CN102083862A

CN102083862A - 有机-可溶性壳聚糖盐和由其制备的壳聚糖衍生生物材料

Info

Publication number: CN102083862A
Application number: CN200980121176XA
Authority: CN
Inventors: C-C·楚; C·钟
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-04-01
Publication date: 2011-06-01
Also published as: US20110150999A1; EP2260060A1; WO2009123713A1; EP2260060A4; US8841440B2

Abstract

公开了有机-可溶性壳聚糖盐，制备有机-可溶性盐的方法，以有机-可溶性壳聚糖盐制备的衍生自壳聚糖的材料，和制备衍生自壳聚糖的材料的方法。

Description

有机-可溶性壳聚糖盐和由其制备的壳聚糖衍生生物材料

发明领域

本发明涉及有机-可溶性(organo-soluble)壳聚糖盐，制备有机-可溶性盐的方法，由有机-可溶性壳聚糖盐制备的壳聚糖衍生物，和制备所述壳聚糖衍生物的方法。

发明背景

壳聚糖作为一种生物相容性的和生物可降解的多糖，已经引起各个行业的高度重视。Vande Vord，P.J.，Matthew，H.W.T.，DeSilva，S.P.，Mayton，L.，Wu，B.，Wooley，P.H.；J.Biomed.Mater.Res.2002，59，585-590。已经进行了很多旨在改进壳聚糖分子结构的尝试，以便向该分子中引入某些性质。Yu等人，Biomacromolecules；8(5)；1425-1435(2007)。

但是，与壳聚糖发生的化学反应通常在剧烈和非均一条件下发生(即，相比相应的均一条件而言为较高的温度和较长的反应时间)，并且，由于该分子在常见的有机溶剂中溶解性差，所以通常涉及多步保护和去保护方案。典型的方法是：1)使壳聚糖与环酐在诸如二甲基甲酰胺和水的溶液中在100℃-120℃的温度直接反应以获得第一个中间体；2)使第一个中间体与吡啶和例如三苯基氯代甲烷的反应物在85℃-105℃反应以获得第二个中间体；和3)使第二个中间体与另外的反应物在100℃-120℃的温度反应以获得最终产物，所述另外的反应物例如一水合肼和水。反应示例如下：

但是，从这些类型的反应获得的最终产物具有很多缺点Holappa等人，Macromolecules，37，2784-2789(2004)。例如，最终产物表现出低程度的取代(由于反应活性低造成的低修饰水平)和/或壳聚糖中存在的官能团的不可控制的(随机的)取代。

本申请的发明人已发现了一种在温和条件下生产有机-可溶性壳聚糖盐的有效方式。然后所述有机-可溶性壳聚糖盐可用于生产新的壳聚糖衍生物。

发明概述

本发明的第一个实施方式涉及制备有机-可溶性壳聚糖盐的方法，其包括：将壳聚糖分散在水溶液中以形成混合物，向该混合物中加入形成壳聚糖盐的酸，搅拌含有形成壳聚糖盐的酸的混合物以形成均一溶液，向该均一溶液中加入溶剂以沉淀有机-可溶性壳聚糖盐，以及回收所述有机-可溶性壳聚糖盐。

在第二个实施方式中，公开了有机-可溶性壳聚糖盐，其在有机-可溶性壳聚糖盐溶解性测试中是可溶的，在二甲基亚砜和甲酰胺中是可溶的，如用溶解于1mlDMSO或甲酰胺中的10mg盐样品进行的溶解性测试中所测定的。

第三个实施方式涉及制备壳聚糖衍生物的方法，其包括：获得有机-可溶性壳聚糖盐，将该有机-可溶性壳聚糖盐溶解于第一溶剂中以形成混合物，向该混合物中加入形成壳聚糖衍生物的化合物，使形成壳聚糖衍生物的化合物与该有机-可溶性壳聚糖盐反应以获得含有壳聚糖衍生物的反应溶液，终止反应，向所述反应溶液中加入第二溶剂以沉淀壳聚糖衍生物，以及回收所述壳聚糖衍生物。

本发明的第四个实施方式涉及制备壳聚糖衍生物的方法，其包括：将壳聚糖分散在第一溶剂中以形成混合物；向该混合物中加入形成壳聚糖盐的酸；向该混合物中加入形成壳聚糖衍生物的化合物；使形成壳聚糖衍生物的化合物、壳聚糖和形成壳聚糖盐的酸反应以获得含有壳聚糖衍生物的反应溶液；终止反应；向所述反应溶液中加入第二溶剂以沉淀壳聚糖衍生物；以及回收所述壳聚糖衍生物。

本发明的第五个实施方式涉及壳聚糖衍生物。

第六个实施方式涉及包含该壳聚糖衍生物的组合物。

术语“壳聚糖”在本文中的意思是一组乙酰基葡萄糖胺聚合物，但是具有一定程度的脱乙酰化。

术语“形成壳聚糖盐的酸”在本文中的意思是任何可用于形成根据本发明的壳聚糖盐的酸。特别地，根据本发明可以使用的形成壳聚糖盐的酸产生在有机溶剂中具有改进的溶解性的有机-可溶性壳聚糖盐。

“有机-可溶性壳聚糖盐溶解性测试”在本文中的意思是这样的测试，其中将10mg有机-可溶性壳聚糖盐样品分散在1ml 100％的DMSO和100％的甲酰胺二者中。使混合物静置24小时，然后进行研究以确定所述有机-可溶性壳聚糖盐是否是可溶的(即，完全溶解)、部分可溶的(即部分溶解)或不溶解。

术语“形成壳聚糖衍生物的化合物”在本文中的意思是任何可用于形成根据本发明的壳聚糖盐的化合物。

本文使用的术语“水凝胶”是指这样的聚合物材料，其表现出在水中膨胀并且将相当大一部分的水保留在其结构内而不溶解的能力。

本文使用的术语“光致交联”是指通过应用辐射能(radiant energy)引起乙烯键断裂并形成交联。

附图简述

图1显示了以下的X射线衍射图：(a)壳聚糖，(b)壳聚糖盐酸盐，c)壳聚糖乙酸盐，(d)壳聚糖甲基磺酸盐和(e)壳聚糖甲基苯磺酸盐。

图2A-E显示了以下的结果：(A)N-马来酸壳聚糖的¹H NMR光谱，(B)N-马来酸壳聚糖的¹³C NMR光谱，(C)N，O-马来酸壳聚糖的¹H NMR光谱，(D)N，O-马来酸壳聚糖的¹H-¹H COSY(双键信号区)和(E)N，O-马来酸壳聚糖的¹³C NMR光谱。

图3显示了MTT检验的结果。

图4显示了研究马来酸壳聚糖-PEGDA水凝胶对于平滑肌细胞的细胞毒性的实验结果。

图5显示了研究马来酸壳聚糖-PEGDA水凝胶对于大鼠平滑肌原代细胞的细胞毒性的实验结果。

图6显示了以下的FTIR：a)壳聚糖，b)聚-苄基-谷氨酸壳聚糖和c)聚谷氨酸壳聚糖。

图7显示了壳聚糖/聚(Z-苄基-谷氨酸)的NMR。

图8显示了壳聚糖聚-(谷氨酸)的NMR。

发明详述

壳聚糖和壳聚糖盐一般具有宽范围的分子量。本发明中优选使用具有相对高分子量的壳聚糖和壳聚糖盐。但是，根据本发明可以使用具有宽范围分子量的壳聚糖。

由于壳聚糖在25℃的水中一般是不可溶的，所以通常通过测定相应的壳聚糖盐的粘性而间接测定壳聚糖的粘性，例如，通过使用1重量％的乙酸水溶液。适合用于本发明的壳聚糖或壳聚糖盐优选在25℃在1.0重量％的水溶液中具有大约100厘泊(100mPa.s)至大约80,000厘泊(80,000mPa.s)的粘性，更优选为大约500厘泊(500mPa.s)至大约60,000厘泊(60,000mPa.s)的粘性，最优选为大约1,000厘泊(1,000mPa.s)至大约50,000厘泊(50,000mPa.s)的粘性。

壳聚糖是通过几丁质的脱乙酰化商业化生产的。乙酰化的程度是指存在于壳聚糖材料的脱水葡萄糖单元上的乙酰基团的平均数目。可以通过NMR光谱法确定脱乙酰化的程度。根据本发明可以使用的具有不同程度乙酰化的壳聚糖可以变化。在一个方面，壳聚糖具有60-99％的乙酰化程度。

