CN102041292A - 一种常压蒸汽灭菌生物指示剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种常压蒸汽灭菌生物指示剂及其制备方法，它包括有干培养基、指示菌片。所述的指示菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石蜡、石蜡乳液或脂肪酸。制备方法为：将指示菌接种至生芽孢细菌培养基斜面上培养，芽孢生成后制成指示菌悬液；吸取指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，即制成染菌载体片；将染菌载体片放置在融化的石蜡或脂肪酸液体或石蜡乳液中浸渍，然后干燥即制成防水指示菌片；将防水指示菌片与干培养基组合成一体。本发明指示剂进行常压蒸汽灭菌效果测定时，不论指示剂瓶内加水时间早晚，都能够保证指示菌芽孢实际接触水的时间是基本一致，从而有效避免了同一灭菌锅的指示剂由于加水时间前后不一，而导致通过指示剂指示灭菌能力不一的问题。

Description

一种常压蒸汽灭菌生物指示剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种常压蒸汽灭菌指示剂和该指示剂的制备方法。

背景技术

在对食用菌栽培料常压蒸汽灭菌效果监测的物理、化学和生物三种方法中，生物监测方法是效果最为可靠的方法。生物监测的原理是依靠某种抗常压蒸汽灭菌且具有灭菌效果指示能力的菌类，将其芽孢(孢子)经灭菌后培养，通过芽孢存活与否来判定栽培料中杂菌被杀灭的效果。生物监测技术的应用，确实收到了提高灭菌效果、减少污染发生、改善食用菌菌丝生长的显著效果。

常压蒸汽灭菌生物指示剂是由指示菌干芽孢麸皮菌剂、灭菌粉状培养基(干培养基)、增色剂混合组成的，分装在透明耐高温的瓶内，使用时往指示剂瓶内加入水后，再伴随食用菌栽培料进行灭菌。灭菌工作完成后，对指示剂瓶内的指示菌进行培养，观察其指示瓶内有无指示菌菌落长出，如有菌落长出，则说明食用菌栽培料灭菌质量不达标，反之即为达标。由于常压蒸汽灭菌指示剂所应用的指示菌，是在某一种类的食用菌栽培料营养水平上和食用菌菌丝正常生长所需温度范围内(20～36℃)能够生长的菌类。其在指示剂中被干培养基所包围时，因缺少芽孢萌发生长所需水分而处于休眠状态，在使用时加水后，就具备了芽孢萌发生长所需的营养、水分条件。加之，食用菌栽培时的温度一般高于20℃，从而又具备了芽孢快速萌发生长所需的温度条件，因此孢子将很快打破休眠状态进入营养生长阶段。然而芽孢休眠状态的打破，会减弱指示菌对常压蒸汽灭菌的抗力，故可降低或失去指示灭菌效果的能力。因此，指示剂一旦加水后，应马上或尽快进入灭菌程序。然而在实际使用过程中，指示剂加水后并不可能马上进入灭菌程序。这是因为每个常压蒸汽灭菌锅(或灭菌室、灭菌池)的装量是很大的，小的可装1000个菌袋，大的可装6000多个菌袋，一般是边装料袋边入锅，装满后才苫严灭菌池或将灭菌锅、室封口，而后通汽、升温灭菌，整个装袋装锅过程约需要5～7小时。这样，在不同时间、不同位置所放置的指示剂的遇水时间就有1～7个小时的差别。由此可见，提前遇到水的指示菌干芽孢就会吸水膨胀转向生长状态而降低对常压蒸汽的抗力，晚遇到水的芽孢仍保持强的抗力，由于指示菌芽孢生理状态的不同，从而造成在同一灭菌锅的指示剂指示灭菌的能力有很大差异，这一方面增加了灭菌效果判定的难度，另一方面降低了判定结果的准确度。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种不受遇水时间长短影响的常压蒸汽灭菌生物指示剂，同时提供一种该指示剂的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂，包括有干培养基、指示菌片，其特征在于所述的指示菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石蜡、石蜡乳液或脂肪酸。

