CN102071157B - 一株自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体地说，本发明公开了一种新的自养硝化细菌，该细菌有很好的硝化效果。同时，本发明还公开了该细菌的筛选和鉴定方法，该方法简单有效、选择性强，解决了自养硝化细菌分离困难的难题。

Description

一株自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及一种自养硝化细菌及其筛选鉴定方法。 
背景技术
污水生物脱氮是水处理领域关注和研究的热点，城市污水处理厂采用的废水生物脱氮工艺一般由硝化和反硝化作用共同完成。硝化作用分为两个阶段，首先由氨氧化细菌把氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌两类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细菌是参与生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率，是污水生物脱氮的限制性因素。目前，硝化细菌的文献报道集中在富集培养、异养菌的纯化分离培养和混合菌群的多样性研究方面，对污水生物脱氮起主要作用的完全自养型硝化细菌纯化分离报道不多，主要是因为：(1)自养型硝化细菌时代时间长、生长速率慢；(2)形态极其微小不易观察；(3)对环境因子变化敏感易受损；(4)生物量小，生长迅速的伴生异养菌会掩蔽目标菌群，这给自养型硝化细菌的深入研究带来困难。 
经文献检索发现，现有技术公开的为申请号1786184A的中国发明专利，公开了异养硝化细菌的分离筛选方法，将混合菌群涂布于牛肉膏-蛋白胨培养基中，30℃恒温培养7～10d，在形成的菌落中挑取单菌落，划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种与硝化效果鉴定培养基中进行硝化效果鉴定。申请号03118597.5 的中国发明专利，公开了一株异养硝化细菌WR-2，培养方法及应用。还未有技术公开的自养硝化细菌，筛选鉴定方法的发明专利。因此，筛选鉴定自养型硝化细菌显得尤为重要。 
发明内容
本发明的一个目的是提供一株自养硝化细菌，该菌株具有很好的硝化效果。 
本发明的另一个目的是为了解决现有的自养硝化细菌分离筛选困难，提供筛选和鉴定自养硝化细菌的方法。 
本发明所提供的自养硝化细菌N.W-3，已于2009年11月05日保藏在位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3390，分类命名为维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi。 
经过富集培养和多次分离筛选得到的优势菌株N.W-3的硝化效果高达90％，硝化速率最高可达42.7mg/L·d，具体结果见图1。N.W-3菌落乳白色、湿润、针尖大小，细胞为短杆状，革兰氏阴性，吲哚实验、明胶液化实验、甲基红实验、淀粉水解试验均为阴性，需养性实验、接触酶实验为阳性，葡萄糖产酸试验结果不产酸，系统发育地位见图4。 
本发明自养硝化细菌的筛选和鉴定是按下述步骤实现的： 
首先是自养硝化细菌的筛选，共包括以下六个步骤： 
(1)稀释菌源：取活性污泥做微生物菌源，将样品与无菌水按体积比1∶9的比例放入盛有玻璃珠的三角瓶中，在28℃恒温、150r/min的条件下，空气浴摇床振荡15min，使微生物菌群分布均匀； 
(2)制备富集培养基：向1000mL超纯水中加入NaNO2 0.0-1.5g、NaCl 0.1-0.6g、K2HPO4 0.0-0.7g、MgSO4 0.5-1.0g、FeSO4 0.1-0.6g和Na2CO3 0.5-1.5g，调节pH＝7.8，并121℃高温灭菌30min； 
(3)富集培养：将稀释好的样品按体积比1∶9的比例接种至装有硝化细菌富集培养基的锥形瓶中28℃恒温黑暗培养8个月。培养前期用二苯胺试剂检测NO3 -的生成情况，二苯胺试剂可以使NO3 -生成蓝色的物质，根据是否变蓝和蓝色的深浅可以指示是否有NO3 -生成，当蓝色深时，取吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘汰杂菌。培养后期进行硝化效果定量检测(测定NO2 -N、NO3 -N、TN的变化情况)，当NO3 -N的生成率在90％以上时，吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘汰杂菌； 
(4)制备分离培养基：在1000mL超纯水中加入NaNO2 0.5-1.2g，NaCl0.2-0.5g，K2HPO4 0.15-0.8g，MgSO4 0.05-0.7g，FeSO4 0.15-0.4mg，(NH4)6Mo7O240.05-0.6mg，CaCO3 1.0-3.0mg，调节pH＝7.8，并121℃高温灭菌30min，以质量分数2％的琼脂糖做平板分离支持物； 
(5))细菌的分离纯化：选取硝化效果好的富集培养液，采用“十字划线法”进行平板分离培养。28℃恒温、黑暗培养14～21d，观察菌落生长情况，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分离平板，重复划线分离2～6次； 
(6)对步骤(5)得到的纯菌株用接种环挑取一接种环菌苔接种与硝化细菌分离培养基中，28℃恒温黑暗培养14d，测定NO2-N、NO3-N、TN的变化情况，选取硝化效果好的菌株，即完成对自养硝化细菌的筛选。 
然后是对筛选出的自养硝化细菌进行16S rDNA的鉴定，共包括以下两个步骤： 
(1)观察菌落的形态大小、革兰氏染色和生理生化实验，所得结果与《伯杰士细菌鉴定手册》比较，初步确定该自养硝化细菌属于硝化杆菌属； 
(2)提取该细菌的DNA进行PCR扩增，建立单克隆体系，对阳性重组子测序，将测序得到的核酸序列与GenBank核酸数据库进行比对分析，确定该细菌的系统发育分析地位。 