壳聚糖一般被认为是晶体材料。结晶的程度一般取决于壳聚糖的来源及其加工史。在这个意义上，壳聚糖优选为粉末或晶体形式。

最初将壳聚糖分散在水溶液中以形成含有壳聚糖的混合物。水溶液优选是水，更优选是去离子水。壳聚糖中存在的大量游离氨基使得壳聚糖成为聚合性弱碱。壳聚糖在水、稀碱水和多数有机溶剂中不可溶。壳聚糖在稀酸(通常为羧酸)水中是可溶的，作为壳聚糖盐。

在这方面，将形成壳聚糖盐的酸也加入到混合物中。形成壳聚糖盐的酸可以是任何允许形成有机-可溶性壳聚糖盐的酸，所述有机-可溶性壳聚糖盐在有机溶剂中是可溶的。本发明的优选特征是该有机-可溶性盐在DMSO和甲酰胺中均可溶，如通过有机-可溶性壳聚糖盐溶解性测试所测定。

在该实施方式的一个方面，形成壳聚糖盐的酸选自甲酸、乙酸、磺酸(例如，烷基或烯丙基磺酸)、甲基磺酸、对甲基苯磺酸、樟脑磺酸、水杨酸、三氟甲基磺酸及其混合物。优选的方面是形成壳聚糖盐的酸是甲基磺酸或对甲基苯磺酸。

在该实施方式的另一个方面，形成壳聚糖盐的酸是短链磺酸。优选地，这些短链磺酸的特征在于具有不同于主要由壳聚糖显现的官能团(例如主要是羟基-OH和胺-NH₂)或具有其它能够与壳聚糖反应的官能团(例如巯基-SH)。在优选的方面，与短链磺酸形成的壳聚糖衍生物表征如下：

其中R选自

乙基磺酸(CH₃CH₂SO₃H)

1-丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃H)

苯基苯并咪唑磺酸(C₁₃H₁₀N₂O₃S)

(1R)-(-)-10-樟脑磺酸(C₁₀H₁₆O₄S)

樟脑醌-10-磺酸(C₁₀H₁₄O₅S)

2-(三甲基甲硅烷基)乙基磺酸(CH₃)₃SiCH₂CH₂SO₃H

三氟甲基磺酸(CF₃SO₃H)

加入足量的形成壳聚糖盐的酸，从而形成壳聚糖盐的酸能够与壳聚糖反应。优选向混合物中加入相对于壳聚糖的量为等摩尔量的形成壳聚糖盐的酸。

为了促进壳聚糖的溶解，可以使用搅拌子将溶液搅拌1-6小时，优选1-2小时。由此获得的溶液变成相对透明和均一的溶液。

发生反应的温度可以变化。但是，反应优选在15℃至35℃的温度进行，更优选在室温(即20℃至25℃)进行。在该实施方式的另一个特征中，温度绝不超过75℃，优选绝不超过90℃，更优选绝不超过100℃。该实施方式的优选特征还在于排除了保护反应、去保护反应和剧烈的酸处理条件。

反应示例如下：

向溶液中加入溶剂以沉淀有机-可溶性壳聚糖盐。溶剂优选为丙酮或醇，所述醇例如异丙醇。优选特征是在任何额外步骤之前沉淀有机-可溶性壳聚糖盐，所述额外步骤例如透析和/或干燥有机-可溶性壳聚糖盐。

沉淀的有机-可溶性壳聚糖盐任选地可以以另外的溶剂进行洗涤，所述溶剂例如丙酮。一旦洗涤之后，任选地通过过滤回收该有机-可溶性壳聚糖盐。可以使用多种过滤技术和设备完成过滤步骤。

然后，可以使用干燥方法将有机-可溶性壳聚糖盐干燥，所述干燥方法例如真空过滤或冷冻干燥。该实施方式的优选方面是在干燥之前使用溶剂将有机-可溶性壳聚糖盐沉淀。产物(即有机-可溶性壳聚糖盐)的产率在60-99％变化，优选为89％-99％。

所述有机-可溶性壳聚糖盐的纯度任选地在另一个步骤中加以改进：将有机-可溶性壳聚糖盐重新溶解于水溶液中，然后使用透析膜将有机-可溶性壳聚糖盐针对水溶液进行透析。透析膜的分子量截留值为20,000D，优选为10,000D，更优选为5,000D，再更优选为3,500D。

最终产物是纯化的有机-可溶性壳聚糖盐。

我们现在描述第二个实施方式。

第二个实施方式的有机-可溶性壳聚糖盐在(多种)有机溶剂中是可溶的。在一个方面，有机-可溶性壳聚糖盐在DMSO和甲酰胺中是可溶的和/或部分可溶的，如通过有机-可溶性壳聚糖盐溶解性测试所测。

在该实施方式的一个方面，有机-可溶性壳聚糖盐选自壳聚糖磺酸盐、壳聚糖甲基磺酸盐、壳聚糖甲基苯磺酸盐、壳聚糖樟脑磺酸盐、壳聚糖水杨酸盐和壳聚糖三氟甲基磺酸盐。有机-可溶性壳聚糖盐优选是壳聚糖甲基磺酸盐和壳聚糖甲基苯磺酸盐。壳聚糖甲基磺酸盐和壳聚糖甲基苯磺酸盐的例子如下：

在另一个方面，有机-可溶性壳聚糖盐选自壳聚糖乙基磺酸盐、壳聚糖苯基苯并咪唑磺酸盐、壳聚糖1-丙基磺酸盐、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸盐和壳聚糖樟脑醌-10-磺酸盐。

在优选的实施方式中，该实施方式的有机-可溶性盐通过第一个实施方式中描述的方法获得。与通过常规方法(即使用剧烈和非均一反应条件)获得的有机-可溶性壳聚糖盐相比，相信第一个实施方式的方法中采用的温和条件产生的有机-可溶性壳聚糖盐具有较少的聚合物骨架降解，直至没有聚合物骨架降解。

相信本发明的生产有机-可溶性壳聚糖盐的较温和条件产生了具有改进特征的有机-可溶性壳聚糖盐和使用有机-可溶性盐产生的壳聚糖衍生物。例如，以本发明的有机-可溶性盐产生的壳聚糖衍生物被官能团取代。在本发明的优选特征中，与使用剧烈和非均一反应条件获得的有机-可溶性壳聚糖盐相比，以有机-可溶性的产生的壳聚糖衍生物显示出较高程度的取代。另外，本发明的壳聚糖衍生物的取代的位置和程度也是可控的。

我们现在描述第三个实施方式，其涉及制备壳聚糖衍生物的方法，包括：获得有机-可溶性壳聚糖盐，将该有机-可溶性壳聚糖盐溶解于第一溶剂中以形成混合物，向该混合物中加入形成壳聚糖衍生物的化合物，使形成壳聚糖衍生物的化合物与有机-可溶性壳聚糖盐反应以获得含有壳聚糖衍生物的反应溶液，终止反应，向所述反应溶液中加入第二溶剂以沉淀壳聚糖衍生物，以及回收所述壳聚糖衍生物。

将根据本发明的第一个和/或第二个实施方式的有机-可溶性壳聚糖盐分散在有机溶剂中，所述有机溶剂例如甲酰胺、DMSO或其混合物。以所产生溶液的1-25重量％，优选1-5重量％的量加入有机-可溶性壳聚糖盐。该实施方式的优选特征是边搅拌溶液边向该溶液中加入有机-可溶性壳聚糖盐。有机-可溶性壳聚糖盐通常在30分钟至5个小时、30分钟至2个小时以及更优选为1-2个小时内溶解。该步骤优选在15℃至35℃的温度进行，更优选在室温(即20℃至25℃)进行。

然后可以向溶液中加入形成壳聚糖衍生物的化合物。形成壳聚糖衍生物的化合物是这样的化合物，即该化合物能够与根据本发明的实施方式的有机-可溶性壳聚糖盐反应以提供在有机溶剂中可溶的壳聚糖衍生物。壳聚糖衍生物还可以具有功能性双键(我们应该进一步描述该双键)和羧基官能团。壳聚糖衍生物优选是水溶性的、生物相容性的、带负电的、和生物可降解的。本发明的优选特征是C2、C3和/或C6位置的取代是可控的。这些位置示意如下：

优选特征是壳聚糖衍生物，其中形成壳聚糖衍生物的化合物是环酐，优选是在环中具有碳-碳双键的环酐(例如马来酸酐)。关于马来酸酐，马来酸酐中的环经历开环机制。从开环形成的马来酸酐的酸与如上所示的壳聚糖的C2位碳的氨基基团结合。环中存在的碳-碳双键现在被引入壳聚糖衍生物中，形成羧基，其本身可以被其它化合物官能化或通过光学方法形成凝胶。

