CN102040641A

CN102040641A - 一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取分离方法

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Publication number: CN102040641A
Application number: CN 200910075665
Authority: CN
Inventors: 马百平; 康利平; 刘奕训; 余河水; 邹鹏; 贾继明; 王宏涛; 郑亚杰; 吴以岭
Original assignee: Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2009-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2029-10-13
Also published as: CN102040641B

Abstract

本发明公开了一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取方法。本发明中药组合物由黄芪、人参、丹参等11味中药组成，临床用于治疗冠心病、高血压病所致轻、中度充血性心力衰竭等有较好疗效，本发明从其活性部位提取分离得到了一个孕甾糖苷，首次报道其来源于中药香加皮，该提取分离方法可用于质量控制或者制备新的制剂。

Description

一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取分离方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取分离方法，具体地，涉及从一种中药组合物中提取分离Δ⁵-pregnene-3β，16β，20(R)-triol3-O-[2，-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-digitalopyranoslde]的方法。

背景技术

本发明中中药组合物包含如下原料药：黄芪、附子、人参或党参、丹参、葶苈子、香加皮或南五加皮、泽泻、玉竹、桂枝、红花、陈皮，该中药组合物是石家庄以岭药业股份有限公司研制的一个治疗中轻度慢性心衰的药物，临床用于治疗冠心病、高血压病所致轻、中度充血性心力衰竭等有较好疗效【[1]魏聪，贾振华，吴以岭，刘建勋.芪苈强心胶囊对兔实验性慢性心力衰竭心室重构的保护作用[J].疑难病杂志，2007，6(3)：144-146】。中国专利ZL 02146573.8公开了该中药组合物的组方和制备工艺以及用途。

化合物孕甾糖苷Δ⁵-pregnene-3β，16β，20(R)-triol3-O-[2，-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)β-D-cymaropyranoside]20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-digitalopyranoslde](简称S-4a)首次报道其来源于中药香加皮【[5]Hideji Itokawa，Junping Xu and Koichi Takeya.Pregnane Glycosides from an Antitumour Fraction of Periploca sepium[J].Phytochemistry，1988，27(4)：1173-1179】。

传统的中药质量控制技术多为经验式的主观评判和常规的理化及仪器分析，很难从根本上解决中药质量控制中的关键问题.随着现代工程技术的发展，一些先进的中药制药工程技术逐渐在中药质量控制中得以推广和应用，从中药中提取一些富有代表性的化合物，为新的质量控制方法提供了可能。

随着现代药剂学及有关药学科学的发展，新研究手段及现代技术应用于中药制剂的研究和生产，使中药制剂突破了常规制剂的传统观念。中药中的化合物的确定与分离，为中药制剂保证安全、有效、实用提供了物质依据。

发明内容

本发明目的是提供一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取分离方法；

所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：黄芪150-450份、附子40-120份、人参或党参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮或南五加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，所述孕甾糖苷的化合物结构为Δ⁵-pregnene-3β，16β，20(R)-triol3-O-[2，-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)β-D-cymaropyranoside]20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-digitalopyranoslde](简称S-4a)，分离方法如下：

a、按比例称取其中黄芪、人参或党参、葶苈子、泽泻、香加皮，加入8倍量70％乙醇，浸泡30分钟，回流提取3小时，滤过，再加入8倍量70％乙醇，回流提取2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至在60℃测定相对密度为1.15-1.20，得醇提浸膏；

b、步骤a所得醇提浸膏冷藏过夜，板框过滤，加水稀释至密度为0.1克药材/ml，得中药液；

c、大孔树脂加入4倍树脂体积的5％氢氧化钠，充分搅拌，浸泡，水洗至中性，加入95％乙醇浸泡、装柱，以两倍柱体积的95％乙醇冲洗，继水洗至无醇味，备用；

d、步骤b所得中药液以1倍柱体积/小时通过树脂柱，收集过柱液；

e、用4倍柱体积的水进行洗脱，收集洗脱液，与过柱液合并，减压浓缩呈浓浸膏，记为E1；继续用4倍柱体积的10％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩呈浓浸膏，记为E2；继续用4倍柱体积的30％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩呈浓浸膏，记为E3；继续用4倍柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩呈浓浸膏，记为E4；继续用4倍柱体积的70％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩呈浓浸膏，记为E5；继续用4倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩呈浓浸膏，记为E6；

