的递送和治疗策略。
Bingham等人的美国专利6,331,559和6,951,887以及Bingham等人的美国临时申请号60/912,598，全部在此通过引用并入，公开了新一类硫辛酸衍生物治疗剂，这些治疗剂选择性靶向并杀死肿瘤细胞和某些其他的病态细胞类型。这些专利进一步公开了药物组合物及其使用方法，所述药物组合物包含有效量的这样的硫辛酸衍生物及药学可接受的载体。然而，这些专利虽然描述了这些硫辛酸衍生物的结构和一般用途，但并未在任一专利中指明这些衍生物可用于调节PDH复合物的结构和/或表达水平，和/或调节PDH复合物的活性。
已证实PDH复合物的结构和/或活性是肿瘤活性至关重要的决定因素，因此，提供PDH复合物的结构和/或活性或甚至表达水平的药学可接受的调节剂及其使用方法是有益的。
发明目的及工业应用
因此，本发明的目的之一是提供用于治疗或诊断特征为细胞过度增殖的疾病、病症或综合征，如癌症，的药物组合物，其对肿瘤细胞有选择性的活性。
本发明的目的之二是提供用于治疗或诊断上述的疾病、病症或综合征的药物组合物，其施用后导致最小的副反应。
本发明的目的之三是提供用于治疗或诊断上述的疾病、病症或综合征的药物组合物，所述药物组合物易于以尽可能低的成本制造，并能够储存尽可能长的时间。
本发明的目的之四是提供用于治疗或诊断上述的疾病、病症或综合征药物组合物，所述药物组合物调节肿瘤细胞线粒体内PDH复合物的结构、活性和/或表达水平。
发明概述
根据上述目的，本发明广泛提供药物组合物，该药物组合物可用于治疗、诊断或预防包括人的温血动物中、特征为至少一种酶复合物如PDH复合物的结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征，包括特征为细胞过度增殖的疾病、病症或综合征，如癌症或其综合征，其中药物组合物含有有效量的至少一种硫辛酸衍生物及至少一种其药学可接受的载体，所述硫辛酸衍生物包括全部在此通过引用并入的美国专利6,331,559和6,951,887以及美国临时申请号60/912,598中描述的硫辛酸衍生物。
通过抑制线粒体的能量代谢，本发明的硫辛酸衍生物导致病态细胞线粒体膜电位损失及其他线粒体后果，进而导致细胞死亡的不可逆的开始。本发明的硫辛酸衍生物也可通过下列方式抑制线粒体的能量代谢：激活PDK和/或抑制PDP，或通过抑制PDH复合物的E1亚基的活性来抑制丙酮酸向毒性更小的分子乙偶姻转变。乙偶姻的合成受抑会干扰其他过程，包含氧化还原的平衡，也可能导致毒性副产物的生成，所述毒性副产物包括乙醛、过氧化物、过氧化氢和其他羟基自由基，这些副产物本身随后导致病态细胞线粒体的不可逆损伤。
本发明药物组合物可以调节PDK1、PDK2、PDK3、PDK4以及它们各自的突变体或同种型的效应。药物化合物也可调节PDP1、PDP2及它们各自的同种型的效应。
本发明药物组合物也可调节PDH复合物中的磷酸化酶、激酶和脱氢酶酶组分的表达水平。这种调节可能发生在转录、翻译或翻译后阶段，包括适合基因的后生沉默。
作为源于根本上与TCA循环并进而与糖酵解相关的分子的化合物，本发明药物组合物表现为选择性摄取进入肿瘤细胞。而且，这种选择性肿瘤细胞摄取将施用这种药物组合物对健康的未转化的细胞和组织的副反应降至最低。
在本发明的一种实施方案中，所述硫辛酸衍生物具有通式(I)或其盐：
Figure BPA00001249978400061
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、烷基CnH2n+1、烯CnH2n、烯基CnH2n-1、炔CnH2n-2、炔基CnH2n-3、烷基硫CH3(CH2)n-S-、烷基化二硫CH3CHt-S-S-、硫代氨基甲酸酯(CH2)nC＝NH-、和硫代半缩醛CH3CH(OH)-S-，其中n是1-10且t是0-9；芳香族；以R3C(O)-定义的酰基；杂芳基；以R4C(＝NH)-定义的亚氨基；有机金属芳基；烷基-有机金属芳基；以及半缩醛R5CH(OH)-S-；
其中，上述定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由以下组成的组：氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基和有机金属芳基，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R4选自由由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5是CCl3、CF3或COOH；
并且其中x是0-16。
在本发明的第二种实施方案中，所述硫辛酸衍生物由第二个通式(II)或其盐定义：
Figure BPA00001249978400071
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-、或金属鳌合物、或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R3C(O)-、烷基CnH2n+1、以CmH2m-1定义的烯基、以CmH2m-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R3C(＝NH)-定义的亚氨基、以及以R4CH(OH)-S-定义的半缩醛；
其中，上述定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3和R4独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基、和杂环基组成的组，其任一个可是未取代或取代的；
其中，R5选自由-CCl3、-CF3或-COOH组成的组；
并且其中x是0-16、z是0-5、n是0-10且m是2-10。
在本发明的第三种实施方案中，所述硫辛酸衍生物具有第三个通式(III)或其盐：
Figure BPA00001249978400081
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、烷基CnH2n+1、烯CnH2n、烯基CnH2n-1、炔CnH2n-2、炔基CnH2n-3、烷基硫CH3(CH2)n-S-、烷基化二硫CH3CHt-S-S-、硫代氨基甲酸酯(CH2)nC＝NH-和硫代半缩醛CH3CH(OH)-S-，其中n是1-10且t是0-9，芳香族、以R4C(O)-定义的酰基、杂芳基、以R5C(＝NH)-定义的亚氨基、有机金属芳基、烷基-有机金属芳基、半缩醛R6CH(OH)-S-、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、以及它们的多聚体和组合；