在另一个特征中，N-羧基α-氨基酸酐(NCA)可以与壳聚糖盐反应。使用开环反应来制备壳聚糖衍生物。虽然NCA是酐类，但NCA不同于环酐，这是因为NCA反应引起类似于活性聚合的反应。结果是，在反应之后长的多肽链可以结合至壳聚糖上。

制备壳聚糖衍生物的第一个步骤(其中NCA是形成壳聚糖的衍生物)是制备氨基酸-NCA试剂(AA2NCA)。在20℃-75℃，优选40℃-50℃的温度将经保护的或未保护的α-氨基酸与例如三光气的反应物反应1-6个小时，优选2-4个小时。该反应产生氨基酸NCA。该反应的例子如下：

可用于该反应的氨基酸的例子如下：

在接下来的步骤中，将AA2NCA接枝到壳聚糖盐上。在20℃-35℃的温度，优选在室温将壳聚糖盐分散在有机溶剂(优选为DMSO或甲酰胺)中，以获得壳聚糖衍生物多肽。用于该反应的壳聚糖盐优选为第二个实施方式的壳聚糖盐。使用甲基磺酸盐或甲基苯磺酸盐的反应示例如下：

在α-氨基酸被保护的方面中，可以使用再混合保护基团的反应来恢复氨基酸中的最初官能团。

一个例子如下：

优选以糖单元的2-10倍摩尔比，更优选为糖单元的4.5至6.5倍摩尔比加入形成壳聚糖衍生物的化合物。形成壳聚糖衍生物的化合物与有机-可溶性盐的反应优选在搅拌和例如N2的保护气中在30℃-90℃，优选40℃-75℃，更优选50℃-70℃的温度进行6至72小时，优选为12至36小时。本发明的优选特征是在反应中不加酸和/或温度绝不超过90℃，优选为绝不超过100℃。

有机-可溶性壳聚糖盐和环酐进行的反应示例如下：

一旦生成足量的壳聚糖衍生物则终止反应。然后可以向混合物中加入溶剂以将壳聚糖衍生物沉淀出来，所述溶剂例如丙酮、醇或异丙醇。在该实施方式的优选方面，沉淀步骤在搅拌下进行。

沉淀的壳聚糖衍生物任选地以另一种溶剂洗涤，所述另一种溶剂例如丙酮、水溶液或醇。一旦洗涤之后，通过例如过滤回收壳聚糖衍生物。可以使用多种过滤技术和设备完成过滤步骤。

可以使用干燥方法将壳聚糖衍生物干燥，所述干燥方法例如真空过滤或冷冻干燥。

壳聚糖衍生物任选地可以进一步加以修饰。例如，壳聚糖衍生物可以进行水解。水解允许进行壳聚糖的广泛的位点选择性N-乙酰化修饰。例如，马来酸壳聚糖可以被进一步修饰以获得壳聚糖衍生物化合物，例如N-马来酸壳聚糖，或N，O-马来酸壳聚糖。通过水解策略完全除去N，O-马来酸壳聚糖上的酯基团产生N-马来酸壳聚糖。因此，从甲基磺酸(或甲基苯磺酸)壳聚糖盐中间体衍生的简易合成路线与在强碱性溶液中的水解策略联合将允许进行壳聚糖的广泛的位点选择性N-乙酰化修饰。

通过将壳聚糖衍生物以形成基本透明溶液的量重新溶解于例如NaHCO₃的溶剂中持续1-4小时，优选2小时，以此来产生N，O-马来酸壳聚糖。然后使用透析膜将溶液中的修饰的壳聚糖衍生物针对水溶液(例如去离子水)进行透析。透析膜的分子量截留值为20,000D，优选为10,000D，更优选为5,000D，再更优选为3,500D。

然后可以回收并干燥修饰的壳聚糖衍生物。例如，可以使用液氮将壳聚糖衍生物冻干。产物的最终产率优选范围为60％-95％。

修饰的马来酸壳聚糖(即N，O-马来酸壳聚糖)的生产示例如下：

形成壳聚糖盐的酸(例如，如第一个实施方式中所讨论的)和壳聚糖一起直接分散在有机溶剂中，该有机溶剂例如甲酰胺、DMSO或混合物。换言之，不直接使用第一个和第二个实施方式的有机-可溶性壳聚糖盐。而是，足量的形成壳聚糖盐的酸和壳聚糖盐能够反应。优选地以相对于壳聚糖的量等摩尔的量向水溶液中加入形成壳聚糖盐的酸。

发生反应的温度可以变化。但是，反应优选在15℃至35℃的温度进行，更优选在室温(即20℃至25℃)进行。在该实施方式的另一个优选特征中，温度绝不超过75℃，优选绝不超过90℃，更优选绝不超过100℃。该实施方式的优选特征还在于排除了保护反应、去保护反应和剧烈的酸处理条件。

然后向溶液中加入形成壳聚糖衍生物的化合物(例如，根据第三个实施方式)并与壳聚糖和形成壳聚糖盐的酸反应以生成壳聚糖衍生物。优选以糖单元的2-10倍摩尔比，更优选为糖单元的4.5至6.5倍摩尔比加入形成壳聚糖衍生物的化合物。形成壳聚糖衍生物的化合物与有机-可溶性盐的反应优选在搅拌和例如N2的保护气中在30℃-90℃，优选40℃-75℃，更优选50℃-70℃的温度进行6至72小时，优选进行12至36小时。本发明的优选特征是在反应中不加酸和/或温度绝不超过90℃，优选为绝不超过100℃。

一旦产生生成的壳聚糖衍生物，可以根据如第三个实施方式中公开的相同步骤、条件和反应剂对壳聚糖衍生物进行进一步处理。也获得相似的产物和产率。

本发明的第五个方面涉及壳聚糖衍生物。

在优选的情况下，根据第三个或第四个实施方式生产壳聚糖衍生物。

壳聚糖衍生物是水溶性的，生物相容性的，带负电的和生物可降解的。壳聚糖衍生物还具有功能性双键(我们应该进一步描述该双键)和羧基官能团。壳聚糖衍生物优选是水溶性的，生物相容性的，带负电的的和生物可降解的。本发明的优选特征是形成壳聚糖衍生物的化合物可以在C2、C3和/或C6位置结合至有机-可溶性壳聚糖盐。

形成壳聚糖衍生物的化合物的酸可以来自第三个和第四个实施方式中讨论的那些形成壳聚糖衍生物的化合物。在优选的实施方式中，形成壳聚糖衍生物的化合物是马来酸酐，而马来酸酐用于生产马来酸壳聚糖。

根据本发明的马来酸壳聚糖的例子如下所示：

在优选的特征中，壳聚糖衍生物在C2、C3和/或C6位置被取代并且壳聚糖衍生物具有0.55至1.75的取代度，优选具有1.2-1.6的取代度。

壳聚糖衍生物上的羧基官能团可以被生物活性材料取代，所述生物活性材料例如带正电的氨基酸、肽、抗生素、药物、多肽、抗炎剂、抗血小板剂、抗凝剂、免疫抑制剂、一氧化氮衍生物、抗微生物剂、生长因子、聚合物、形成凝胶的聚合物及其组合。在本发明的一个方面，壳聚糖衍生物被PEGDA、TEMPO或GRGD取代。

本文使用的“氨基酸”是D或L形式的天然氨基酸残基(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，以及具有一个或多个开放价的非天然氨基酸(例如，磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；磷酸酪氨酸；羟基脯氨酸；γ-羧基谷氨酸盐(gamma-carboxyglutamate)；马尿酸；八氢吲哚-2-羧酸；抑胃酶氨酸；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；青霉胺；鸟氨酸；瓜氨酸；α-甲基-丙氨酸；对苯甲酰苯丙氨酸；苯基甘氨酸；炔丙基甘氨酸；肌氨酸；和叔丁基甘氨酸)残基。该术语还包括具有氨基保护基(例如，乙酰基、酰基、三氟乙酰基或苄氧羰基)的天然和非天然氨基酸，以及以保护基团(例如，(C1-C6)烷基苯基或苄基酯或酰胺)在羧基保护的天然和非天然氨基酸。其它合适的氨基和羧基保护基团对本领域技术人员是已知的(参见，例如T.W.Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981；D.Voet，Biochemistry Wiley：New York，1990；L.Stryer，Biochemistry，(第三版)，W.H.Freeman and Co.：New York，1975；J.March，Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Structure，(第二版)，McGraw Hill：New York，1977；F.Carey and R.Sundberg，Advanced Organic Chemistry，Part B；Reactions and Synthesis，(第二版)，Plenum：New York，1977；以及其中引用的参考文献)。根据本发明，氨基或羧基保护基团还可以包含非金属放射性核(例如氟-18、碘-123或碘-124)。