本发明中的干培养基是指加水后即可适于指示菌生长的培养基。即用于培养指示菌的培养基标准配方中除水之外的、由其他固体成分组成的培养基。

注：用于培养指示菌的培养基标准配方是指按照此配方制成的培养基可直按用于培养指示菌的配方。

本发明指示剂在使用时，需向干培养基中加入标准培养基配方规定比例的水后方可使用。故在以下表述中，1个指示剂中干培养基的量等于一定体积标准培养基中除水以外各种固体成分用量之和。用其实际使用时加水后所形成的培养基在液态时的体积表示(单位mL)。或简单表述为相当于培养基标准配方多少毫升。

本发明中的指示菌除选用棉籽壳抗热菌01号外，还可选用从其他种类的食用菌栽培料中(如甘蔗渣、玉米芯、锯末等)筛选培养出的，能够在该栽培料营养水平上和食用菌菌丝正常生长所需温度范围内(20～36℃)生长，且对该栽培料的常压灭菌具有指示能力的耐热菌。选用的棉籽壳抗热菌01号为一种枯草芽孢杆菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽壳抗热菌01号，保藏编号为CGMCC No.4153，保藏日期2010年9月8日。

本发明所述的脂肪酸为软脂酸或硬脂酸中的任意一种；所说的石蜡为熔点在50～70℃的石蜡；所说的石蜡乳液为熔点在50～70℃的石蜡乳化剂。

本发明中所说染菌载体片可以是纸片，也可以是滤纸。由于采用滤纸更易于干燥，故优选滤纸。

本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂的制备方法包括以下步骤：

a、将指示菌接种至适合其生长的生芽孢细菌培养基斜面上，在34～36℃下培养，芽孢生成后，用无菌水冲洗菌苔制成指示菌悬液，85～90℃下灭活20～25分钟，使指示菌悬液中指示菌营养体灭活，震荡后静置或低速离心处理，取上清液，上清液即为指示菌芽孢悬液母液，测定指示菌芽孢悬液母液的活孢子浓度，再用无菌水稀释指示菌芽孢悬液母液为所需浓度的指示菌芽孢悬液；

b、吸取a步所制的所需浓度的指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，使每一载体片上附着有规定剂量(即1个指示剂应含的全部芽孢量)的指示菌芽孢，随后在36℃以下干燥，即制成染菌载体片；

c、将染菌载体片放置在融化的石蜡或脂肪酸液体或石蜡乳液中浸渍，然后在36℃以下干燥，即制成防水指示菌片；

d、将防水指示菌片与干培养基组合成一体。

本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂，在常温下，指示菌片中的指示菌芽孢在疏水物质石蜡或脂肪酸的保护下，可与水隔离。因而，在灭菌前，无论何时往指示瓶内加入水，只要温度低于石蜡或脂肪酸的熔点时，石蜡或脂肪酸所形成的防水膜即可阻止指示菌芽孢与水直接接触，因而即使指示菌片处于水中，指示菌片中的芽孢也无法吸收水分，而依旧处于休眠状态。当温度高于其熔点时，石蜡或脂肪酸所形成的防水膜即被破坏，此时指示菌片中的芽孢一边分散到培养基中，一边吸水分继而膨胀转为生长状态。由此可见本发明指示菌片，其指示菌芽孢与水直接接触的时间，可通过温度来控制。由于在同一锅灭菌时，起始温度基本是一致的，因此在采用本发明指示剂进行常压蒸汽灭菌效果测定时，不论指示剂瓶内加水时间早晚，都能够保证指示菌芽孢实际接触水的时间是基本一致，从而有效避免了同一灭菌锅的指示剂由于加水时间前后不一，而导致通过指示剂指示灭菌能力不一的问题。

附图说明

图1是本发明实施例1所采用的棉籽壳抗热菌01号菌株的脂肪酸组成气相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但其并不对本发明的保护范围做不利的限定。

以下实施例中所要制备的指示剂，均用100毫升输液瓶封装，指示剂芽孢浓度均为4×10⁶个/毫升，1个指示剂中的干培养基的量均为40毫升培养基标准配方中所含的干物质的量，染菌载体片均为1×1.5厘米大小的滤纸片。

实施例1以棉籽壳抗热菌01号为指示菌，制备本发明指示剂。

该指示剂由棉籽壳抗热菌01号防水指示菌片及其干培养基(加水后用于棉籽壳抗热菌01号指示菌的恢复生长，为无菌状态)组成。石蜡、硬脂酸、软脂酸、石蜡乳液中的任一种均可用作制防水指示菌片的防水材料。