f、取E4部分经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇-水洗脱，分份收集，合并相同流份；

g、将步骤f中第四个相同流份减压浓缩干燥，再经开放C18柱色谱，依次用50％甲醇、甲醇洗脱，甲醇部分经HPLC制备纯化，即得目标化合物。

其中步骤c所述大孔树脂，优选为AB-8树脂。

该方法优选为如下步骤：

b、醇提浸膏冷藏过夜，板框过滤，加水稀释至密度为0.1克药材/ml，得中药液；

c、AB-8树脂加入4倍树脂体积的5％氢氧化钠，充分搅拌，浸泡，水洗至中性，加入95％乙醇浸泡、装柱，以两倍柱体积的95％乙醇冲洗，继水洗至无醇味，备用；

f、取E4部分20g溶解于60％甲醇中，与90g薄层硅胶拌匀后烘干，上样于10×30cm的硅胶干柱，依次用9∶1的氯仿-甲醇2000mL，18∶3的氯仿-甲醇6000mL，9∶2的氯仿-甲醇7000mL，65∶35∶10的氯仿-甲醇-水6000mL梯度洗脱，每份收集100mL，共收集150份，最后用纯甲醇洗脱2000mL；TLC检测各流份，10％浓硫酸显色，分别将相近斑点的流份合并，得到16个部分分别标记为Fr1-Fr16；

g、Fr4溶解于50％甲醇中，上样于50％甲醇平衡的3×32cm的C18柱色谱，依次用50％甲醇洗脱2000mL，甲醇洗脱500mL，分份收集，每份80mL；HPLC-ELSD检测，合并相同流份，其中甲醇洗脱部分再经制备HPLC即得目标化合物。

本发明中所述中药组合物组方中的其它药味的提取和浓缩等制备工艺在中国专利ZL 02146573.8均已公开，本发明中化合物S-4a仅是从本发明中药组合物中醇提部分分离得到，但该中药组合物密不可分，缺少某些药味可能会丧失临床价值。

本发明所述中药组合物原料药的重量份比例优选为：

黄芪450份、附子112.5份、人参或党参225份、丹参225份、

葶苈子150份、香加皮或南五加皮180份、泽泻225份、玉竹75份、

桂枝90份、红花90份、陈皮75份。

或者

黄芪250份、附子112.5份、人参或党参200份、丹参120份、

葶苈子135份、香加皮或南五加皮150份、泽泻200份、玉竹60份、

桂枝75份、红花75份、陈皮60份。

或者

黄芪150份、附子40份、人参或党参225份、丹参225份、

葶苈子50份、香加皮或南五加皮180份、泽泻75份、玉竹75份、

桂枝30份、红花90份、陈皮25份。

为阐明本发明提取分离方法所得化合物的结构，对实施例中所的化合物(表述为化合物a)，进行如下鉴定：

1、实验条件

各种NMR实验均在Varian ^UNITYINOVA 600超导核磁共振谱仪上完成，¹H观测频率为599.66MHz，¹³C观测频率为150.78MHz，样品以pyridine-d₅为溶剂，使用5mm NMR探头，NMR实验在27℃进行，氢谱以TMS为内标，碳谱以pyridine-d₅为内标(δ＝149.9，135.5，123.5)。¹H谱谱宽12004.8Hz，碳谱谱宽36003.6Hz。二维谱包括¹H-¹H COSY，HSQC，HMBC谱，均采用标准脉冲程序。¹H-¹H COSY谱宽为：5700.0Hz×5700.0Hz，采样矩阵点数分别为：2048×2048；HSQC谱宽为5800Hz×28000Hz，采样矩阵点数分别为2048×128。HMBC谱宽分别为5800Hz×34000Hz，采样矩阵点数分别为2048×256。

