CN102037933B - 一种饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法，属于昆虫饲养技术领域。方法包括：(1)合成培养基的配制与灭菌；(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置；(3)烟粉虱成虫的吸取及释放；(4)饲养及观察等步骤。较能真实地模拟叶片在植株上生长时的状况，能延长叶片的新鲜度，培养基不易发霉，有效避免烟粉虱试虫的非毒力死亡，在常规毒力测定的72小时内能保证对照烟粉虱成虫的正常存活，达到实验试虫的标准化。本方法能适用于花卉、蔬菜和经济作物饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的需求。
Description
技术领域
本发明涉及昆虫饲养技术领域，尤其涉及一种用于生物测定的烟粉虱成虫饲养方法。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属同翅目Homoptera粉虱科Aleyrodidae，原产于北非和中东地区，是热带、亚热带保护地及大田作物的主要害虫之一(Brown等，1995)。烟粉虱主要通过吸食植物汁液、分泌蜜露招致霉菌污染叶面影响光合作用、传播植物病毒和诱导作物产生非正常生理反应等为害植物的正常生长(Davidson等，2000)，其中其诱发植物病毒病所造成的危害比其它危害要严重得多(冯兰香等，2001)，受其危害所造成的粮食和经济作物损失可达30-100％(Brown，1994)。
截至2005年，世界范围内共描述至少有26种烟粉虱生物型，而我国至少存在6种烟粉虱生物型(B、Q、ZHJ-1、ZHJ-2、ZHJ-3和FJ-1)(Wan等，2009)。目前，保守估计浙江省每年因烟粉虱危害造成的损失达2亿元，而且烟粉虱在浙江一带还有进一步加重为害与扩散蔓延的趋势，对蔬菜、花卉和棉花等作物生产构成严重威胁(万方浩等，2009)。化学防治因具有防治效果显著、杀虫范围广和便于使用等优点，仍然是目前控制烟粉虱的主要手段。烟粉虱化学防治技术研究必然离不开要对其进行毒力测定，而琼脂保湿浸叶法是目前国内外普遍采用的一种烟粉虱成虫毒力测定的方法(Nauen等，1996；刘燕等，2010；文吉辉等，2008；宋晓宇等，2006)。然而，将琼脂保湿浸叶法应用在花卉、蔬菜和经济等作物上时，往往会产生以下问题：例如将叶片剪成圆形叶盘并直接贴放在琼脂面上后，既容易导致琼脂的发霉(2天)、又容易造成叶面叶肉的损伤及枯萎(2-3天)、且烟粉虱成虫也容易粘着在琼脂上导致死亡而影响测定的正确性等。因此，寻找一种能够较真实模拟叶片生长时的状态、既能适应烟粉虱成虫在自然状态下的飞行活动习性，又能延长完整叶片的保鲜时间，且能降低琼脂污染率及提高试虫安全性的烟粉虱成虫的饲养方法，是本技术领域迫切希望解决的问题。关于其中应用合成培养基和插叶保鲜饲养烟粉虱成虫的方法尚未见有报道。
发明内容
本发明目的是，针对传统琼脂保湿浸叶法所存在的琼脂容易发霉、叶片剪成圆形叶盘后容易造成叶肉损伤及枯萎、烟粉虱粘着在琼脂上的概率较大等缺陷，提供一种较能真实模拟叶片生长时的状况、能延长叶片保鲜期、降低琼脂污染率及提高试虫安全性的烟粉虱成虫的饲养方法，使试虫能达到标准化，保证实验结果的可靠性。
本发明目的通过以下技术方案得以实现。
一种饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)合成培养基的配制与灭菌：配制浓度为14-16g/L的琼脂溶液500mL后，再加入25-30mL由NH4NO320-25mg/L、KNO31-3mg/L、MgSO4·7H2O 1-3mg/L、KH2PO4 1-3mg/L、无水CaCl21-3mg/L并用水补足至1升的营养液，搅拌均匀即成合成培养基；将该合成培养基高压灭菌后，在超净工作台上将其分别倒入长度×直径×厚度为30mm×25mm×1.5mm的灭菌平底玻璃试管内，冷却后将该批玻璃试管放入灭菌、干燥后的广口玻璃瓶内，广口瓶用无菌塑料纸封口后，备用；
