KR20110004846A

KR20110004846A - 효소의 구조, 활성 및/또는 발현 정도의 조절

Info

Publication number: KR20110004846A
Application number: KR1020107022085A
Authority: KR
Inventors: 로버트 쇼어; 로버트 로드리게즈; 라진더 바신; 폴 빙함; 락말 더블유. 보테주; 주자나 자칼
Original assignee: 로버트 쇼어; 로버트 로드리게즈
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2008-03-04
Publication date: 2011-01-14
Also published as: JP2011513395A; EP2260019A4; EP2260019A1; AU2008352076A1; MX2010009673A; IL207943A0; WO2009110859A1; BRPI0821176A2; CN102089276A; CA2717511A1

Abstract

본 발명은 인간을 포함한 온혈 동물의 미토콘드리아 내에서 변형된 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 복합체와 같은 효소 복합체의 구조, 활성 또는 발현 정도를 조절하는 약학적으로 허용가능한 조절제 및 그 사용 방법을 제공하며, 본 발명의 조절제는 유효량의 적어도 하나의 리포산 유도체와 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 함유한다. 조절제는 PD 복합체 E1α 서브유니트의 활성을 억제시켜 무산소성 해당작용의 독성 대사산물의 해독을 방해함으로써, PD 키나제 활성을 증가시키고, 이와 동반해서 PD 포스파타제 활성을 감소시키며, 이로 인해 미토콘드리아 내에서 산화성 인산화 활성이 증가되도록 한다. 또한, 종양 세포와 같이 과증식에 의해 특성이 나타나는 세포는 PD 복합체의 E2 서브유니트의 활성을 억제시키는 조절제의 작용으로 인해 아세틸-CoA 및 NADH를 생성할 수 없기 때문에, 미토콘드리아 막 분극(membrane polarization)이 상실되며, 이로써 세포 사멸을 유발한다.

Description

효소의 구조, 활성 및/또는 발현 정도의 조절{MODULATION OF ENZYMATIC STRUCTURE, ACTIVITY, AND/OR EXPRESSION LEVEL}

본 발명은 암 세포를 포함하여 과증식에 의해 특성이 나타나는 세포 내로 선택적으로 흡수되어, 효소의 구조, 활성 및/또는 발현 정도를 조절(modulation)함으로써, 상기 세포의 파괴를 촉진시키며, 특히, 대부분의 암과 관련있는 변형 미토콘드리아 피루베이트 데하이드로게나제(PDH, pyruvate dehydrogenase) 복합체를 표적화하는 치료 및 진단 조성물, 특히 약제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

성장이 빠른 대부분의 종양 세포는 비형질전환 세포(nontransformed cell)와 유전적, 생화학적, 및 조직학적 차이가 크며, 원 조직과 비교해서 현저히 변화된 에너지 대사를 보인다. 종양 세포에 있어서 가장 악명높고 잘 알려진 에너지 대사 변화는 고농도의 O₂ 존재하에서도 해당작용 능력(glycolytic capacity)이 높은 현상이다. 이러한 현상을 와버그 효과(Warburg effect)라고 한다.

와버그는 종양 세포에서의 높은 해당작용의 구동력은 미토콘드리아 기능의 비가역적 손상에 의해 야기되는 에너지 결핍이며, 종양 세포에서는 무산소 근육에서와 마찬가지로 포도당이 해당작용을 통해 이후에 분비되는 젖산염(lactate)으로 전환된다는 것을 처음으로 제안하였다. 종양 세포에서의 이러한 해당작용 흐름의 증가는 저산소 고형 종양에서 관찰되는 부분성 저산소증과 같이, O₂ 농도가 낮은 환경에서 생존 및 증식하기 위한 대사 전략(metabolic strategy)이라는 것이 제안되었다. 특히, 많은 사람의 저산소증 종양 내의 O₂ 농도가 20㎛보다 낮기 때문에, 산화적 인산화가 거기서 제한된다. 따라서, 해당작용이 고형 종양 세포(예를 들어, 성장이 느린 흑생종 및 유방암종)에서 주 에너지 경로인 듯하다.

세포 증식 속도와 ATP 공급 속도 사이의 비례 관계는 성장이 빠른 종양 세포에서 확인되었다. 몇몇 제안자는 해당작용 활성은 종양의 악성 정도와 상관이 있으며, 따라서 해당작용 속도는 성장이 느린 종양 또는 정상 세포보다는 고도의 미분화된 성장이 빠른 종양에서 높다는 것을 제안하였다. 실제로, 고함량의 젖산염이 악성의 예측변수로서 제안되고 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 수년간 트리카르복실산(TCA) 사이클은 유기체의 에너지원으로서 ATP의 생성 과정에서만 그 역할이 생물학적으로 상당히 중요한 것으로 간주되었다. 그러나, 최근 연구에서, TCA 사이클 활성이 세포 증식 및 사멸 결정을 포함하여 신호 전달 경로 기능에도 영향을 미치며, 해당작용 및 TCA 사이클 관련 효소는 상향조절(up-regulated)되거나 하향조절(down-regulated)될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 성장이 빠른 종양 세포에서 매우 증가되는 해당작용 효소인 헥사키나제 및 포스포프룩토키나제(PFK) 1의 활성과 종양 진행 정도 사이에는 직접적인 상관관계가 있다. 따라서, 산화 능력에서 결핍을 보이는 종양 세포가 활성적인 산화적 인산화를 보이는 종양 세포보다 악성인 것으로 추정된다. 저산소 조건이든 산소적 조건이든 간에, 암 조직의 해당작용 의존성은 악성 증가와 관련이 있다.

PDH 복합체에서의 리포산(lipoic acid)의 역할에 대해서는 잘 연구되고 있다. PDH 복합체는 3개의 중심 서브유니트, E1, E2, 및 E3(각각, 피루베이트 데하이드로게나제, 디하이드로리포일 트랜스아세틸라제, 및 디하이드로리포아미드 데하이드로게나제)를 함유한다. 이 복합체는 중심 E2 코어가 있고, 다른 2개 서브유니트가 이 코어를 둘러싸서 복합체를 형성한다. 상기 2개 서브유니트 사이의 간극 내에서, 리포일 도메인은 활성 자리 사이의 중간물질을 전달한다. 리포일 도메인 자체는 가요성 링커에 의해 E2 코어에 결합되어 있다. 피루베이트 및 피로인산 티아민의 반응에 의해 헤미티오아세탈이 생성될 때, 이 음이온은 리신 잔기에 부착되어 있는 산화 리포에이트 종의 S1을 공격한다. 그 결과, 리포에이트 S2가 황화물 또는 설프히드릴(sulfhydryl) 부분으로 대체되고, 이후 테트라헤드랄 헤미티아졸아세탈의 분해로 인해 티아졸이 생성되며, 이로써 TPP 보조인자가 방출되고 리포에이트의 S1에 티오아세테이트가 생성된다. 이 시점에서, 리포에이트-티오에스테르 작용기가 E2 활성 자리로 이동되며, 여기서 트랜스아실레이션 반응에 의해 리포에이트의 "스윙 암(swinging arm)"의 아세틸이 조효소 A의 티올로 이동한다. 이로써, 아세틸-CoA가 생성되는데, 이 물질은 효소 복합체로부터 방출되어 TCA 사이클로 투입된다. 그 다음, 여전히 복합체의 리신 잔류물과 결합되어 있는 디하이드로리포에이트가 E3 활성 자리로 이동하는데, 여기서 플라빈-중간체로 하는 산화과정을 거치게 되어 리포에이트 휴지 상태로 되돌아감으로써, FADH₂ (및 최종적으로 NADH)를 생성하고 리포에이트는 완전한 아실 수용체로 재생성된다. 그 다음, 이 리포에이트 종이 차단되면, 전자의 FADH₂로의 흐름 또는 아세틸-CoA의 생성이 이루어지지 않으며, 결과적으로 세포 내에 피루베이트의 독성물질이 축적된다.

미토콘드리아 내의 PDH 복합체의 활성은 다양한 알로스테틱 효과인자(allosteric effector)에 의해, 그리고 공유결합적 변형에 의해 고도로 조절될 수 있다. PDH 활성은 그 인산화 상태에 의해 조절되며, 탈인산화 상태에서 가장 활성을 나타낸다. PDH 인산화는 PDH 키나제(PDK)에 의해 촉매화된다. PDK 활성은 ATP, NADH 및 아세틸-CoA의 양의 증가에 의해 증가된다. 탈인산화를 통해 PDH를 활성화시키는 효소인 PDH 포스파타제(PDP)의 조절에 대해 완전히 밝혀진 것은 아니지만, Mg⁺²및 Ca⁺²가 PDP를 활성화시킨다는 것은 알려져 있다.

복합체의 두가지 생성물인 NADH와 아세틸-CoA는 PDH-a(PDH의 탈인산화 활성 형태)의 음성 알로스테틱 효과인자이다. 이 효과인자는 피루베이트에 대한 효소의 친화성을 감소시킴으로써, PDH 복합체를 통한 탄소 흐름을 제한한다. 또한, NADH와 아세틸-CoA는 PDH를 인산화 PDH-b 형태로 전환시킴으로써 PDH를 불활성화시키는 효소인 PDK의 강력한 양성 알로스테틱 효과인자이다. NADH와 아세틸-CoA는 세포 에너지 전하(energy charge)가 높을 때 축적되기 때문에, ATP 농도 높으면 또한 PDK 활성이 상향 조절됨으로써 에너지가 풍부한 세포 내의 PDH 활성이 하향조절된다는 사실이 놀랄만한 것은 아니다. 그러나, 피루베이트는 PDK의 강력한 음의 효과인자이기 때문에, 피루베이트의 양이 증가하면, NADH와 아세틸-CoA의 양이 많을 경우에도 PDH-a가 촉진될 것이다.

PDH-a를 유지하는 피루베이트 농도는, ATP가 풍부한 세포 내에서, PDH의 알로스테릭하게 하향조절된 높은 Km 형태가 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있도록 충분히 높아야 한다. ATP 및 NADH 농도가 높은 세포 내의 피루베이트의 양이 많으면, 피루베이트 탄소는 두가지 탄소의 저장 형태(글리코겐 대 글루코네오제네시스 및 지방 생성 대 지방산 합성)로 변하게 될 것이다. 여기서 아세틸-CoA는 주된 탄소 공여자이다. PDP-b의 조절에 대해서는 잘 알려져 있지 않지만, ATP 농도가 감소되면 피루베이트 산화가 최대화되고, ATP 농도가 증가되면 PDH 활성이 최소화될 수 있도록 조절되는 것으로 추측된다.