术语“氨基酸”包括α氨基酸和β氨基酸。α氨基酸包括单羧基单氨基酸、二羧基单氨基酸、多氨基酸和杂环氨基酸。单羧基单氨基酸的例子包括甘氨酸、α-苯基甘氨酸、α-丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、β-巯基缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基亮氨酸、β-羟基亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、N-甲基苯丙氨酸、哌可酸、肌氨酸、硒氨酸、酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素。二羧基单氨基酸和酰胺的例子包括天冬氨酸、β-甲基天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、α-氨基己二酸、4-酮-哌可酸、羊毛硫氨酸和谷氨酰胺。多氨基酸的例子包括鸟氨酸、赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、5-羟基赖氨酸、锁链赖氨素、精氨酸和胱氨酸。杂环氨基酸的例子包括脯氨酸、4-羟基脯氨酸和组氨酸，和色氨酸。其它α-氨基酸的例子有γ-羧基谷氨酸盐和瓜氨酸。β氨基酸的例子包括例如β-丙氨酸。

本文使用的“肽”是2至25个氨基酸(例如上文所定义的那些)的序列或具有一个或多个开放价的肽残基。该序列可以是线性的或环形的。例如，环肽可以通过序列中的两个半胱氨酸残基之间二硫桥的形成而制备或由此产生。肽可以通过羧基末端、氨基末端或通过任何其它方便的结合点连接，如，例如通过半胱氨酸的硫。可以按照美国专利号4,612,302；4,853,371和4,684,620的公开内容制备肽衍生物。本文中具体提及的肽序列按照氨基端在左、羧基端在右的顺序书写。优选的肽是GRGD。

适宜的抗生素包括阿霉素PFS/RDF

(Pharmacia & Upjohn)、Blenoxane(Bristol-Myers Squibb Oncology/Immunology)、Cerubidine(Bedford)、Cosmegen(Merck)、DaunoXome

(NeXstar)、Doxil

(Sequus)、Doxorubicin Hydrochloride(Astra)、Idamycin

PFS Pharmacia & Upjohn)、Mithracin

(Bayer)、Mitamycin

(Bristol-Myers Squibb Oncology/Immunology)、Nipen(SuperGen)、Novantrone

(Immunex)和Rubex(Bristol-Myers Squibb Oncology/Immunology)。适宜的抗代谢剂包括Cytostar-U

(Pharmacia & Upjohn)、Fludara(Berlex)、Sterile FUDR

(Roche Laboratories)、Leustatin

(Ortho Biotech)、Methotrexate

(Immunex)、Parinethol

(Glaxo Wellcome)、Thioguanine

(Glaxo Wellcome)和Xeloda

(Roche Laboratories)。

一种或多种药物可以通过连接子连接直接或间接连接到壳聚糖衍生物。具体地，每种药物可以直接连接到壳聚糖衍生物的羧基基团。任何合适数目的药物可以直接连接到壳聚糖衍生物。药物是治疗剂或诊断剂，其包括除了食物以外的用于预防、诊断、减缓、治疗或治愈疾病的任何物质。Stedman′s Medical Dictionary第25版，Illustrated(1990)p.486。物质可以通过口服摄入；注射入肌肉、皮肤、血管或体腔；或局部施用。Mosby′s Medical，Nursing & Allied Health Dictionary，第5版，(1998)p.516。药物可以包括下列至少一项中公开的任何物质：The Merck Index，第12版(1996)；Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology.Pei-Show Juo，(1996)；U.S.Pharmacopeia Dictionary 2000年版；和Physician′s Desk Reference，2001年版。

具体地，药物可以包括但不限于下列一种或多种：多肽、治疗性抗体阿昔单抗、抗炎剂、血液调节剂、抗血小板剂、抗凝剂、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、抗癌剂、抗细胞增殖剂和一氧化氮释放剂。

多肽可以具有任何适宜的长度。具体地，多肽可以是大约2至大约5,000个氨基酸的长度，含端点值；大约2至大约2,000个氨基酸的长度，含端点值；大约2至大约1,000个氨基酸的长度，含端点值；或大约2至大约100个氨基酸的长度，含端点值。

多肽还可以包括“肽模拟物”。肽类似物通常在药业中用作具有类似于模板肽的那些性质的非肽类药物。这些类型的非肽类化合物被称作“肽模拟物”或“拟肽”。Fauchere，J.(1986)Adv.Drug Res.15：29；Veber和Freidinger(1985)TINS p.392；和Evans等人(1987)J.Med.Chem.，30：1229；并且通常通过计算机化分子模型的帮助进行开发。一般地，拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有某生化性质或药理学活性的多肽)，但是，其具有的一个或多个肽键任选地被选自以下的键替换：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-，通过本领域已知的方法和下列参考文献进一步描述的方法进行：Spatola，A.F.in在“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，”中，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，“Peptide Backbone Modifications”(一般性综述)；Morley，J.S.，Trends.Pharm.Sci.，(1980)pp.463-468(一般性综述)；Hudson，D.等人，Int J.Pept.Prot.Res.，(1979)14：177-185(-CH₂NH-，CH₂CH₂-)；Spatola，A.F.等人，Life Sci..(1986)38：1243-1249(-CH₂-S-)；Hann，M.M.，J.Chem.Soc.Perkin Trans I(1982)307-314(-CH＝CH-，顺式和反式)；Almquist，R.G.等人，J.Med.Chem.，(1980)23：1392-1398(-COCH₂-)；Jennings-White，C.等人，Tetrahedron Lett.，(1982)23：2533(-COCH₂-)Szelke，M.等人，European Appln.，EP 45665(1982)CA：97：39405(1982)(-CH(OH)CH₂-)；Holladay，M.W.等人，Tetrahedron Lett.，(1983)24：4401-4404(-C(OH)CH₂-)；和Hruby，V.J.，Life Sci.，(1982)31：189-199(-CH₂-S-)。这样的肽模拟物可以具有显著优于多肽实施方式的优点，包括例如：生产更经济、化学稳定性更高、药理学特性增强(半衰期、吸附性、效力、功效等)、特异性改变(例如广谱的生物学活性)、抗原性降低和其它的优点。

另外，以相同类型的D-氨基酸替换多肽中的一个或多个氨基酸(例如以D-赖氨酸替换L-赖氨酸)可用于产生更稳定的多肽和对外源蛋白酶呈抗性的多肽。

在一个方面，多肽可以是抗体。这样的抗体的例子包括单链抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab片段、IgA、IgG、IgM、IgD、IgE和人源化抗体。在一个实施方式中，抗体能够与诸如钙粘蛋白、整合素或选择素的细胞吸附性分子结合。在另一种情况下，抗体能够与诸如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白的分子结合。在另一种情况下，抗体能够与诸如肾上腺素受体、B-细胞受体、补体受体、胆碱能受体、雌激素受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体、生长因子受体或T细胞受体的受体结合。本发明的抗体还能够与血小板聚集因子(例如纤维蛋白原)、细胞增殖因子(例如生长因子和细胞因子)和血液凝固因子(例如纤维蛋白原)结合。

在另一种情况下，抗体能够与例如毒素的活性试剂缀合。在另一种情况下，抗体可以是阿昔单抗(ReoPro(R))。阿昔单抗是与β(3)整合素结合的嵌合抗体的Fab片段。阿昔单抗对于血小板糖蛋白IIb/IIIa受体例如血液细胞上的那些是特异性的。人类主动脉平滑肌细胞在其表面表达α(v)β(3)整合素。处理表达β(3)的平滑肌细胞可以阻止其它细胞的吸附并减少细胞迁移或增殖，从而减少经皮冠状动脉介入治疗干预(CPI)之后的再狭窄，例如狭窄、血管成形术、支架。阿昔单抗还抑制血液血小板的聚集。

