CN102079793A - 具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.将螠蛏肉用组织捣碎匀浆机匀浆捣碎装入容器中再加入蒸馏水制成螠蛏肉匀浆液，螠蛏肉与蒸馏水的比重为30g：120ml；b.将螠蛏肉匀浆液置于70℃水浴中加热6h，3000r/min离心15min，收集上清液，在上清液中按体积比为1：2加入无水乙醇，4℃静置过夜；c.5000r/min离心20min，收集沉淀置于培养皿上，自然挥发干燥后收集；d.用Sevage法去除所收集固体中的蛋白，然后用丙酮脱色，将所得沉淀置于培养皿中，自然挥发干燥过夜后收集。

Description

具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是一种操作简单、成本低廉，具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法。

背景技术

螠蛏（Sinonovacula constrictaIamarck）俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（LameUibranchia）、真瓣鳃目（Eulamellibranchia）、蛏科（Pharellidae），是我国与日本特有的种类，也是100多年来我国沿海养殖的重要贝类之一。螠蛏肉味鲜美，营养丰富，蛋白质含量5.5％，脂肪0.8％，糖1.8％和无机盐1.1％。螠蛏的软体部还有补虚的作用，对阴虚、血虚效果最佳，产后、病后多用之。近年来，海洋贝类的研究已引起人们极大重视，海洋贝类中所具有的多种生物活性肽、多糖、不饱和脂肪酸等已成为海洋保健食品和功能食品的重要原材料，如Bordenave等将太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）用胃蛋白酶水解，得到具有抑制ACE能力的水解产物；文蛤（Meretrix meretrix (Linnaeus)）多糖对不同剂量的环磷酰胺(CTX)引起的迟发型超敏反应（DTH）有双向调节功能等。但是，目前关于螠蛏的研究多集中在干制品加工及营养成分分析方面，对其生物活性的研究甚少，产品品种单调，在一定程度上限制了螠蛏养殖业的发展。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低廉，具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 将螠蛏肉用组织捣碎匀浆机匀浆捣碎装入容器中再加入蒸馏水制成螠蛏肉匀浆液，螠蛏肉与蒸馏水的比重为30 g：120ml；

b. 将螠蛏肉匀浆液置于70 ℃水浴中加热6 h，3000 r/min离心15 min，收集上清液，在上清液中按体积比为1：2加入无水乙醇，4℃静置过夜；

c. 5000 r/min离心20 min，收集沉淀置于培养皿上，自然挥发干燥后收集；

d. 用Sevage法去除所收集固体中的蛋白，然后用丙酮脱色，将所得沉淀置于培养皿中，自然挥发干燥过夜后收集。

本发明是以来源丰富、价格便宜的螠蛏为原料，所提取的螠蛏多糖具有多种活性：抑菌活性、抗氧化活性效果显著，具有一定的诱抗活性，可抑制蚕豆根尖细胞微核形成，并且对人乳腺癌细胞MCF-7有抑制活性。操作简单、成本低廉，适合于大规模生产，可制成海鲜调味料、保健食品、营养食品及天然药物等。

具体实施方式：

本发明实施例依次按如下步骤进行：

a. 将螠蛏肉用组织捣碎匀浆机匀浆捣碎装入容器中再加入蒸馏水制成螠蛏肉匀浆液，螠蛏肉与蒸馏水的比重为30 g：120ml；

b. 将螠蛏肉匀浆液置于70 ℃水浴中加热6 h，3000 r/min离心15 min，收集上清液，在上清液中按体积比为1：2加入无水乙醇，4℃静置过夜；

c. 5000 r/min离心20 min，收集沉淀置于培养皿上，自然挥发干燥后收集；

d. 用Sevage法去除所收集固体中的蛋白，然后用丙酮脱色，将所得沉淀置于培养皿中，自然挥发干燥过夜后收集。

用苯酚-浓硫酸法检验所得固体，结果为多糖。

本发明实施例所得固体（螠蛏多糖）的实验如下：

1．滤纸片法检测抑菌活性：大肠杆菌Escherichia coli （EC）、变形杆菌Proteus vulgaris（PV）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（SA）、产气杆菌Enterobacter aerogenes（EA）和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis （BS）用牛肉膏蛋白胨培养基；乳酸菌Lactobacterium delbruckii （LD）用MRS培养基；酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae （SC）用YPD培养基，上述菌种均可购自上海坤肯生物化工有限公司。将上述各菌种分别接种于相应的液体培养基中，振荡培养24 h作指示菌。

分别用移液枪取指示菌液100 μL于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后将各固体培养基平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取螠蛏多糖水溶液样品10 μL滴入滤纸片中央，置于37 ℃培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结果表明：螠蛏多糖对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作用较强，对产气杆菌也有抑制活性，而金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌和产气杆菌分别属于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，因此可用螠蛏多糖开发功能性食品或食品添加剂，因其抑菌活性而延长产品的保藏时间。

2．超氧阴离子自由基（O^2-）清除作用的测定：取邻苯三酚0.1 mL于试管中，加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液5 mL，加入螠蛏多糖水溶液0.25 mL，迅速混匀，在25℃反应15 min。使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处时测吸光度A _i，并测定样液本底的吸光度值A_j。酶解液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：清除率S（%）=Ao－（A_i－A_j）/Ao×100％。式中，Ao为试剂空白的吸光度值；A_i为样液的吸光度值；A_j为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基（0^2-）不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的·OH，因此常用样品对超氧阴离子自由基（O^2-）的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao为0.499，经清除率公式S(%)= Ao－(A_i－A_j)/Ao×100 计算超氧阴离子自由基清除率。结果表明：螠蛏多糖的超氧阴离子自由基清除率高达66.53%。因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。