종양 세포는 피루베이트 및 관련 알데히드와 라디칼, 예를 들어 아세트알데히드, 슈퍼옥사이드, 과산화 수소 및 수산기를 무한정 축적할 수 없다. 그 이유는 이러한 분자가 세포의 pH를 현저히 감소시키는 메카니즘을 통해 고농도에서 세포독성을 나타내기 때문이다. 따라서, AS-30D 및 에를리히 간종양(Ehrlich hepatomas)의 경우, 결합된 β-히드록시에틸티아민 피로포스페이트를 통해 PDH 복합체의 E1 성분에 의해 상당 분율의 미토콘드리아 피루베이트가 활성 아세트알데히드로 탈카르복실화된다. 이 활성 아세트알데히드는 차례로 제 2 아세트알데히드와 축합되고, 결국 아미노산 글루타민 또는 리포산에 의해 원 피루베이트를 탈산성화 또는 환원시킴으로써, PDH를 완전히 억제하며 피루베이트 전구체보다 세포에 덜 독성인 화합물인 아세토인(3-히드록시부타논)을 생성시킨다(예를 들어, 세포내에서 pH 항상성을 유지함으로써). 그러나, ATP 생성원으로서 해당작용의 종양 세포 의존성 때문에, 피루베이트 축적의 결과로서 종양 세포 해독 경로에 있어서 아세토인의 중요성에도 불구하고, 종래 기술에는 아세토인 생성을 차단하는 것이 종양 세포 생존력에 미치는 영향에 대한 문헌이 거의 없다.

최근 연구에서, 암 세포가 보다 산소 호흡을 하도록 강제하는 것이 종양 성장을 억제시킨다는 점이 제안되었다. 그러므로, 와버그 대사로의 변화는 PDH 복합체의 차단을 필요로 한다. 이러한 변화에서, 암세포에서 저산소-유도 인자(HIF)에 의해 신호전달이 증가되는데, 도 2에 도시한 바와 같이, 포도당의 대사에서 HIF의 역할이 중요하다는 사실이 놀랄만한 것은 아니다. 실제로 HIF 신호전달을 직접 또는 간접으로 유발시키는 변이가 통상적인 암의 진행 메카니즘인 것으로 보인다. HIF는 PDK1의 과다발현을 유도하며, 이로써 PDH 복합체 활성을 낮추는 역할을 한다. 불활성 PDH 복합체를 유지하는데에는 PDK1에 의한 인산화가 특히 효과적인데, 그 이유는 그 이성체(isoform)가 유일하게 PDH 복합체의 첫번째 서브유니트인 E1 알파 서브유니트 내의 3개의 세린 잔기를 인산화시키기 때문이다. E1의 재활성화는 3개의 모든 인산염 기의 제거를 필요로 한다. 더욱이, PDH 복합체 활성은 반응성 산소 종의 생성을 증가시킬 수 있으며, 차례로 아폽토시스로 유도할 수 있다. 그러나, 암에서 관측되는 PDK1의 변화는 농도의 변화 뿐만 아니라 그 활성의 변화 및 한 종양 종류 또는 한 환자에서 다른 종양 또는 환자까지 사이의 아미노산 배열의 변화 때문일 수 있다. 또한, PDK1은 종양과 관련있는 다양한 분자와 상이한 복합체를 형성할 수 있는데, 이는 종양 종류에 따라 좌우된다. 따라서 PDK의 억제는 종양의 아폽토시스를 유발하는데 있어서 잠정적인 목표가 될 수 있다. 그러나, 현재까지, 알려진 PDK 1 억제제는 최대로 동질 효소의 60%만을 억제시키는 것으로 나타났다.

통상적인 화학요법은 분화성 증식성 세포를 표적으로 하고 있으나, 모든 임상적으로 허용된 화학요법 치료는 정상적인 분화성 숙주 세포에도 심각한 손상을 줄 수 있는 다량의 약물을 사용한다. 따라서, 암 치료에 보다 선택적인 표적화가 요구된다. 화학요법과 관련한 또 다른 문제점은, 많은 종양 종류에 있어서, 항종양성(antineoplastic) 약물에 선천성 또는 후천성 내성이 있다는 점이다. 전체적으로, 통상적인 화학요법은 현재 대부분의 악성 종양에 장기적인 이점을 거의 제공하지 못하며, 종종 수명 또는 삶의 질을 저하시키는 부작용을 가진다. 그러므로 남부럽지 않은 삶의 질을 보장하면서 종양을 장기간 관리할 수 있는 근본적이고 신규한 방안이 요구된다.

확실히, 신규한 화학요법을 개발하는데 있어서, 해결해야 할 문제는 약물의 효능, 전달 및 부작용이다. 고형 종양에 있어서, 약물이 상이한 세포층에 용이하게 스며들지 못하는 경우에는 저산소 영역(hypoxic region)으로의 전달이 어려울 수 있다. 이러한 불확실성을 없애기 위해서, 적어도 서브마이크로몰라 범위(submicromolar range)의 대사 억제 상수를 갖는 항암제를 설계하는 것이 적절할 것이다. 암세포는 유전적이고 형질 다양성을 가진다는 점을 주장할 수 있다. 그러나, 모든 암세포주는 ATP 공급을 위해 해당작용 및 산화성 인산화에 의존한다. 와버그 효과의 면에서 보면, 건강한 숙주 조직 및 기관의 기능에 영향을 주지 않으면서 종양의 대사 및 증식에만 선택적으로 작용하는 전달 수단 및 치료 전략을 촉진시키기 위해서, 종양 세포와 정상 세포 사이의 물리화학적 및 생화학적 강력한 차이를 기반으로 하는 약물을 제조할 수 있다.

본 명세서에서 참고문헌으로 소개되어 있는 미국 특허 제 6,331,559 호 및 제 6,951,887 호(Bingham et al) 뿐만 아니라 미국 특허 가출원 제 60/912,598 호(Bingham et al)는 종양 세포 및 다른 특정 종류의 질병 세포를 선택적으로 표적화하여 죽이는 신규한 리포산 유도체 치료제를 개시한다. 상기 특허들은 또한 유효량의 리포산 유도체와 약학적으로 허용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)를 함유하는 약제 조성물 및 그 사용 방법을 개시한다. 그러나, 상기 특허들은 리포산 유도체의 구조 및 일반적인 용도에 대해서는 기술하고 있지만, 이러한 유도체가 PDH 복합체의 구조 및/또는 발현 정도를 조절하는데, 및/또는 PDH 복합체의 활성을 조절하는데 유용하다는 점에 대한 언급은 전혀 없다.

PDH 복합체의 구조 및/또는 활성은 종양 활성의 중요한 결정요인이라는 점이 밝혀졌기 때문에, PDH 복합체의 구조 및/또는 활성, 또는 발현 정도까지도 조절하는 약학적으로 허용가능한 조절제 및 그 사용 방법을 제공하는 것이 유익할 것이다.

본 발명의 목적 및 산업상 이용가능성

따라서, 본 발명의 목적은 암과 같이 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 진단 및 치료하는데 사용되는 조성물로서, 종양 세포에 대해 선택적 활성을 가지는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 앞서 언급한 질병, 이상 또는 증후군을 진단 및 치료하는데 사용되는 조성물로서, 투여에 따른 부작용을 최소화시킬 수 있는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 앞서 언급한 질병, 이상 또는 증후군을 진단 및 치료하는데 사용되는 조성물로서, 가능한 최소의 비용으로 용이하게 제조되고 가능한 최장 기간 동안 저장할 수 있는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 앞서 언급한 질병, 이상 또는 증후군을 진단 및 치료하는데 사용되는 조성물로서, 종양 세포 미토콘드리아 내의 PDH 복합체의 구조, 활성 및/또는 발현 정도를 조절하는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 개요

전술한 목적에 따라서, 본 발명은 인간을 포함한 온혈 동물의 암과 같이, 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 포함해서, PDH 복합체와 같은 적어도 하나의 효소 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 치료, 진단 또는 예방하는데 유용한 약제 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제 조성물은 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되어 있는 미국 특허 제 6,331,559 호 및 제 6,951,887 호와 미국 특허 가출원 제 60/912,598 호에 개시되어 있는 리포산 유도체를 포함하는 유효량의 적어도 하나의 리포산 유도체와, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 함유한다.

본 발명의 리포산 유도체는 미토콘드리아 에너지 대사를 억제함으로써, 질병 세포에서 미토콘드리아 막 전위 및 다른 미토콘드리아 기능을 손상시켜 비가역적 세포 사멸이 유발되도록 한다. 본 발명의 리포산 유도체는 또한 PDK를 활성화시키거나 및/또는 PDP를 억제함으로써, 또는 PDH 복합체의 E1 서브유니트의 활성 억제를 통해 피루베이트가 덜 독성 분자인 아세토인으로 전환되는 것을 억제함으로써, 미토콘드리아 에너지 대사를 억제할 수 있다. 아세토인 합성이 억제되면, 산화환원 밸런스를 포함한 다른 프로세스가 왜곡될 것이며, 또한 아세트알데히드, 슈퍼옥사이드, 과산화 수소 및 수산기를 포함하는 독성 부산물의 생성을 초래할 수 있는데, 그 결과, 이러한 부산물 자체가 질병 세포의 미토콘드리아에 비가역적 손상을 유발한다.

본 발명의 약제 조성물은 PDK1, PDK2, PDK3, PDK4 및 그 각각의 변이체 또는 이성체의 효력을 조절할 수 있다. 본 약제 조성물은 또한 PDP1, PDP2 및 그 각각의 이성체의 효력을 조절할 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 PDH 복합체에서 발견되는 포스포릴라제, 키나제 및 데하이드로게나제 효소 구성성분의 발현 정도를 조절할 수 있다. 이러한 조절은 적합한 유전자의 후생유전적 침묵(epigenetic silencing)단계를 포함한, 전사 단계, 번역 단계 또는 번역후 단계에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 확장 해당작용에 의해 기본적으로 TCA 사이클과 관련있는 분자로부터 유도되는 화합물로서, 종양 세포 내로 선택적으로 흡수된다. 더욱이, 이러한 선택적인 종양 세포내로의 흡수는 비형질전환된 건강한 세포 및 조직에 약제 조성물 투여시 가질 수 있는 부작용을 최소화한다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식(I)을 가진다.

이 식에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소, 알킬 C_nH_2n ₊₁, 알켄 C_nH_2n, 알케닐 C_nH_2n _-1, 알킨 C_nH_2n _-2, 알키닐 C_nH_2n-3, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, 디설파이드 알킬 CH₃CH_t-S-S-, 티오카바믹 에스테르 (CH₂)nC=NH-, 및 세미티오아세틸 CH₃CH(OH)-S-(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9이다); 방향족; R₃C(O)-로 표시되는 아실; 헤테로아릴; R₄C(=NH)-으로 표시되는 이미도일; 오가노메탈릭 아릴; 알킬-오가노메탈릭 아릴; 및 세미아세탈 R₅CH(OH)-S- ; 또는 그 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되며,

상기 정의한 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며,

R₃는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,

x는 0 ~ 16이다.

본 발명의 제 2 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 제 2 일반식(II)을 가진다.