其中，上述定义的R1和R2可以是未取代的或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质和其多聚体组成的组；
其中，R4选自由氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基和有机金属芳基组成的组，其任一个可以是取代的或未取代的；
其中，R5选自由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R6是CCl3、CF3或COOH；
并且其中，x是0-16。
在本发明的第四种实施方案中，所述硫辛酸衍生物由第四个通式(IV)或其盐定义：
Figure BPA00001249978400091
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-、或金属鳌合物、或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R4C(O)-、烷基CnH2n+1、以CmH2m-1定义的烯基、以CmH2m-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R4C(＝NH)-定义的亚氨基、以R6CH(OH)-S-定义的半缩醛、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和它们的多聚体和组合；
其中，以上定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和其多聚体组成的组；
其中，R4和R5独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基、和杂环基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由CCl3、CF3或COOH组成的组中；
并且其中，x是0-16，z是0-5，n是0-10，且m是2-10。
每一个通式中，针对每个特定的硫辛酸衍生物而言，其(R)-异构体比(S)-异构体拥有更强的生理活性。因此，硫辛酸衍生物应当呈现为单一的(R)-异构体形式或(R)-异构体和(S)-异构体的混合物。
本发明的另一方面也提供一种诊断、治疗或预防包括人的温血动物中特征为至少一种酶复合物如PDH复合物的结构或功能改变的疾病、病症、综合征或其症状的方法，所述疾病、病症、综合征或其症状包括特征为细胞过度增殖的那些，如癌症。其中，所述方法包括向此类动物施用有效量的在此公开的药物组合物。
本发明的另一方面提供一种在患者中诊断和预测益处的方法，所述患者呈现出特征为至少一种酶复合物如PDH复合物的结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征，包括特征为细胞过度增殖的疾病、病症或综合征，如癌症，所述方法包括：从患者获得细胞样品；在体外向所述细胞施用有效量的本发明药物组合物，并从其中获得结果。
附图简述
图1显示丙酮酸的糖酵解生成中底物和产物的结构；也显示了ATP和NADH的生成和相关的酶。
图2显示HIF-1对葡萄糖代谢的调节。
图3A显示正常组织和癌组织之间体内能量代谢的差异。
图3B描述PDH复合物中硫辛酸生物形式和形成本发明药物组合物部分的硫辛酸衍生物之间的差异。
图3C显示通过硫辛酰残基对PDK的效应对PDH复合物的调节。
图4显示本发明药物组合物对异种移植肿瘤生长的效应。
图5显示本发明药物组合物对三种肿瘤细胞和一种未转化细胞的治疗效果。
图6A显示用致死阈或以上量的本发明药物组合物治疗后肺癌细胞中的ATP水平。
图6B比较了本发明药物组合物在含丙酮酸的培养基与含葡萄糖的培养基中对ATP合成的抑制。
图6C比较了本发明药物组合物在乳腺癌细胞与正常乳腺细胞中对ATP合成的抑制。
图6D比较了肺癌细胞中本发明药物组合物与硫辛酸以及本发明无活性形式对ATP合成的抑制。
图7显示本发明药物组合物对PDH复合物以及α-酮戊二酸脱氢酶(αKDH)酶活性的肿瘤细胞线粒体水平的效应。
图8A显示来自用本发明药物组合物治疗或模拟治疗的肺癌细胞的提取物的双向凝胶的Western分析。
图8B显示用本发明药物组合物治疗或模拟治疗的配对双向凝胶样品的放大图。
图9A描绘了PDK受共价结合于PDH复合物E2亚基的内源性硫辛酸调节时的调节作用。
图9B描绘了本发明药物组合物对肿瘤细胞PDH复合物差异失活作用的可能机理。
图10代表本发明药物组合物对H460肺癌细胞线粒体膜电位的效应。
图11显示其中本发明药物组合物导致各种肿瘤细胞类型的细胞死亡途径的Western印迹分析结果。
发明详述
本发明总的来说涉及治疗、诊断或预防温血动物中、特征为PDH复合物的结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征的药物组合物，所述疾病、病症或综合征包括特征为细胞过度增殖的疾病、病症或综合征，如癌症或其综合征。所述动物包括遭受包括癌症的特征为细胞过度增殖的疾病及其他病理症候和综合征的那些哺乳动物类，如人、马、牛、包括狗和猫的家养动物及诸如此类。本发明的药物组合物含有有效量的至少一种硫辛酸衍生物以及其药学可接受的载体或赋形剂，所述硫辛酸衍生物包括美国专利6,331,559和6,951,887以及美国临时申请号60/912,598中描述的那些，也被称作thioctan。作为不仅是线粒体中正常存在的一种衍生物，而且是有助于如Warburg效应所见的提高的肿瘤细胞糖酵解活性的一种衍生物的分子，本发明的硫辛酸衍生物，尤其良好地适宜于选择性递送至、且有效集中于特征为过度增殖的细胞和组织如肿瘤细胞和组织的线粒体内，从而使正常细胞和组织免于该组合物的效应。
本发明的药物组合物可调节PDK1、PDK2、PDK3、PDK4以及它们各自的同种型的效应。所述药物组合物也可调节PDP1、PDP2及它们各自的同种型和/或突变体的效应。所述调节可通过促进或抑制激酶或磷酸酶的活性发生。
通过抑制线粒体的能量代谢，本发明的硫辛酸衍生物导致病态细胞中线粒体膜电位丧失以及其他线粒体后果，导致细胞死亡不可逆的开始。本发明的硫辛酸衍生物也可通过激活PDK和/或抑制PDP、或通过抑制PDH复合物的E1亚基的活性而抑制丙酮酸向毒性较小分子乙偶姻的转变来抑制线粒体的能量代谢。乙偶姻的合成受抑制会干扰其他过程，包括氧化还原的平衡，也可导致毒性副产物的生成，包括乙醛、过氧化物、过氧化氢和羟基自由基，这些副产物自身随后导致病态细胞线粒体的不可逆损伤。
在本发明的第一种实施方案中，所述硫辛酸衍生物由第一种通式(I)或其盐定义：
Figure BPA00001249978400121