2、结果分析

化合物a为白色无定形粉末。正离子FAB-MS m/z：1187.5[M+Na]+，1165.5[M+H]⁺，1003.5[M+H-162]⁺，801.3[M+H-162-202]⁺，639.2[M+H-162-202-162]⁺，299.1[M+H-162-202-162-144-160-36]⁺。结合化合物a的¹H和¹³C NMR数据可知其分子式为C₅₆H₉₂O₂₅，分子量为1164。在¹HNMR中：δ0.94(3H，s，CH₃-19)，1.03(3H，s，CH₃-18)，1.65(3H，d，J＝6.5Hz，CH₃-21)，分别为苷元上3个甲基的特征信号；δ1.45(3H，d，J＝7.2Hz，CH₃-6′″)，1.46(3H，d，J＝6.6Hz，CH₃-6′)，1.56(3H，d，J＝6.0Hz，CH₃-6″)，2.12(3H，s，2″-COCH₃)，3.35(3H，s，3″-OCH₃)，3.51(6H，s，3′-OCH₃和3′″-OCH₃)，分别是加拿大麻糖和洋地黄糖上的甲基和甲氧基；δ4.61(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′″)，4.72(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″)，5.26(1H，d，J＝9.6Hz，H-1′)，5.35(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″″)和5.44(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′″″)为5个糖基的端基质子信号，糖端基氢的J值大于7，说明均为β构型，糖上其它质子信号大都集中在δ3.5～5.0之间【张洁，马百平，康利平et.滇黄精中两个呋甾皂苷的NMR研究[J].波谱学杂志，2006，23(1)：30-40；Agrawal P K.NMR spectroscopy inthe structural elucidation of oligosaccharides and glycosides[J].Phytochemistry，1992，31(10)：3307-3330；杨秀伟，崔育新，刘雪辉.卷丹皂苷A和甾体皂苷的NMR特征[J].波谱学杂志，2002，19(3)：301-308.】；δ5.28(1H，br s，H-6)是C-5和C-6双键的特征质子信号；δ3.78(1H，m，H-3)，4.26(1H，m，H-20)和5.11(1H，m，H-16)为苷元含氧碳上的特征质子信号。在¹³C NMR中：δ96.3(C-1′)，103.6(C-1″)，104.3(C-1′″)，104.1(C-1″″)和105.3(C-1′″″)是糖的端基碳信号；δ140.7(C-5)和122.1(C-6)是C-5和C-6双键的特征信号。以上主要数据均与S-4a【Hideji Itokawa，Junping Xu and Koichi Takeya.PregnaneGlycosides from an Antimmour Fraction of Periploca sepium[J].Phytochemistry，1988，27(4)：1173-1179】一致，但未见其氢信号的全归属报道。

综合利用COSY，HMQC和HMBC谱，将化合物a的所有碳氢信号进行了确切的归属。通过糖的端基氢和甲基氢等特征信号为出发点，通过COSY将氢信号进行确切位置归属，再通过HSQC确定碳的位置，中间辅以HMBC解决一些信号重叠和连接中断的问题，从而确定各个自旋系统的所有碳氢信号，最后通过HMBC把糖与糖之间和苷元与糖联系起来，确定化合物的结构，见图1。

苷元上，在COSY谱中，从特征的角甲基质子信号δ1.65(CH₃-21)出发，可以依次看到如下相关关系：δ1.65→δ4.25(H-20)→δ1.73(H-17)→δ5.11(H-16)→δ1.40和δ2.32(H-15)→δ1.04(H-14)→δ1.50(H-8)→δ0.89(H-9)→δ1.35和1.37(H-11)→δ1.17和1.84(H-12)；从特征的烯基质子出发，有如下相关信号：δ5.28(H-6)→δ1.56和1.92(H-7)→δ1.50(H-8)；从特征的3位含氧碳原子上质子信号出发，可得到如下相关信号：δ2.34和2.48(H-4)←δ3.78(H-3)→δ1.70和2.07(H-2)→δ0.94和1.70(H-1)。在HMBC谱上，δ1.65(CH₃-21)与碳信号δ62.7(C-17)和79.4(C-20)远程相关，δ1.03(CH₃-18)与碳信号δ39.6(C-13)，41.2(C-12)，54.3(C-14)和62.7(C-17)远程相关，δ0.94(CH₃-19)与碳信号δ36.9(C-10)，37.4(C-1)，50.3(C-9)和122.1(C-5)远程相关，见图2。从而可以将苷元上的所有碳氢信号确切归属，见表1，确定苷元的结构为：Δ⁵-pregnene-3β，16β，20(R)-triol【Hideji Itokawa，Junping Xu andKoichi Takeya.Pregnane Glycosides from an Antitumour Fraction of Periplocasepium[J].Phytochemistry，1988，27(4)：1173-1179】。其中16位20位的构型是由碳原子的化学位移δ39.6(C-13)，54.3(C-14)，35.7(C-15)，71.5(C-16)，62.7(C-17)，79.4(C-20)和22.2(C-21)确定的(16α，20(S)构型化合物的化学位移位δ42.4(C-13)，53.6(C-14)，35.8(C-15)，77.3(C-16)，68.5(C-17)，82.0(C-20)和23.8(C-21))【Hideji Itokawa，Junping Xu and Koichi Takeya.PregnaneGlycosides from an Antitumour Fraction of Periploca sepium[J].Phytochemistry，1988，27(4)：1173-1179；Kaoru Umehara，Nacomi Samm，Iiua and Hiroko Satoh，et.al.Studies on differentiation Inducers.V.Steroid glycosides from periplocaeradicis cortex[J].Chem Pharm Bull，1995，43(9)：1565-1568.】。

