CN102041236A - 弱后酸化发酵剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种弱后酸化发酵剂的制备方法，保加利亚乳杆菌经菌体悬液制备、辐照、离心分离、清洗、培养、纯化、挑选、冷冻离心、冻干粉碎和混合后最终制得弱后酸化发酵剂，制备过程中利用60Co-γ射线辐照与硫酸新霉素联合诱变的方法对保加利亚乳杆菌选育，筛选过程不带入其它基因片段，具有使用安全性，筛选得到的菌株在储藏期内表现出较好的弱后酸化特性，从根本上解决发酵产品过酸化问题，硫酸新霉素处理既是诱变，又是筛选，省时省力。经研究，本发明制得的由保加利亚乳杆菌菌株参与的发酵剂解决了活性乳酸菌饮品保质期短的缺陷，降低生产成本，延长货架期，显示出该保加利亚乳杆菌菌株作为酸奶、活性乳酸菌果蔬汁发酵剂的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的弱后酸化发酵剂的制备方法。
背景技术
早在80年前西方便有商业公司开始出售发酵剂，经过不断的发展和完善，在国外市场上的发酵剂各式各样，可以满足不同用户的需要。我国在发酵剂研究方面起步较晚，从80年代后期才开始研究，至今还没有成熟的发酵剂供应市场，究其原因是相关行业需求的缺乏、发酵剂领域科技水平的制约和对国外产品的依赖。随着我国发酵食品行业的快速发展，对发酵剂行业提出了新的要求，需求量连年上升，特别是研制具有特殊性能的优良发酵剂尤为重要。乳酸菌发酵产品正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售、食用前这一过程中，菌体仍要生长繁殖、产品的pH值继续下降，以致出现消费者不可接受的过酸味和感官质量，致使存在产品货架期短、活菌数低等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种弱后酸化发酵剂的制造方法，由本发明的方法制得的弱后酸化发酵剂可以降低生产成本，延长产品货架期，从根本上解决发酵产品在贮藏过程中的过酸化问题，是一种新型、高效的发酵剂。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：一种弱后酸化发酵剂的制备方法，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成菌体悬液；
②、辐照：用射线辐照步骤①所述的菌体悬液；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管进行离心分离，得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀进行清洗，制成菌悬液；
⑤、培养：取设定量步骤④制得的菌悬液涂布在含硫酸新霉素的MRS培养基的平板上进行培养；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，进行划线分离纯化；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5环境下进行培养后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：往步骤⑧所得沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与其他发酵菌株的冻干粉混合制成相应的弱后酸化发酵剂。
本发明的进一步技术方案是：其他发酵菌株是指嗜热链球菌、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌中的至少一种。
本发明的进一步技术方案是：弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与嗜热链球菌的冻干粉以1∶1.5比例混合制成弱后酸化乳品发酵剂。
本发明的进一步技术方案是：弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌的冻干粉和肠膜明串珠菌的冻干粉以1∶1.5∶0.8比例混合制成弱后酸化果蔬汁发酵剂。
本发明的进一步技术方案是：一种弱后酸化发酵剂的制备方法，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成106cfu/mL(cfu/mL为每毫升样品中含有的细菌群落总数)菌体悬液；
②、辐照：用100kR(kR为千伦琴)辐射诱变剂量进行60Co-γ射线辐照步骤①所述的菌体悬液20min；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管中，在温度4℃下，以6000rpm(rpm为每分钟转数)的转速离心10min，分离得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀用无菌质量分数为0.85％的NaCL溶液清洗两次，制成600nm下、OD值0.45的菌悬液；