(一)制备防水指示菌片：

(1)制取指示菌芽孢悬液

将棉籽壳抗热菌01号指示菌划线接种在生芽孢细菌培养基试管斜面上，34～36℃下培养48小时，20℃下培养72小时；用10毫升无菌水洗脱掉菌苔，洗脱液倒入15毫升无菌离心管中；振荡器振荡菌苔悬液15分钟；在烘箱内热处理装菌苔悬液的离心管，当菌苔悬液温度达90℃后持续20分钟，以杀死菌苔悬液中的指示菌营养体；离心10分钟(500r·min^-1)，弃去管底沉淀物，将上清液倒入另一个无菌离心管内即为指示菌芽孢悬液母液，采用平板计数法测定指示菌芽孢悬液母液中活孢子浓度。

上述的生芽孢细菌培养基，其1000毫升配方为：胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化钠8克，硫酸锰0.3克，琼脂20克，水定容至1000毫升。分装在18×180毫米试管内，每管分装10毫升，121℃下灭菌30分钟，出锅摆放成斜面。

用于平板计数的培养基，其1000毫升配方为：胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化钠8克，琼脂20克，水定容至1000毫升。121℃下灭菌30分钟，出锅后无菌条件下用9厘米平皿制成平板。

(2)配制制备染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液：

染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液可根据制作指示剂时的规格要求及染菌载体所承载的适宜菌液量来确定。

1张染菌载体片应含的指示菌芽孢总数＝1个指示剂所含指示菌芽孢总数＝指示剂芽孢浓度(个/毫升)×1个指示剂实际使用时的培养基量(毫升)

指示剂芽孢浓度为1个指示剂中的干培养基在实际使用时每毫升中含芽孢的个数。

根据指示剂芽孢浓度(4×10⁶个/毫升)，可计算出指示剂中1张染菌载体片应含指示菌芽孢总数为4×10⁶×40＝1.6×10⁸个。

染菌载体片所需指示菌芽孢悬液浓度＝1张染菌载体片应含的指示剂芽孢总数÷染菌载体染菌量(毫升)。

预备试验得知，1×1.5厘米大小滤纸片承载的适宜菌液量为20微升，如此，染菌载体片所需指示菌芽孢悬液浓度即为1.6×10⁸个÷20微升＝8×10⁹个/毫升。

根据上述(1)步中指示菌芽孢悬液母液的浓度，可配制出染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液，若(1)步中所配制的指示菌芽孢悬液母液的浓度高于10⁹个/毫升，则用无菌水将其稀释到8×10⁹个/毫升浓度；若其浓度低于10⁹数量级，则离心15分钟(8000r·min^-1)后取沉淀物，再用无菌水稀释至所需浓度。

(3)制备染菌载体片：

将滤纸裁成1×1.5厘米大小的纸片，装入塑料袋内，121℃下灭菌30分钟，将纸片排在无菌土壤筛的筛底上，用微量加液器吸取上一步已配制至所需浓度的指示菌芽孢悬液20微升，滴加在纸片的中央位置，纸片吸收水分后，放置在30℃鼓风培养箱内快速干燥。

(4)给染菌载体片做防水涂层(可采用以下①-④中的任意一种方式)：

①用熔点在58～60℃的石蜡做防水涂层：在无菌室内，将装有熔点为58～60℃的石蜡(该石蜡由天津福晨化学试剂厂生产)放在烧杯内，置于66～68℃烘箱内融化，用镊子夹住滤纸片的一角，在熔化的石蜡内浸渍后，36℃下摊凉在无菌土壤筛底上，凝固后，即制成以石蜡作防水涂层的防水指示菌片。

②用软脂酸做防水涂层：将染菌载体片放置在融化的软脂酸液体中浸渍，然后在36℃以下干燥，即制成以软脂酸作防水涂层的防水指示菌片。

③用硬脂酸做防水涂层：将染菌载体片放置在融化的硬脂酸液体中浸渍，然后在36℃以下干燥，即制成以硬脂酸作防水涂层的防水指示菌片。

④用石蜡乳液做石蜡防水涂层：将染菌载体片放置在石蜡乳液中浸渍，然后在36℃以下干燥，纸片水分蒸发后留下石蜡，同样成为石蜡作防水涂层的防水指示菌片。本例所用石蜡乳液以56℃～58℃半精炼石蜡为主要原料生产，含固量40％，pH 6～7，生产单位藁城市西城工业区宽力乳液厂。