从洋地黄糖的端基氢信号δ4.72(H-1″)出发，在COSY谱中，可以看到如下关系，δ4.72→δ5.82→δ3.53→δ4.08依次相关，见图3，δ1.56和δ3.77相关；在HMBC谱中，δ1.56的甲基信号分别于δ67.8和δ71.5两个碳信号有远程相关，δ3.35的甲氧基信号与δ82.3的碳有远程相关，见图2，δ5.82的氢信号和δ2.12的甲基信号分别与δ169.7的碳有远程相关；在HSQC谱中，δ4.08和δ67.8相关，这样就确定了这个糖上所有氢质子的确切位置和一个乙酰基的连接位置；再通过HSQC谱，即可确定这个糖上所有碳氢的信号：δ4.72(H-1″)/103.6(C-1″)，5.82(H-2″)/71.8(C-2″)，169.7(O＝C-2″)，2.12/56.2(-COCH₃-2″)，3.53(H-3″)/82.3(C-3″)，3.35/56.5(OCH₃-3″)，4.08(H-4″)/67.8(C-4″)，3.77(H-5″)/71.5(C-5″)，1.56(H-6″)/17.2(C-6″)。

从加拿大麻糖的端基氢信号δ5.26(H-1′)出发，在COSY谱中，可以看到如下关系，δ5.26和δ1.89相关，δ2.32→δ4.07→δ3.53→δ4.23→δ1.46依次相关；在HMBC谱中，δ1.46的甲基信号分别于δ68.8和δ84.2两个碳信号有远程相关，δ3.51的甲氧基信号与δ77.5的碳有远程相关；这样就可将这个糖上所有氢的位置和所连甲氧基的位置进行确切归属，再通过HSQC得到对应碳的信号，就可全归属加拿大麻糖上所有碳氢信号，见表1和图2。

从葡萄糖的端基氢信号δ5.44(H-1′″″)出发，在COSY谱中，可以看到如下关系，δ5.44→δ4.02→δ4.47→δ4.17→δ4.12→δ4.38→δ4.57依次相关，实际归属中，由于δ4.04～4.26之间氢信号重叠严重，并不能确切δ4.17→δ4.12的相关关系，见图3；但在HSQC谱中，六碳糖中比较特征的6位碳信号δ63.0与δ4.38和δ4.57两个氢信号相关，在HMBC谱中，碳信号δ63.0与δ4.17的氢信号远程相关，氢信号δ4.38与δ72.1和78.4两个碳有远程相关；再通过HSQC得到相互对应的碳氢信号，就可全归属加这个葡萄糖糖上所有碳氢信号。

同样的方法，我们可以分别通过端基氢δ4.61(H-1′″)和5.35(H-1″″)出发，归属另一个洋地黄糖和葡萄糖的所有碳氢信号。具体见表1。

表1 化合物a的核磁数据

在HMBC谱中，端基质子信号4.61(H-1′″)、4.72(H-1″)、5.26(H-1′)、5.35(H-1″″)和5.44(H-1′″″)分别与碳信号δ79.4(C-20)、84.2(C-4′)、77.4(C-3)、75.0(C-2′″)和69.8(C-6″″)有远程相关，从而确定了糖基之间及糖链和苷元之间的连接位置，见图1。综合以上信息，化合物a的结构确定为Δ5-pregnene-3β，16β，20(R)-triol3-O-[2，-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-digitalopyranoslde]。

附图说明

图1化合物a的主要HMBC相干关系。

图2化合物a的HSQC低场局部放大图。

图3化合物a的¹H-¹H COSY低场局部放大图

具体实施方式

实施例1：

原料药重量：

黄芪450g 附子112.5g 人参225g 丹参225g 葶苈子150g

香加皮180g 泽泻225g 红花90g 玉竹75g 陈皮75g 桂枝90g

提取分离方法：

f、取E4部分20g溶解于60％甲醇中，与90g薄层硅胶拌匀后烘干，上样于10×30cm的硅胶干柱，依次用9∶1的氯仿-甲醇2000mL，18∶3的氯仿-甲醇6000mL，9∶2的氯仿-甲醇7000mL，65∶35∶10的氯仿-甲醇-水6000mL梯度洗脱，每份收集100mL，共收集150份，最后用纯甲醇洗脱2000mL；TLC检测各流份，10％浓硫酸显色，分别将相近斑点的流份合并，得到16个部分分别标记为Fr1-Fr16，其中Fr4得到475.1mg；

g、Fr4溶解于50％甲醇中，上样于50％甲醇平衡的3×32cm的C18柱色谱，依次用50％甲醇洗脱2000mL，甲醇洗脱500mL，分份收集，每份80mL；HPLC-ELSD检测，合并相同流份，其中甲醇洗脱部分再经制备HPLC即得目标化合物15.9mg。