이 식에서, M은 공유결합 -[C(R₁)(R₂)]z-, 혹은 금속 킬레이트 또는 다른 금속 착화합물(여기서, 금속은 팔라듐이 아님)이고,

R₁ 및 R₂는 각각 수소, 아실 R₃C(O)-, 알킬 C_nH_2n ₊₁, C_mH_2m _-1로 표시되는 알케닐, C_mH_2m-3으로 표시되는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, CH₃(CH₂)n-S-로 표시되는 알킬 설파이드, R₃C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 및 R₅CH(OH)-S- 로 표시되는 헤미아세탈, 또는 그 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되며,

R₃ 및 R₄는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,

x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10, m은 2 ~ 10이다.

본 발명의 제 3 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 제 3 일반식(III)을 가진다.

이 식에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소, 알킬 C_nH_2n ₊₁, 알켄 C_nH_2n, 알케닐 C_nH_2n _-1, 알킨 C_nH_2n _-2, 알키닐 C_nH_2n _-3, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, 디설파이드 알킬 CH₃CH_t-S-S-, 티오카바믹 에스테르 (CH₂)nC=NH-, 및 세미티오아세틸 CH₃CH(OH)-S-(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9이다), 방향족, R₄C(O)-로 표시되는 아실, 헤테로아릴, R₅C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 오가노메탈릭 아릴, 알킬-오가노메탈릭 아릴, 및 세미아세탈 R₆CH(OH)-S- , 또는 그 염, 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머 및 이들의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되며,

R₃는 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머로 구성된 그룹으로부터 선택되며,

R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₅는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₆는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,

x는 0 ~ 16이다.

본 발명의 제 4 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 제 4 일반식(IV)을 가진다.

R₁ 및 R₂는 각각 수소, 아실 R₃C(O)-, 알킬 C_nH_2n ₊₁, C_mH_2m _-1로 표시되는 알케닐, C_mH_2m-3으로 표시되는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, CH₃(CH₂)n-S-로 표시되는 알킬 설파이드, R₄C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 및 R₆CH(OH)-S- 로 표시되는 헤미아세탈, 또는 그 염, 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머, 이들의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되며,

R₄는 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,

x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10, m은 2 ~ 10이다.

상기 각각의 일반식에 있어서, 각각의 특정 리포산 유도체의 (R)-이성체는 (S)-이성체보다 높은 생리적 활성을 갖는다. 따라서, 리포산 유도체는 (R)-이성체 단독 형태 또는 (R)-과 (S)-이성체의 혼합물로서 존재하여야 한다.

본 발명의 또 하나의 특징에 있어서, 인간을 포함한 온혈 동물의 암과 같이, 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상, 증후군 또는 증상을 포함해서, PDH 복합체와 같은 적어도 하나의 효소 복합체의 구조 또는 기능의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군 또는 증상을 진단, 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 전술한 약제 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 특징에 있어서, 암과 같이 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 포함해서, PDH 복합체와 같은 적어도 하나의 효소 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군의 증상을 나타내는 환자를 진단 및 예측하는 방법으로서, 환자로부터 세포 샘플을 얻는 단계, 시험관 내에서 상기 세포에 유효량의 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 단계, 및 그로부터 결과를 도출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

도 1은 해당작용에서 피루베이트의 생성 과정의 기질 및 생성물의 구조를 도시한 것으로, 또한 ATP 및 NADH 생성 및 관련 효소도 보여준다.
도 2는 HIF에 의한 포도당 대사의 조절을 도시한 것이다.
도 3A는 생체 내에서 정상 세포 조직과 암 조직 사이의 에너지 대사 차이를 도시한 것이다.
도 3B는 PDH 복합체 내의 생체 형태의 리포산과 본 발명의 약제 조성물의 일부를 구성하고 있는 리포산 유도체 사이의 차이를 도시한 것이다.
도 3C는 리포일 잔기에 의한 PDH 복합체의 조절이 PDK에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 약제 조성물이 제노그라프트 종양(xenograft tumor) 성장에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 약제 조성물을 이용한 치료가 3종류의 종양 세포 및 비형질전환 세포에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 6A는 치사 한계 농도 또는 그 이상의 본 발명의 약제 조성물로 처리한 후 폐암 세포 내의 ATP 농도를 도시한 것이다.
도 6B는 피루베이트 함유 배양액 대 포도당 함유 배양액 내에서 본 발명의 약제 조성물의 ATP 합성 저해를 비교한 그래프이다.
도 6C는 유방암 세포 대 정상 유방 세포 내에서 본 발명의 약제 조성물의 ATP 합성 저해를 비교한 그래프이다.
도 6D는 폐암 세포 내에서 본 발명의 약제 조성물의 ATP 합성 저해와 본 발명의 비활성 형태 및 리포산의 ATP 합성 저해를 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 약제 조성물이 종양 세포 미토콘드리아 내의 PDH 복합체 및 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제(αKDH) 효소 활성의 정도에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 8A는 본 발명의 약제 조성물로 처리된 또는 모의(mock) 처리된 폐암 세포 추출물의 2차원 겔의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
도 8B는 본 발명의 약제 조성물로 처리된 또는 모의(mock) 처리된 1쌍의 2차원 겔 샘플의 확대 사진을 보여준다.
도 9A는 PDH 복합체의 E2 서브유니트에 공유결합되어 있는 내생성 리포산에 의해 조절되는 PDK의 조절 기능을 도시한 것이다.
도 9B는 본 발명의 약제 조성물에 의해 종양 세포 PDH 복합체의 차등 불활성(differential inactivation)에 대한 가능한 메카니즘을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 약제 조성물이 H460 폐암 세포 내의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 약제 조성물에 의해 다양한 종양 세포 종류의 세포 사멸 경로를 보여주는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 온혈 동물의 암 또는 그 증상과 같이, 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 포함해서, PDH 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 치료, 진단 또는 예방하기 위한 약제 조성물에 관한 것이다. 상기 동물에는 암을 포함하여 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병 및 다른 병리학적 이상 및 증후군을 가진 인간, 말, 소, 개와 고양이를 포함하는 가축과 같은 포유동물류가 포함된다. 본 발명의 약제 조성물은 미국 특허 제 6,331,559 호 및 제 6,951,887 호와 미국 특허 가출원 제 60/912,598 호에 개시되어 있는 리포산 유도체를 포함하는 유효량의 적어도 하나의 리포산 유도체(치옥탄(thioctan)이라고도 함)와, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제를 함유한다. 본 발명의 리포산 유도체는 미토콘드리아 내에서 통상적으로 발견되는 물질의 유도체일 뿐만 아니라 와버그 효과에서 관찰되는 바와 같은 해당작용 활성 증가에 도움을 주는 분자로서, 종양 세포 및 조직과 같이 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 미토콘드리아 세포 및 조직 내로 유효 농도로 선택적 전달이 이루어지며, 그럼으로써 본 조성물의 영향이 정상 세포 및 조직에는 미치지 않도록 하는데에 특히 적합하다.

본 발명의 약제 조성물은 PDK1, PDK2, PDK3, PDK4 및 그 각각의 이성체의 효력을 조절할 수 있다. 본 약제 조성물은 또한 PDP1, PDP2 및 그 각각의 이성체 및/또는 변이체의 효력을 조절할 수 있다. 이러한 조절은 키나제 또는 포스파타제 활성의 촉진 또는 억제를 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 리포산 유도체는 미토콘드리아 에너지 대사를 억제함으로써, 질병 세포에서 미토콘드리아 막 전위 및 다른 미토콘드리아 기능의 손상시켜 비가역적 세포 사멸이 유발되도록 한다. 본 발명의 리포산 유도체는 또한 PDK를 활성화시키거나 및/또는 PDP를 억제함으로써, 또는 PDH 복합체의 E1 서브유니트의 활성 억제를 통해 피루베이트가 덜 독성 분자인 아세토인으로 전환되는 것을 방해함으로써, 미토콘드리아 에너지 대사를 억제할 수 있다. 아세토인 합성이 억제되면, 산화환원 밸런스를 포함한 다른 프로세스가 왜곡될 것이며, 또한 아세트알데히드, 슈퍼옥사이드, 과산화 수소 및 수산기를 포함하는 독성 부산물의 생성을 초래할 수 있는데, 그 결과, 이러한 부산물 자체가 질병 세포의 미토콘드리아에 비가역적 손상을 유발시킬 수 있다.

본 발명의 제 1 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식(I)에 의해 정의된다.

이 식에서, x는 0 ~ 16이고,

R₁ 및 R₂는 각각 다음과 같은 기일 수 있다.

(1) 아실기 R₃C(O)- (여기서 R₃는 티오에스테르 링크를 통해, 특정 예를 들어 비스-아세틸 리포에이트와 결합되는 알킬, 아릴 또는 오가노메탈릭 아릴기이며, 아세틸 및 부타아릴을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(2) 티오에스테르 링크를 통해, 특정 예를 들어 비스-벤조일 리포에이트와 결합되는 방향족기(벤조일 또는 벤조일 유도체를 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(3) 티오에테르 링크를 통해, 예를 들어 -OH, -Cl 또는 -NH2 등의 다른 부분으로 치환된 알킬기와 결합되는 알킬기 C_nH_2n ₊₁(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9임)(메틸, 에틸, 부틸, 데카닐 및 6,8-비스 카보모일메틸리포에이트를 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(4) 티오에테르 링크를 통해 결합되는 알케닐기 C_nH_2n _-1(여기서, n은 2 ~ 10임)(프로필렌, 2,3-디메틸-2-부텐 및 헵텐을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님),

(5) 티오에테르 링크를 통해 결합되는 알키닐기 C_nH_2n _-2(여기서, n은 2 ~ 10임)(아세틸렌, 프로핀 및 옥틴을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(6) 헤테로고리화합물을 형성하기 위해 탄소가 첨가되거나 치환된 알리시클릭기를 가진 알리시클릭이거나 오픈 사슬인 알킬, 알케닐 및 알키닐기(시클로프로판, 시클로펜텐 및 6,8-메틸-숙신이미도 리포에이트를 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(7) 탄소에 첨가체를 가질 수 있는 알킬, 알케닐 및 알키닐기(하이드로실 및 아민을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(8) 벤젠 또는 벤젠 유도체일 수 있는 티오에테르 링크를 통해 결합되는 방향족 또는 아릴기(톨루엔 및 아닐린을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

(9) 디설파이드 링크를 통해 결합되는 알킬 설파이드기 CH₃(CH₂)n-S- (여기서, n은 1 ~ 9일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아님);

(10) 티오아미드 링크를 통해 결합되는 이미도일기 CHR₄C(=NH)- (여기서, n은 1 ~ 10일 수 있으나 이에 국한되는 것은 아님);

(11) 세미아세탈기 R₅CH(OH)-S- (여기서, R₅는 강한 전자 당김 치환체(electron withdrawing substituents)를 갖는 화합물에 국한됨)(트리클로로아세트알데히드 및 피루브산을 포함하나 이에 국한되는 것은 아님);

또는 그 염.

상기 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며, 또한 예를 들어 각각 C-S(O)-R 또는 C-S(O)₂-R, 술폭사이드 또는 술폰을 생성하기 위해 산화될 수 있는 티오에스테르를 함유할 수 있다.