(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置：剪取试材鲜嫩叶片并保留叶柄长30-40mm；叶片按试验设计进行药剂处理后，将叶柄浸泡入50％多菌灵可湿性粉剂500-1000倍稀释液中10-20s进行消毒；用镊子在步骤(1)每一玻璃试管的合成培养基内，按叶面向上将叶柄斜插入，以保持叶片在植株上的生长状况；
(3)烟粉虱成虫的吸取及释放：使用由橡胶管、玻璃管和隔虫纱布组成的简易吸虫器，吸取在人工气候箱内用相应试材植株饲养的羽化12-24h的烟粉虱成虫10-15头后，将吸虫器的吸口对准步骤(2)广口玻璃瓶内的叶面上，一次性吹入后，迅速用灭菌塑料纸封口、扎紧，并用解剖针扎数孔；
(4)饲养及观察：将步骤(3)玻璃瓶放入人工气候箱内，在光周期14:10，温度27℃，湿度70％条件下，分别饲养1h、24h、48h、72h后观察、记载瓶内烟粉虱的存活率，同时每天观察叶片保鲜及合成培养基的发霉情况，连续观察10天。
所述的叶片按试验设计进行的药剂处理，为用10％吡虫啉可湿性粉剂1000-3000倍稀释液进行的处理。
本发明的有益效果：
(1)本发明提出的应用合成培养基插整叶保鲜、饲养烟粉虱成虫的方法，基本实现了叶片在植株上生长状态的模拟，经灭菌的合成培养基辅以消毒后扦插的完整叶片能延长叶片的新鲜度(第5天开始才有叶片卷曲)，并使培养基不易发霉(第6天开始培养基才有发霉)，从而能在常规药剂毒力测定的72小时内保证了对照烟粉虱成虫的正常存活，达到了实验试虫的标准化要求；
(2)本发明通过使用小表面积的平底玻璃试管(长度×直径×厚度为30mm×25mm×1.5mm)作为合成培养基的容器与扦插叶片的支架，能有效避免以往因烟粉虱粘着在琼脂上而导致的死亡，并且还能节省琼脂的用量；
(3)本发明在琼脂中加入了由NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、无水CaCl2及水组成的营养液后，既增加了合成培养基的营养成分，有利延长叶片的保鲜期，也提高了培养基的粘着力，能方便试材叶柄的插入、固定倾斜角度、且不开裂；
(4)本方法从第6天开始才有培养基发霉现象、第5天开始才有叶片卷曲(见表1)，充分保证72h之内对照烟粉虱的正常存活，也显著避免了烟粉虱成虫如粘着于培养基而导致的非毒力死亡(见表2)，使实验数据更具可靠性；
(5)本发明方法能广泛适用于花卉、蔬菜和经济作物等有柄植物对烟粉虱成虫的生物毒力测定。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明方法作进一步的详细描述，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。
实施例1：(一品红饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法)
(1)合成培养基的配制与灭菌：称量7g琼脂加热、搅拌溶解在500mL蒸馏水中，配制成琼脂溶液；再加入25mL由NH4NO320mg/L、KNO33mg/L、MgSO4·7H2O2mg/L、KH2PO42mg/L、无水CaCl21mg/L并用水补足至1升的营养液，搅拌均匀即成合成培养基；将该合成培养基在121℃，进行15-20分钟高压灭菌后，在超净工作台上将其分别倒入长度×直径×厚度为30mm×25mm×1.5mm的灭菌平底玻璃试管内，冷却后将该玻璃试管放入灭菌、干燥后的广口玻璃瓶内，并用无菌塑料纸封口后，备用；
(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置：剪取试材一品红(Euphorbiapulcherrima)鲜嫩叶片并保留其叶柄长30-40mm；叶片按试验设计用10％吡虫啉可湿性粉剂1000倍稀释液进行处理后、阴干，再将该叶柄浸泡入50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液中10-20s进行消毒；用镊子在步骤(1)每一平底玻璃试管的合成培养基内，按叶面向上将叶柄斜插入，以保持该叶片在原植株上的生长状态；
(3)烟粉虱成虫的吸取及释放：将玻璃管的末端罩一层纱布后插入橡胶管的前端，即组成简易的吸虫器；使用时，在人工气候箱内，将橡胶管的后端含入操作人员的口中，以吸虫器的玻璃管前端为吸口，对准饲养在一品红植株上羽化12-24h的烟粉虱成虫，吸入10-15头后，再将该吸虫器的吸口移至步骤(2)的玻璃瓶内，对准瓶内叶面一次性地将玻璃管内的成虫吹入后，迅速用灭菌塑料纸封口、扎紧，并用解剖针扎数孔以保持通气；