其中，x是0-16，R1和R2可以独立为：
(1)通过硫酯键连接的酰基R3C(O)-，其中R3是烷基、芳基或有机金属芳基，包括但不限于乙酰基和丁酰基(butaryl)，具体实例是二乙酰硫辛酸；
(2)通过硫酯键连接的芳香族基团，包括但不限于苯甲酰基或苯甲酰衍生物，具体实例是二苯甲酰硫辛酸；
(3)通过硫酯键连接的烷基CnH2n+1，在此n是1-10，这种烷基用其他部分(如，举例来说，-OH、-C1或-NH2)取代，包括但不限于甲基、乙基、丁基、癸基、和6，8-二氨甲酰甲基硫辛酸；
(4)通过硫酯键连接的烯基CnH2n-1，在此n是2-10，包括但不限于丙烯、2，3二甲基-2-丁烯和庚烯；
(5)通过硫酯键连接的炔基CnH2n-2，在此n是2-10，包括但不限于乙炔、丙炔和辛炔；
(6)烷基、烯基和炔基，其可以是开链或者脂环，脂环基团含有任一碳的添加或取代以构成杂环，包括但不限于环丙烷、环戊烯、和6，8甲基-琥珀酰亚氨基硫辛酸；
(7)烷基、烯基和炔基，其可在它们的任一碳上具有添加，包括但不限于羟基和胺；
(8)通过硫酯键连接的芳香族基团或芳基，其可是苯或苯的衍生物，包括但不限于甲苯和苯胺；
(9)通过二硫键连接的烷基硫基团CH3(CH2)n-S-，其中n可以是但不限于0-9；
(10)通过硫酯键连接的亚胺基CHR4C(＝NH)-，其中n可以是但不限于1-10；以及
(11)半缩醛基R5CH(OH)-S-，其中R5限于有强吸电子取代物的化合物，包括但不仅限于三氯乙醛和丙酮酸。
以上定义的R1和R2可是未取代或取代的，也可含有能被氧化生成亚砜或砜的硫酯，分别如C-S(O)-R和C-S(O)2-R。
R1和R2可进一步含有能被氧化为硫代亚磺酸或硫代磺酸的二硫化物，分别如：C-S(O)-S-R和C-S(O)2-S-R。
R3选自由氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基、和有机金属芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的。类似地，R4选自由由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基、和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的。
R5是-CCl3、-CF3或-COOH。
在本发明的第二种实施方案中，所述硫辛酸衍生物由第二种通式(II)或其盐定义：
Figure BPA00001249978400131
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-、或金属鳌合物或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R3C(O)-、烷基CnH2n+1、以CnH2n-1定义的烯基、以CnH2n-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R3C(＝NH)-定义的亚氨基、和以R4CH(OH)-S-定义的半缩醛；
其中，以上定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3和R4独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基和杂环基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由-CCl3、-CF3或-COOH组成的组；
并且其中x是0-16、z是0-5，且n是0-10。
在本发明的第三种实施方案中，所述硫辛酸衍生物有第三种通式(III)或其盐：
Figure BPA00001249978400141
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、烷基CnH2n+1、烯CnH2n、烯基CnH2n-1、炔CnH2n-2、炔基CnH2n-3、烷基硫CH3(CH2)n-S-、烷基化二硫CH3CHt-S-S-、硫代氨基甲酸酯(CH2)nC＝NH-、和硫代半缩醛CH3CH(OH)-S-、其中n是1-10且t是0-9、芳香族、以R4C(O)-定义的酰基、杂芳基、以R5C(＝NH)-定义的亚氨基、有机金属芳基、烷基-有机金属芳基、半缩醛R6CH(OH)-S-、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、以及它们的多聚体和组合；
其中，以上定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和其多聚体组成的组；
其中，R4选自由氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基、和有机金属芳基组成的组；其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基、和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R6是CCl3、CF3、或COOH；
并且其中，x是0-16。
在本发明的第四种实施方案中，所述硫辛酸衍生物由第四种通式(IV)或其盐定义：
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-、或金属鳌合物、或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R4C(O)-、烷基CnH2n+1、以CmH2m-1定义的烯基、以GmH2m-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R4C(＝NH)-定义的亚氨基、以R6CH(OH)-S-定义的半缩醛、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、以及它们的多聚体和组合；
其中，以上定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和其多聚体组成的组；
其中，R4和R5独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基、和杂环基组成的组；其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由CCl3、CF3或COOH组成的组；
并且其中，x是0-16，z是0-5，n是0-10且m是2-10。