R₁ 및 R₂는 또한, 예를 들어 각각 C-S(O)-S-R 또는 C-S(O)₂-S-R, 티오술핀산 또는 티오술폰산을 생성하기 위해 산화될 수 있는 디술파이드를 함유할 수 있다.

R₃는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있다. 마찬가지로, R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있다.

R₅는 -CCl₃, -CF₃, 또는 -COOH이다.

본 발명의 제 2 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 제 2 일반식(II)에 의해 정의된다.

이 식에서, M은 공유결합 -[C(R₁)(R₂)]z-, 혹은 금속 킬레이트 또는 다른 금속 착화합물(여기서, 금속은 팔라듐이 아님)이고;

R₁ 및 R₂는 각각 수소, 아실 R₃C(O)-, 알킬 C_nH_2n ₊₁, C_mH_2m _-1로 표시되는 알케닐, C_nH_2n-3으로 표시되는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, R₃C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 및 R₄CH(OH)-S- 로 표시되는 헤미아세탈, 또는 그 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

R₃ 및 R₄는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며;

R₅는 -CCl₃, -CF₃, 또는 -COOH이고;

x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10이다.

이 식에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소, 알킬 C_nH_2n ₊₁, 알켄 C_nH_2n, 알케닐 H_2n _-1, 알킨 C_nH_2n _-2, 알키닐 C_nH_2n _-3, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, 디설파이드 알킬 CH₃CH_t-S-S-, 티오카바믹 에스테르 (CH₂)nC=NH-, 및 세미티오아세틸 CH₃CH(OH)-S-(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9이다), 방향족, R₄C(O)-로 표시되는 아실, 헤테로아릴, R₅C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 오가노메탈릭 아릴, 알킬-오가노메탈릭 아릴, 및 세미아세탈 R₆CH(OH)-S- , 또는 그 염, 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 멀티머 및 이들의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

상기 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며;

R₃는 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며;

R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며;

R₅는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며;

R₆는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고;

x는 0 ~ 16이다.

본 발명의 제 4 실시예에 있어서, 리포산 유도체는 다음과 같은 제 4 일반식(IV)에 의해 정의된다.

R₄ 및 R₅는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,

R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,

x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10, m은 2 ~ 10이다.

상기 제 1 및 제 2 두 일반식에 있어서, 각각의 특정 리포산 유도체의 (R)-이성체는 (S)-이성체보다 높은 생리적 활성을 갖는다는 점이 관측되었다. 따라서, 두 가지 이성체 모두 본 발명에 사용하지만, 특히 바람직한 실시예에서는, (R)-이성체가 우선적으로 사용되거나 또는 (R)-는 (S)-이성체와의 혼합물로서 존재하는 것이 특히 고려된다.

본 발명의 약제 조성물은 또한, PDH 복합체에서 발견되는 포스파타제, 키나제 및 데하이드로게나제 효소 구성성분의 발현 정도를 조절할 수 있다. 이러한 조절은 적합한 유전자의 후생유전적 침묵 단계를 포함한, 전사 단계, 번역 단계 또는 번역후 단계에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제를 함유한다. 약학적으로 허용가능한 운반체의 예는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 약제 조성물에 통상적으로 사용되는 물질, 예를 들어 항산화제, 완충제, 킬레이트화제, 풍미제, 착색제, 보존료, 생체이용율을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 항균제 및 이들의 배합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 첨가제의 양은 원하는 특성에 따라 달라지는데, 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 일반적으로 염, 완충제, 보존료 및 양립가능한 운반체를 함유할 수 있으며, 필요에 따라 다른 치료적 성분도 배합할 수 있다. 약으로 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용가능한 것이어야 하나, 약학적으로 허용가능한 염의 제조를 위해 편의상 약학적으로 허용되지 않는 염을 사용할 수도 있다. 그러나 본 발명의 범위를 벗어나지 않아야 한다. 이러한 약리학적으로 및 약학적으로 허용가능한 염은 다음과 같은 산, 즉 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 염산, 말레산, 아세트산, 팔리실산(palicylic acid), p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠 술폰산으로부터 제조되는 염을 포함하나, 이에 국한되는 아니다. 또한, 약학적으로 허용가능한 염은 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로서 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 세포 과증식에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상, 증후군 또는 증상을 포함해서, 적어도 하나의 효소 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 상태 또는 증후군을 예방, 진단 또는 치료하기 위해서, 유효량의 적어도 1종의 치료제 또는 진단제를 세포에 전달함으로써 치료제 또는 진단제를 사용하여 환자를 치료 또는 진단하는 방법을 제공한다. 종양 세포 과증식, 혈관신생(angiogenesis), 전이성 성장(metastatic growth), 아폽토시스(apoptosis)의 조절에 의한 원발성 종양에 대한 치료, 외과적 제거술에 동반되거나 그 후에 발생하는 미세전이암의 진행에 대한 치료, 및 원발성 종양의 방사선 또는 다른 화학요법적 치료를 포함하여 암에 대한 치료 개선법으로서 특히 고려되는 방법은 PDH 복합체를 조절하는 것이다. 본 발명의 약제 조성물은 원발성 또는 전이성 흑색종, 림프종, 육종(sarcoma), 폐암, 간암, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 대장암, 및 선암종, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암 및 췌장암 등과 같은 암 종류에 유용하다.

본 약제 조성물은 치료 또는 진단에 사용시, 약학적으로 허용가능한 운반체와 조합하여 환자에 직접 투여될 수 있다. 이 방법은 치료제 또는 진단제 단독으로, 또는 유효량의 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 투여됨으로써 실행될 수 있다. 상기 다른 치료제 또는 진단제의 예로는 해당작용 억제제, 미세소관 상호작용제(microtubule-interacting agent), 세포증식 억제제(cytostatic agent), 엽산 억제제, 알킬화제, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, 티로신 키나제 억제제, 포도필로톡신(podophyllotoxin) 또는 그 유도체, 항종양 항생제, 화학요법제, 아폽토시스 유도제, 항혈관형성제(anti-angiogenic agent), 질소 머스타드, 핵산 삽입제(intercalating agent) 및 이들의 배합물 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 치료제는 또한 다른 대사 억제 물질을 포함할 수 있다. 이러한 많은 치료제는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 조합 치료법은 이 치료법에 대한 환자 반응을 증대 또는 확실하게 할 필요가 있는 상태를 치료할 때 동시적으로, 연속적으로, 또는 별개로 사용된다.

본 발명의 방법은 의학적으로 허용가능한 어떠한 방식의 투여법을 이용하여 실행될 수 있으며, 임상학적으로 허용되지 않는 부작용을 유발시키지 않고 유효량의 활성 화합물을 생성시킨다. 본 발명의 조성물은 특히 비경구 투여용으로 적합하지만, 에어로졸, 스프레이, 분말, 젤, 로션, 크림, 좌약, 연고 등의 형태로, 흡입, 경구용, 국소용, 경피성, 경비, 안구, 폐, 직장, 경점막, 정맥내, 근육내, 피하, 복강, 가슴내, 흉막강내, 자궁내, 종양내 주입 방법이나 투여용으로도 조성될 수도 있다.

당해 분야에 숙련자는 치료제 또는 진단제를 투여하는 특정 방식이 선택되는 특이적 작용제; 투여가 질병, 이상, 증후군, 또는 증상의 치료, 진단 또는 예방을 위한 것인지 여부; 치료 또는 진단하고자 하는 의학적 이상증상의 심각성; 및 치료 효과를 위한 필요량 등에 따라 달라진다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 백혈병 치료를 위해 선호되는 항암제 투여 방식은 정맥내 투여를 포함하는 반면, 피부암 치료에 선호되는 방식은 국소 또는 경피성 투여를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 원하는 치료 또는 진단 효과가 달성되는 치료제 또는 진단제의 1회 투여량 또는 수회 투여량을 의미한다. 일반적으로 치료제 또는 진단제의 유효량은 사용되는 특이적 작용제의 활성; 이러한 작용제의 대사 안정성 및 작용 길이; 대상자의 종, 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 음식물 상태, 성별, 및 식이요법; 투여 방식 및 시간, 배설 속도; 약물 조합(해당되는 경우); 및 치료되어야 하는 특별한 상태의 진행 정도 및 심각성에 따라 달라질 것이다. 정확한 투여량은 원하는 결과를 도출하기 위해, 과도한 실험없이 1일당 1회 또는 수회 투여로 당해 분야에 숙련자에 의해 결정될 수 있으며, 합병증의 경우 또는 원하는 결과를 얻기 위해서 개개의 개업의사에 의해 투여량이 조절될 수 있다. 중요한 점은 암 치료용으로 사용되는 경우, 사용되는 치료제의 투여량이 정상 세포에는 손상을 주지 않으면서 종양 세포만을 억제하거나 파괴하기에는 충분하여야 한다는 점이다.

본 발명의 약제 조성물에 함유되는 치료제 또는 진단제는 환자에 안전하게 투여될 수 있는 최대량 이하로 어떠한 원하는 양으로도 제조될 수 있다. 진단제 또는 치료제의 양은 0.01 mg/mL 이상 1000 mg/mL 이하의 범위이며, 바람직하게는 약 50 mg/mL이다.

일반적으로, 본 발명의 약제 조성물은 PDH 복합체의 구조 및/또는 활성을 조절하기에 효과적인 양을 환자에 투여하기에 충분한 방식으로 전달될 것이다. 따라서, 투여량은 약 0.3 mg/m² 내지 약 2000 mg/m²의 범위이며, 바람직하게는 약 60 mg/m²이다. 투여량은 1회량으로 투여될 수도 있고, 1일당 1회 내지 4회 또는 그 이상과 같이 개별적인 분할량의 형태로 투여될 수도 있다. 환자의 반응이 특정 투여량으로는 부족한 경우, 환자가 인내할 수 있는 수준까지 훨씬 많은 양(또는 상이한, 보다 국소적인 전달 경로에 의해 효과적인 많은 양)을 사용할 수 있다. 치료제 또는 진단제의 적절한 체계적 또는 표적화된 수준을 달성하기 위해서는, 1일당 수회의 투여가 고려된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 리포산 유도체는 시험관 내에서 진단 및 예측제로서 사용된다. 전술한 바와 같이, PDH 복합체의 조절을 통해 별개의 종양 종류를 억제시키는 데에는, 문제시되는 특정 종양 세포 또는 세포 종에 따라, 상이한 리포산 유도체가 다소 효과적이다. 따라서, 예를 들어 적절한 화학요법 전략의 진단 및 선택이 곤란한 경우, 종양 종류의 정체를 확인하고 효과적인 치료를 하기 위한 대체 방안은, 특정 종양 세포 종을 표적화하는 것으로 알려져 있는 리포산 유도체로 종양 세포의 배양체를 시험관 내 테스트하는 것이다.

