CN102038003A - 蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌的应用，特别涉及蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用。在污染了致病菌的新鲜蔬菜中喷洒蛭弧菌游泳体菌液或使其浸泡在蛭弧菌游泳体菌液中，使其浓度至少达到101pfu/mL。在加工设备及操作环境中喷洒或涂擦蛭弧菌游泳体菌液，使其浓度至少达到101pfu/mL。应用中致病菌清除率均在99％以上。本发明适合推广应用于所有蔬菜中，不仅可提高消费者生食即食蔬菜的安全系数，保护消费者的健康，也为蔬菜的绿色加工生产提供保障。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及细菌的应用，提供了蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的新应用。
背景技术
食品安全已经成为全世界共同关注的问题，世界卫生组织(WHO)将食品安全看作是一个世界性的挑战。而保证食品的安全和卫生，目的就是要防止食物中毒的发生。目前，细菌性食物中毒的发病人数和发生件数在我国各类食物中毒中都占第1位，据我国近五年食物中毒统计资料表明，细菌性食物中毒占食物中毒总数的50％左右。
诱发细菌性食物中毒的细菌主要是大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。而对于新鲜蔬菜来说，大肠埃希氏菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等为常见污染的致病菌，其中大肠杆菌、沙门氏菌最多。
新鲜生食蔬菜主要有香葱、香菜、番茄、黄瓜等，这些蔬菜在日常食用前基本不会经过杀菌，简单清洗后直接食用，这样就导致了很多生食蔬菜过程中细菌性食物中毒的发生。近几年，市面上出现一种即食蔬菜，为许多市民所喜爱。其原料蔬菜可以采用除叶菜类的各种蔬菜，包括冬笋、藕、土豆、香芹、胡萝卜等等。其加工生产流程主要是：新鲜蔬菜-清洗-加工-包装。
因此，清洗过程杀菌就显得尤为重要。而目前新鲜蔬菜的清洗过程，主要有紫外线杀菌、臭氧杀菌、化学药品杀菌以及酸电解水等物理除菌方法。这些除菌方法都有一定的局限性，物理方法破坏 蔬菜本身的营养成分，而化学杀菌剂不可避免的在蔬菜中的残留还容易导致食物中毒的发生，其导致工业三废的排放也极大的污染了环境。除此之外，所有这些除菌方法都不够经济方便快捷，不能满足新鲜生食蔬菜即洗即食的要求，也不能满足即食蔬菜加工低成本高利润的要求，因此研究生物的方法清除蔬菜中常见致病菌，就能从保障蔬菜的营养价值、安全性、环保、经济效益四方面提供一种有效的新技术。
噬菌蛭弧菌(以下简称蛭弧菌)是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌。广泛存在于自然水体，污水及土壤中，并能从动物或人体粪便中检出。1962年首次发现于菜豆枯萎病假单胞菌体中，命名为Bdellovibrio bacteriovorus，它比通常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用，但它不是病毒，它具有细菌的一切形态特征，单细胞，呈弧形或逗点状，有时呈螺旋状，大小0.2～0.6×0.8～1.2微米，端生鞭毛，多为一根。革兰氏染色呈阴性，可以裂解致病菌或潜在致病性细菌。我们的最新研究表明，有的蛭弧菌菌株可以裂解包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等一些常见食源性致病菌。蛭弧菌的生活史分两个阶段：自由生活，能运动，不进行增殖的游泳体阶段和在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式，蛭弧菌在游泳体阶段，识别并与宿主发生不可逆结合，然后侵入宿主。蛭弧菌进入宿主菌细胞周质空间后，宿主细菌在30分钟内即停止呼吸作用，死亡；而蛭弧菌则分泌多种酶，通过降解宿主细胞的大分子成为单体，然后摄入用于其生物大分子的合成。随着细胞增殖和水解酶产生，使宿主细胞壁膜被破坏，从而裂解释放出蛭弧菌。
已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工 业还是在(海洋)水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如：在国外，Lenz and Hespell(1978)研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R. W.，Hespell R. B.Attempts to growbedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives ofMicrobiology，1978，119(3)：245-248]。在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌BDH2102对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1)：7-11]。
蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般几秒钟内即可完成。相对于蛭弧菌蛭质体而言，虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点，但用蛭弧菌游泳体消除蔬菜中常见致病菌具有起效快、活力强的优点。从而克服了蔬菜食用前或加工过程清洗时杀菌不彻底以及物理化学杀菌方法的不良影响等弊端。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜清洗过程、加工设备及加工环境中致病菌的新应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用。
所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。
所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用是将蔬菜在蛭弧菌游泳体菌液中浸泡15-45min或者在蔬菜的加工环境中喷洒蛭弧菌游泳体菌液，喷洒用量为10～100mL/m2。
所述蛭弧菌游泳体菌液浓度至少为101pfu/mL，优选101～106 pfu/mL。
所述蛭弧菌游泳体菌液的制备方法为：
接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25～35℃下，以150～300rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，上清经16000～18000rpm离心15～20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为1011～1012pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。
蛭弧菌BDFM05进行负染后于电子显微镜下进行形态观察：BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1.43×0.53μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少2μm；所述蛭弧菌BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2～3mm的透明圆形噬菌斑。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明蛭弧菌游泳体菌液在蔬菜清洗中，消除其携带菌落总数及常见致病菌应用效果显著。
如图1至图5所示，菌落总数及各致病性的消除率均可达99％以上。
2、用蛭弧菌游泳体菌液消除食用前、加工过程蔬菜中菌落总数及常见致病菌安全性好。
蛭弧菌游泳体菌液消除蔬菜中常见致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合应用于蔬菜食用前、加工清洗过程中，以抑制或清除蔬菜表面的致病菌，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作 用。不仅可提高消费者食用蔬菜的安全系数，保护消费者的健康，也为即食蔬菜的绿色加工生产提供保障。
3、用蛭弧菌游泳体菌液消除蔬菜食用前、加工过程的常见致病菌可以最大程度的保存蔬菜的营养价值，使新鲜生食蔬菜食用起来更安全，使即食蔬菜加工前带菌基数更低。
4、本发明为消除蔬菜所携带的食源性致病菌提供一种新的方法，并适合推广应用于所有蔬菜食用、加工前的预处理过程，特别有利于减少或消除化学药物杀菌剂残留的可能，确保蔬菜的优质、安全，从根本上避免食用蔬菜食物中毒事件的发生。
5、在新鲜生食蔬菜食用前和即食蔬菜加工前清洗过程使用蛭弧菌游泳体除菌，不仅满足生食蔬菜即洗即食方便快速的特点，还能够节省即食蔬菜加工前清洗设备投资成本，节约能源，保护环境。
6、本发明所用蛭弧菌游泳体消除蔬菜中常见致病菌具有起效快、活力强的优点。
附图说明
图1不同浓度蛭弧菌游泳体菌液做为除菌剂在消除蔬菜表面菌落总数的试验效果比较图。
图2不同浓度蛭弧菌游泳体菌液做为除菌剂在消除蔬菜表面致病菌的试验效果比较图。
图3蔬菜施加103pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液时致病菌浓度对数值-时间图；
图4蔬菜施用10pfu/ml蛭弧菌游泳体菌液消除大肠杆菌时的致病菌残留率-时间图；
图5加工设备及环境喷洒蛭弧菌游泳体菌液时菌落总数残留率-喷洒量图。
图6各常规杀菌剂在蔬菜清洗中消除其携带致病菌时各致病菌浓度平均值的对数值-时间图。