⑤、培养：取0.1ml步骤④制得的菌悬液涂布在含100ug/mL硫酸新霉素的MRS培养基的平板上，在温度37℃条件下培养3天；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，划线于含100ug/mL硫酸新霉素的MRS平板上，分离纯化两次；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5、37℃恒温条件下静置培养48h后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中，在37℃的环境下培养48小时后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：加入质量分数为5％的冻干保护剂至步骤⑧所得沉淀后在冷冻干燥机里冻干48小时，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与其他发酵菌株的冻干粉混合制成相应的弱后酸化发酵剂。
本发明的进一步技术方案是：以冻干保护剂总重量百分比计，所述冻干保护剂的配方为：海藻糖8％，甘油10％，乳糖12％，酪蛋白5％，无菌水65％。
本发明的有益效果是：本发明利用60Co-γ射线辐照与硫酸新霉素联合诱变的方法对保加利亚乳杆菌进行选育，属于物理化学方法，筛选过程不带入其它基因片段，具有使用安全性，筛选得到的菌株在储藏期内，活性乳酸菌制品的酸度降低大幅减小，表现出较好的弱后酸化特性，从根本上解决发酵产品的过酸化问题。同时硫酸新霉素的处理过程既是诱变过程，又是筛选过程，工作量大大降低，省时省力。经研究，根据本发明制得的由保加利亚乳杆菌菌株参与的发酵剂解决了活性乳酸菌饮品保质期短的缺陷，降低生产成本，延长货架期，显示出该保加利亚乳杆菌菌株作为酸奶、活性乳酸菌果蔬汁发酵剂的优势。
具体实施方式
实施例1：一种弱后酸化发酵剂的制备方法，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成106cfu/mL(cfu/mL为每毫升样品中含有的细菌群落总数)菌体悬液；
②、辐照：用100kR(kR为千伦琴)辐射诱变剂量进行60Co-γ射线辐照步骤①所述的菌体悬液20min；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管中，在温度4℃下，以6000rpm(rpm为每分钟转数)的转速离心10min，分离得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀用无菌质量分数为0.85％的NaCL溶液清洗两次，制成600nm下、OD值0.45的菌悬液；
⑤、培养：取0.1ml步骤④制得的菌悬液涂布在含100ug/mL硫酸新霉素的MRS培养基的平板上，在温度37℃条件下培养3天；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，划线于含100ug/mL硫酸新霉素的MRS平板上，分离纯化两次；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5、37℃恒温条件下静置培养48h后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中(所述MRS培养基推荐配方为，脱盐乳清粉80g/L，乳清蛋白粉10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖5g/L，七水硫酸镁0.50g/L，四水硫酸锰0.25g/L)，在37℃的环境下培养48小时后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：加入质量分数为5％的冻干保护剂(以冻干保护剂总重量百分比计，所述冻干保护剂的配方为：海藻糖8％，甘油10％，乳糖12％，酪蛋白5％，无菌水65％)至步骤⑧所得沉淀后在冷冻干燥机里冻干48小时，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冻干粉以1∶1.5比例混合制成弱后酸化乳品发酵剂，用该发酵剂生产的发酵乳制品，在贮藏过程酸度降低幅度小，保质期长，具有较好的稳定性。
实施例2：一种弱后酸化发酵剂的制备方法，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成106cfu/mL(cfu/mL为每毫升样品中含有的细菌群落总数)菌体悬液；
②、辐照：用100kR(kR为千伦琴)辐射诱变剂量进行60Co-γ射线辐照步骤①所述的菌体悬液20min；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管中，在温度4℃下，以6000rpm(rpm为每分钟转数)的转速离心10min，分离得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀用无菌质量分数为0.85％的NaCL溶液清洗两次，制成600nm下、OD值0.45的菌悬液；