도면에 대해서 설명하자면, 도 3A는 생체 내에서 정상 세포 조직과 암 조직 사이의 에너지 대사의 여러 차이들 중 하나를 도시한 것이다. 종양 세포는 상응 조건하에서 정상 세포에 비해서 ATP 생성을 위한 미토콘드리아 에너지 대사보다 원형질 해당작용에 더 많이 의존한다. PDH 복합체의 조절 및 발현 변화는 이러한 종양- 특이적 적응의 일부인 것으로 보인다. PDH 촉매 성분의 양의 감소 및/또는 이러한 효과를 유발하는 억제성 PDK의 양의 증가는 정상 세포 보다 종양 세포가 PDH 복합체를 공격하는 작용제에 훨씬 더 취약하게 한다.

도 3B는 PDH 복합체 내의 피루베이트로부터 아세틸-CoA를 합성하는 데에 관련있는 정상 반응을 촉매화하는 리포산의 구조를 도시한 것이다. 생체 내에서 리포산은 비펩티드 아미드 링크를 통해서 E2 리포일 도메인 활성 자리의 리신의 엡실론 아미노기와 결합된다. 또한, PDH E2-결합 리포에이트의 산화/환원/아세틸화 상태는 E1 PDH 서브유니트의 인산화 불활성을 조절함으로써 PDH 활성을 조절하는 키나제 및 포스파타제에 의해 모니터링된다는 점을 이해해야 한다. 이 그림은 또한 본 발명에 사용될 수 있는 3개의 대표적인 리포산 유도체의 구조를 도시한 것이다. CPI-613 및 CPI-045는 높은 항암 효능을 가지는 반면, CPI-157은 세포 배양체 내에서 활성이 거의 또는 전혀 없으므로, 몇몇 실험에서 대조용으로 사용된다.

도 3C는 리포에이트와 결합되는 E2, E1를 포함하는 PDH 복합체 구성성분과 조절 PDK와의 상관관계를 나타낸 것이다. 다량의 아세틸-리포에이트 또는 디하이드로리포에이트(도시되어 있지 않음)는 PDH 복합체 촉매작용에서 제 1 단계를 촉매화하는 서브유니트인 E1α를 비활성화함으로써, PDH 복합체를 통한 흐름을 더욱 억제시키는 PDK를 활성화시킨다. 이러한 과정은 PDH 복합체를 통한 탄소/에너지 흐름의 조절자로서 역할을 하며, 이러한 조절 과정은 도 3A에 도시된 바와 같이, 변화된 에너지 대사를 유지하도록 사실상 변경된다.

도 4는 본 발명의 약제 조성물이 제노그라프트 종양 성장에 미치는 영향을 도시한 것이다. 실시예 2에서 기술하는 바와 같이, 등의 측면에 피하로 세포를 이식하였다. 그 다음, 그림에서 제시된 바와 같은 날자를 시작으로 하여, 생쥐에 약물(또는 운반체 단독만 주입; "모의(mock)")을 복강내 주입하였다. 좌측 패널은 1 mg/kg의 본 발명의 약물 또는 운반체(대조용)를 1주 3회씩 주입시킨 췌장 종양 모델을 보여준다. 이 실험은 BxPC3 세포로 2회 수행되고 AsPC-1으로 2회 수행된 것을 대표한다. 우측 3개의 패널들은 1주 1회(원), 1회 3회(역삼각형), 또는 1회 5회(운반체로 처리한 경우 삼각형, 약물로 처리한 경우 사각형)씩 지시된 농도로 주입시킨 H460 폐 종양 모델을 보여준다. 이 실험은 H460 세포로 4회 수행된 것을 대표한다.

도 5는 본 발명의 약제 조성물을 이용한 처리(200 ~ 300μM ;"처리된" 또는 모의 처리된; "Mock 처리된")가 3 가지 종양 세포 종류 및 비형질전환 세포 종류(MDCK)에 미치는 영향을 도시한 것이다. 세포를 10% 혈청을 함유하는 적절한 조직 배양액 내에서 48시간 동안 처리하였다. 실시예 2에서 기술하는 형태론을 통해, 3가지 암 세포주에서 아폽토시스 또는 아폽토시스에 준하는 경로에 의해 세포 사멸이 증가하는 것이 관찰된다(도 11에서도 보임). 이와 대조적으로, 비형질전환 NDCK 세포는 이러한 투여량의 약물 처리에 의해 영향을 받지 않는다는 것이 확실하다.

도 6A는 치사 한계 농도 또는 그 이상의 본 발명의 약제 조성물로 처리한 후 폐암 세포 내의 ATP 농도를 도시한 것이다. 일점 쇄선은 제시된 농도에서의 처리를 나타낸다. 상응하는 구조의 실선은 제시된 시간동안 처리한 후, 약물을 제거하고 약물을 함유하지 않는 운반체 내에서 60분 동안 회복을 나타낸다. 블록 화살표는 ATP 회복의 간격을 나타낸다.

도 6B는 피루베이트(메틸 피루베이트의 형태)가 1차 탄소원인 배양액(일점 쇄선) 대 포도당이 1차 탄소원인 배양액(실선) 내에서 ATP 합성 저해를 비교한 것이다. 본 발명의 약제 조성물은 궁극적으로 상기 두 배양액 내에서 동일한 역치 농도에서 세포 사멸을 유발하지만, 총 세포 ATP 양의 초기 소모가 피루베이트 함유 배양액에서는 크고, 포도당 함유 배양액에서는 없다는 점을 주목해야 한다. 또한 세포 사멸 개시는 약물 농도 200μM보다 300μM에서 더 신속하다.

도 6C는 SK-Br-3 유방암 세포 대 HMEC 정상 유방 세포 내에서 본 발명의 약제 조성물의 ATP 합성 저해를 비교한 것이다. 결과가 도 6A 및 6B에 도시되어 있는 실험과 대조적으로, 이 실험은 혈청이 없는 배양액(MEBM) 내에서 수행되었다, 그 결과, 약물의 치사 한계 농도는 낮은 수준인 약 50μM이다. 22시간 정상 세포 샘플 내의 ATP 양의 완만한 감소는 약물 투여량과는 관계가 없으며, 정상적인 실험 편차를 반영하는 것이라는 점을 주목해야 한다.

도 6D는 본 발명의 약제 조성물(좌측 그래프), 리포산(중앙 그래프), 및 본 발명의 불활성 형태(우측 그래프)에 의한 H460 폐암 세포 내의 ATP 합성 저해를 비교한 것이다. 이 실험은 도 6C에서와 같이, 약물의 치사 한계 농도가 약 50μM이 되도록 혈청이 없는 배양액 내에서 수행된다.

도 7은 본 발명의 약제 조성물이 종양 세포 미토콘드리아 내의 PDH (PDC) 및 (αKDH) 효소 활성의 정도에 미치는 영향을 도시한 것이다. PDH는 강하게 억제되는 반면, αKDH는 그렇지 않다는 것에 주목해야 한다. 효소 활성 농도는 실시예 2에서 기술하는 바와 같이, 첨가된 탄소원에 대한 반응으로 레자주린 환원(resazurin reduction)을 이용하여 정제된 미토콘드리아의 추출물 내에서 측정된다. 백그라운드 선은 첨가된 탄소원이 존재하지 않을 때의 레자주린 환원에 해당한다.

그 다음, 도 8A에서, 본 발명의 약제 조성물로 처리된(+) 또는 모의 처리된(-) H460 폐암 세포 추출물의 2차원 겔의 웨스턴 블롯 분석(10% 혈청을 함유하는 RPMI 배양액 내에서 120분 동안 400μM)이 수행되었다. 웨스턴 트랜스퍼는 PDH 복합체의 E1α 및 E2 서브유니트에 대항하는 모노클론 항체 칵테일로 조사되었다. 웨스턴 트랜스퍼는 E2에서 조정된다. 약물 처리 샘플 중 E1의 과인산화 형태(hyper-phosphorylated form)는 사실상 고농도이고, 차아인산화(hypo-phosphorylated) 형태는 저농도라는 점을 알아야 한다. 좌측의 수직의 흰색 선은 겔을 조정하기 위한 기준 중의 하나인 E2 서브유니트의 이동성을 도시한 것이다. 우측의 수직의 흰색 선은 덜 인산화된 E1α 형태인, 추정상 효소적 활성인 성분을 통과한다.

도 8B는 본 발명의 약제 조성물로 처리된 또는 모의 처리된 1쌍의 2차원 겔 샘플의 확대 사진을 보여준다. 엘리먼트 A는 도 8A의 일부를 확대한 사진이다. 엘리먼트 B는 MEBM 혈청 비함유 유방 상피세포 배양액 내에서 180분 동안 80μM의 본 발명의 조성물로 처리된(+) 및 모의 처리된(-) SK-Br-3 유방암 세포이다. 엘리먼트 C는 MEBM 혈청 비함유 유방 상피세포 배양액 내에서 240분 동안 80μM의 본 발명의 조성물로 처리된(+) 및 모의 처리된(-) SK-Br-3 유방암 세포이다. 엘리먼트 D는 MEBM 혈청 비함유 유방 상피세포 배양액 내에서 240분 동안 80μM의 본 발명의 조성물로 처리된(+) 및 모의 처리된(-) HMEC 정상 유방 상피 세포이다. 수직의 흰색 선은 덜 인산화된 E1α 형태인, 추정상 효소적 활성인 성분을 통과한다.

도 9A 및 도 9B는 생체 내에서 본 발명의 조성물의 강하고 선택적인 항암 효과에 대한 작업 가설(working hypothesis)을 도시한 것이다. 예를 들어, 도 9A는 PDC E2 서브유니트에 공유결합되어 있는 내생성 리포산에 의해 조절될 때 PDK의 조절 역할을 도시한 것이다. PDK는 일반적으로 환원된 및/또는 아실화된 리포에이트가 높은 농도인 것에 대한 반응으로 PDC를 불활성화시키는데, 이는 사실상 종양 세포 내에서 변화된 과정인 것으로 보인다.

부수적으로, 도 9B는 PDC의 기질 PDC-E1 대 PDK의 비의 현저한 차이를 보여준다. 이는 생체 내에서 정상 세포와 종양 세포를 구별짓는 것으로 추측된다. 정상 세포에서, 저농도의 PDK이 PDH 복합체 주변을 두손으로 번갈아 쥐어 잡고 (두 개의 이량체 서브유니트를 통해) "워크"함으로써 점차로 E1을 인산화하는 것으로 생각된다. 이 인산화는 PDP 탈인산화와 정상 상태의 평형을 유지하고 있다(도시되어 있지 않음). 여기에 도시되어 있는 작업 가설에서, 치옥탄은 일반적으로 아세틸-리포에이트 및/또는 디하이드로리포에이트를 결합시키는 자리와 동일한 자리를 통해 PDK를 자극시킴으로써, 인위적으로 하나 이상의 PDK 이성체를 자극하여 E1α를 불활성화되도록 한다. 암 세포에서, 치옥탄에 의한 이러한 자극을 유발시키는 PDK의 농도가 높으면 높을수록, PDC 효소 활성 및 미토콘드리아 에너지 대사를 중단시키는데 훨씬 더 효과적이다.