3．羟自由基（·OH）清除作用的测定：取9 mmol/L的FeSO₄ 1 mL、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL、蛏多糖水溶液样品1 mL，最后加入8.8 mmol/L 的H₂O₂ 1 mL启动反应，在37℃反应30分钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510 nm下测各个提取液吸光度值。对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算：

S_A=[(Ac—As)／(Ac—Ao)]×100％

式中：Ac为对照组OD值；As为样品组OD值；A₀为空白组OD值。

羟基自由基（·OH）是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的·OH，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。

经公式S_A=[(Ac—As)／(Ac—Ao)]×100％算出羟自由基清除率S%，结果表明：螠蛏多糖的羟基自由基（·OH）清除率达61.48%，因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。

4．诱抗活性的测定：将发芽大豆放入洗净的解剖盘中浇水浸没，光照培养，每天浇水培养，待大豆长出两片真叶后，在无菌条件下，将刚刚长出真叶的大豆子叶剪下，用8%次氯酸钠溶液灭菌5 min，再用无菌水冲洗。用刀片削去子叶外表皮厚约1 mm，形成直径约6 mm的伤口，用无菌水浸泡清洗，约30秒后取出，滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿10片子叶作为一个处理。每个处理做一次重复，对照组用无菌水，使用微量移液器取螠蛏多糖水溶液10 μL加在一个伤口上。处理后的子叶在28℃黑暗的温箱中培养24 h后，将每皿中的子叶转移到一个盛有10 μL双蒸水的试管中，充分振荡，用紫外分光光度计在286 nm处测定OD值。

植物体内存在潜在抗病性，受到外界损害和病原物侵染的植物可通过激发子和诱导剂（inducer）激活植物抗病基因，使植物产生系统抗病性，以免受到进一步的伤害。豆科植物在受到病原体侵染时，能通过莽草酸途径、醋酸—丙二酸途径或醋酸—甲羟戊酸途径，产生以异黄酮类为主的植保素，直接杀死入侵的病原体，抑制病斑的扩大。在外源激发子的处理下豆科植物也能够产生抗性反应，合成植保素。大豆子叶法就是利用激发子处理大豆子叶，然后通过测定子叶产生的植保素的量，来表示激发子诱导植物抗性活性的方法。结果表明：螠蛏多糖水溶液的OD286值为0.5465，而对照仅为0.2605，因此螠蛏多糖具有明显的诱抗活性，可用作植物诱抗剂用于农业生产领域。 

5．抑制肿瘤细胞活性测定：取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板中，接种细胞数为每孔1×105个，设空白对照组、实验组（加样浓度分别为50、200 μg/mL），设5个平行孔，置37℃、5％ CO2培养箱中培养。待稳定后，空白对照组每孔加RPMI1640培养液1 μL，试验组每孔加1 μL 螠蛏多糖多糖水溶液，培养结束后每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，5 h后加入150 μL 二甲基亚砜溶液，振荡5 min。在DG5031型酶联免疫检测仪下，以RPMI1640 培养液10 μL加20 μL MTT 溶液调零，检测各孔的OD₅₇₀值。实验重复一次。

计算方法：

取平均值，按公式计算：抑制率％＝（1－OD实/OD对）×100％

式中，OD对为对照组OD值（不加样液）；OD实为样品组OD值。

使用MTT法测定螠蛏多糖抗癌活性，其检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值，来判断活细胞数量，OD值越小，则说明癌细胞被抑制率越好，样品抑制能力越强。使用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，结果表明，200 ??g/mL样品抑制率为27.08%，因此可用作抗肿瘤药物或保健品的制备。

6．抑制蚕豆根尖微核形成活性检测：首先将蚕豆在清水中浸泡24 h，然后放入垫有吸水脱脂棉的培养皿中，盖上双层湿纱布于25℃恒温培养箱中培养，待根尖长至1～1.5cm时，将萌发蚕豆分成3组，每组8 个，分别用浓度为200μg/mL螠蛏多糖水溶液和1.6μg/ml 的丝裂霉素混合物、1.6μg/ml 的丝裂霉素、双蒸水浸根，同时设3个平行组合，25℃培养8 h，自来水冲洗，吸干水后加1mol/mL HCl 于60℃水解8～12min，再用水冲洗2 次；将根尖呈现乳白色处（即分生组织） 切下，放于载玻片捣碎涂片。苯酚品红染色3～5min，盖上载玻片，并用镊子后背轻轻敲打使其分散成一层细胞显微观察。每个根尖观察1000 个以上间期细胞，每个处理组观察4个根尖，统计含微核的细胞数，计算其微核率(MCN)和抑制率（%）。

  

目前，在人类的生活环境中存在着许多可能损害遗传物质，并造成“致癌、致畸、致突变”等遗传毒性效应的环境致突变物，严重威胁着人类健康和生存。人们广泛应用微核在组织细胞中出现的频率来反映该组织受损伤的程度，即微核的大量出现是一个危险的讯号。结果表明：螠蛏多糖对微核的抑制率达49%，可制成保健品及临床治疗药品等。

Claims (1)

1.一种具有多种生物活性的螠蛏多糖的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 将螠蛏肉用组织捣碎匀浆机匀浆捣碎装入容器中再加入蒸馏水制成螠蛏肉匀浆液，螠蛏肉与蒸馏水的比重为30 g：120ml；

b. 将螠蛏肉匀浆液置于70 ℃水浴中加热6 h，3000 r/min离心15 min，收集上清液，在上清液中按体积比为1：2加入无水乙醇，4℃静置过夜；

c. 5000 r/min离心20 min，收集沉淀置于培养皿上，自然挥发干燥后收集；

d. 用Sevage法去除所收集固体中的蛋白，然后用丙酮脱色，将所得沉淀置于培养皿中，自然挥发干燥过夜后收集。