本发明PCR扩增的引物： 
F为5′GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT， 
R为5′GCAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT； 
本发明PCR扩增的体系：10×PCR Buffer：5μL；10mmol/L的dNTP(含Mg2+)：1μL；DNA模板：1μL；正反向引物(10pmol/L)各1μL；primestar聚合酶(5U/μL)：0.5μL；超纯水40.5μL。PCR扩增的程序：94℃预变性5min；94℃变性50s；54℃退火50s；72℃延伸1min30s；35个循环；72℃后延伸10min程序； 
本发明的克隆体系：4μL回收的PCR产物、1μLpEASY-blunt载体，室温反应15min。加连接产物至50μL大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击30s，立刻置于冰上2min，然后加入至300μL LB(不含Kan+)培养基中，37℃、180r/min孵育1h。取200μL菌液涂布LB平板(含X-Gal、IPTG、Kan+)，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于600μL的LB培养基中，37℃培养4小时，重组子进行PCR阳性检测。 
相对于现有技术，本发明具有下述优点： 
(1)筛选出了一种自养硝化细菌。 
(2)提供了一种自养硝化细菌筛选的方法，解决了由于自养硝化细菌生物量 小，异养菌生长速度快，容易占优势而造成的自养硝化细菌筛选困难，该方法采用不同的富集和分离培养基不断淘汰异养菌，“十字划线法”分离单株纯菌，通过测定NO2-N、NO3-N、TN等指标反应硝化效果，根据硝化效果筛选出菌株N.W-3。 
(3)提供了一种结合传统微生物学和现代分子生物学鉴定硝化细菌的方法。 
附图说明
图1为N.W-3的硝化效果图； 
图2为N.W-3的16S rDNA的PCR扩增图； 
图3为N.W-3的重组子阳性检测的琼脂糖电泳图； 
图4为N.W-3的系统发育图。 
具体实施方式
结合具体实例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明要求保护的范围。 
实施例1 自养硝化细菌的筛选 
(1)菌源稀释 
取北京市肖家河污水处理厂A2/O处理工艺的好氧段活性污泥作为菌源。将活性污泥与无菌水按体积比1∶9的比例放入盛有玻璃珠的三角瓶中，28℃恒温、150r/min的条件下，空气浴摇床振荡15min，使微生物菌群分布均匀。 
(2)富集培养基的制备： 
称取NaNO2 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.4g，Na2CO31g，用超纯水定容至1000mL，调节pH值至7.8，121℃高温灭菌30min。 
(3)富集培养： 
将稀释好的菌源按体积比1∶9的比例接种至装有硝化细菌富集培养液的锥形瓶中，28℃恒温黑暗富集培养，培养前期用二苯胺试剂检测NO3 -的生成情况，二苯胺试剂可以使NO3 -生成蓝色的物质，根据是否变蓝和蓝色的深浅可以指示是否有NO3 -生成，当蓝色深时，取吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘汰杂菌。培养后期进行硝化效果定量检测(测定NO2-N、NO3-N、TN的变化情况)，直至在7d左右，NO3 -的生成率在90％以上，进行分离纯化培养。 
经过几个月不断更换培养基的富集培养，硝化效果定量检测结果表明：在3.3天左右时硝酸盐氮大量生成，并且积累量开始超过亚硝酸盐氮，硝化细菌进入对数生长期，第6天时，亚硝酸盐氮全部转化为硝酸盐氮，完全自养型硝化细菌富集培养取得了预期结果。 
(4)分离培养基的制备： 
称取NaNO2 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.15g，MgSO4 0.05g，FeSO4 0.15mg，(NH4)6Mo7O24 0.05mg，CaCO3 3mg，超纯水定容至1000mL，调节pH值至7.8，121℃高温灭菌30min，以质量分数2％的琼脂糖做平板分离支持物。 
(5)细菌的分离纯化： 
采用“十字划线法”接种富集培养后的菌源至琼脂糖平板分离培养。28℃恒温黑暗培养14～21d，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分离平板，重复划线分离3次。通常，可以认为一个菌落是由一个细胞发育而来，因此是由一个种类细菌组成的。可是，也有由几类不同的几个细菌细胞形成一个菌落的 可能，所以，为了慎重起见需要对这些菌落进行多次分离纯化。 
经过2～3周琼脂糖平板分离培养，平板上长出13株无色或乳白色针尖大小菌落。通过连续3代单菌落纯化培养，淘汰重复菌落，最后分离得到7株无色或乳白色的菌落，编号为N.W-1至N.W-7。 
(6)细菌的硝化效果测定： 
用接种环分别挑取N.W-1至N.W-7一接种环分离纯化后的细菌菌苔接种与硝化细菌分离培养基(不加琼脂糖)，28℃恒温黑暗培养14d，用离子色谱(DIONEX IC-1000)和TOC(SHIMADZU TOC-VCPH)分别测定NO2-N、NO3-NTN的变化情况，每隔2天测定一次。 
菌株N.W-3具有最理想的硝化效果，结果如图1所示，从图1可知N.W-3在第0～4天，硝酸盐氮的转化率为0；第4～8天，开始有硝化效果，并且硝化速率逐渐增，N.W-3在第4天后，硝化速率为7.35mg/L·d；第6天后，硝化速率为14.7mg/L·d；第8～10天为对数生长期，硝化速率最快，第8天后，硝化速率为42.7mg/L·d；第10～14天，进入稳定生长期，第10天后，硝化速率为27.8mg/L·d，第12天后，为9.54mg/L·d，亚硝酸盐氮在第14天全部转化为硝酸盐氮，硝化效果可达100％。根据硝化效果，初步确定其为自养硝化细菌，完成自养硝化细菌的筛选。 