已观察到：在第一种和第二种通式中，每个特定的硫辛酸衍生物的(R)-异构体比(S)-异构体拥有更强的生理活性。因此，虽然在本发明中考虑使用两种异构体，但在特别优选的实施方案中，尤其考虑优先使用(R)-异构体或在(S)-异构体的混合物中存在(R)-异构体。
本发明药物组合物也可调节在PDH复合物中发现的磷酸酶、激酶和脱氢酶酶组分的表达水平。这种调节可发生在转录、翻译或翻译后阶段，包括适合基因的后生沉默。
本发明组合物可进一步包含药学可接受的载体或赋形剂。药学可接受载体的实例是本领域众所周知的且包括那些常在药物组合物中使用的，如，但不限于抗氧化剂、缓冲剂、鳌合剂、食用香料、着色剂、防腐剂、提高生物利用度的吸收增强剂、抗微生物及和它们的组合。这些添加剂的量取决于所需的特性，这可轻而易举地由本领域技术人员决定。
本发明药物组合物通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂和相容性载体，任选地组合其他治疗成分。当在药物中使用时，盐应是药学可接受的，但非药学可接受的盐也可适当地使用以制备其药学可接受的盐，而且未从本发明的范围被排除。这种药理学和药学可接受的盐包括但不限于从下列酸中制备的那些：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、palicylic、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。而且，药学可接受的盐可制备为碱金属或碱土金属盐，如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
本发明还提供用治疗或诊断剂治疗或诊断患者的方法，通过递送有效量的至少一种治疗剂或诊断剂至细胞，来实现对特征为至少一种酶复合物的结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征，包括特征为细胞过度增殖或其症状的那些的预防、诊断或治疗。调节PDH复合物作为癌症的改进的治疗尤其受到重视，包括通过控制肿瘤细胞增殖、血管形成、转移性生长、凋亡的原发肿瘤的治疗，和手术切除之后或同时的微小转移进展的治疗；以及原发肿瘤的放疗或其他化学治疗。本发明药物组合物对诸如下述的癌症类型有用：原发或转移性黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
对于治疗和诊断应用，所述药物组合物在结合药学可接受的载体后可直接施用于患者。这种方法可通过施用单独或与有效量的另一种治疗或诊断剂组合的治疗或诊断剂来实施，所述另一种治疗或诊断剂可以是但不限于糖酵解抑制剂、微管相互作用剂(microtubule-interacting agent)、抑细胞生长剂、叶酸抑制剂、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨激酶抑制剂、足叶草毒素或其衍生物、抗肿瘤抗生素、化疗剂、凋亡诱导剂、抗血管生成剂、氮芥、核酸插入剂、及它们的组合。这些治疗剂可进一步包含其他代谢抑制试剂。许多这种治疗剂为本领域已知的。该组合治疗方法提供同时、相继或分开用于治疗需要放大或保证患者对治疗方法应答的病症。
本发明方法可使用任何医学可接受的施用方式实施，并能产生活性化合物的有效水平而不导致临床不可接受的副反应。尽管优选特别适于胃肠外施用的制剂，但本发明组合物也可以气溶胶、喷雾剂、粉末、凝胶、洗剂、乳剂、栓剂、软膏和类似物的形式，被配置用于吸入、口服、局部、经皮、鼻内、眼内、肺部、直肠、粘膜、静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、胸内、胸膜内、子宫内、瘤内、或输注方法或施用。若需要这些制剂，也可包含本领域众所周知的其他添加剂以赋予制剂所需的稠度和其他特性。
本领域技术人员知道，施用治疗或诊断剂的特定方式取决于：选择的特定剂；施用是为了治疗、诊断还是预防疾病、病症、综合征或其症状；治疗或诊断的医学疾病的严重程度；以及治疗效力所需的剂量。举例来说，施用治疗白血病的抗癌剂的优选方式包括静脉内施用，而治疗皮肤癌的优选方法包括局部或皮内施用。
如本文使用，“有效量”指治疗或诊断剂在取得期望的治疗或诊断效果时的剂量或多重剂量。大体上，治疗或诊断剂的有效量可根据下述而改变：使用的特定剂的活性、该剂的代谢稳定性和作用时长；受试者的物种、年龄、体重、一般健康、饮食情况(dietary status)、性别和饮食(diet)；施用的方式和时间；排泄速率；药物组合(若有)；以及要治疗的特定病症的表现程度和/或严重程度而不同。准确剂量可无过多试验由本领域普通技术人员确定，以每天一次或几次施用来达到期望结果，而且剂量也可由独立医师调整来达到期望治疗效果或在发生任何并发症时调整。重要的是，当用于治疗癌症时，使用的治疗剂的剂量应足以抑制或杀死肿瘤细胞而正常细胞基本上不受伤害。
在本发明药物组合物中包含的治疗或诊断剂可被以任何需要量至可安全施用于患者的最高量制备。诊断剂或治疗剂的量范围可从少于0.01mg/mL至高于1000mg/mL，优选约50mg/mL。
总的来说，本发明药物组合物将以足以将有效调节PDH复合物的结构和/或活性的量的施用至患者的方式被递送。因此，剂量范围可从约0.3mg/m2至2000mg/m2，优选约60mg/m2。剂量可以一剂或以各个分开剂的形式施用，如每天一次至四次或更多次。在某一剂量下受试者的应答不足的情况下，可使用更高剂量(或通过不同的、更集中的递送途径的有效更高剂量)，至患者耐受的程度。为达到治疗或诊断剂合适的系统或靶向水平，可考虑每天多剂。
在本发明的另外一个实施方案中，本发明硫辛酸衍生物也可用作体外的诊断和预测剂。如前所述，根据论及的特定肿瘤细胞或细胞类型，不同的硫辛酸衍生物通过调节PDH复合物对抑制不同肿瘤种类可能具有或多或少的有效性。因此，举例来说，在诊断或选择适当的化疗策略困难的情况下，用已知靶向特定肿瘤细胞类型的硫辛酸衍生物对体外肿瘤细胞培养物的测定提供一种鉴定肿瘤类型和有效治疗的可选的方法。
转向附图，图3A显示在体内正常组织和肿瘤细胞中能量代谢的许多可能差异之一。与相应状态的正常细胞相比，肿瘤细胞的ATP产生常更多地依赖于细胞质的糖酵解而非线粒体能量代谢。PDH复合物表达和调节的改变显然是这种肿瘤特异适应的一部分。PDH催化组分水平的降低和/或产生这些效应的抑制性PDK的水平的增加可使肿瘤细胞比正常细胞对攻击PDH复合物的药剂更易感。
图3B描绘催化从PDH复合物中丙酮酸合成乙酰辅酶A中涉及的正常反应时的硫辛酸的结构。在体内，硫辛酸通过其非肽酰胺键上的羧基端连接于E2硫辛酰结构域活性位点上赖氨酸的ε氨基。同时注意，PDH E2-结合硫辛酸的氧化/还原/乙酰化状态是被控制PDH活性的激酶和磷酸酶通过控制PDH E1α亚基的磷酸化失活监测的。该图也描绘了可能在本发明中使用的三种代表性的硫辛酸衍生物的结构。CPI-613和CPI-045有高的抗癌效价，而CPI-157对细胞培养物很少或无活性且在几个试验中被用作对照。