다음의 실시예는 본 발명의 약제 조성물에 대한 이해를 증진시키기 위해 제공된다.

실시예 1

치옥탄의 화학적 제조

출발 물질로서 6,8-비스메르캅토옥탄산을 사용하여, 미국 특허 제 6,331,559 B1 호 및 제 6,951,887 B2 호에 개시되어 있는 수정된 방법으로 리포산 유도체(즉, 치옥탄) CPI-613 및 CPI-157을 제조하였다. 치옥탄 CPI-045는 미국 특허 제 6,331,559 B1 호에 기술된 바와 같이 제조하였다.

3가지 치옥탄에 대한 구조 분석은 아래와 같다. CPI-045 및 CPI-613의 여러가지 독립적 제조는 그 항암 특성에 있어서는 구별할 수 없었다. 제노그라프트(도 4) 및 ATP 측정(도 6)에서 사용된 CPI-613의 순도는 99% 초과 수준이었다. 모든 다른 제제는 순도 98% 이상이었다.

CPI-613: 6,8-비스-벤질술파닐옥탄산: 백색 결정성 고체, 용융점 65-66℃ (lit.¹ 67.5-69°); ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ7.15-7.4 (m, 10H), 3.66 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 2.52-2.62 (m, 1H), 2.50 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.29 (t, J=7.6 Hz, 2H), 1.2-1.8 (m, 8H); ¹³C-NMR (62.9MHz, CDC1₃); δ179.6, 138.6, 138.5, 128.9, 128.8, 128.5, 128.4, 126.9, 44.1, 36.4, 35.1, 34.4, 33.8, 28.7, 26.0, 24.4.

CPI-157: 6,8-비스-에틸술파닐옥탄산: 무색 오일, TLC (EtAc:헥산:HAc, 200:200:1 v/v): Rf = 0.60; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ2.64-2.76 (m, 1H), 2.65 (t, J=7.5Hz, 2H), 2.52 (q, J = 7.5Hz, 2H), 2.49 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.40-1.85 (m, 8H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 7.5Hz, 3H); ¹³C-NMR (75 MHz, CDC1₃); δ180.0, 44.3, 34.6, 33.9, 28.9, 26.2, 25.9, 24.5, 24.2, 14.9, 14.7; IR (film): 2963, 1708, 1449, 1423, 1283, 1263 cm^-1.

CPI-045: 6,8-비스-벤조일술파닐옥탄산: 무색 점성오일, TLC (EtAc:헥산:HAc, 100:50:1 v/v): Rf = 0.30; ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ7.9-8.1 (m, 4H), 7.38-7.60 (m, 6H), 3.8-4.0 (m, 1H), 3.0-3.3 (m, 2H), 2.34 (t, J=7.1Hz, 2H), 1.4-2.2 (m, 8H); ¹³C-NMR (62.9MHz, CDC1₃); δ191.7, 191.5, 179.7, 137.0, 136.9, 133.3, 128.5, 127.3, 127.1, 43.6, 35.0, 34.6, 33.8, 26.4, 26.2, 24.3; IR (film): 2973, 1710, 1704, 1667, 1665, 1662, 1448, 1207, 1175, 911, 773, 757, 733, 688, 648 cm^-1.

실시예 2

치옥탄 항암 효과를 결정하는데 사용되는 방법

세포: 인간의 종양 세포주를 ATCC사로부터 구입하여, ATCC 추천(ATCC recommendation)에 따라서 번식시켰다. 인간의 유방 상피세포(HMEC), 소기도(Small Airway) 상피세포(SAEC), 및 인간 정상 표피 각질형성 세포(NHEK) 원 세포를 LONZA Walkersville, Inc(Walkersville, MD)사로부터 구입하였다. 각 세포주를 공급사의 설명서에 따라서 공급사로부터 구입하여 발현시킨 적절한 배양액 속에서 유지시켜 번식시켰다. 본 명세서에 기록된 실험은 패시지 3 ~ 6의 정상 세포를 사용하였다.

종양 성장 억제 조사: CD1-Nu/Nu 암컷 생쥐에 피하(SC) 주입에 의해 인간의 BxPC-3 또는 AsPC-1 췌장 종양 세포 또는 H460 NSCLC를 이식하였다. 약 8 ~ 12일 후에, 그림 설명문에 지시된 바와 같은 스케줄 및 투여량으로 복강내(IP) 주입하였다. 약물 또는 운반체는 체중 25gm 당 ca. 2ml의 양으로 주입되었다. 약물 농도는 1.25 mg/ml(ca. 3.1mM) 또는 그 이하이었다. 모의처리된 동물에 주사된 운반체는 항상 이 실험에서 가장 많은 투여량의 약물이 주입되는 용매와 동일한 것이었다. 매일 생쥐의 육체적 상태 및 사망율을 모니터링하였다. 처리 이전에는 매일, 처리 중 및 후에는 매주 약 3회씩 체중 및 종양 체적을 평가하였다. 생쥐를 12시간 낮/밤 주기로 유지시키고 자유롭게 먹이를 주며 기관 지침서에 따라 스토니 브룩 대학(Stony Brook University) 동물 시설에 수용하였다.

세포 사멸 분석: 대부분의 세포 생존 능력 평가에 있어서, 치옥탄에 의한 초기의 ATP 합성 억제로 인해 혼동되지 않도록 충분히 긴 시간에서 Celltiger-Glo 분석(Peomega)을 이용하였다(도 6). 전형적인 실험에서는, 셀을 검은색 투명 바닥의 36-웰 플레이트 내에서 웰 당 5,000 세포의 수준으로 플레이팅하였다. 18 ~ 25시간 후에, 배양액을 약물 용매(혈청 함유 배양액 중 2.8mM 및 혈청 비함유 배양액 중 0.7mM의 물속의 트리에탄올아민) 또는 동일 용매 속의 치옥탄 CPI-613을 함유하는 신선한 배양액으로 대체하였다. 제조사의 지시사항에 따라서, 약물 투여량에 따라 약물 첨가 후 24시간 또는 48시간 후에 분석을 수행하였다.

몇몇 경우에 있어서는, 셀을 48-웰 플레이트 내에서 웰 당 10,000 세포의 수준으로 플레이팅하였으며, 18 ~ 25시간 후에, 배양액을 약물 용매(1% EtOH 최종 농도) 또는 동일 용매 속의 상이한 농도의 치옥탄 CPI-045를 함유하는 신선한 배양액으로 대체하였다. 나머지 실험을 위하여 용매 또는 약물을 함유하는 배양액 속에 세포를 남겨 두었다. 약물을 가한 후 24, 48 및 72시간 후에 플레이트를 조사하였으며, 세포 수를 세포밀도 퍼센트(confluence percentage)로서 산정하였다. 이러한 조건하에, 치옥탄 유도 세포 사멸은 거의 한계 농도의 투여량에서 매우 높으며, 세포 수 산정은 매우 신뢰성있는 사망 지표가 된다(도 7). 72시간 후에 남아있는 세포가 있다면, 그 세포의 무결성은 트리판 블루 염색법(trypan blue exclusion)에 의해 테스트하였다.

표 1은 시험관 내에서 종양 세포에 대한 치옥탄의 작용에 관한 데이터를 제공한다. 인간의 종양 세포 및 원세포를 CPI-613 및/또는 CPI-045 사망에 대한 민감성에 대해 조사하고 이를 목록화하였다. "+"는 약 200 ~ 300μM(10% 혈청 존재) 및 혈청 비함유 배양액 내의 약 50μM의 투여량으로 세포가 아폽토시스 또는 괴사 형태로 사멸하였다는 것을 의미한다(도 5 및 6). "-"는 동일한 배양액 내에서 세포 사멸을 유도하기 위해 약물 투여량이 약 5배 정도 더 필요하였다는 것을 의미한다. "nt"는 테스트 되지않는 배합을 의미한다. 모든 종양 세포주는 도 5의 MDCK 정상 세포에서와 같이, 적절한 10% 혈청함유 배양액 내에서 분석되었다. 또한, HMEC, SAEC, NHKC 인간 원세포, 및 SK-BR-3, A549 및 H460 종양 세포주는 적절한 혈청-비함유 배양액 내에서 분석되었다. 원세포는 접촉저지(contact inhibition)되었으며, 형질전환 세포는 비슷한 밀도에서 억제되었다.

ATP 분석: 셀을 검은색 투명 바닥의 96-웰 플레이트 내에서 웰 당 5,000 세포의 수준으로 플레이팅하였다. 18 ~ 25시간 후에, 지시사항에 따르는 약물 농도 및 시간 간격으로, 배양액을 약물 용매(트리에탄올아민) 또는 치옥탄(CPI-613 또는 CPI-157)을 함유하는 신선한 배양액으로 대체하였다. 세포의 생존 능력 및 무결성은 트리판 블루 염색법을 이용하여 약물 금단 후 회복에 의해 분석하였다. ATP는 제조사의 지시사항에 따라서 CellTiger-Glo 발광 분석법(luminescence assay)(Peomega)을 이용하여 측정하였다. 모든 측정은 2회 수행되었으며, 높은 일치성을 보여주었다. 평균치의 표준 오차는 측정치의 0.1 ~ 2% 범위이다. 그 결과로서, 오차 구간(error bar)은 도 6에서 생략되었다. 메틸 피루베이트 배양액은 10% 투석된 우태 혈청(FBS), 5mM HEPES (pH 7.4) 및 10mM 메틸피루베이트(Sigma Aldrich)가 보강된 포도당 비함유 RPMI((Invitrogen)로 구성되었으며, 이에 매칭되는 포도당 배양액은 통상적인 RPMI(Invitrogen)이었다.

PDH 및 α KDH 효소 분석: 종양 세포를 15cm 플레이트 내에서 세포밀도 80%로 증식하고 제시된 바와 같은 CPI-613으로 처리하였다. Moreadith and Fiskum 방법에 따라서 미토콘드리아를 분리하였다.¹ 미토콘드리아를 4% 라우릴 말토시드(lauryl maltoside) 내에서 용해시켰다. 50μ의 미토콘드리아 용해물을 96-웰 플레이트에 가하였다. 미토콘드리아 용해물에 50μ의 반응 혼합물(50mM Tris, pH 7.5, 2mM β-NAD+, 225uMv TPP, 2mM 피루베이트 또는 α-케토글루타레이트, 150μM 조효소 A, 2.6mM 시스테인, 1mM MgCl₂)를 가하고, 이 혼합물을 37℃에서 45분 동안 배양시켰다. 이 시점에서, 혼합물에 15μM 레자주린 및 0.5U/ml 디아포라제를 가하고 5분 동안 더 배양시켰다. 마이크로플레이트 리더(Fluorostar)에서 여기 파장(excitation wavelength) 530nm, 방출 파장 590nm를 이용하여 형광성을 측정함으로써 NADH 생성을 모니터링하였다. 모든 측정은 2회 수행되었으며, 높은 일치성을 보여주었다. 평균치의 표준 오차는 측정치의 0.3 ~ 4% 범위이다. 그 결과로서, 오차 구간은 도 7에서 생략되었다.