实施例2 自养硝化细菌的鉴定 
(1)形态观察、生理生化实验： 
N.W-3菌落乳白色、湿润、针尖大小，细胞为短杆状； 
参照《微生物学实验》对分离出的菌株进行革兰氏染色实验和相应的生理 生化实验。实验结果为：革兰氏阴性；吲哚实验、明胶液化实验、甲基红实验、淀粉水解试验均为阴性，需养性实验、接触酶实验为阳性，葡萄糖产酸试验的结果是不产酸。 
参照《伯杰士细菌鉴定手册》，初步确定活性污泥中分离出的菌株N.W-3属于硝化杆菌属。 
(2)16S rDNA鉴定： 
采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取N.W-3的DNA，用作16SrDNA扩增的模板。 
应用Oligo软件设计引物，F为5′GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT，R为5′GCAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT，预期扩增片段大小为1500bp左右，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司(北京合成部)合成。PCR反应体系(50μL)组成：10×PCR Buffer：5μL；10mmol/L的dNTP(含Mg2+)：1μL；DNA模板：1μL；正反向引物(10pmol/L)各1μL；primestar聚合酶(5U/μL)：0.5μL；超纯水40.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50s；54℃退火50s；72℃延伸1min30s；35个循环；72℃后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，通过和marker(DL2000)比较片段大小确定是否为目的片段，N.W-3的16S rDNA的PCR扩增结果见图2，由图可知，条带在1500bp左右，为目的条带。 
含有目的片段的PCR产物用TIANGEN DNA胶回收试剂盒进行片断回收。在微型离心管加入4μL回收的PCR产物、1μLpEASY-blunt载体，轻轻混合，室温反应15min。加连接产物至50μL大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，轻弹均匀，冰浴30min，42℃热击30s，立刻置于冰上2min，然后加入至300μL LB(不含Kan+)培养基中，37℃、180r/min孵育1h。取200μL菌液涂布LB平板(含X-Gal、IPTG、 Kan+)，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于600μL的LB培养基中，37℃培养4小时，PCR扩增进行重组子阳性检测。阳性检测采用M13F和M13R引物，M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，通过和marker(DL2000)比较片段大小确定是否克隆成功，N.W-3的重组子阳性检测的琼脂糖结果见图3，由图可知重组子的阳性率可达100％。克隆成功的样品送往测序公司进行测序，所得序列长度为1542bp，结果见序列。 
将所得序列与GenBank核酸数据库进行同源性比对分析，结果表明，菌株N.W-3与Nitrobacter Winogradskyi的序列相似性高达98％，与NitrobacterHamburgensis的序列相似性为90％。从中挑选部分相似性高的菌株以及一些常见的硝化细菌作系统发育分析，用MEGA软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图4，由图可知N.W-3与Nitrobacter Winogradskyi的遗传距离最近，与常见硝化杆菌Nitrobacter Hamburgensis和Preudomonas aeruginosa的遗传距离较近，与硝化球菌Nitrococcus oceanus较远，而与Nitrosomonaseuropaea的遗传距离最远。根据同源性比对和系统发育分析结果表明，N.W-3为维氏硝化杆菌。 
序列表 
菌株N.W-3的核酸序列，长度为1542bp： 
1    ATGGACATCC GAGCTCAAGT TTCGATGGTC TTTCACCTGG ACAAGTGCAT CGGTTGCCAC 
61   ACCTGCAGCA TCGCGTGCAA GAACATCTGG ACCGATCGCA AGGGCACCGA GTACATGTAC 
121  TGGAACAACG TGGAGACCAA GCCGGGTACG GGTTACCCGA CACGTTGGGA AGACCAGACC 
181  AAGTATCGTG GCGGCTGGGT GGTTGACGGT CAGAGGCAGA AGAGCCTTCG GCTTCGGCTG 
241  CAGGGCAAGT GGGGAACGCT GACGAACATT TTCTACAACC CCTATCTGCC GACGCTTGAC 
301  GACTATTTCG AGCCGTGGAC CTACGATTAC CAGAACCTGA TCAATGCGCC GCTGGCTGAC 
361  GAGCAGCCGA CCGCGCGGGC GATCTCGATG GTGACCGGCA AATACATGGA CACGATCGAG 
421  GCGGGCCCGA ACTGGGACGA CGACCTCGGC GGTTCGCAGG TTTACGCCAA CAACGACCCG 
481  AACTTCGACG GCGCTTCCGA TGAGGAAATG CGCCAGATCA ACGAGATCAA CAGCACGGTG 
541  TTTTTCTATC TGCCGCGCAT CTGCAACCAT TGCCTCAATC CGGGATGCGT TGCGGCCTGT 