制好的防水指示菌片装入复合塑料袋内，封口后4～6℃下存放。

(二)将防水指示菌片与干培养基组合成一体。

本实施例中指示剂干培养基所依据的培养基标准配方为胰蛋白胨1克，葡萄糖0.5克，氯化钠0.8克，琼脂粉2.0克，水100毫升。配制一个(瓶)指示剂用干培养基的量(等于按培养基标准配方配制40毫升时所需除水以外各种材料的量)是：无菌胰蛋白胨0.4克、葡萄糖0.2克、氯化钠0.32克、琼脂粉0.8克，各种材料总重1.72克。

往1个100毫升无菌输液瓶内放1张防水指示菌片、无菌胰蛋白胨0.4克、葡萄糖0.2克、氯化钠0.32克、琼脂粉0.8克，丁基胶塞、铝盖封口，即制成1个用棉籽壳抗热菌01号作指示菌的本发明指示剂。

(三)棉籽壳抗热菌01号的来源。

绵籽壳抗热菌01号为从棉籽壳栽培料中筛选出的具有指示棉籽壳栽培料常压灭菌效果的指示菌，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽壳抗热菌01号，保藏编号CGMCC No.4153，保藏日期2010年9月8日。

(1)形态学特征为：革兰氏阳性、菌体杆状，单个排列，好氧，芽孢椭圆形。

(2)生理生化特征为：经Bio1og Microplate GP检测(24小时培养)，可利用95种碳源中的如下类型：β-Methyl-D-Glucoside(β-甲基-D-葡萄糖苷)，α-Methyl-D-Glucoside(α-甲基-D-葡萄糖苷)，α-D-Glucose(α-D-葡萄糖)，Tween80(吐80)，Tween 40(吐温40)，Turanose(松二糖)，Sucrose(蔗糖)，N-Acetyl-D-Glucosamine(N-乙酰氨基葡萄糖)，Maltotriose(麦芽三糖)，Maltose(麦芽糖)，L-Fucose(L-岩藻糖)，L-Arabinose(L-阿拉伯糖)，Glycerol(丙三醇)，Gentiobiose(龙胆二糖)，D-Xylose(D-木糖)，D-Trehalose(D-海澡糖)，D-Ribose(D-核糖)，D-Psicose(D-阿洛酮糖)，D-Mannose(D-甘露糖)，D-Mannitol(D-甘露醇)，D-Fructose(D-果糖)，Dextrin(糊精)，D-Cellobiose(纤维二糖)，2，3-Butanediol(2，3-丁二醇)，其他为阴性，详见表2。

表2：Biolog碳源利用测定结果

α-Cyclodcxtrin	-	β-Methyl-D-Galactoside	-	Pyruvic Acid Methyl Ester	-
						β-Cyclodextrin	b	3-Methyl-D-Glucose	-	Succinic AcidMono-Methyl Ester	-
Dextrin	+	α-Methyl-D-Glucoside	+	Propionic Acid	-
						Glycogen	-	β-Methyl-D-Glucoside	+	Pyruvic Acid	-
Inulin	-	α-Methyl-D-Mannoside	-	Succinamic Acid	-
						Mannan	-	Palatinose	b	Succinic Acid	-
Tween 40	+	D-Psicose	+	N-Acetyl-L-Glutamic Acid	b
						Tween 80	+	D-Raffinose	-	L-Alaninamide	-
N-Acctyl-D-Glucosamine	+	L-Rhamnose	-	D-Alanine	b
						N-Acctyl-β-D-Mannosamine	-	D-Ribose	+	L-Alanine	-
Amygdalin	-	Salicin	-	L-Alanyl-Glycine	-
						L-Arabinose	+	Sedoheptulosan	-	L-Asparaginc	-
D-Arabitol	-	D-Sorbitol	b	L-Glutamic Acid	-
						Arbutin	-	Stachyose	-	Glycyl-L-Glutamic Acid	-