图3C显示PDH复合物组分之间的关系，PDH复合物组分包括它结合的硫辛酸的E2、E1、调节的PDK。乙酰-硫辛酸或二氢硫辛酸(图中未示)的高水平激活PDK，其反过来通过失活E1α，即催化PDH复合物催化反应中第一步的亚基，抑制通过PDH复合物的更多流量。如图3A所见，这个过程充当通过PDH复合物的碳/能量流的调节器，并且这个调节过程被明显地改变以支持肿瘤细胞变异的能量代谢。
图4显示本发明药物组合物对异种移植肿瘤生长的效应。如实施例2所述，细胞皮下移植入小鼠背例部。然后，向小鼠腹膜内注射药物(或仅媒介物；“模拟”)，起始天数如图中所示。左图示本发明按1mg/kg或媒介物对照每周3次注射的胰腺肿瘤模型。这个试验是两次用BxPC-3细胞做的和两次用AsPC-1细胞做的典型代表。右侧三幅图显示按所示浓度每周一次(圈)、每周三次(倒三角)、或者每周五次(媒介物治疗为三角形；药物治疗为正方形)注射的H406肺肿瘤模型。这个试验是四次用H460细胞做的典型代表。
图5显示本发明药物组合物按200-300μM(“治疗的”)或者模拟治疗(“模拟治疗的”)对三种肿瘤细胞类型和一种未转化细胞类型(MDCK)的治疗效应。细胞在含10％血清的适当组织培养基中治疗48小时。三种癌症细胞系中通过凋亡或类凋亡途径大量细胞死亡(也见图11)通过实施例2所描述的方法观察。相反，未转化的MDCK细胞明显不被这个剂量的药物治疗影响。
图6A显示用致死阈(200μM在10％血清中)或以上的本发明药物组合物治疗后H460肺癌细胞的ATP水平。虚线代表按所示浓度的治疗。相应粗细的实线代表持续所示时间的治疗，随后去除药物并在无药物培养基中恢复60分钟。箭头表示ATP恢复的间隔。
图6B比较了在以丙酮酸(以甲基-丙酮酸的形式)作为主要碳源(虚线)的培养基中和以葡萄糖作为主要碳源(实线)的培养基中ATP合成的抑制作用。注意本发明药物组合物在两种培养基中最终以相同的阈浓度产生细胞死亡；然而，含丙酮酸的培养基中总细胞ATP水平早期消耗高并且含葡萄糖的培养基中无早期消耗。而且，在300μM比在200μM药物浓度时细胞死亡的起始更快。
图6C比较了在SK-Br-3乳腺癌细胞和MEC正常乳腺细胞中本发明药物组合物的ATP合成的抑制作用。不同于描绘于图6A和图6B的试验结果，这些试验在无血清培养基(MEBM)中做。结果，药物的致死阈较低，约50μM。注意22-小时正常细胞样品中ATP水平的少量下降与药物剂量无关并反映正常的试验差异。
图6D比较了本发明药物组合物(左图)、硫辛酸(中图)以及本发明的无活性形式(右图)对H460肺癌细胞中ATP合成的抑制。如图6C中，这些试验在无血清培养基中做，因此药物的致死阈为约5OμM。
图7显示本发明药物组合物(以在含10％血清的DMEM中400μM)对PDH(PDC)以及(αKDH)酶活性的肿瘤细胞线粒体水平的效应。注意，PDH强烈受抑，而αKDH则未。如实施例2所述，酶活性水平是在纯化的线粒体的提取物中使用应答于加入的碳源的刃天青还原测量的。背景线对应于缺乏添加的碳源的刃天青还原。
接下来，图8A中，对来自用本发明的药物组合物(在含10％血清的RPMI培养基中按400μM持续120分钟)治疗的(+)或模拟治疗(-)的H460肺癌细胞的提取物进行双向电泳凝胶的Western分析。Western转移物由针对PDH复合物E1α和E2亚基的单克隆抗体的混合物探测。Western转移物在E2亚基对齐。注意药物治疗样品中E1的高度磷酸化形式水平明显升高而低度磷酸化形式水平明显降低。左侧竖直白线显示对齐凝胶的标准之一，E2亚基的迁移。右侧竖直白线穿过较低磷酸化E1α形式，假定的酶活性组分。
图8B显示本发明的药物组合物治疗和模拟治疗的配对双向电泳凝胶样品的放大。部分A是图8A的部分的放大。部分B是以80μM组合物在MEBM无血清乳腺上皮细胞培养基中持续180分钟模拟治疗(-)和治疗(+)的SK-Br-3乳腺癌细胞。部分C是以80μM组合物在MEBM无血清乳腺上皮细胞培养基中持续240分钟模拟治疗(-)和治疗(+)的SK-Br-3乳腺癌细胞。部分D是以80μM组合物在MEBM无血清乳腺上皮细胞培养基中持续240分钟模拟治疗(-)和治疗(+)的HEMC正常乳腺细胞。竖直白线穿过较低磷酸化E1α形式，假定的酶活性成分。
图9A和9B描绘了本发明药物组合物在体内强大的、选择性抗癌效应的作用假说。比如，图9A显示了PDK受共价结合于PDC E2亚基的内源性硫辛酸调节时的调节作用。PDK正常情况下应答于还原的和/或乙酰化硫辛酸的高水平而使PDC失活，该过程在肿瘤细胞中被明显改变。
同时，图9B显示了PDC中PDK与它的底物PDC-E1的比率的巨大量化差异，被认为以在体内区别正常和肿瘤细胞。正常细胞中PDK的低水平被认为围绕PDH复合物交替“游走”(通过其两个二聚的亚基)，逐渐使E1磷酸化。这种磷酸化与PDP的脱磷酸处于稳态平衡中(未图示)。在此图示的作用假说中，thioctan通过正常结合乙酰基-硫辛酸和/或双脱氢硫辛酸的相同位点刺激PDK，由此人为地激活一个或多个PDK同种型使E1α失活。癌细胞中，明显更高的PDK水平可能通过thioctan使得这种刺激作用更有效于关闭PDC酶活性和线粒体能量代谢。
提供下列实施例以利于理解本发明的药物组合物。
实施例1
thioctan的化学合成
硫辛酸衍生物(即thioctan)CPI-613和CPI-157以6，8-二巯基辛酸作为起始物料通过使用改良的美国6,331,559B1和美国6,951,887B2所述的方法合成。Thioctan CPI-045按照US 6,331,559B1所述合成。
这三种thioctan的结构分析如下。CPI-613和CPI-157的多个独立合成在其抗癌特性上是不能区分的。在异体移植(图4)和ATP测量(图6)中使用的CPI-613的纯度超过99％。所有其他的制备物大于98％的纯度。
CPI-613：6，8-二苯6，8-二苯甲酰基硫烷基辛酸：白色晶状固体，熔点65-66℃(文献1 67.5-69°)；1H-NMR(250MHz，CDCl3)：δ7.15-7.4(m，10H)，3.66(s，2H)，3.64(s，2H)，2.52-2.62(m，1H)，2.50(t，J＝7.6Hz，2H)，2.29(t，J＝7.6Hz，2H)，1.2-1.8(m，8H)；13C-NMR(62.9MHz，CDCl3)：δ179.6，138.6，138.5，128.9，128.8，128.5，128.4，126.9，44.1，36.4，35.1，34.4，33.8，28.7，26.0，24.4.