601  CCGCAGGGCG CGCTCTACAA GCGCGGCGAG GACGGCGTTG TGCTGGTGAG CCAGGAACGC 
661  TGCCGCGCCT GGCGCATGTG CGTCTCCGGC TGCCCCTACA AGAAGACCTA CTTCAACTGG 
721  TCGACGGGCA AGGCCGAGAA GTGCATCCTG TGCTATCCGC GCCTTGAGAG CGGCCAGCCG 
781  CCGGCGTGTT TCCACTCCTG CGTGGGACGC ATCCGGTATA TCGGCCTCGT GCTTTACGAT 
841  GCGGATGCGA TCGAGGAGAC CGCGAAGTCG CCGCAGGATC AGCTGGTGAT GGCCCAGCGC 
901  AACATCATCA AGGATCCGTT TGATCCGGAG ATCATCGCGG CCGCGAGGGC CAACGGGATT 
961  CCGGACTCCA AGATTGAGGC GGCTCAGAAG TCTCCGGTAT TTCAGTTCGT GAAGAAGTGG 
1021 GGCATCGCGC TGCCGCTGCA TCCGGAGTTC CGCACGCTGC CGATGCTGTT CTATGTGCCG 
1081 CCGCTGGGGC CGGTTCTGGC CAAGGTGGAG AACGGCGTGT ACGACAATGT AGCCAATGAA 
1141 GCGCGGCTGG GACCGCTGAT GAGCTCGCTC GAACGGTCGC GTATTCCGCT TCGGTACATG 
1201 GCGAGCCTGC TGTCGGGCGG CAATGAGGAG ATCATCCGCG ACGTCTACAA GAAGCTGGTT 
1261 GCGGTGCGCG TCTACATGCG TTCGCGGAAG GTCAAGGACA TTCCGGACGA GGAGGTGCAG 
1321 CGGGCGCTGT CCGAAGGCAA GACCACCGCG GCGGAGGTCG AGGCGATCTG GCGTCTGACA 
1381 TCGATGCCAA CCTTCGAGGA GCGCTTCGTG GTTCCGCCGA TGGAGCGCGA GACGGCGGTT 
1441 GATGCCCTGT TCCCGCAGCT CGATCCGGTC TCTCATAACT ACCCGATCCG CAAGGGCGCG 
1501GTCGGCGTCG GCTTCCACAC CGATCCGGCA AGAGGACCAT AG 
注：ATG为起始密码子；TAG为终止密码子 
                    N.W-3’s-sequence_ST25.txt 
SEQUENCE LISTING 
<110>中国环境科学研究院 
<120>一株自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法 
<130>A new facultatively nitrite oxidizing bacterium，Nitrobacter 
 vulgaris sp.nov 
<160>2 
<170>PatentIn version 3.5 
<210>1 
<211>1542 
<212>DNA 
<213>Nitrobacter winogradskyi 
<220> 
<221>CDS 
<222>(1)..(1542) 
<400>1 
atg gac atc cga gct caa gtt tcg atg gtc ttt cac ctg gac aag tgc         48 
Met Asp Ile Arg Ala Gln Val Ser Met Val Phe His Leu Asp Lys Cys 
1               5                   10                  15 
atc ggt tgc cac acc tgc agc atc gcg tgc aag aac atc tgg acc gat         96 
Ile Gly Cys His Thr Cys Ser Ile Ala Cys Lys Asn Ile Trp Thr Asp 
            20                  25                  30 
cgc aag ggc acc gag tac atg tac tgg aac aac gtg gag acc aag ccg        144 
Arg Lys Gly Thr Glu Tyr Met Tyr Trp Asn Asn Val Glu Thr Lys Pro 
        35                  40                  45 
ggt acg ggt tac ccg aca cgt tgg gaa gac cag acc aag tat cgt ggc        192 
Gly Thr Gly Tyr Pro Thr Arg Trp Glu Asp Gln Thr Lys Tyr Arg Gly 
    50                  55                  60 
ggc tgg gtg gtt gac ggt cag agg cag aag agc ctt cgg ctt cgg ctg        240 
Gly Trp Val Val Asp Gly Gln Arg Gln Lys Ser Leu Arg Leu Arg Leu 
65                  70                  75                  80 
cag ggc aag tgg gga acg ctg acg aac att ttc tac aac ccc tat ctg        288 