D-Cellobiose	+	Sucrose	+	L-Pyroglutamic Acid	-
						D-Fructose	+	D-Tagatose	-	L-Serine	-
L-Fucose	+	D-Trehalose	+	Putrescine	-
						D-Galactose	b	Turanose	+	2，3-Butanediol	+
D-Galacturonic Acid	-	Xylitol	-	Glycerol	+
						Gentiobiose	+	D-Xylose	+	Adenosine	b
D-Gluconic Acid	-	Acetic Acid	-	2’-Deoxy Adenosine	-
						α-D-Glucose	+	α-HydroxybutyricAcid	-	Inosine	b
m-Inositol	-	β-HydroxybutyricAcid	-	Thymidine	b
						α-D-Lactose	-	γ-HydroxybutyricAcid	-	Uridine	b
Lactulose	-	p-Hydroxy-phenylacetic Acid	-	Adenosine-5′-Monophosphate	-
						Maltose	+	α-Ketoglutaric Acid	-	Thymidine-5′-Monophosphate	-
Maltotriose	+	α-Ketovaleric Acid	-	Uridine-5′-Monophosphate	-
						D-Mannitol	+	Lactamide	-	D-Fructose-6-Phosphate	-

D-Mannose	+	D-Lactic Acid Methyl Ester	-	α-D-Glucose-l-Phosphate	-
						D-Melezitose	-	L-Lactic Acid	-	D-Glucose-6-Phosphate	-
D-Melibiose	-	D-Malic Acid	-	D-L-α-GlycerolPhosphate	-
						α-Methyl-D-Galactoside	-	L-Malic Acid	-

(3)Biolog自动细菌鉴定仪鉴定Biolog GP板培养18-24小时检测结果表明，与Bacillus amyloliquefaciens最为相似。

(4)脂肪酸组成 主要组成成分15:0iso(40.16％)和15:0anteiso(38.16％)，与数据库中Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens(Bacillus subtilis group)相似值最高。测定结果详见表3、图1。

表3：脂肪酸组成及含量

Peak Name	Percent
		SOLVENT PEAK	----
14:0iso	1.29
		15:0iso	40.16
15:0anteiso	38.16
		16:0iso	2.02
16:0	2.05
		17:0iso	9.16
17:0anteiso	5.55
		Sum In Feature 8	1.62

(5)16s rDNA测序试验所测得的部分序列在NCBI上BLAST结果与Bacillus Subtilis模式种不同亚种菌株的相似性菌为100％，与Bacillusamyloliquefaciens模式菌株的相似性菌为99.4％。其16S rDNA的部分序列为：

CCGGTTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTC

实施例2用从玉米芯栽培料中筛选出的具有指示玉米芯栽培料常压灭菌效果的指示菌制备本发明指示剂。

该指示剂由玉米芯栽培料常压灭菌指示菌片及其干培养基(加水后用于玉米芯栽培料常压灭菌指示菌的恢复生长，为无菌状态)组成。石蜡、硬脂酸、软脂酸、石蜡乳液中的任一种均可用作制防水指示菌片的防水材料。

(一)筛选玉米芯常压灭菌指示菌：

(1)配制栽培料按照7∶3的质量比称取玉米芯、麸皮，将二者混合均匀，在35℃烘箱内烘干，粉碎，过40目筛。

(2)制取杂菌悬液按照水、栽培料体积重量比(毫升/克)为100∶52的比例，用水浸提杂菌(即将玉米芯栽培料放入蒸馏水中，振荡器振荡20分钟，四层纱布过滤并挤压滤渣，滤液即为含有玉米芯栽培料杂菌的杂菌悬液)。每100毫升水，可浸提出20毫升杂菌悬液。每次用1100毫升水，浸提572克栽培料，可制取220毫升杂菌悬液，能够满足下一步骤中(即步骤(3))一次制作500毫升培养基的需要。

(3)配制内含杂菌的细菌培养基(即把栽培料中杂菌分散到细菌培养基中)。

具体制备100毫升培养基方法为：用60毫升蒸馏水将2克琼脂溶化后，再加入1克胰蛋白胨、0.5克葡萄糖、40毫升上述步骤(2)制取的杂菌悬液，混合均匀，煮沸，加蒸馏水定容至100ml。

将上述制好的含杂菌的细菌培养基分装至试管中，每只装量10毫升，棉塞封口，即制成含杂菌的细菌培养基。

一次配制500毫升上述含杂菌细菌培养基，分装成50支试管，供下面步骤(4)中一个灭菌时长使用。为防止杂菌被水浸提后，处于水中的杂菌吸水而影响其对常压蒸汽的抗力，特别注意，在用水浸提杂菌时，从栽培料投入水中开始，到分装好的含杂菌的培养基试管入常压灭菌锅时止，在1个小时内完成，即每一个时长需要灭菌的培养基试管，从预定的入锅时间点起前推1个小时，开始水浸提杂菌的操作。