E1 α 인산화:

2-D 겔에 대한 세포 용해물: 세포를 60mm 디쉬 내에서 세포밀도 95%로 증식하고, 제시된 바와 같은 약물 또는 용매로 처리하였다. 세포를 450μl 용해 완충액(Lysis buffer) A [455μl Zoom 2D 단백질 용해제 1(Invitrogen), 2.5μl 1M 트리스 염기, 5μl 100×프로테아제 억제제 칵테일(Complete min, EDTA 비함유, Roche); 5μl 2M DTT]로 인시튜(in situ) 용해시켰다. 세포 용해물을 1.5ml의 마이크로퓨지관에 이동시키고 50% 파워에서 15 패시지에 대해 얼음 상에서 초음파 조사하였다. 실온에서 배양시킨 후 10분 후에, 2.5μl의 디메틸아크릴아미드(DMA, Sigma-Aldrich)를 가하고, 이 용해물을 10분 동안 더 배양시켰다. 과량의 DMA를 중화시키기 위해서 5μl의 2M DTT를 가하였다. 이 용해물을 15분 동안 16,000×g에서 원심분리하였다.

2-D 겔: 제조사의 지시사항에 따라 Zoom benchtop proteomics system(Invitrogen)을 사용하였다. 간단히 설명하면, 30 ~ 50μl의 용해물을 0.8μl의 pH 3~ 10 양성전해질(ampholytes), 0.75μl의 2M DTT와 혼합하고, Zoom 2D 단백질 용해제 1으로 150μl가 되도록 하였다. 150μl의 샘플을 IPG 러너에 로딩하고, pH 3 ~ 10의 NL IPG 스트립을 가하였다. 이 스트립을 실온에서 밤새 침지시켰다. 스텝 프로토콜이 등전초점법(isoelectric focusing)에 사용되었다(250V, 20분; 450V, 15분; 750V, 15분; 2000V, 30분). 1× 로딩 완충액 속에서 15분 동안, 그 다음 1× 로딩 완충액 플러스 160mM 요도아세트산 속에서 15분 동안, 스트립을 처리하였다. 스트립을 NuPAGE 4 ~ 12% Bis Tris ZOOM 겔(Invitrogen) 상에서 전기이동시켰다.

시험관내 종양 세포 및 원세포에 대한 치옥탄의 효과

종양세포	뇌, 세포종	U-87MG	+	+
	뇌, 세포종	LN-229	+	nt
	유방, 선암	SK-Br-3	+	+
	유방, 선암	MCF7	nt	+
	뼈, 골육종	Saos-2	nt	+
	자궁경부, 선암	HeLa	+	+
	대장, 선암	SW480	nt	+
	간, 암종	Hep G2	+	+
	신장, 암종	A-498	+	nt
	폐, 암종	A459	+	+
	폐, 암종	H460	+	+
	근육, 횡문근육종	RD	nt	+
	난소, 암종	SKOV-3	+	nt
	췌장, 선암	AsPC-1	+	nt
	췌장, 선암	BxPC-3	+	nt
	전립선, 암종	LnCaP	nt	+
	자궁, 육종	Mes_SA	+	+
	자궁, 육종	Mes_SA/dx5	+	+

원세포	유방, 상피세포	HMEC	-	-
	소기도 상피세포	SAEC	-	nt
	케라티노사이트	NHKC	nt	-

웨스턴 블롯: 단백질을 PVDF 4.5㎛ 막 위에 블로팅하였다. mAbs(Invitrogen)을 사용하여 PDH E1α 및 E2를 검출하였다.

카스파제 -3( Caspase -3) 및 PARP 절단( cleavage ): Roy and Nicholson에 따라 웨스턴 블롯에서 절단된 카스파제-3를 검출하였다.⁴³ 간단히 설명하면, 약물 또는 용매 처리후에, 세포를 스크레입(scrape)하고, 이 배양액/세포/사멸체 혼합물을 6000×g에서 원심분리하였다. 용해 완충액 C (4M 요소, 10% 글리세롤, 2% SDS, 0.003% BPB; 5% 2-메르캅토에탄올)로 펠릿(pellet)을 용해시켰다. 웰 당 30μg의 총 세포용해물 단백질을 12% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 단백질을 PVDF 4.5㎛ 막 위에 블로팅하였다. 항-카스파제-3 mAbs(생쥐 모노클론[31A1067]; abcam)을 사용하여 프로- 및 활성- 카스파제-3를 검출하였다. 항-폴리(AP-리보즈) 폴리머라제 항체, 클론 C-2-10(Sigma-Aldrich)을 사용하여 PARP 절단을 검출하였다.

미토콘드리아 Ca ⁺² 검출: 세포를 35mm 유리바닥 플레이트(BD Biosciences) 상에서 3×10⁵으로 살포하고, 밤새 성장시킨 다음, 제시된 바와 같은 약물 또는 용매로 처리하였다. 그 다음, 세포를 페놀 레드-프리 배양액 내에 칼슘 염료 Fluo-4, X-Rhod-1 또는 Rhod-2 (4μM, Invitrogen)로 로딩하고, 37℃에서 10분 동안 배양시켰다. 세포를 일단 PBS로 1회 세척하고, FITC 필터를 이용하여 고정 노출시간에서 Axiovert 200M (Zeiss), 디컨볼루션(deconvolution) 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하였다. 제조사에 의해 제공되는 소프트웨어를 이용하여 형광성의 정량화를 수행하였다. Rhod-1 또는 Rhod-2는 유사한 결과를 제공하는데(도 10), 이는 이러한 염료가 미토콘드리아 Ca⁺² 신호를 측정하고 있다는 것을 시사한다.^3-4

참고 문헌:

1. Moreadith RW and Fiskum G. Isolation of Mitochondria from Ascites Tumour-Cells Permeabilized with Digitonin. Ananlytical Biochemistry 137, 360-367 (1984).

2. Roy S and Nicholson DW. Criteria for identifying authentic caspase substrates during apoptosis. Apoptosis 322, 110-125 (2000).

3. Gerencser AA and Adam-Vizi V. Selective, high-resolution fluorescence imaing of mitochondrial Ca² ⁺ concentration. Cell Calcium 30, 311-321 (2001)

4. Gyorgy H, Gyorgy C, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Roy SS, and Yi MQ. Mitochondrial calcium signalling and cell death: Approaches for assessing the role of mitochondrial Ca² ⁺ uptake in apoptosis. Cell Calcium 40, 553-560 (2006).

실시예 3

치옥탄은 미토콘드리아 막 준위 및 Ca ⁺² 흡수를 교란시킨다

치옥탄의 ATP 합성 억제에 대한 기질 효과(도 6)는 약물이 미토콘드리아 매트릭스 내의 TCA 사이클을 방해하고 있다는 것을 시사한다. 이 경우, 본 발명자는 미토콘드리아 막 전위¹가 치사 한계 농도 및 그 이상에서 약화되는 것으로 예상하였다. 본 발명자는 전위에 민감한 염료 TMRE를 사용하여 예상된 효과를 관찰하였다 (도 10). 미토콘그리아 막 전위는 악물 처리의 개시와 함께 급속히 강하된다. 막 전위 감소 동역학은 미토콘드리아 기질의 존재하에서 ATP 합성 손실과 매우 유사하다 (도 6).

미토콘드리아에서의 ATP 소모는 소포체(endoplasmic reticulum)를 포함한 원형질 저장소로부터 방출된 Ca⁺² 흡수를 포함하는 항상성 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.² 또한, 이러한 Ca⁺²의 미토콘드리아 내트릭스 내로의 유입에는 미토콘드리아 막 전위가 필요한 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명자는 급격히 강하되는 막 전위 면에서 볼 때, 치사 한계 농도 또는 그 이상의 치옥탄 처리가 Ca⁺² 이온의 일시적인 미토콘드리아 흡수와 함께 이온의 지속적인 원형질 방출을 유발할 수 있다고 예상하였다. 본 발명자는 미토콘드리아 Ca⁺²를 측정하기 위해서는 X-Rhod-1 또는 Rhod-2, 원형질 Ca⁺²를 측정하기 위해서는 Rhod-4를 사용하여, 예상된 효과를 관찰하였다(도 10).

치사 한계 농도 또는 그 보다 약간 높은 농도로 CPI 투여한 후 약 2시간 까지는(도 6과 도 10 비교)- 미토콘드리아 막 전위가 감소 - 초기 미토콘드리아 Ca⁺²가 일시적으로 감소한다. 그 후 4 ~ 6시간에는 두 번째 큰 미토콘드리아 피크가 관측되는데, 이는 칼슘-의존성 세포 사멸 경로의 개시와 관련이 있는 것으로 생각된다.³

참고 문헌:

1. Garrett R and Grisham CM. Biochemistry. Thomason Brook/Cole, Southbank, Vic., Australia; Belmont, CA.(2007).

2. Graier WF, Frieden M, and Malli R. Mithochondria and Ca² ⁺ signaling: old guests, new functions. Pflungers Archiv-European Journal of Physiology 455, 375-396 (2007).

3. Gyorgy H, Gyorge C, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Roy SS, and Yi MQ. Mitochondrial calcium signalling and cell death: Approaches for assessing the role of mitochondrial Ca² ⁺ uptake in apoptosis. Cell Calcium 40, 553-560 (2006).

실시예 4

치옥탄은 다양한 세포 사멸 프로그램을 유도한다

미토콘드리아 에너지 대사의 감소는 비록 그 메카니즘이 완전하게 이해되는 것은 아니지만, 몇몇 경우에 세포 사멸 경로로의 진입을 결정하는 것과 관계가 있는 것으로 알려져 있다.^1-3 상기 한계 농도 이상, 이 최소 치사량의 약 2배 이하의 치옥탄 투여시, 테스트되는 모든 암 세포는 형태학적으로 주로 아폽토시스와 유사한 세포 사멸에 이른다(도 5). 아폽토시스 세포 사멸은 상기 조건하에 통상적인 Annexin 면역염색법 및 TUNEL DNA 말단-라벨링 분석법(결과가 도시되어 있지 않음)에 의해 확인되었다.

더 고농도(치사량보다 약 2배 초과)의 투여시, 활성 치옥탄은 형태학적으로 아폽토시스와의 상관관계없이 세포 사멸(리플레이팅 생존 능력 분석 및 리판 블루 또는 프로피듐 염색법에 의해 평가됨)을 유도하며, 이는 세포괴사형 사멸 경로를 시사한다(결과가 도시되어 있지 않음).

이러한 데이터는 치옥탄 CPI-613에 의한 미토콘드리아 에너지 대사 억제가 세포 사멸 유도와 확실히 관련이 있다는 것을 확인해 준다.