Gln Gly Lys Trp Gly Thr Leu Thr Asn Ile Phe Tyr Asn Pro Tyr Leu 
                85                  90                  95 
ccg acg ctt gac gac tat ttc gag ccg tgg acc tac gat tac cag aac        336 
Pro Thr Leu Asp Asp Tyr Phe Glu Pro Trp Thr Tyr Asp Tyr Gln Asn 
            100                 105                 110 
ctg atc aat gcg ccg ctg gct gac gag cag ccg acc gcg cgg gcg atc        384 
Leu Ile Asn Ala Pro Leu Ala Asp Glu Gln Pro Thr Ala Arg Ala Ile 
        115                 120                 125 
tcg atg gtg acc ggc aaa tac atg gac acg atc gag gcg ggc ccg aac        432 
Ser Met Val Thr Gly Lys Tyr Met Asp Thr Ile Glu Ala Gly Pro Asn 
    130                 135                 140 
tgg gac gac gac ctc ggc ggt tcg cag gtt tac gcc aac aac gac ccg        480 
Trp Asp Asp Asp Leu Gly Gly Ser Gln Val Tyr Ala Asn Asn Asp Pro 
145                 150                 155                 160 
aac ttc gac ggc gct tcc gat gag gaa atg cgc cag atc aac gag atc        528 
Asn Phe Asp Gly Ala Ser Asp Glu Glu Met Arg Gln Ile Asn Glu Ile 
                165                 170                 175 
aac agc acg gtg ttt ttc tat ctg ccg cgc atc tgc aac cat tgc ctc        576 
Asn Ser Thr Val Phe Phe Tyr Leu Pro Arg Ile Cys Asn His Cys Leu 
            180                 185                 190 
aat ccg gga tgc gtt gcg gcc tgt ccg cag ggc gcg ctc tac aag cgc        624 
Asn Pro Gly Cys Val Ala Ala Cys Pro Gln Gly Ala Leu Tyr Lys Arg 
        195                 200                 205 
ggc gag gac ggc gtt gtg ctg gtg agc cag gaa cgc tgc cgc gcc tgg        672 
Gly Glu Asp Gly Val Val Leu Val Ser Gln Glu Arg Cys Arg Ala Trp 
    210                 215                 220 
cgc atg tgc gtc tcc ggc tgc ccc tac aag aag acc tac ttc aac tgg        720 
Arg Met Cys Val Ser Gly Cys Pro Tyr Lys Lys Thr Tyr Phe Asn Trp 
225                 230                 235                 240 
tcg acg ggc aag gcc gag aag tgc atc ctg tgc tat ccg cgc ctt gag        768 
Ser Thr Gly Lys Ala Glu Lys Cys Ile Leu Cys Tyr Pro Arg Leu Glu 
                245                 250                 255 
agc ggc cag ccg ccg gcg tgt ttc cac tcc tgc gtg gga cgc atc cgg        816 
Ser Gly Gln Pro Pro Ala Cys Phe His Ser Cys Val Gly Arg Ile Arg 
            260                 265                 270 
tat atc ggc ctc gtg ctt tac gat gcg gat gcg atc gag gag acc gcg        864 
Tyr Ile Gly Leu Val Leu Tyr Asp Ala Asp Ala Ile Glu Glu Thr Ala 
        275                 280                 285 
aag tcg ccg cag gat cag ctg gtg atg gcc cag cgc aac atc atc aag        912 