(4)对含杂菌的细菌培养基进行不同时长的常压蒸汽灭菌

将上述步骤(3)制成的含杂菌培养基的试管，到预定入锅时间时放入已预热至蒸汽温度为100℃的常压灭菌锅内，迅速封严锅盖，加大火力，蒸汽温度再达100℃时开始计时。最短的灭菌时长为1小时，其它各组的灭菌时长分别为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时。所有各时长的灭菌处理均依次在同一锅内进行。

灭菌到时的含杂菌培养基的试管出锅后摆放成斜面。

(5)20～25℃温度恢复培养

将上述已凝固成斜面的含杂菌培养基试管放置在20～25℃下培养7天。

(6)观察上述试管中细菌恢复生长情况并检出存活菌

结果：经4小时灭菌的50支试管中有3支恢复生长出细菌，经5小时灭菌的50支试管中有1支恢复生长出细菌，经6小时灭菌的50支试管中有2支恢复生长出细菌，经7、8、9小时灭菌后试管中再无细菌菌落长出。将经6小时灭菌后的2支试管中出现的存活菌分别转接到胰蛋白胨葡萄糖细菌培养基斜面试管上(其编号分别为玉6-1、玉6-2)，36℃培养后留存。

上述胰蛋白胨葡萄糖细菌培养基的配方为：胰蛋白胨1克，葡萄糖0.5克，琼脂2克，水定容至100毫升。

(7)从玉6-1、玉6-2号存活菌中筛选出强耐热的菌株。该步骤如下：

①培养玉6-1、玉6-2号存活菌的芽孢：

将上述玉6-1、玉6-2号存活菌，分别接种在生芽孢细菌培养基试管斜面上，36℃下培养72小时。

上述生芽孢细菌培养基配方为：胰蛋白胨1克，葡萄糖0.5克，氯化钠0.8克，硫酸锰0.03克，琼脂2克，水定容至100毫升。培养基分装在18×180毫米试管内，每管分装10毫升，121℃下灭菌30分钟，出锅摆放成斜面。

②分别配制玉6-1、玉6-2号存活菌的芽孢溶液：

配制方法为：用10毫升无菌水洗脱掉试管斜面存活菌的菌苔，洗脱液倒入无菌试管中，振荡菌苔悬液15分钟，在烘箱内，90℃下持续20分钟，杀死菌苔悬液中的营养体。静置，弃去管底沉淀物，将上清液倒入另一个无菌试管内，即为存活菌芽孢悬液。取1毫升该悬液，进行平板计数，测定芽孢悬液中活孢子浓度。根据计数结果用无菌水进行稀释，稀释得到每一编号的存活菌芽孢浓度为5×10⁷个/毫升的芽孢溶液，4℃冰箱存放。

在平板计数时，采用的平板计数培养基为前述的胰蛋白胨葡萄糖细菌培养基。

③对含有玉6-1、玉6-2号存活菌芽孢及培养基的试管同时进行不同时长的常压蒸汽灭菌。每一编号的存活菌，在每一时长灭菌时，有40支供试试管。

供试试管具体制备方法为：在进入灭菌前1小时，取1毫升芽孢浓度为5×10⁷个/毫升的芽孢溶液放到内装有9毫升胰蛋白胨葡萄糖细菌培养基的试管中。

常压蒸汽处理时长取值为：6小时、6小时10分钟、6小时20分钟、6小时30分钟、6小时40分钟、6小时50分钟、7小时、7小时10分钟、7小时20分钟、7小时30分钟。各处理时长依次分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

处理的方式：同一时长的灭菌处理，6-1、6-2号存活菌同时在同一个灭菌锅内进行。一个时长的灭菌处理完成后，再用同一灭菌锅进行下一个时长的灭菌处理。

灭菌后培养检查：上述灭菌后的培养基试管，置36℃下培养，36小时后检查玉6-1、玉6-2号存活菌在各灭菌时长后的存活管数，结果如下表1：

表1：存活菌经不同时长灭菌处理后生长细菌的管数

根据以上结果，从抗热能力上看，同一灭菌时长时玉6-1号存活菌与玉6-2号存活菌存活管基本相同，表明二者抗热能力(即抗常压灭菌能力)基本相同，故指定玉6-1号存活菌为本次筛选得到的强耐热存活菌。