在一种情况下，肽可以是糖肽。“糖肽”是指寡肽(例如七肽)抗生素，其特征在于任选由糖基团取代的多环肽核心，例如万古霉素。可以在Raymond C.Rao的Glycopeptides Classification，Occurrence，and Discovery”和Louise W.Crandall，(“Drugs and the Pharmaceutical Sciences”Volume 63，编者Ramakrishnan Nagarajan，出版者Marcal Dekker，Inc.)中找到该定义中包括的糖肽的例子。糖肽的另外的例子公开于美国专利号4,639,433；4,643,987；4,497,802；4,698,327；5,591,714；5,840,684；和5,843,889；EP 0 802 199；EP 0 801 075；EP 0 667 353；WO 97/28812；WO 97/38702；WO 98/52589；WO 98/52592；和J.Amer.Chem.Soc.，1996，118，13107-13108；J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，12041-12047；以及J.Amer.Chem.Soc.，1994，116，4573-4590。代表性糖肽包括鉴定为A477、A35512、A40926、A41030、A42867、A47934、A80407、A82846、A83850 A84575、AB65、阿克拉宁、类放线菌素、阿达星、阿伏帕星、远青霉素、Balhimycin、Chloroorientiein、Chloropolysporin、Decaplanin、去甲基万古霉素、Bremomycin、Galacardin、Helvecardin、Izupeptin、Kibdelin、LL-AM374、甘露糖肽素、MM45289、MM47756、MM47761、MM49721、MM47766、MM55260、MM55266、MM55270、MM56597、MMS6598、OA-7653、Orenticin、Parvodicin、利托菌素、瑞斯托霉素、Synmonicin、替考拉宁、UK-68597、UK-69542、UK-72051、万古霉素等。本文中使用的术语“糖肽”或“糖肽抗生素”还旨在包括其中糖部分不存在的如上所公开的一般类别的糖肽，即，糖肽的糖苷配基系列。例如，通过温和水解除去万古霉素中苯酚上结合的二糖部分则产生万古霉素糖苷配基。术语“糖肽抗生素”的范围内还包括如上所公开的一般类别的糖肽的合成衍生物，包括烷基化和酰基化衍生物。另外，该术语的范围内还包括以类似于万古胺的方式另外结合附加的糖残基的糖肽，特别是氨基糖苷。

在一个方面，肽可以是脂化糖肽。术语“脂化糖肽”具体是指经过合成修饰以含有脂取代物的那些糖肽抗生素。本文使用的术语“脂取代物”是指任何含有5个或更多个碳原子，优选10至40个碳原子的取代物。脂取代物任选可以含有1至6个选自卤素、氧、氮、硫和磷的杂原子。脂化糖肽抗生素在本领域是熟知的，参见，例如，美国专利号5,840,684、5,843,889、5,916,873、5,919,756、5,952,310、5,977,062、5,977,063、EP 667,353、WO 98/52589、WO 99/56760、WO 00/04044、WO 00/39156，其公开内容通过引用全文并入本文。

抗炎剂包括例如止痛剂(例如NSAIDS和水杨酸盐)、抗风湿剂、胃肠道试剂、痛风制备物、激素(糖皮质激素)、鼻制备物、眼制备物、耳制备物(例如抗生素和类固醇组合)、呼吸试剂和皮肤&粘膜试剂。参见Physician’s Desk Reference，2001年版。具体地，抗炎剂可以包括地塞米松，其化学名称为(11β，16α)-9-氟-11，17，21-三羟基-16-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮。或者，抗炎剂可以包括西罗莫司(雷帕霉素)，其为从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分离而来的三烯大环内酯类抗生素。

抗血小板和抗凝剂包括例如Coumadin

(DuPont)、Fragmin

(Pharmacia & Upjohn)、Heparin

(Wyeth-Ayerst)、Lovenox

Normiflo

Orgaran

(Organon)、Aggrastat

(Merck)、Agrylin

(Roberts)、Ecotrin

(Smithkline Beechamn)、Flolan

(Glaxo Wellcome)、Halfprin(Kramer)、Integrillin

(COR Therapeutics)、Integrillin

(Key)、Persantine

(Boehringer Ingelheim)、Plavix

(Bristol-Myers Squibb)、ReoPro

(Centecor)、Ticlid

(Roche)、Abbokinase

(Abbtt)、Activase

(Genentech)、Eminase

(Roberts)和Strepase(Astra)。参见Physician′s Desk Reference，2001版。特别地，抗血小板和抗凝剂可以包括曲匹地尔(avantrin)、西洛他唑、肝素、水蛭素或伊洛前列素。

曲匹地尔的化学名称是N，N-二甲基-5-甲基-[1，2，4]三唑[1，-5-a]嘧啶4-胺。西洛他唑的化学名称是6-[4-(1-环己基-1H-四唑-5-基)-丁氧基]-3，4-二氢-2(1H)-喹啉酮。

肝素是具有抗凝活性的葡胺聚糖；其是由D-葡萄糖胺和L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸这两者之一的重复单元组成的可变磺化多糖链的非均一混合物。水蛭素是从水蛭例如欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)中提取出来的抗凝蛋白。伊洛前列素的化学名称是5-[六氢-5-羟基-4-(3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-ynyl)-2(1H)-pentalenylidene]戊酸。

免疫抑制剂可以包括例如Azathioprine

(Roxane)、BayRho-D(Bayer Biological)、CellCept(Roche Laboratories)、Imuran

(Glaxo Wellcome)、MiCRhoGAM(Ortho-Clinical Diagnostics)、Neoran

(Novarts)、Orthoclone OKT3

(Ortho Biotech)、Prograf

(Fujisawa)、PhoGAM

(Ortho-ClinicalDiagnostics)、Sandimmune

(Novartis)、Simulect

(Novartis)和Zenapax

(Roche Laboratories)。特别地，免疫抑制剂可以包括雷帕霉素或萨立多胺。雷帕霉素是从吸水链霉菌中分离而来的三烯大环内酯物。萨立多胺的化学名称是2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异-吲哚-1，3(2H)-二酮。

在一种情况下，治疗有效量的一氧化氮(NO)衍生物化合物与壳聚糖衍生物的羧酸结合。这样的化合物的例子为2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧；2，2，5，5-四甲基-3-吡咯烷-1-氧-3-羰基；4-(N，N-二甲基-N-十六烷基)铵-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧，碘化物(CAT16)；4-三甲基铵-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧，碘化物(CAT 1)；3-氨基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧；N-(3-(碘乙酰基)氨基)-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧(PROXYL 1A)；琥珀酰亚胺基2，2，5，5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧-3-羧酸酯；2，2，5，5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧-3-羧酸；2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-羧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-乙酰氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-溴-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-(N，N-二甲基-N-(2-羟乙基))铵-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧；4-(N，N-二甲基-N-(3-硫代丙基)铵-2，2，6，6-四甲基哌啶-1氧；N-(4-(碘乙酰基)氨基-2，2，6，6四甲基哌啶-1-氧；N-(2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧-4-基)马来酰亚胺；及其混合物。特别优选的化合物是4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基。

还可以产生一氧化氮样化合物。适宜的一氧化氮样化合物公开于例如美国专利号5,650,447，和牛或人血清白蛋白的S-亚硝基硫醇衍生物(加合物)。参见，例如Inhibition of neointimal proliferation in rabbits after vascular injury by a single treatment with a protein adduct of nitric oxide；David marks等人J.Clin.Invest.(1995)；96：2630-2638。

抗微生物剂是杀死或抑制诸如细菌、真菌、原生动物或病毒的微生物的生长的物质。抗微生物剂可以是抗病毒、抗细菌、抗真菌剂或金属(例如Ag、Cu或Hg)。在优选的方面，抗微生物剂不与壳聚糖衍生物结合。而是，抗微生物剂浸没在壳聚糖衍生物之内或其周围。在另一个实施方式中，银是优选的抗微生物剂。

术语生长因子是指能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的天然产生的蛋白。生长因子对于调节多种细胞过程是重要的。生长因子通常作为细胞之间的信号分子发挥作用。例子为与其靶细胞表面上的特异性受体结合的细胞因子和激素。它们通常促进细胞分化和成熟，这在诸生长因子之间是不同的。例如，骨成形蛋白刺激骨细胞分化，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。根据要求保护的发明可使用的生长因子的例子包括但不限于内皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)。

在优选的方面，带正电的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)直接连接至壳聚糖衍生物的羧基基团。

除了与一种或多种生物活性材料结合或连接(无论直接或通过连接子)之外，本发明的壳聚糖衍生物可以与一种或多种生物活性材料进行物理混杂以提供壳聚糖衍生的组合物。本文使用的“混杂”是指本发明的壳聚糖衍生物与生物活性材料进行物理混合，或本发明的壳聚糖衍生物与生物活性材料进行物理接触。

可以使用任意合适量的壳聚糖衍生物和生物活性材料以提供组合物。壳聚糖衍生物可以以组合物的大约0.1wt％至大约99.9wt％存在。通常，壳聚糖衍生物可以以组合物的大约25wt％以上存在；以组合物的大约50wt％以上存在；以组合物的大约75wt％以上存在；或以组合物的大约90wt％以上存在。

在此意义上，我们现在描述第六个实施方式，其涉及含有壳聚糖衍生物的组合物。

壳聚糖衍生物可用于多种应用，以提供膜、凝胶、水凝胶、血液凝固产品、伤口愈合产品、骨再生材料、组织工程支架、隐形眼镜、牙齿器具、种衣剂(seed coating)、肥料、可控农用化学品释放组合物、膳食添加剂、防腐剂、抗微生物纺织品面饰(finishes)、废水处理材料、化妆品、洗剂、保湿剂。