별개의 다양한 세포 사멸 경로⁴를 위한 불활성 변이체를 함유하는 것으로 알려지거나 추측되는 다양한 종양 세포가 매우 유사한 치옥탄 투여량에서 모두 사멸한다는 사실의 관찰은 매우 놀랄만한 것이다. 이 관찰 결과는 상기 약물이 다양하고 잠정적으로 중복성인 디스탈 세포 사멸 집행 경로에 관여하는 마스터 신호를 유도한다는 것을 시사한다.⁵

이러한 가능성과 일치해서, 본 발명자는 z-VAD-KMK 제네릭 카스파제 저해제가 치옥탄 처리 세포 내에서 세포 사멸의 형태를 미세하게 변화시키지만 약물의 치사 한계 농도 투여량에 인지가능한 영향을 주지 않는다는 것을 알게 되었다.

치옥탄-유도 세포 사멸이 다양한 터미널 엑시큐션 메카니즘을 통해 실행될 수 있는 가능성을 더 테스트해 보기 위해, 본 발명자는 카스파제-3 및 PARP-1 절단 - 진단성 별개의 세포 사멸 경로를 조사하였다.⁵ 본 발명자는 두 가지 치옥탄 CPI-613 및 CPI-045가 상이한 세포 내에서 매우 다양한 레벨의 상기 두 가지 절단을 유도한다는 것을 알게 되었다(도 11).

일괄적으로, 상기 결과는 치옥탄이 약물 투여량 및 세포 종류에 따라 결정의 말단적 전술적 실행의 여부를 알 수 없는 사멸에 대해 전략적 결행을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.

참고 문헌:

1. Watabe M and Nakaki T. ATP depletion does not account for apoptosis induced by inhibition of mitochondrial electron transport chain in human doaminergic cells. Neurophamacology 52, 536-541 (2007)

2. Yuneva M, Zamboni N, Oefner P, Sachidanandam R, and Lazebnik Y. Definiency in glutamine but nor glucose induces MYC-dependent apoptpsis in human cells. Journal of Cell Biology 178, 93-105 (2007).

3. Skulachev VP. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis 11, 473-485 (2006).

4. Johnstone RW, Ruefli AA, and Lowe SW. Apoptosis: A link between cancer genetics and chemotherapy. Cell 108, 153-164 (2002).

5. Cregan SP, Dawson VL, and Slack RS. role of AIF in caspase-dependent and caspase-independent cell death. Oncogene 23, 2785-2796 (2004).

전술한 내용은 단지 본 발명을 구체적인 예를 통해 설명한 것이다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 내용 및 첨부 도면으로부터, 이후의 특허청구범위에 정의한 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변화, 수정 및 변경이 가능하다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 더욱이, 본 명세서에 실시예가 기술되어 있으나, 당해 분야에 종사하는 다른 사람은 본 발명의 또 다른 디자인 또는 용도를 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 구체적인 실시예와 관련해서 기술하고 있으나, 당해 숙련자에게는 디자인 및 용도에 있어서 다양한 변경이 가능할 것이며, 본 명세서는 어떠한 개조 또는 그 변경도 포함한다. 그러므로 본 발명은 이후의 특허청구범위 및 그 동의어에 의해서만 규정된다는 것을 명백히 한다.

Claims

인간을 포함한 온혈 동물의 질병 세포의 미토콘드리아 내의 변형된 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 복합체와 같은 적어도 하나의 효소 복합체의 구조 및/또는 활성을 조절하는 약학적으로 허용가능한 조절제.
제 1 항에 있어서,
적어도 하나의 리포산 유도체와 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 함유하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 효소 복합체는 키나제 활성, 포스파타제 활성 및/또는 데하이드로게나제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 키나제 활성을 촉진 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 4 항에 있어서,
상기 키나제는 피루베이트 데하이드로게나제 키나제(PDK) 1, PDK2, PDK3, PDK4 및 이들의 이성체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 포스파타제 활성을 촉진 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 6 항에 있어서,
상기 포스파타제는 피루베이트 데하이드로게나제 포스파타제(PDP)1, PDP2, 및 이들의 이성체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 데하이드로게나제 활성을 촉진 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절은 PDH 복합체의 인산화 상태를 변경시킴으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 9 항에 있어서,
상기 조절은 PDH 복합체의 E1α 서브유니트 상에서 유발되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 10 항에 있어서,
상기 조절은 PDP 및 그 이성체와 변이체의 불활성화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 10 항에 있어서,
상기 조절은 PDK 및 그 이성체와 변이체의 불활성화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 9 항에 있어서,
상기 조절제는 무산소성 에너지 대사의 독성 대사산물(metabolite)의 해독을 억제하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 13 항에 있어서,
상기 대사산물은 아세트알데히드, 슈퍼옥사이드, 과산화 수소 및 수산기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 13 항에 있어서,
조절의 효과는 아세티온 생성의 감소에 의해 관측되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 9 항에 있어서,
인산화 또는 탈인산화는 비가역적인 것을 특징으로 하는 조절제.
제 16 항에 있어서,
상기 인산화 또는 탈인산화의 효과는 세포 사멸으로 나타나는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 17 항에 있어서,
상기 효과는 아폽토시스(apoptosis)인 것을 특징으로 하는 조절제.
제 17 항에 있어서,
상기 효과는 세포괴사(necrosis)인 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 PDK 및 그 이성체와 변이체의 발현 수준에 영향을 주는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 PDP 및 그 이성체와 변이체의 발현 수준에 영향을 주는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
상기 발현 수준은 전사, 번역, 또는 번역후의 수준에서 변경되는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 22 항에 있어서,
상기 변경은 후생유전적(epigenetic)인 것을 특징으로 하는 조절제.
제 2 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식을 가지는 것을 특징으로 하는 조절제:

(이 식에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소, 알킬 C_nH_2n ₊₁, 알켄 C_nH_2n, 알케닐 C_nH_2n _-1, 알킨 C_nH_2n _-2, 알키닐 C_nH_2n _-3, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, 디설파이드 알킬 CH₃CH_t-S-S-, 티오카바믹 에스테르 (CH₂)nC=NH-, 및 세미티오아세틸 CH₃CH(OH)-S-(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9임); 방향족; R₃C(O)-로 표시되는 아실; 헤테로아릴; R₄C(=NH)-으로 표시되는 이미도일; 오가노메탈릭 아릴; 알킬-오가노메탈릭 아릴; 및 세미아세탈 R₅CH(OH)-S- ; 또는 그 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 정의한 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며,
R₃는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,
x는 0 ~ 16이다).
제 2 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식을 가지는 것을 특징으로 하는 조절제:

(이 식에서, M은 공유결합 -[C(R₁)(R₂)]z-, 혹은 금속 킬레이트 또는 다른 금속 착화합물(여기서, 금속은 팔라듐이 아님)이고,
R₁ 및 R₂는 각각 수소, 아실 R₃C(O)-, 알킬 C_nH_2n ₊₁, C_nH_2n _-1로 표시되는 알케닐, C_nH_2n-3으로 표시되는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, CH₃(CH₂)n-S-로 표시되는 알킬 설파이드, R₃C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 및 R₄CH(OH)-S- 로 표시되는 헤미아세탈, 또는 그 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 정의한 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며,
R₃ 및 R₄는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₅는 -CCl₃, -CF₃, 또는 -COOH이고,
x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10이다).
제 2 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식을 가지는 것을 특징으로 하는 조절제:

(이 식에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소, 알킬 C_nH_2n ₊₁, 알켄 C_nH_2n, 알케닐 C_nH_2n _-1, 알킨 C_nH_2n _-2, 알키닐 C_nH_2n _-3, 알킬 설파이드 CH₃(CH₂)n-S-, 디설파이드 알킬 CH₃CH_t-S-S-, 티오카바믹 에스테르 (CH₂)nC=NH-, 및 세미티오아세틸 CH₃CH(OH)-S-(여기서, n은 1 ~ 10이고 t는 0 ~ 9임), 방향족, R₄C(O)-로 표시되는 아실, 헤테로아릴, R₅C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 오가노메탈릭 아릴, 알킬-오가노메탈릭 아릴, 및 세미아세탈 R₆CH(OH)-S- , 또는 그 염, 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머 및 이들의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 정의한 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며,
R₃는 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
R₄는 수소, 알케닐, 아키닐, 알킬아릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 및 오가노메탈릭 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₅는 수소, 알케닐, 아키닐, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 및 알킬헤테로아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₆는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH이고,
x는 0 ~ 16이다).
제 2 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 다음과 같은 일반식을 가지는 것을 특징으로 하는 조절제:

(이 식에서, M은 공유결합 -[C(R₁)(R₂)]z-, 혹은 금속 킬레이트 또는 다른 금속 착화합물(여기서, 금속은 팔라듐이 아님)이고,
R₁ 및 R₂는 각각 수소, 아실 R₃C(O)-, 알킬 C_nH_2n ₊₁, C_mH_2m _-1로 표시되는 알케닐, C_mH_2m-3으로 표시되는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, CH₃(CH₂)n-S-로 표시되는 알킬 설파이드, R₄C(=NH)-으로 표시되는 이미도일, 및 R₆CH(OH)-S- 로 표시되는 헤미아세탈, 또는 그 염, 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머, 이들의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
상기 정의한 R₁ 및 R₂는 치환되지 않을 수도 있고 치환될 수도 있으며,
R₃는 아미노산, 탄수화물, 핵산, 지질 및 그 멀티머로 구성된 그룹으로부터 선택되며,
R₄ 및 R₅는 각각 수소, 알킬, 알케닐, 아키닐, 시클로알킬, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는데, 이는 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있으며,
R₅는 CCl₃, CF₃, 또는 COOH으로 구성된 그룹으로부터 선택되고,
x는 0 ~ 16, z는 0 ~ 5, n은 0 ~ 10, m은 2 ~ 10이다).
제 25 항, 제 25 항, 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 (R)-이성체 단독으로서 존재하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 25 항, 제 25 항, 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서,
상기 리포산 유도체는 (R)-이성체와 (S)-이성체의 혼합물로서 존재하는 것을 특징으로 하는 조절제.
제 1 항에 있어서,
상기 조절제는 PDH 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 치료 및 진단하는데 유용한 것을 특징으로 하는 조절제.
제 30 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 세포 과증식에 의해 더욱 특성이 나타나는 것을 특징으로 조절제.
제 31 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 암인 것을 특징으로 하는 조절제.
PDH 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군을 보이는 환자의 PDH 복합체를 조절하는 방법으로서, 유효량의 선행하는 제 1 항의 조절제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 33 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 세포 과증식에 의해 더욱 특성이 나타나는 것을 특징으로 방법.
제 34 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
PDH 복합체의 구조 및/또는 활성의 변화에 의해 특성이 나타나는 질병, 이상 또는 증후군의 증상을 나타내는 환자를 진단 및 예측하는 방법으로서, 환자로부터 세포 샘플을 얻는 단계, 시험관 내에서 상기 세포에 유효량의 선행하는 제 1 항의 조절제를 투여하는 단계, 및 그로부터 결과를 도출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 세포 과증식에 의해 더욱 특성이 나타나는 것을 특징으로 방법.
제 37 항에 있어서,
상기 질병, 이상 또는 증후군은 암인 것을 특징으로 하는 방법.