⑤、培养：取0.1ml步骤④制得的菌悬液涂布在含100ug/mL硫酸新霉素的MRS培养基的平板上，在温度37℃条件下培养3天；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，划线于含100ug/mL硫酸新霉素的MRS平板上，分离纯化两次；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5、37℃恒温条件下静置培养48h后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中(所述MRS培养基推荐配方为，脱盐乳清粉80g/L，乳清蛋白粉10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钾2g/L，葡萄糖5g/L，七水硫酸镁0.50g/L，四水硫酸锰0.25g/L)，在37℃的环境下培养48小时后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：加入质量分数为5％的冻干保护剂(以冻干保护剂总重量百分比计，所述冻干保护剂的配方为：海藻糖8％，甘油10％，乳糖12％，酪蛋白5％，无菌水65％)至步骤⑧所得沉淀后在冷冻干燥机里冻干48小时，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的冻干粉以1∶1.5∶0.8比例混合制成弱后酸化果蔬汁发酵剂，用该发酵剂发酵的活性乳酸菌果蔬汁，储藏内pH值降低速度较慢，储藏温度4℃下发酵果蔬汁的货架期达120d。
Claims (6)
1.一种弱后酸化发酵剂的制备方法，其特征在于，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成菌体悬液；
②、辐照：用射线辐照步骤①所述的菌体悬液；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管进行离心分离，得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀进行清洗，制成菌悬液；
⑤、培养：取设定量步骤④制得的菌悬液涂布在含硫酸新霉素的MRS培养基的平板上进行培养；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，进行划线分离纯化；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5环境下进行培养后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中培养后，进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：往步骤⑧所得沉淀中加入冻干保护剂后进行冻干，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与其他发酵菌株的冻干粉混合制成相应的弱后酸化发酵剂。
2.根据权利要求1所述的一种弱后酸化发酵剂的制备方法，其特征在于，其他发酵菌株是指嗜热链球菌、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的一种弱后酸化发酵剂的制备方法，其特征在于，弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与嗜热链球菌的冻干粉以1∶1.5比例混合制成弱后酸化乳品发酵剂。
4.根据权利要求2所述的一种弱后酸化发酵剂的制备方法，其特征在于，弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉、乳酸乳球菌的冻干粉和肠膜明串珠菌的冻干粉以1∶1.5∶0.8比例混合制成弱后酸化果蔬汁发酵剂。
5.根据权利要求1所述的一种弱后酸化发酵剂的制备方法，其特征在于，按下述步骤进行：
①、制备菌体悬液：将保加利亚乳杆菌活化后制成106cfu/mL(cfu/mL为每毫升样品中含有的细菌群落总数)菌体悬液；
②、辐照：用100kR(kR为千伦琴)辐射诱变剂量进行60Co-γ射线辐照步骤①所述的菌体悬液20min；
③、离心分离：将步骤②辐照后的菌体悬液放入无菌离心管中，在温度4℃下，以6000rpm(rpm为每分钟转数)的转速离心10min，分离得到沉淀；
④、清洗：将步骤③所得沉淀用无菌质量分数为0.85％的NaCL溶液清洗两次，制成600nm下、OD值0.45的菌悬液；
⑤、培养：取0.1ml步骤④制得的菌悬液涂布在含100ug/mL硫酸新霉素的MRS培养基的平板上，在温度37℃条件下培养3天；
⑥、纯化：挑出步骤⑤培养后的菌悬液中的单菌落，划线于含100ug/mL硫酸新霉素的MRS平板上，分离纯化两次；
⑦、挑选：将步骤⑥纯化后的单菌落置于MRS培养基中，在初始pH值为6.5、37℃恒温条件下静置培养48h后，挑选600nm、OD值小于0.7且终止pH值大于4.8的单菌落突变株，即为弱后酸化保加利亚乳杆菌；
⑧、冷冻离心：将步骤⑦挑选出的弱后酸化保加利亚乳杆菌接种到MRS培养基中，在37℃的环境下培养48小时后，在4℃、6000rpm的环境下进行冷冻离心，得到沉淀；
⑨、冻干粉碎：加入质量分数为5％的冻干保护剂至步骤⑧所得沉淀后在冷冻干燥机里冻干48小时，取出后在无菌环境下进行粉碎至粉状，得到弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉。
⑩、混合：把步骤⑨所得弱后酸化保加利亚乳杆菌冻干粉与其他发酵菌株的冻干粉混合制成相应的弱后酸化发酵剂。
6.根据权利要求5所述的一种弱后酸化发酵剂的制造方法，其特征在于，以冻干保护剂总重量百分比计，所述冻干保护剂的配方为：海藻糖8％，甘油10％，乳糖12％，酪蛋白5％，无菌水65％。
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