Lys Ser Pro Gln Asp Gln Leu Val Met Ala Gln Arg Asn Ile Ile Lys 
    290                 295                 300 
gat ccg ttt gat ccg gag atc atc gcg gcc gcg agg gcc aac ggg att        960 
Asp Pro Phe Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Arg Ala Asn Gly Ile 
305                 310                 315                 320 
ccg gac tcc aag att gag gcg gct cag aag tct ccg gta ttt cag ttc       1008 
Pro Asp Ser Lys Ile Glu Ala Ala Gln Lys Ser Pro Val Phe Gln Phe 
                325                 330                 335 
gtg aag aag tgg ggc atc gcg ctg ccg ctg cat ccg gag ttc cgc acg       1056 
Val Lys Lys Trp Gly Ile Ala Leu Pro Leu His Pro Glu Phe Arg Thr 
            340                 345                 350 
ctg ccg atg ctg ttc tat gtg ccg ccg ctg ggg ccg gtt ctg gcc aag       1104 
Leu Pro Met Leu Phe Tyr Val Pro Pro Leu Gly Pro Val Leu Ala Lys 
        355                 360                 365 
gtg gag aac ggc gtg tac gac aat gta gcc aat gaa gcg cgg ctg gga       1152 
Val Glu Asn Gly Val Tyr Asp Asn Val Ala Asn Glu Ala Arg Leu Gly 
    370                 375                 380 
ccg ctg atg agc tcg ctc gaa cgg tcg cgt att ccg ctt cgg tac atg       1200 
Pro Leu Met Ser Ser Leu Glu Arg Ser Arg Ile Pro Leu Arg Tyr Met 
385                 390                 395                 400 
gcg agc ctg ctg tcg ggc ggc aat gag gag atc atc cgc gac gtc tac       1248 
Ala Ser Leu Leu Ser Gly Gly Asn Glu Glu Ile Ile Arg Asp Val Tyr 
                405                 410                 415 
aag aag ctg gtt gcg gtg cgc gtc tac atg cgt tcg cgg aag gtc aag       1296 
Lys Lys Leu Val Ala Val Arg Val Tyr Met Arg Ser Arg Lys Val Lys 
            420                 425                 430 
gac att ccg gac gag gag gtg cag cgg gcg ctg tcc gaa ggc aag acc       1344 
Asp Ile Pro Asp Glu Glu Val Gln Arg Ala Leu Ser Glu Gly Lys Thr 
         435                 440                 445 
acc gcg gcg gag gtc gag gcg atc tgg cgt ctg aca tcg atg cca acc       1392 
Thr Ala Ala Glu Val Glu Ala Ile Trp Arg Leu Thr Ser Met Pro Thr 
    450                 455                 460 
ttc gag gag cgc ttc gtg gtt ccg ccg atg gag cgc gag acg gcg gtt       1440 
Phe Glu Glu Arg Phe Val Val Pro Pro Met Glu Arg Glu Thr Ala Val 
465                 470                 475                 480 
gat gcc ctg ttc ccg cag ctc gat ccg gtc tct cat aac tac ccg atc       1488 
Asp Ala Leu Phe Pro Gln Leu Asp Pro Val Ser His Asn Tyr Pro Ile 
                485                 490                 495 
cgc aag ggc gcg gtc ggc gtc ggc ttc cac acc gat ccg gca aga gga       1536 