CPI-157：6，8-二乙烷6，8-二乙基硫烷基辛酸：无色油状物；TLC(EtAc∶己烷∶HAc，200∶200∶1 v/v)：Rf＝0.60；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.64-2.76(m，1H)，2.65(t，J＝7.5Hz，2H)，2.52(q，J＝7.5Hz，2H)，2.49(q，J＝7.2Hz，2H)，2.36(t，J＝7.4Hz，2H)，1.40-1.85(m，8H)，1.25(t，J＝7.2Hz，3H)，1.22(t，J＝7.5Hz，3H)；13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ180.0，44.3，34.6，33.9，28.9，26.2，25.9，24.5，24.2，14.9，14.7；IR(薄膜)：2963，1708，1449，1423，1283，1263cm-1。
CPI-045：6，8-苯甲酰6，8-二苯甲酰基硫烷基辛酸：无色，粘稠油状物；TLC(己烷∶EtAc∶HAc，100∶50∶1 v/v)：Rf＝0.30；1H-NMR(250MHz，CDCl3)：δ7.9-8.1(m，4H)，7.38-7.60(m，6H)，3.8-4.0(m，IH)，3.0-3.3(m，2H)，2.34(t，J＝7.1Hz，2H)，1.4-2.2(m，8H)；13C-NMR(62.9MHz，CDCl3)：δ191.7，191.5，179.7，137.0，136.9，133.3，128.5，127.3，127.1，43.6，35.0，34.6，33.8，26.4，26.2，24.3；IR(薄膜)：2973，1710，1704，1667，1665，1662，1448，1207，1175，911，773，757，733，688，648cm-1。
实施例2
用于测定thioctan抗癌效应的方法
细胞：人肿瘤细胞系获取自ATCC并依据ATCC建议繁殖。人乳腺上皮细胞(HMEC)、小气道上皮细胞(SAEC)及正常人的表皮角质化细胞(NHEK)原代细胞获取自LONZA Walkersville，Inc(Walkersville，MD)。每种细胞系均在供应商开发的、购自供应商的适当培养基中按照供应商说明维持和繁殖。此处报道的试验使用在3至6代的正常细胞。
肿瘤生长抑制研究：将人BxPC-3或AsPC-1胰腺肿瘤细胞或H460NSCLC通过皮下注射(SC)移植于CD1-Nu/Nu雌鼠。约8-12天后，按图例所示的剂量及时间表腹膜内(IP)注射小鼠。药物或媒介物按每25gm体重大约2ml注射。药物浓度为1.25mg/ml(大约3.1mM)或更少。媒介物/溶剂由浓度为25mM或更少的三乙醇胺水溶液构成。模拟治疗动物注射的媒介物总是与该次试验中注射最高药物剂量的溶剂相同。每天监测小鼠的身体状况及死亡率。治疗前每天测定体重及肿瘤体积，治疗中及治疗后每周测量约三次。小鼠依据机构指导原则维持于12小时明/暗循环、随意获取食物并圈养于Stony Brook大学动物房。
细胞死亡测定：当时间足够长而不被早期ATP合成的thioctan抑制干扰时，大部分细胞存活测定使用CellTiter-Glo试剂(Promega)。(图6)典型实验中，细胞按每孔5,000个细胞铺板于黑色、透明底96-孔板。18-25小时后，用含药物溶剂(三乙醇胺水溶液血清培养基中按2.8mM和无血清培养基中按0.7mM)或相同溶剂中的CPI-613thioctan的新鲜培养基来替换培养基。依据药物剂量，按照厂家说明在药物加入后24或48小时进行测定。
有些情况下，细胞按每孔10,000个细胞铺板于48-孔板，并且18-25小时后，用含药物溶剂(约1％乙醇终浓度)或相同溶剂中不同浓度的CPI-045thioctan的新鲜培养基来替换培养基。细胞维持于溶剂或含药培养基以继续实验。加入药物后24，48，72小时观察平板，并估算细胞数目为融合百分比。在这些条件下，在接近阈值的剂量下，thioctan诱导的细胞死亡是高度凋亡的，并且估算的细胞数是死亡十分可靠的指示物。(图7)在72小时保持的细胞完整性，如果有，通过台盼蓝排除法测定。
表1提供关于thioctan体外对肿瘤细胞的作用数据。所列是我们已考察了对CPI-613和/或CPI-045杀伤的敏感性的人肿瘤和人原代细胞。“+”表示细胞在约200-300μM(含10％血清)剂量和约50μM在无血清培养基的剂量下出现凋亡或类坏死的细胞死亡。(图5和6)“--”表示这些细胞在相应培养基中需约5倍高剂量来诱导细胞死亡。“nt”表示未试验的组合。如同图5中的MDCK正常细胞，所有肿瘤细胞系在含10％血清的适当培养基中分析。另外，HMEC、SAEC、NHKC人原代细胞和SK-BR-3、A549和H460肿瘤细胞系也在适当的无血清培养基中分析。原代细胞被接触抑制并且转化的细胞密度相当。
ATP测定：细胞按每孔5,000个细胞铺板于黑色透明底96-孔板。18-25h后，按所示时间间隔和药物浓度用含药物溶剂(三乙醇胺)或thioctan(CPI-613或CPI-157)或硫辛酸的新鲜培养基来替换培养基。细胞存活和完整性通过去除药物后回收用台盼蓝排除法测定。按照厂家说明书使用CellTiter-Glo发光测定(Promega)测量ATP。所有测量均重复进行，并表现高度一致性。均值的标准误差范围是测量值的0.1-2％。因此，图6中误差棒被省略。图6中的甲基丙酮酸培养基由无葡萄糖的RPMI(Invitrogen)构成，添加有10％经透析的胎牛血清、5mM HEPES(pH7.4)、和10mM甲基丙酮酸(Sigma-Aldrich)，并且相应的葡萄糖培养基是常规RPMI(Invitrogen)。
PDH和αKDH酶测定：15cm平板上肿瘤细胞长至80％融合，并按所示用CPI-613治疗。按照Moreadith和Fiskum1的方法分离线粒体。线粒体在0.4％月桂基麦芽苷中裂解。将50μl线粒体裂解物加入至96-孔板。向线粒体裂解物加入50μl反应混合物(50mM Tris，pH 7.5，2mM β-NAD+，225uMv TPP，2mM丙酮酸或α-酮戊二酸、150μM辅酶A、2.6mM半胱氨酸、1mM MgCl2)，并将混合物在37℃孵育45分钟。这时，加入15μM刃天青和0.5U/ml硫辛酰胺脱氢酶至混合物并继续孵育5分钟。通过在微板读数仪(Fluorostar)上使用530nm激发波长和590nm发射波长测定荧光来监测NADH的产生。所有测定均重复进行，并显示高度一致性。均值的标准误范围是测量值的0.3-4％。因此，图7中误差棒被省略。
E1α磷酸化：
细胞裂解物的2-D凝胶：细胞在60mm平皿上长至95％融合，并用所示的药物或溶剂治疗。用450μl裂解缓冲液A[455μl Zoom 2D蛋白助溶剂1(Invitrogen)，2.5μl IM Tris碱，5μl 100X蛋白酶抑制剂混合物(Completemin，无EDTA，Roche)；5μl 2M DTT]原位裂解细胞。将细胞裂解物转移至1.5ml微量离心管并50％功率冰上超声15轮回。室温孵育10分钟后加入2.5μl二甲基丙烯酰胺(DMA，Sigma-Aldrich)，并继续孵育10分钟裂解物。加入5μl 2M DTT以中和过量的DMA。将裂解物在16,000×g离心15分钟。
2-D凝胶：我们按照说明书使用Zoom Benchtop蛋白组系统(Invitrogen)。简言之，将30-50μl裂解物与0.8μl pH 3-10的两性电解质、0.75μl 2M DTT混合，并用Zoom 2D蛋白助溶剂1定容至150μl。将150μl样品加样至IPG电泳仪中，并加入pH 3-10NL IPG胶条。将IPG胶条室温下浸泡过夜。将分步方案用于等电聚焦(250V，20分钟；450V，15分钟；750V，15分钟2000V，30分钟)。胶条用1×上样缓冲液处理15分钟，再用加入160mM碘乙酸的1×上样缓冲液处理15分钟。将胶条在NuPAGE 4-12％Bis Tris ZOOM胶(Invitrogen)上电泳。
表1：thioctan对肿瘤和原代细胞的体外效应
Figure BPA00001249978400251