图7蛭弧菌游泳体菌液在蔬菜清洗中消除其携带大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeriamonocytohenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)时的致病菌浓度对数值-时间图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
蛭弧菌游泳体菌液在黄瓜清洗过程，对其携带菌落总数、致病菌的消除作用。
蛭弧菌游泳体优选通过申请号“200710031166.X”，的发明专利公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备，具体步骤如下：
步骤一、蛭弧菌游泳体菌液的制备
蛭弧菌游泳体通过申请号“200710031166.X”，的发明专利公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行制备，具体步骤如下：
取103pfu/mL蛭弧菌BDFM0510mL，与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)菌液混合后加入到含有100mL DNB培养基的三角锥瓶中，恒温摇床250rpm、28℃培养24h。培养物经过6000rpm、4℃离心20min，取上清液，再16000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清，5mL pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，制成1011～1012pfu/mL蛭弧 菌游泳体菌液，待用。
步骤二、蛭弧菌游泳体菌液对蔬菜携带致病菌的消除
(1)致病菌的制备
于4瓶含100mL普通营养肉汤培养基中，分别接种10mL x1010cfu/mL大肠杆菌(Escherichia coli，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.137)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.237)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.228)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，购于广东省微生物研究所，编号GIM1.142)，摇床培养，160rpm 28℃培养12-16h，增殖培养液经6000rpm、4℃离心20min，弃上清液，沉淀菌体用5mL无菌pH7.2的PBS(磷酸盐缓冲溶液)悬浮，得到浓度为109cfu/ml的原液，最后制备上述四种菌的混合液，每种菌的终浓度为105cfu/ml。
(2)致病菌消除
取新鲜黄瓜，试验设对照组和试验组。其中对照三个黄瓜，为三个平行样，剩下黄瓜为试验组，所有对照组和试验组的黄瓜先经75％酒精杀菌，后浸泡到(1)中制备好的500mL混合菌液中1min，取出沥干后，试验组的黄瓜浸渍于蛭弧菌游泳体菌液中，菌液浓度分别为101pfu/mL、103pfu/mL、105pfu/mL、106pfu/mL，每浓度均有三个平行样，对照组的黄瓜用清水(常规方法)浸泡，浸泡时间为30min。具体检测方法是：从每组试样中取出黄瓜放入无菌搅碎机中同时加入适量的无菌蒸馏水搅碎，震荡均匀后取原液依次用无菌蒸馏水进行10倍稀释后，取0.1mL涂布检测。根据GB4789.2-2010菌落总数用营养琼脂培养基检测、根据国标4789.38-2008大肠杆菌用VRB-MUG(中性红-胆盐培养基)培养基检测、根据国标4789.4-2010 沙门氏菌用BS(亚硫酸铋琼脂)培养基检测、根据国标4789.30-2010单增李斯特菌用李斯特氏菌显色培养基检测、根据国标4789.10-2010金黄色葡萄球菌用Baird-Parker琼脂平板检测。
检测结果如图1，2、3所示：
蛭弧菌游泳体菌液消除致病菌的残留量要远远低于单纯用自来水冲洗的效果，而且蛭弧菌游泳体浓度越高，消除致病菌的效果越好，最低浓度101pfu/mL对于致病菌的消除率已经达到96％，当蛭弧菌浓度达103pfu/mL及以上时，对致病菌的消除率可达99.99％。而且蛭弧菌游泳体在蔬菜表面通过裂解而消除病原菌，不会对水果的质量产生影响，也不会导致杀菌剂在水果中的残留。杀菌快速，高效，安全使得蛭弧菌游泳体在消除蔬菜携带的致病菌方面应用潜力广大，将其做为一种蔬菜的新型的清洗方法既能达到杀菌的目的，也能保护蔬菜制品的食用安全。
实施例2
蛭弧菌游泳体菌液在清洗过程消除鲜藕表面大肠杆菌的应用
试验具体步骤及条件如下：
蛭弧菌游泳体制备方法同例1。
大肠杆菌菌液制备方法同例1，稀释到105cfu/mL备用。