Arg Lys Gly Ala Val Gly Val Gly Phe His Thr Asp Pro Ala Arg Gly 
             500                 505                 510 
cca tag                                                               1542 
Pro 
<210>2 
<211>513 
<212>PRT 
<213>Nitrobacter winogradskyi 
<400>2 
Met Asp Ile Arg Ala Gln Val Ser Met Val Phe His Leu Asp Lys Cys 
1               5                   10                  15 
Ile Gly Cys His Thr Cys Ser Ile Ala Cys Lys Asn Ile Trp Thr Asp 
            20                  25                  30 
Arg Lys Gly Thr Glu Tyr Met Tyr Trp Asn Asn Val Glu Thr Lys Pro 
        35                  40                  45 
Gly Thr Gly Tyr Pro Thr Arg Trp Glu Asp Gln Thr Lys Tyr Arg Gly 
    50                  55                  60 
Gly Trp Val Val Asp Gly Gln Arg Gln Lys Ser Leu Arg Leu Arg Leu 
65                  70                  75                  80 
Gln Gly Lys Trp Gly Thr Leu Thr Asn Ile Phe Tyr Asn Pro Tyr Leu 
                85                  90                  95 
Pro Thr Leu Asp Asp Tyr Phe Glu Pro Trp Thr Tyr Asp Tyr Gln Asn 
            100                 105                 110 
Leu Ile Asn Ala Pro Leu Ala Asp Glu Gln Pro Thr Ala Arg Ala Ile 
        115                 120                 125 
Ser Met Val Thr Gly Lys Tyr Met Asp Thr Ile Glu Ala Gly Pro Asn 
    130                 135                 140 
Trp Asp Asp Asp Leu Gly Gly Ser Gln Val Tyr Ala Asn Asn Asp Pro 
145                 150                 155                 160 
Asn Phe Asp Gly Ala Ser Asp Glu Glu Met Arg Gln Ile Asn Glu Ile 
                165                 170                 175 
Asn Ser Thr Val Phe Phe Tyr Leu Pro Arg Ile Cys Asn His Cys Leu 
            180                 185                 190 
Asn Pro Gly Cys Val Ala Ala Cys Pro Gln Gly Ala Leu Tyr Lys Arg 
        195                 200                 205 
Gly Glu Asp Gly Val Val Leu Val Ser Gln Glu Arg Cys Arg Ala Trp 
    210                 215                 220 
Arg Met Cys Val Ser Gly Cys Pro Tyr Lys Lys Thr Tyr Phe Asn Trp 
225                 230                 235                 240 
Ser Thr Gly Lys Ala Glu Lys Cys Ile Leu Cys Tyr Pro Arg Leu Glu 
                245                 250                 255 
Ser Gly Gln Pro Pro Ala Cys Phe His Ser Cys Val Gly Arg Ile Arg 
            260                 265                 270 
Tyr Ile Gly Leu Val Leu Tyr Asp Ala Asp Ala Ile Glu Glu Thr Ala 
        275                 280                 285 
Lys Ser Pro Gln Asp Gln Leu Val Met Ala Gln Arg Asn Ile Ile Lys 
    290                 295                 300 