Western：蛋白印迹于PVDF 4.5μm膜。使用单抗(Invitrogen)检测PDHE1α和E2。
胱天蛋白酶-3和PARP裂解：按照Roy和Nicholson43在Western印迹检测裂解的胱天蛋白酶-3。简言之，药物或溶剂治疗后，刮出细胞并将培养基/细胞/凋亡体混合物6,000×g离心。用裂解缓冲液C(4M尿素，10％甘油，2％SDS，0.003％BPB；5％2-巯基乙醇)裂解沉淀。将每孔30μg总细胞裂解蛋白上样至12％Bis-Tris胶。蛋白印迹于PVDF 4.5μm膜。用抗胱天蛋白酶-3的单抗(鼠单克隆[31A1067]；abcam)检测原-胱天蛋白酶-3和活性-胱天蛋白酶-3。使用抗-聚(ADP-核糖)聚合酶单抗，克隆C-2-10(Sigma-Aldrich)检测PARP裂解。
线粒体Ca+2检测：细胞按3×105接种于35mm玻璃底板(BDBiosciences)，生长过夜，并用所示药物或溶剂治疗。然后，在无酚红培养基中用钙染料Fluo-4、X-Rhod-1或Rhod-2(4μM，Invitrogen)加样细胞，并在37℃孵育10分钟。PBS洗细胞一次，并使用FITC滤波片，在固定的暴露时间使用Axiovert 200M(Zeiss)去卷积显微镜捕获图片。用由厂家提供的软件进行荧光定量。X-Rhod-1和Rhod-2的结果类似(图10)，说明这些染料测量线粒体Ca+2信号。3-4
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实施例3
Thioctan干扰线粒体膜电位和Ca+2摄入
Thioctan对ATP合成抑制的底物效应(图6)显示该药物干扰线粒体基质中的TCA循环。若确实如此，我们期望线粒体膜电位1可能在致死阈剂量及以上时降低。使用电位-敏感的染料TMRE，我们观测到期望效应。(图10)随着药物治疗的开始，线粒体膜电位快速下降。膜电位下降的动力学极其类似于存在线粒体底物时ATP合成的损失。(图6)
已知线粒体中ATP的减少激发包括摄入从细胞质储备(包括内质网)中释放的Ca+2的摄取的平衡稳态反应。而且，认为这种Ca+2至线粒体基质的输入需要线粒体膜电位。因此，我们期望基于持续下降的膜电位，thioctan在致死阈或以上的治疗可产生持续的细胞质Ca+2释放伴随瞬时的线粒体的离子摄入。使用X-Rhod-1和Rhod-2测定线粒体Ca+2并使用Fluo-4测定细胞质Ca+2，我们观察到这些预期效应。(图10)
通过以致死阈和稍高的CIP剂量(比较图6和10)约2小时-当线粒体膜电位下降-这种初始的线粒体Ca+2瞬时下降。随后在4-6小时出现被认为与钙依赖的细胞死亡途径的开启有关的第二大线粒体Ca+2峰。3
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实施例4
Thioctan诱发多种细胞死亡程序
尽管详细机制未完全明了，已知有些情况下线粒体能量代谢的降低与进入细胞死亡途径的决定相关。1-3在thioctan剂量高于致死阈但在该最小致死剂量2倍内时，所有试验的癌细胞类型经历形态学主要类似于凋亡的细胞死亡。(图5)这些情况下的凋亡式死亡已由常规的膜联蛋白免疫染色和TUNEL DNA末端-标记测定证实(结果未显示)。
在更高药物剂量(超过致死阈约2倍以上)，活性thioctan诱导细胞死亡(如用再铺板(replating)存活测定和台盼蓝或丙啶排除所评定的)，与凋亡无形态学相关，暗示坏死样途径(结果未给出)。
这些数据证实thioctan CPI-613抑制线粒体能量代谢确与细胞死亡诱导相关。
已知或推测含不同的和多样的细胞死亡途径4的失活突变的多样的肿瘤细胞均以极其类似的thioctan剂量被杀死(图5和表1)，该发现令人震惊。这个发现暗示这些药物诱导一种能够参与多个、潜在过剩的远端细胞死亡执行途径的主要信号。5
与这种可能性一致，我们发现Z-VAD-FMK类胱天蛋白酶抑制剂微妙地改变thioctan治疗细胞中的细胞死亡形态，但对药物的致死阈剂量无可识别的效应。
为进一步研究thioctan诱导的细胞死亡可通过多个终端执行机理而进行的可能性，我们检验了胱天蛋白酶-3和PARP-1裂解-不同细胞死亡途径的诊断。5我们发现thioctan CPI-613和CPI-045都在不同细胞中诱导这两种裂解事件的高度可变的水平。(图11)
总之，这些结果表明：thioctan能够诱导对死亡的战略性保证，而根据药物剂量和细胞类型，这种战略性保证对于该决定的终端战术执行是不可预知的。
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前述讨论仅公开和描述了本发明示例性的实施方案。依据这种讨论及所附权利要求，本领域技术人员将轻而易举地认识到其中可做出各种更改、改进和调整而不背离下列权利要求所限定的本发明的精神和范围。而且，虽然在此已表述示例性的实施方案，但本领域实施的其他实施方案也可获悉本发明的其他设计或使用。因此，虽然本发明已连同其示例性实施方案而被描述，但应理解在设计和使用上的许多改进对本领域技术人员是显然的，并且期望本申请包括其任何调整或变动。因此明确期望本发明仅受权利要求及其等效物所限制。

Claims (38)

1.温血动物病态细胞线粒体中至少一种酶复合物的结构和/或活性的药学可接受的调节剂，所述酶复合物例如改变的丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物，所述温血动物包括人。
2.如权利要求1所述的调节剂，含有至少一种硫辛酸衍生物及至少一种其药学可接受的载体。
3.如权利要求1所述的调节剂，其中所述酶复合物有激酶活性、磷酸酶活性和/或脱氢酶活性。
4.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂促进或抑制激酶活性。
5.如权利要求4所述的调节剂，其中所述激酶选自包括丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)1、PDK2、PDK3、PDK4以及它们各自的同种型的组。
6.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂促进或抑制磷酸酶活性。
7.如权利要求6所述的调节剂，其中所述磷酸酶选自包括丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)1、PDP2以及它们各自的同种型的组。
8.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂促进或抑制脱氢酶活性。
9.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节是通过改变PDH复合物的磷酸化状态实现的。
10.如权利要求9所述的调节剂，其中所述调节发生在PDH复合物的E1α亚基。
11.如权利要求10所述的调节剂，其中所述调节通过失活PDP及其同种型和突变体而发生。
12.如权利要求10所述的调节剂，其中所述调节通过激活PDK及其同种型和突变体而发生。
13.如权利要求9所述的调节剂，其中所述调节剂防止无氧能量代谢的毒性代谢物的解毒。
14.如权利要求13所述的调节剂，其中所述代谢物选自由乙醛、过氧化物、过氧化氢和羟基自由基组成的组。
15.如权利要求13所述的调节剂，其中调节效应通过乙偶姻生成的降低而观察。
16.如权利要求9所述的调节剂，其中磷酸化或去磷酸化是不可逆的。
17.如权利要求16所述的调节剂，其中所述磷酸化或去磷酸化效应导致细胞死亡。
18.如权利要求17所述的调节剂，其中所述效应是凋亡。
19.如权利要求17所述的调节剂，其中所述效应是坏死。
20.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂影响PDK及其同种型和突变体的表达水平。
21.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂影响PDP及其同种型和突变体的表达水平。
22.如权利要求20或21所述的调节剂，其中所述表达水平是在转录、翻译或翻译后的水平改变的。
23.如权利要求22所述的调节剂，其中所述改变是后生的。