在该实施方式的一个特征中，本发明的壳聚糖衍生物用于生产水凝胶，该水凝胶用于生物载体。壳聚糖衍生物以适宜的重量比溶于例如蒸馏水的水溶液中以产生如上所述的浓度，以制备浓度为10-30％(w/v)的溶液。然后向该溶液中加入光引发剂。可以使用任何光引发剂，但是光引发剂优选为2，2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯、4-(2-羟基乙氧基)-苯基-(2-羟基-2-丙基)酮(Irgacure 2959)和DMPAP。优选以0.01-10％、0.1-3.0％(w/w)的量加入光引发剂。任选地加入溶剂，这取决于所用的光引发剂(例如DMPAP)的类型。向溶液中加入溶剂，例如N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。通过UV照射进行光致交联，例如，在室温，优选在20℃至30℃进行5至30分钟，优选进行10至20分钟。然后优选将未反应的化学物质从产生的水凝胶中滤除(leach out)。优选通过在热水(例如35℃至75℃)中浸没1-4个小时，优选2个小时，来进行水凝胶的干燥，从而获得收缩，在40℃-80℃，优选在60℃在真空炉中将收缩的水凝胶干燥5至15个小时。

以壳聚糖衍生物生产的水凝胶可用于多个目的，包括生物活性材料的可控释放。在这个方面，生物活性材料可以与壳聚糖衍生物中的游离羧基反应以在生物活性材料和前体之间形成共价键，或者，生物活性材料可以物理地被前体封装或包封。通过水凝胶上的代谢作用，生物活性材料被释放，和水凝胶的结合或包封于水凝胶或用水凝胶封装延缓释放，例如，延缓释放2至48小时或更长。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶还可用作临时皮肤覆盖物，例如，作为伤口敷料或人造皮肤。在这种情形中，水凝胶中可以有利地掺入抗微生物剂和/或伤口愈合生长因子。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶还可封装用于基因治疗的病毒以保护病毒抵抗身体的免疫系统直至它们到达要进行遗传改变的位点。在常规基因治疗中，是将病毒注射在预期的引入位点，需要进行很多注射以适应病毒的失活。本文的水凝胶对病毒进行保护，从而可以使用较少的注射。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶还可用于农业目的以包被种子。水凝胶包衣促进种子萌芽过程中水分的保留并促进氧气通过孔结构的运输，并且其可以包括化学试剂，例如杀虫剂，以递送至种子。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶可以用于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的给药以刺激成骨细胞的增殖(即促进骨形成)并刺激血管生成(血管的发育)。壳聚糖衍生物中的羧酸基团作为bFGF的离子结合位点。将掺入bFGF的水凝胶局部施用到骨或血管。在水凝胶的生物降解之后获得bFGF的持续释放以促进骨生长和血管形成。bFGF与本文的壳聚糖衍生物的结合保护bFGF抵抗酶降解或变性，从而bFGF能够发挥其生物学功能并且由于bFGF针对酸性化合物的内在亲和性而发生。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶可以用于例如生物传感器的微型装置中的组成成分。水凝胶中的羧基基团对例如pH和金属离子浓度的各种环境刺激是极其敏感的，水凝胶的膨胀率和其它性质可以根据可控外部刺激的变化发生相应改变。

来自本文的壳聚糖衍生物的水凝胶还可用于常规使用水凝胶的情况，例如，用于食物增浓、用于向植物进行水分释放、用于清洁环境中的流体摄取和保持、作为纺织品应用的亲水性包衣、用于隐形眼镜和用于色谱和电泳中的分离和扩散凝胶。

本文的生物可降解水凝胶是从含有至少一种生物可降解成分(即，由水和/或自然中存在的酶降解的成分)的水凝胶形成体系形成的水凝胶。

不与本文的水凝胶形成体系的成分反应的生物活性分子可以物理地包封在水凝胶内或者物理地封装在水凝胶内：通过将其加入到反应混合物中，反应混合物进行光致交联，从而光致交联引起水凝胶的形成，所述水凝胶带有包封在其中或被其封装的生物活性试剂。

在该实施方式的优选方面，产生可用于形成用于组织工程的支架的水凝胶。例如，GRGD基团通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC)化学法结合到壳聚糖衍生物上。含有GRGD的壳聚糖衍生物可以光聚合到具有良好的细胞吸附能力的功能性水凝胶中。GRGD壳聚糖衍生物凝胶可用作组织工程的支架(例如，用作进一步生物矿化的模板以制备骨组织工程支架)。

此外，如上所述，本发明的壳聚糖衍生物的优点在于它们可以含有一个以上的游离羧基基团。在此意义上，不含Gly-Arg-Gly-Asp(GRGD)基团的羧基基团可以进行进一步生物官能化。

在该特征的优选方面，壳聚糖衍生物是马来酸壳聚糖，形成GRGD马来酸壳聚糖。

反应示例如下：

在一个方面，壳聚糖衍生物可以与聚合物反应以形成凝胶。如上所述，凝胶本身可以在UV光下在水溶液中形成。壳聚糖衍生物和生物兼容性凝胶聚合物例如PEGDA可以在紫外光下在水溶液中进行光聚合。然后，可以加入溶液重量的0.01％至10％，优选0.01％至5％的量的光引发剂浓度。在形成基于聚合物-壳聚糖衍生物的凝胶的过程中，可以通过调节壳聚糖衍生物和聚合物之间的比例、化合物的分子量和壳聚糖衍生物的取代度来控制水凝胶的强度和多孔性。

例如，这可以通过控制马来酸壳聚糖和PEGDA之间的比例、PEGDA的分子量和马来酸壳聚糖的取代度在PEGDA-马来酸壳聚糖化合物中实现。在优选的方面，凝胶用作药物载体和组织工程支架。特别地，由于PEGDA和壳聚糖衍生物均是水溶性的，因此，这个特征联同随后的UV光启动的光聚合可以使该体系作为用于药物递送和组织工程应用的可注射体系。

在该实施方式的优选特征中，壳聚糖衍生物是马来酸，生物兼容性聚合物是PEGDA。

结构式如下：

反应本身可以示例如下：

在另一个方面，可以以第五个实施方式中所讨论的抗微生物剂处理PEGDA马来酸壳聚糖化合物。特别地，在马来酸壳聚糖/PEGDA浸泡在含有硝酸盐的水溶液中之后，马来酸壳聚糖/PEGDA中的阴离子羧基基团从硝酸银中捕获银离子。

组合物可以包含所述材料，实质上由其组成，或由其组成。方法可以包括使用所述材料的所述步骤，实质上由其组成，或由其组成。

已经呈现了本发明的以上描述，描述了一些可操作的和优选的实施方式。无意将本发明局限于此，因为其变体和改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，这些变体和改变全部落在本发明的精神和范围内。

以下给出本发明的工作实施例。

实施例1

壳聚糖甲基磺酸盐的合成

将1.0g壳聚糖分散在100ml去离子水中。然后向悬浮液中加入甲基磺酸[摩尔比(酸∶氨基基团)＝1.2]并搅拌2个小时。2小时后，壳聚糖完全溶解，通过加入过量的丙酮或异丙醇将其沉淀。以丙酮将沉淀的产物洗涤几次并在真空中干燥。产物的产率范围为93％-97％。

实施例2

马来酸壳聚糖的合成

N，O-马来酸壳聚糖

在室温搅拌下将实施例1中制备的1.489g壳聚糖甲基磺酸盐溶于100ml甲酰胺溶剂中。然后向溶液中加入3.52g的6倍摩尔比的固体马来酸酐。在60℃在N₂下将反应混合物搅拌24小时。

使用丙酮将溶液中生成的产物沉淀出来、过滤、以大量丙酮洗涤并干燥。然后通过加入0.1M NaHCO₃溶液将产物中的甲基磺酸阴离子从壳聚糖盐中除掉。最后将溶液针对去离子水透析3天以上(MW截留值为12,000)并冻干至89％的产物产率。

实施例3

N-马来酸壳聚糖

在室温将0.5g N，O-马来酸壳聚糖在20ml 0.1M的水性氢氧化钠中水解10小时，然后针对去离子水透析3天并冻干以获得0.33g产物。

实施例4

壳聚糖甲基苯磺酸盐的合成

将1.0g壳聚糖分散在100ml去离子水中。然后向悬浮液中加入甲基苯磺酸[摩尔比(酸∶氨基基团)＝1.2]并搅拌2个小时。2小时后，壳聚糖完全溶解，通过加入大量的丙酮或异丙醇将其沉淀。以丙酮将沉淀的产物洗涤几次并在真空中干燥。产物的产率是93％。