实施例2：

原料药重量：

黄芪150g 附子40g 人参225g 丹参225g 葶苈子50g

香加皮180g 泽泻75g 玉竹75g 桂枝30g 红花90g 陈皮25g

提取分离方法：

b、醇提浸膏冷藏过夜，板框过滤，加水稀释至密度为0.1克药材/mi，得中药液；

c、聚苯乙烯树脂加入4倍树脂体积的5％氢氧化钠，充分搅拌，浸泡，水洗至中性，加入95％乙醇浸泡、装柱，以两倍柱体积的95％乙醇冲洗，继水洗至无醇味，备用；

f、取E4部分20g溶解于60％甲醇中，与90g薄层硅胶拌匀后烘干，上样于10×30cm的硅胶干柱，依次用9∶1的氯仿-甲醇2000mL，18∶3的氯仿-甲醇6000mL，9∶2的氯仿-甲醇7000mL，65∶35∶10的氯仿-甲醇-水6000mL梯度洗脱，每份收集100mL，共收集150份，最后用纯甲醇洗脱2000mL；TLC检测各流份，10％浓硫酸显色，分别将相近斑点的流份合并，得到16个部分分别标记为Fr1-Fr16，其中Fr4得到455.8mg；

g、Fr4溶解于50％甲醇中，上样于50％甲醇平衡的3×32cm的C18柱色谱，依次用50％甲醇洗脱2000mL，甲醇洗脱500mL，分份收集，每份80mL；HPLC-ELSD检测，合并相同流份，其中甲醇洗脱部分再经制备HPLC即得目标化合物12.7mg。

实施例3：

处方：

黄芪250g 附子112.5g 党参200g 丹参120g 葶苈子135g

南五加皮150g 泽泻200g 玉竹60g 桂枝75g 红花75g 陈皮60g

提取分离方法：

f、取E4部分20g溶解于60％甲醇中，与90g薄层硅胶拌匀后烘干，上样于10×30cm的硅胶干柱，依次用9∶1的氯仿-甲醇2000mL，18∶3的氯仿-甲醇6000mL，9∶2的氯仿-甲醇7000mL，65∶35∶10的氯仿-甲醇-水6000mL梯度洗脱，每份收集100mL，共收集150份，最后用纯甲醇洗脱2000mL；TLC检测各流份，10％浓硫酸显色，分别将相近斑点的流份合并，得到16个部分分别标记为Fr1-Fr16，其中Fr4得到478.3mg；

g、Ft4溶解于50％甲醇中，上样于50％甲醇平衡的3×32cm的C18柱色谱，依次用50％甲醇洗脱2000mL，甲醇洗脱500mL，分份收集，每份80mL；HPLC-ELSD检测，合并相同流份，其中甲醇洗脱部分再经制备HPLC即得目标化合物16.7mg。

Claims

1.一种中药组合物中一个孕甾糖苷的提取分离方法，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：黄芪150-450份、附子40-120份、人参或党参75-225份、丹参75-225份、葶苈子50-150份、香加皮或南五加皮60-180份、泽泻75-225份、玉竹25-75份、桂枝30-90份、红花30-90份、陈皮25-75份，该孕甾糖苷的结构为Δ⁵-pregnene-3β，16β，20(R)-triol 3-O-[2，-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-digitalopyranoslde]，其特征在于该孕甾糖苷是经如下步骤制得的：

2.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于该分离方法中步骤c所述大孔树脂为AB-8树脂。

3.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于该分离方法经如下步骤：

4.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪450份、附子112.5份、人参或党参225份、丹参225份、

桂枝90份、红花90份、陈皮75份。

5.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪150份、附子40份、人参或党参225份、丹参225份、

葶苈子50份、香加皮或南五加皮180份、泽泻75份、玉竹75份、

桂枝30份、红花90份、陈皮25份。

6.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

黄芪250份、附子112.5份、人参或党参200份、丹参120份、

桂枝75份、红花75份、陈皮60份。