24.如权利要求2所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物具有下式或其盐：
Figure FPA00001249978300021
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、烷基CnH2n+1、烯CnH2n、烯基CnH2n-1、炔CnH2n-2、炔基CnH2n-3、烷基硫CH3(CH2)n-S-、烷基化二硫CH3CHt-S-S-、硫代氨基甲酸酯(CH2)nC＝NH-和硫代半缩醛CH3CH(OH)-S-，其中n是1-10且t是0-9；芳香族；以R3C(O)-定义的酰基；杂芳基；以R4C(＝NH)-定义的亚氨基；有机金属芳基；烷基-有机金属芳基；以及半缩醛R5CH(OH)-S-；
其中，上述定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由以下组成的组：氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基和有机金属芳基，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R4选自由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5是CCl3、CF3或COOH；
并且其中，x是0-16。
25.如权利要求2所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物具有下式或其盐：
Figure FPA00001249978300031
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-或金属鳌合物或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R3C(O)-、烷基CnH2n+1、以CnH2n-1定义的烯基、以CnH2n-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R3C(＝NH)-定义的亚氨基和以R4CH(OH)-S-定义的半缩醛；
其中，上述定义的R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3和R4独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基和杂环基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由-CCl3、-CF3或-COOH组成的组；
并且其中，x是0-16、z是0-5，并且n是0-10。
26.如权利要求2所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物具有下式或其盐：
Figure FPA00001249978300041
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、烷基CnH2n+1、烯CnH2n、烯基CnH2n-1、炔CnH2n-2、炔基CnH2n-3、烷基硫CH3(CH2)n-S-、烷基化二硫CH3CHt-S-S-、硫代氨基甲酸酯(CH2)nC＝NH-和硫代半缩醛CH3CH(OH)-S-，其中n是1-10且t是0-9，芳香族、以R4C(O)-定义的酰基、杂芳基、以R5C(＝NH)-定义的亚氨基、有机金属芳基、烷基-有机金属芳基、半缩醛R6CH(OH)-S-、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和它们的多聚体和组合；
其中，R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质和其多聚体组成的组；
其中，R4选自由氢、烯基、炔基、烷基芳基、杂芳基、烷基杂芳基和有机金属芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由氢、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、杂芳基和烷基杂芳基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R6是CCl3、CF3或COOH；
并且其中，x是0-16。
27.如权利要求2所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物具有下式或其盐：
Figure FPA00001249978300051
其中，M是共价键、-[C(R1)(R2)]z-或金属鳌合物或其他金属配合物，其中所述金属不是钯；
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：氢、酰基R4C(O)-、烷基CnH2n+1、以CmH2m-1定义的烯基、以CmH2m-3定义的炔基、芳基、杂芳基、烷基硫CH3(CH2)n-S-、以R4C(＝NH)-定义的亚氨基、以R6CH(OH)-S-定义的半缩醛、氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质、和它们的多聚体和组合；
其中，R1和R2可是未取代或取代的；
其中，R3选自由氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质和其多聚体组成的组；
其中，R4和R5独立地选自由氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷基芳基、杂芳基和杂环基组成的组，其任一个可是取代或未取代的；
其中，R5选自由CCl3、CF3或COOH组成的组；
并且其中，x是0-16，z是0-5，n是0-10，且m是2-10。
28.如权利要求24、25、26或27所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物仅以其(R)-异构体存在。
29.如权利要求24、25、26或27所述的调节剂，其中所述硫辛酸衍生物以其(R)-异构体和(S)-异构体的混合物存在。
30.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂用于治疗和诊断特征为PDH复合物结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征。
31.如权利要求30所述的调节剂，其中所述疾病、病症或综合征进一步特征为细胞过度增殖。
32.如权利要求31所述的调节剂，其中所述疾病、病症或综合征是癌症。
33.一种在呈现特征为PDH复合物结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征的患者中调节PDH复合物的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1所述的调节剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述疾病、病症或综合征进一步特征为细胞过度增殖。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述疾病、病症或综合征是癌症。
36.一种在呈现特征为PDH复合物的结构和/或活性改变的疾病、病症或综合征的症状的患者中诊断和预测益处的方法，所述方法包括：从患者获得细胞样品，在体外向所述细胞施用有效量的权利要求1所述的调节剂，并从其中获得结果。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述疾病、病症或综合征进一步特征为细胞过度增殖。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述疾病、病症或综合征是癌症。
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