实施例5

马来酸壳聚糖衍生物的合成

N，O-马来酸壳聚糖

在室温搅拌下将实施例4中获得的1.875g壳聚糖甲基苯磺酸盐溶于100ml甲酰胺溶剂中。然后加入3.52g的6倍摩尔比的固体马来酸酐以形成溶液，在60℃在N₂下将反应混合物搅拌24小时。使用丙酮将溶液中生成的产物沉淀出来、过滤、以过量丙酮洗涤并干燥。然后通过加入0.1M NaHCO₃溶液将产物中的甲基苯磺酸阴离子从壳聚糖盐中除掉。最后将溶液针对去离子水透析3天以上(MW截留值为12,000)并冻干至69％-89％的产物产率。

实施例6

N-马来酸壳聚糖

在室温将0.5g实施例5中获得的N，O-马来酸壳聚糖在20ml 0.1M的水性氢氧化钠中水解10小时，然后针对去离子水透析3天并冻干以获得0.33g N-马来酸壳聚糖产物。

实施例7

从壳聚糖甲基磺酸盐和壳聚糖甲基苯磺酸盐制备而来的N，O-马来酸壳聚糖

使用壳聚糖甲基磺酸(MeSO₃-)盐和甲基苯磺酸(TSO₃-)盐作为中间体用于甲酰胺或DMSO中的马来酸壳聚糖的化学合成。使用壳聚糖甲基磺酸盐和壳聚糖甲基苯磺酸盐作为中间体能够使壳聚糖与马来酸酐在温和反应条件下在有机溶剂中的均一反应混合物中发生化学反应。取代度(DS)和最终马来酸壳聚糖的产率范围分别为0.58至1.53，和69％至89％，这取决于如下所示的最佳反应条件下壳聚糖盐中间体和溶剂的类型：

表1

实施例8

产物的分析

根据以上实施例产生的有机-可溶性壳聚糖盐和N-马来酸壳聚糖并进行x射线衍射和核磁共振分析。

关于有机-可溶性壳聚糖盐，相信壳聚糖至壳聚糖盐的转化已经基本上破坏了壳聚糖的晶体结构，如图1(a、d、e)所示的XRD图像所确认。与壳聚糖(图1a)相反，壳聚糖甲基磺酸盐和甲基苯磺酸盐几乎都以无定形状态存在(图1d&e)，这解释了它们在一些有机溶剂中增强的溶解性。但是，它们在有机溶剂中的溶解性还取决于盐中的反离子的性质。例如，壳聚糖盐酸盐和乙酸盐的晶体结构被完全破坏(图1b&c)，这些壳聚糖盐在除了水之外所测的任何有机溶剂中都不溶解。

酯基团在0.1M氢氧化钠溶液中对于乙酰基团无甚影响的完全水解产生N-马来酸壳聚糖。¹H和¹³C NMR光谱均表明在羟基基团位点完全除掉了取代基团，而在同样条件下C-2氨基基团的取代基几乎不受到任何不利影响(图2a，b)。在N-马来酸壳聚糖的IR光谱中在大约1730cm^-1处酯基团的带的消失进一步确认了在两个C-6和C-3羟基位点上取代基的完全去除。因此，显示了C-2氨基基团上的壳聚糖的位点选择性修饰。

在均一的反应条件下，在壳聚糖的氨基基团和羟基基团上均发生取代，如来自¹H，¹³C NMR中双键结构的多个信号所示(图2c，d)。¹H-¹H COSY NMR进一步确认了取代不仅发生在C-6羟基基团和C-2氨基基团，还发生在活性相对较低的C-3羟基基团，因为在¹H-¹H COSY NMR中双键信号的区域出现不在对角线上的3个不同的信号(图2e)。

这3个不同信号直接来自于3个不同分子环境(或者更具体地说，不同的取代位置)中的双键结构的相邻质子之间的偶联。在壳聚糖单元上的这3个不同取代位点中，取代主要发生于C-2胺位点，然后是C-6羟基基团位点，而发生在C-3羟基基团位点的取代最少。这提示离子化的胺和甲基磺酸阴离子之间存在离子键，而且取代仍成功地发生在C-2氨基基团。这可能是由于甲基磺酸或甲基苯磺酸阴离子和离子化胺之间相对较弱的离子键容易断裂的缘故。在FT-IR(图1)和NMR(图2c，e)光谱中均确认了阴离子的完全去除，因为在最终产物的光谱中来自阴离子的所有信号均消失了。

实施例9

在水溶液中将N，O-马来酸壳聚糖(取代度，DS＝1.3)和PEGDA混合。加入浓度为0.5％的光引发剂(即Irgacure 2959)。将此溶液置于UV光照以形成马来酸壳聚糖-PEGDA水凝胶，其中PEGDA与马来酸壳聚糖的重量比为2∶1，并且其中PEGDA具有大约700D的分子量。

以A10平滑肌细胞和NRK49成纤维细胞进行微培养四唑检验(MTA)检验。图3显示了MTA检验的结果。细胞毒性为N，O-马来酸壳聚糖对于A10平滑肌细胞的细胞毒性，大鼠平滑肌原代细胞用于凝胶样品的细胞毒性测试。对于细胞毒性测试，将1wt％的马来酸壳聚糖溶液加入细胞培养基(96孔)中。孵育4小时和48小时后，测试马来酸壳聚糖的细胞毒性(使用A10：平滑肌细胞，NRK49：成纤维细胞)。将马来酸壳聚糖-PEGDA水凝胶(50mg)在10ml蒸馏水中膨胀(膨胀后凝胶的重量为2.0g左右)并在室温储存10天。然后取出溶液并加入到培养基(96孔)中。孵育48小时后，测试水凝胶的细胞毒性(使用A10：平滑肌细胞和大鼠平滑肌原代细胞)。结果显示于图4和5。

实施例10

称取大约0.2130克AgNO₃并溶于玻璃烧杯中9.96毫升的DI水中。将一单位的马来酸壳聚糖样品(大约重5mg)在硝酸银溶液中浸没大约6至54小时，使银替换水凝胶中的钠离子。然后使用DI水润洗得到的水凝胶并制备以进行SEM/EDS和电子微探针分析。产生的膜可以表征如下：

表2

将细菌分离物悬浮于无菌盐水中从而可视浊度等于0.5McFarland标准。将此细菌悬浮液直接用于圆片扩散测试。在Rotterdam，通过将细菌悬浮于0.45％的无菌盐水制备接种物至等于0.5McFarland浊度标准(使用光度计)。测试4种微生物：金黄色葡萄球菌(S.Aureus)、Kleb、大肠杆菌和绿脓杆菌(P.Aerug)。

按照CLSI(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2000a，b，c)的推荐进行圆片扩散法。简而言之，将细菌悬浮液涂布在Mueller-Hinton琼脂的表面。在35℃在空气中过夜孵育后，使用尺子或卡钳测定抑菌圈，以厘米记录抑菌圈。

通过取出硝酸银浸泡的马来酸壳聚糖/PEGDA凝胶样品并将其涂布在培植了四种细菌中的一种的琼脂板上来进行抗微生物测试。通过马来酸壳聚糖/PEGDA凝胶周围的空白圈确定抗微生物性质。肉眼测定并记录凝胶样品周围的空白圈的尺寸。结果如下：

表3

实施例11

壳聚糖衍生物(聚谷氨酸杂合物)

在45℃将z-苄基-谷氨酸在四氢呋喃中分散3个小时以获得Z-苄基-谷氨酸NCA。在室温将Z-苄基-谷氨酸NCA在含有壳聚糖甲基磺酸盐或壳聚糖甲基苯磺酸盐的DMSO中分散4天以获得结合了Z-苄基-谷氨酸NCA的壳聚糖衍生物。在室温使用1N NaOH反应12个小时将具有Z-苄基-谷氨酸NCA的壳聚糖衍生物去保护。反应如下所示：

以FTIR(见图6)和NMR(见图7)分析获得的聚-苄基谷氨酸壳聚糖。

实施例12

壳聚糖衍生物—壳聚糖聚亮氨酸杂合物(无需去保护)

在45℃将亮氨酸在四氢呋喃中分散3个小时以获得亮氨酸NCA。在室温将亮氨酸NCA在含有壳聚糖甲基磺酸盐或壳聚糖甲基苯磺酸盐的DMSO中分散以获得结合了亮氨酸的壳聚糖衍生物(即壳聚糖-聚亮氨酸)。无需去保护步骤。反应如下所示：