取新鲜藕，试验设对照和实验组，每组三个平行，每个平行用藕一根。所有对照组和试验组的鲜藕先经75％酒精杀菌，后浸泡到制备好的500mL混合体菌液中1min，取出沥干后，实验组喷洒10pfu/mL蛭弧菌游泳体液5mL，对照组喷清水，室温放置30min，每隔10min取样检测一次，具体方法是取经无菌生理盐水湿润的灭菌拭子(棉花签)在藕表面上均匀的涂抹4次后，置含无菌生理盐水的无菌离心管中振荡、混匀，然后采用平板涂布方法检测。检测 检测方法同例1。
结果如图4所示，在使用蛭弧菌游泳体菌液(BDFM05)的实验组，在30min的试验结束时，大肠杆菌已检测不到，即完全消除；而施用清水的对照组，大肠杆菌的残留率仍达到85％。
实施例3
蛭弧菌游泳体菌液应用于蔬菜加工过程应用设备、加工环境的消毒杀菌。
试验包括以下具体步骤及其条件：
步骤一：同实施例1的步骤一
步骤二：致病菌消毒的应用实验。
对蔬菜加工车间地面和墙体、运输蔬菜的传送带及蔬菜清洗设备的表面，均匀喷洒浓度为10pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液，喷洒使用量则按试验组的不同分别为10mL/m2、30mL/m2、50mL/m2、70mL/m2、或100mL/m2，每天喷洒一次，连续喷洒两天，对照喷洒清水。具体检测方法是用湿的无菌棉签在加工设备表面或车间地、墙表涂擦涂取样，再用平板培养计数。
如图5所示，在随后的环境病菌检测中，喷洒清水的对照组各种致病菌均有检出，菌落总数的残留率依然很高，达到78％，而在喷洒蛭弧菌游泳体的试验组中，仅在喷洒量为10mL/m2组中检测到1～2cfu/mL的沙门氏菌，其他喷洒量的试验组没有检测到常见致病菌。本试验研究的结果表明蛭弧菌在消除蔬菜加工过程中致病菌方面的效果显著，可确保蔬菜产品品质及安全。由此可见，蛭弧菌作为杀菌剂可以广泛地推广应用于蔬菜的清洗加工过程中。
实施例4
蛭弧菌游泳体菌液与常规蔬菜杀菌剂的比较
常规蔬菜杀菌剂有氯系杀菌剂(次氯酸钠、漂白粉、漂粉精等)、电解酸性离子水、二氧化氯、臭氧、过氧化物与氯氧化物混合。
本例以新鲜小白菜为例，蛭弧菌采用BDFM05，蔬菜用75％酒精杀菌后，先将新鲜蔬菜浸泡到制备好的500mL致病菌混合液中1min，取出沥干，再将其浸泡到500mL各种杀菌剂及蛭弧菌游泳体菌液中，40min。初始每隔1min检测一次，10min后，每隔10min检测一次。实施方法同例2，具体检测方法同例1。
蛭弧菌游泳体菌液制备同例1，浓度为10pfu/mL。致病菌混合液制备方法同例1，各致病菌浓度为105cfu/mL，常规杀菌剂杀菌图中致病菌取各致病菌数平均值。
结果如图6及图7所示。从图6中可以看出常规杀菌剂起效快，一般2min内可基本上杀灭病原菌。从图7中可以看出单株蛭弧菌游泳体菌液30min内可杀灭99％的致病菌，40min时致病菌已检测不到。蛭弧菌游泳体菌液通过菌裂解消除致病菌需要一个过程，所以起效慢，但是20min内可杀灭75％的病原菌。蛭弧菌游泳体菌液通过裂解消除致病菌属于生物防治，使用安全不会对环境造成污染，也不会对蔬菜品质造成影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用。
2.根据权利要求1所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。
3.根据权利要求1所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用是将蔬菜在蛭弧菌游泳体菌液中浸泡15-45min。
4.根据权利要求1所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用是在蔬菜的加工环境中喷洒蛭弧菌游泳体菌液，喷洒用量为10～100mL/m2。
5.根据权利要求3或4所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌游泳体菌液浓度至少为101pfu/mL。
6.根据权利要求5所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌游泳体菌液浓度为101～106pfu/mL。
7.根据权利要求1所述蛭弧菌游泳体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌游泳体菌液的制备方法为：
接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25～35℃下，以150～300rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，上清经16000～18000rpm离心15～20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为1011～1012pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110504 |