Asp Pro Phe Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Arg Ala Asn Gly Ile 
305                 310                 315                 320 
Pro Asp Ser Lys Ile Glu Ala Ala Gln Lys Ser Pro Val Phe Gln Phe 
                325                 330                 335 
Val Lys Lys Trp Gly Ile Ala Leu Pro Leu His Pro Glu Phe Arg Thr 
             340                 345                 350 
Leu Pro Met Leu Phe Tyr Val Pro Pro Leu Gly Pro Val Leu Ala Lys 
        355                 360                 365 
Val Glu Asn Gly Val Tyr Asp Asn Val Ala Asn Glu Ala Arg Leu Gly 
    370                 375                 380 
Pro Leu Met Ser Ser Leu Glu Arg Ser Arg Ile Pro Leu Arg Tyr Met 
385                 390                 395                 400 
Ala Ser Leu Leu Ser Gly Gly Asn Glu Glu Ile Ile Arg Asp Val Tyr 
                405                 410                 415 
Lys Lys Leu Val Ala Val Arg Val Tyr Met Arg Ser Arg Lys Val Lys 
            420                 425                 430 
Asp Ile Pro Asp Glu Glu Val Gln Arg Ala Leu Ser Glu Gly Lys Thr 
        435                 440                 445 
Thr Ala Ala Glu Val Glu Ala Ile Trp Arg Leu Thr Ser Met Pro Thr 
    450                 455                 460 
Phe Glu Glu Arg Phe Val Val Pro Pro Met Glu Arg Glu Thr Ala Val 
465                 470                 475                 480 
Asp Ala Leu Phe Pro Gln Leu Asp Pro Val Ser His Asn Tyr Pro Ile 
                485                 490                 495 
Arg Lys Gly Ala Val Gly Val Gly Phe His Thr Asp ProAla Arg Gly 
            500                 505                 510 
Pro 
Figure ISB00000428280200011
Figure ISB00000428280200021
Figure ISB00000428280200031
Figure ISB00000428280200041

Claims (2)

1.一株具有硝化作用的细菌，其生物学特征在于该细菌是短杆菌N.W-3，保藏登记号为：CGMCC3390，命名为：维氏短杆菌(Nitrobacter winogradskyi)。
2.一种权利要求要求1中所述细菌的鉴定方法，该方法是采用16S rDNA鉴定方法，其特征在于：所述16S rDNA鉴定方法的PCR扩增引物，该引物是：
F为5′GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT，
R为5′GCAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT；
所述16S rDNA鉴定方法的PCR扩增体系为10×PCR Buffer 5μL、10mmol/L的含Mg2+dNTP 1μL、DNA模板1μL、正反向引物10pmol/L各1μL、5U/μL的primestar聚合酶0.5μL、超纯水40.5μL；
所述16S rDNA鉴定方法的PCR扩增程序是94℃预变性5min、94℃变性50s、54℃退火50s、72℃延伸1min30s、35个循环、72℃后延伸10min；
所述16S rDNA鉴定方法的克隆体系是3-5μL回收的PCR产物、1μLpEASY-blunt载体，室温反应10-20min，加连接产物至50μL大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击30s，立刻置于冰上2-3min，然后加入至300μL不含Kan+LB培养基中，37℃、180r/min孵育0.5-1.5h，取200μL菌液涂布含X-Gal、IPTG、Kan+的LB平板，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于600μL的LB培养基中，37℃培养2-5小时，重组子进行PCR阳性检测。
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