Claims

1.一种用于制备有机-可溶性壳聚糖盐的方法，其包括：

i)将壳聚糖分散在水溶液中以形成混合物；

ii)向所述混合物中加入形成壳聚糖盐的酸；

iii)搅拌所述含有形成壳聚糖盐的酸的混合物以形成均一溶液；

iv)向所述均一溶液中加入溶剂以沉淀有机-可溶性壳聚糖盐；

v)回收所述有机-可溶性壳聚糖盐。

2.根据权利要求1的方法，其中所述壳聚糖具有50-90％的脱乙酰程度。

3.根据权利要求1的方法，其中所述水溶液是去离子水。

4.根据权利要求1的方法，其中所述形成壳聚糖盐的酸选自磺酸、甲基磺酸、对甲基苯磺酸、樟脑磺酸、水杨酸、三氟甲基磺酸(CH₃CH₂SO₃H)、1-丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃H)、苯基苯并咪唑磺酸(C₁₃H₁₀N₂O₃S)、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸(C₁₀H₁₆O₄S)、樟脑醌-10-磺酸(C₁₀H₁₄O₅S)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基磺酸((CH₃)₃SiCH₂CH₂SO₃H)、三氟甲基磺酸(CF₃SO₃H)。

5.根据权利要求1的方法，其中所述形成壳聚糖盐的酸是甲基磺酸。

6.根据权利要求1的方法，其中所述形成壳聚糖盐的酸是对甲基苯磺酸。

7.根据权利要求1的方法，其中以相对于壳聚糖等摩尔量加入所述形成壳聚糖盐的酸。

8.根据权利要求7的方法，其中所述溶剂是异丙醇。

9.根据权利要求1的方法，其进一步包括透析经回收的有机-可溶性壳聚糖盐并冻干所述经透析的有机-可溶性壳聚糖盐。

10.由权利要求1的方法产生的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐在二甲基亚砜和甲酰胺中是可溶的，并且其中所述溶解性是通过用溶解于1ml DMSO或甲酰胺的10mg盐样品进行的溶解性测试所测定的。

11.根据权利要求10的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐选自壳聚糖磺酸盐、壳聚糖甲基磺酸盐、壳聚糖甲基苯磺酸盐、壳聚糖樟脑磺酸盐、壳聚糖水杨酸盐、壳聚糖三氟甲基磺酸盐、壳聚糖乙基磺酸盐、壳聚糖苯基苯并咪唑磺酸盐、壳聚糖1-丙基磺酸盐、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸盐和壳聚糖樟脑醌-10-磺酸盐。

12.根据权利要求11的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐是壳聚糖甲基磺酸盐。

13.根据权利要求11的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐是壳聚糖甲基苯磺酸盐。

14.在二甲基亚砜和甲酰胺中可溶的有机-可溶性壳聚糖盐，如用溶解于1mlDMSO或甲酰胺的10mg盐样品进行的溶解性测试所测定。

15.根据权利要求14的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐选自壳聚糖磺酸盐、壳聚糖甲基磺酸盐、壳聚糖甲基苯磺酸盐、壳聚糖樟脑磺酸盐、壳聚糖水杨酸盐、壳聚糖三氟甲基磺酸盐、和壳聚糖乙基磺酸盐、壳聚糖苯基苯并咪唑磺酸盐、壳聚糖1-丙基磺酸盐、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸盐和壳聚糖樟脑醌-10-磺酸盐。

16.根据权利要求15的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐是壳聚糖甲基磺酸盐。

17.根据权利要求15的有机-可溶性壳聚糖盐，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐是壳聚糖甲基苯磺酸盐。

18.一种用于制备壳聚糖衍生物的方法，其包括：

i)获得根据权利要求14的有机-可溶性壳聚糖盐；

ii)将所述有机-可溶性壳聚糖盐溶解于第一溶剂中以形成混合物；

iii)向所述混合物中加入形成壳聚糖衍生物的化合物；

iv)使形成壳聚糖衍生物的化合物与有机-可溶性壳聚糖盐反应以获得含有壳聚糖衍生物的反应溶液；

v)终止所述反应；

v)向所述反应溶液中加入第二溶剂以沉淀马来酸壳聚糖盐；以及

v)回收所述壳聚糖衍生物。

19.根据权利要求18的方法，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐选自壳聚糖磺酸盐、壳聚糖甲基磺酸盐、壳聚糖甲基苯磺酸盐、壳聚糖樟脑磺酸盐、壳聚糖水杨酸盐、壳聚糖三氟甲基磺酸盐、壳聚糖乙基磺酸盐、壳聚糖苯基苯并咪唑磺酸盐、壳聚糖1-丙基磺酸盐、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸盐和壳聚糖樟脑醌-10-磺酸盐。

20.根据权利要求19的方法，其中所述有机-可溶性壳聚糖盐是壳聚糖甲基磺酸盐或壳聚糖甲基苯磺酸盐。

21.根据权利要求19的方法，其中所述形成壳聚糖衍生物的化合物是N-羧基α-氨基酸酐(NCA)或环酐。

22.根据权利要求18的方法，其进一步包括透析经回收的壳聚糖衍生物并冻干所述经透析的壳聚糖衍生物。

23.根据权利要求18的方法，其中所述第一溶剂是二甲基亚砜或甲酰胺。

24.根据权利要求18的方法，其中所述第二溶剂是丙酮或异丙醇。

25.一种用于制备壳聚糖衍生物的方法，其包括：

i)将壳聚糖分散在第一溶剂中以形成混合物；

ii)向所述混合物中加入形成壳聚糖盐的酸；

iii)向所述混合物中加入形成壳聚糖衍生物的化合物；

iv)使所述形成壳聚糖衍生物的化合物、壳聚糖和形成壳聚糖盐的酸反应以获得含有壳聚糖衍生物的反应溶液；

v)终止所述反应；

v)向所述反应溶液中加入第二溶剂以沉淀所述壳聚糖衍生物；以及

v)回收所述壳聚糖衍生物。

26.根据权利要求25的方法，其中所述形成壳聚糖盐的酸选自乙基磺酸(CH₃CH₂SO₃H)、1-丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃H)、苯基苯并咪唑磺酸(C₁₃H₁₀N₂O₃S)、(1R)-(-)-10-樟脑磺酸(C₁₀H₁₆O₄S)、樟脑醌-10-磺酸(C₁₀H₁₄O₅S)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基磺酸(CH₃)₃SiCH₂CH₂SO₃H)、三氟甲基磺酸(CF₃SO₃H)、磺酸、甲基磺酸、对甲基苯磺酸、樟脑磺酸、水杨酸和三氟甲基磺酸。

27.根据权利要求26的方法，其中所述形成壳聚糖盐的酸是甲基磺酸或对甲基苯磺酸。

28.根据权利要求25的方法，其中所述形成壳聚糖衍生物的化合物是邻苯二甲酸酐并且所述壳聚糖衍生物是邻苯二甲酸壳聚糖。

29.根据权利要求25的方法，其中所述形成壳聚糖衍生物的化合物是N-羧基α-氨基酸酐(NCA)、环酐、马来酸酐或邻苯二甲酸酐。

30.根据权利要求25的方法，其进一步包括透析经回收的壳聚糖衍生物并冻干所述经透析的壳聚糖衍生物。

31.根据权利要求25的方法，其中所述第一溶剂是二甲基亚砜或甲酰胺，并且所述第二溶剂是丙酮或异丙醇。

32.以形成壳聚糖衍生物的化合物取代的壳聚糖衍生物，从而所述壳聚糖衍生物含有功能性双键和羧基基团；并且，

其中所述壳聚糖衍生物是水溶性的、生物相容性的、和生物可降解的。

33.根据权利要求32的壳聚糖衍生物，其中所述壳聚糖衍生物在C2、C3和/或C6位置被取代并且所述壳聚糖衍生物具有0.55至1.75的取代度。

34.根据权利要求32的壳聚糖衍生物，其中所述壳聚糖衍生物是马来酸壳聚糖。

35.根据权利要求25的壳聚糖衍生物，其中所述羧基基团以PEGDA、TEMPO、生物活性分子或GRGD进行官能化。

36.一种用于生长骨矿物质的模板，其包括根据权利要求32的壳聚糖衍生物。

37.根据权利要求36的模板，其进一步包括抗微生物剂。

38.根据权利要求36的模板，其中所述抗微生物剂是银。

39.水凝胶，其包含根据权利要求32的壳聚糖衍生物。

40.根据权利要求36的水凝胶，其进一步包含抗微生物剂。

41.根据权利要求40的水凝胶，其中所述抗微生物剂是银。