⑧玉6-1号强耐热存活菌在玉米芯栽培料上的生长能力检验

目的是检验上一步获得的玉6-1号强耐热存活菌能否在玉米芯栽培料上生长，检验用培养基配方为：玉米芯10克、琼脂粉2克，水定容至100毫升；制作时将玉米芯用开水煮20分钟，过滤取煮汁，煮汁溶化琼脂后，用水定容，然后分装成试管，灭菌后制成试管斜面，接种玉6-1号强耐热存活菌，在20～25℃培养24～48小时，其能够在试管斜面培养基上形成明显菌落，表明该存活菌具有在玉米芯上生长的能力，是与栽培菌类生长所需营养一致、生长温度范围重叠的菌类。

⑨玉6-1号强耐热存活菌指示能力检验

目的是测试上一步已通过生长能力检验的玉6-1号强耐热存活菌与玉米芯栽培料中杂菌相比，是不是具有更抗常压蒸汽灭菌的能力。检验步骤如下：

①准备检验材料以玉米芯栽培料和玉6-1号抗热存活菌芽孢含量为5×106个/克的麸皮菌剂为检验材料。

玉米芯栽培料选用的是玉米芯、麸皮质量比7∶3的料，35℃干燥，粉碎过40目筛。

玉6-1号强耐热存活菌麸皮菌剂的制备方法为：按照麸皮(20～40目粒度)∶豆粉∶碳酸钙∶水等于50∶10∶1∶42的质量比，称取麸皮75克、豆粉15克、碳酸钙1.5克、水63克，将各组分混合均匀后装入1个500毫升输液瓶内，121℃灭菌2小时，接入玉6-1号强耐热存活菌芽孢浓度为5×10⁷个/毫升的芽孢溶液，接种量18毫升，经36℃下48小时培养后，再在24℃下48小时培养，然后35℃下干燥48小时，90℃恒温20分钟，杀死麸皮菌剂的中的营养体，35℃下烘干至恒重，无菌条件下研磨开干结的麸皮块即成含有6-1号强耐热存活菌的麸皮菌剂母剂，用平板计数方法对该母剂的活孢子进行计数，用无菌麸皮把上述母剂中的活孢子数稀释到5×10⁶个/克，即制成玉6-1号强耐热存活菌芽孢含量为5×10⁶个/克的麸皮菌剂。

②检验过程：分别将0.23克的玉米芯栽培料和0.23克芽孢含量为5×10⁶个/克的玉6-1号强耐热存活菌麸皮菌剂放入含有10毫升已灭菌的胰蛋白胨葡萄糖细菌培养基试管内，同时进行不同时长(分别为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个小时)的常压蒸汽灭菌处理，一次灭菌处理时，每种检验材料各灭菌处理10只试管，灭菌后摆放成斜面，36℃下培养36小时，观察装有玉米芯栽培料和装有玉6-1号强耐热存活菌麸皮菌剂的试管中细菌恢复生长的情况，结果发现在灭菌时长3小时时，装有玉米芯栽培料的试管各管均没有细菌菌落产生，而装有玉6-1号强耐热存活菌麸皮菌剂的试管，在灭菌时长3、4、5、6小时时，各管均有菌落产生，7、8、9小时时，各管均没有菌落产生，这表明玉6-1号强耐热存活菌在经常压灭菌时，与玉米芯栽培料杂菌相比，具有更抗常压蒸汽灭菌的能力，意即，在存活菌被杀死时，栽培料中杂菌早已被杀死。

由此看来，本次筛选获得的玉6-1号强耐热存活菌是在玉米芯栽培料营养水平上和食用菌菌丝正常生长所需温度范围内(20～36℃)能够生长，且具有指示玉米芯栽培料常压灭菌效果能力的菌类，可作为玉米芯栽培料常压灭菌指示菌使用。