(4)饲养及观察：将步骤(3)吹入成虫后的玻璃瓶放入人工气候箱内，在光周期14:10，温度27℃，湿度70％条件下，分别饲养1h、24h、48h、72h后观察、记载、统计瓶内烟粉虱的存活率，同时每天观察瓶内一品红叶片的保鲜及合成培养基的发霉情况，连续观察10天(见表1、表2)。
实施例2：(茄子饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法)
本例中，步骤(1)合成培养基的配制为：称量7.5g琼脂溶解在500mL蒸馏水中，配制成琼脂溶液；再加入27.5mL由NH4NO322.5mg/L、KNO32mg/L、MgSO4·7H2O 1mg/L、KH2PO43mg/L、无水CaCl22mg/L并用水补足至1升的营养液，搅拌均匀即成合成培养基；步骤(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置：剪取试材茄子叶片用10％吡虫啉可湿性粉剂2000倍稀释液进行处理后、阴干，将该叶柄浸泡入50％多菌灵可湿性粉剂800倍稀释液中10-20s进行消毒；其余的步骤、工艺同于实施例1。
实施例3：(棉花饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法)
本例中，步骤(1)合成培养基的配制为：称量8g琼脂溶解在500mL蒸馏水中，配制成琼脂溶液；再加入30mL由NH4NO325mg/L、KNO31mg/L、MgSO4·7H2O3mg/L、KH2PO41mg/L、无水CaCl23mg/L并用水补足至1升的营养液，搅拌均匀即成合成培养基；步骤(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置：剪取试材棉花叶片用10％吡虫啉可湿性粉剂3000倍稀释液进行处理后、阴干，将该叶柄浸泡入50％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液中10-20s进行消毒；其余的步骤、工艺同于实施例1。
表1合成培养基发霉及叶片保鲜情况
注：叶片边缘发卷也同样记录为枯萎状况；数值为实施例1、2、3的平均值。
表2烟粉虱自然死亡率
注：数值为实施例1、2、3的平均值。
Claims (1)
1.一种饲养烟粉虱成虫进行毒力测定的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)合成培养基的配制与灭菌：配制浓度为14-16g/L的琼脂溶液500mL后，再加入25-30mL由NH4NO3 20-25mg/L、KNO3 1-3mg/L、MgSO4·7H2O 1-3mg/L、KH2PO4 1-3mg/L、无水CaCl2 1-3mg/L并用水补足至1升的营养液，搅拌均匀即成合成培养基；将该合成培养基高压灭菌后，在超净工作台上将其分别倒入长度×直径×厚度为30mm×25mm×1.5mm的灭菌平底玻璃试管内，冷却后将该玻璃试管放入灭菌、干燥后的广口玻璃瓶内，广口瓶用无菌塑料纸封口后，备用；
(2)叶片的药剂处理、叶柄消毒及插置：剪取试材鲜嫩叶片并保留叶柄长30-40mm；叶片按试验设计用10％吡虫啉可湿性粉剂1000-3000倍稀释液进行药剂处理后，将叶柄浸泡入50％多菌灵可湿性粉剂500-1000倍稀释液中10-20s进行消毒；用镊子在步骤(1)每一玻璃试管的合成培养基内，按叶面向上将叶柄斜插入，以保持叶片在植株上的生长状况；
(3)烟粉虱成虫的吸取及释放：将玻璃管的末端罩一层纱布后插入橡胶管的前端组成简易吸虫器，吸取在人工气候箱内用相应试材植株饲养的羽化12-24h的烟粉虱成虫10-15头后，将吸虫器的吸口对准玻璃瓶内的叶面上，一次性吹入后，迅速用灭菌塑料纸封口、扎紧，用解剖针扎数孔；
(4)饲养及观察：将吹入烟粉虱成虫的玻璃瓶放入人工气候箱内，在光周期14∶10，温度27℃，湿度70％条件下，分别饲养1h、24h、48h、72h后观察、记载瓶内烟粉虱的存活率，同时每天观察叶片保鲜及合成培养基的发霉情况，连续观察10天。
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