(二)制备玉6-1号防水指示菌片：

(1)制取指示菌芽孢悬液

操作过程及方法与实施例1之(一)(1)叙述的相同。

(2)配制制备染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液：

操作过程及方法与实施例1之(一)(2)叙述的相同。

(3)制备染菌载体片：

操作过程及方法与实施例1之(一)(3)叙述的相同。

(4)给染菌载体片做防水涂层：

操作过程及方法与实施例1之(一)(4)叙述的相同。

(三)将防水指示菌片与干培养基组合成一体。

用石蜡、硬脂酸、软脂酸、石蜡乳液4种材料制作的防水指示菌片中的任一种均可用于本发明指示剂。

指示剂干培养基所依据的培养基标准配方为胰蛋白胨1克，葡萄糖0.5克，氯化钠0.8克，琼脂粉2.0克，水100毫升，则配制一个(瓶)指示剂用干培养基的量(等于按培养基标准配方配制40毫升时所需除水以外各种材料的量)是：无菌胰蛋白胨0.4克、葡萄糖0.2克、氯化钠0.32克、琼脂粉0.8克，各种材料总量1.72克。

往1个100毫升无菌输液瓶内放1张防水指示菌片、无菌胰蛋白胨0.4克、葡萄糖0.2克、氯化钠0.32克、琼脂粉0.8克，丁基胶塞、铝盖封口，即制成1个用玉6-1号作指示菌的本发明指示剂。

实施例3本发明指示剂与常规指示剂不同加水时的指示效果比较

(一)实验材料

本发明指示剂用实施例1制作的指示剂(其中的防水指示菌片用石蜡乳液制成)，芽孢浓度4×10⁶个/毫升，培养基装量相当于培养基标准配方40毫升(使用时加入40毫升水)，用100毫升输液瓶分装。实验代号为“本”。

常规指示剂由棉籽壳抗热菌01号芽孢麸皮菌剂、干培养基组成(为减少误差，不放增色剂)，芽孢浓度4×10⁶个/毫升，培养基装量相当于培养基标准配方40毫升(使用时加入40毫升水)，用100毫升输液瓶分装。

实验代号为“常”。

(二)实验方法

为了模拟在实际使用过程中，指示剂随不同料袋入锅，而形成的在不同时间加水的情形，在往指示剂瓶内加水时，设置了不同的加水时间，分别为在灭菌前1、2、3、4、5、6小时加水，加水量40毫升水。然后将同一时间加水的两种指示剂放在同一灭菌锅内进行常压灭菌处理，处理时间又分为7小时、8小时两个时长，灭菌完成后，直接卧放在36℃培养箱内，24小时后观察瓶内培养基上是否有指示菌菌落长出。每个灭菌时长每种指示剂灭菌数量为10瓶。实验时室温30℃。

(三)实验结果

实验结果详见表2。从表2中可以看出，本发明指示剂的存活瓶数不受加水时间的影响，表明不管加水早晚，均能保持住正常的指示能力；常规指示剂的存活瓶数受加水时间的影响明显，表明指示能力随提前加水时间的增加下降明显。

表2：两种指示剂不同时间加水后经常压处理后存活指示菌的瓶数

本发明中的实施例2所制指示剂经实验证明均具有实施例3所述效果，在此不再赘述。

Claims (7)

1.一种常压蒸汽灭菌生物指示剂，包括有干培养基、指示菌片，其特征在于所述的指示菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石蜡、石蜡乳液或脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的生物指示剂，其特征在于所说的指示菌是从食用菌栽培料中筛选培养出的，对食用菌栽培料常压灭菌具有指示能力的耐热菌。

3.根据权利要求1所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的指示菌为棉籽壳抗热菌01号，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽壳抗热菌01号，保藏编号为CGMCC No.4153，保藏口期2010年9月8日。

4.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的脂肪酸为软脂酸或硬脂酸中的任意一种。

5.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的石蜡为熔点在50～70℃的石蜡。

6.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说染菌载体片为滤纸。

7.一种权利要求1所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

a、将指示菌接种至生芽孢细菌培养基斜面上，在34～36℃下培养，芽孢生成后，用无菌水冲洗菌苔制成指示菌悬液，85～90℃下灭活20～25分钟，震荡后静置或低速离心处理，取上清液，测定上清液活孢子浓度，再用无菌水稀释为所需浓度的指示菌芽孢悬液；

b、吸取a步所制的指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，使每一载体片上附着有规定剂量的指示菌芽孢，随后在36℃以下干燥，即制成染菌载体片；

c、将染菌载体片放置在融化的石蜡、石蜡乳液或脂肪酸液体中浸渍，然后在36℃以下干燥，即制成防水指示菌片；

d、将防水指示菌片与干培养基组合成一体。

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