CN102030764A

CN102030764A - 4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法

Info

Publication number: CN102030764A
Application number: CN 201010547766
Authority: CN
Inventors: 武临专; 赫卫清; 王以光; 林灵; 倪四阳; 陶佩珍; 王红远
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: CN102030764B

Abstract

本发明涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素新衍生物4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法，所述新衍生物是通过构建格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997 P450单加氧酶基因(gdmP)阻断变株，并经发酵、提取获得；研究结果表明，4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素具有抗病毒活性和非常好的水溶性，有望开发成为临床有用的抗病毒药物。

Description

4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法

技术领域：

本发明涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素新衍生物4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法和应用。

技术背景：

吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从我国土壤中分离到的，经鉴定其可以产生格尔德霉素(geldanamycin，Gdm)。Gdm具有抗原虫、抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种生物学活性[Sasaki K et al.J Antibiot(Tokyo)1979，32(8)：849-51]；[中国专利ZL97100523.0]；[陶佩珍等，中国抗生素杂志，1997，22：368-372]。根据最近报道，Gdm还具有调节上皮氮氧合酶活性以及抗炎等作用[Murphy P et al.Journal ofNcuroscience Research，2002，67(4)：461-470]。研究证明，格尔德霉素的特异性作用靶点是热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子，Gdm通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此，有望成为一种颇具潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。但是Gdm还存在毒性大及水溶性差等缺点，水溶性差会影响其生物利用度。这些缺陷限制了其开发成为有效药物。所以，寻找一种毒性低、水溶性好的衍生物，已成为其深入研究的主要目标。目前，已有两个在C17位进行取代的Gdm衍生物17-AAG和17-DMAG，相继在美国进行II期和I期临床试验[Goetz MP et al J Clin Oncol，2005，23(6)：1078-1087]；[Glaze ER et al.，Cancer Chemother Pharmacol.2005，56(6)：637-647]。

Gdm的生物合成，是以3-氨基-5-羟基苯甲酸为起始物，2C单位为延伸单位，包括1个丙二酰，4个甲基丙二酰和2个甲氧基丙二酰，在荷载域和7个聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)模块，顺序进行碳链的延伸反应形成聚酮链骨架，再经过酰胺合酶的环化，形成格尔德霉素前体-原Gdm(ProGdm)。继而通过后修饰过程，包括：C17位的羟基化及氧甲基化、C21位的氧化、C7位的氨甲酰基化和C4，5位的氧化，最终形成Gdm。为了实现对Gdm生物学方法的改造，本实验室从Streptomyces hygroscopicus 17997基因文库中克隆了与Gdm生物合成相关的基因簇[高群杰等，中国抗生素杂志，2002，27(1)：13-27]；[赫卫清，王以光，中国生物工程学报，2006，22：902-906]。本发明通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成基因-P450单加氧酶基因(gdmP)的方法，获得一种新的格尔德霉素衍生物4，5-双氢噻嗪酮格尔德霉素(4，5-dihydro-thiazinogeldanamycin)。4，5-双氢噻嗪酮格尔德霉素具抗病毒活性，其水溶性比Gdm提高了33倍。本发明所述通过基因工程技术获得的Gdm新衍生物及其制备方法，为制备水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途径。

利用生物学方法获得4，5-双氢噻嗪酮格尔德霉素的研究，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素新化合物，其结构如式(1)所示：

本发明还提供了制备4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素新化合物的方法，具体步骤依次为：

1、P450单加氧酶基因(gdmP)阻断变株的构建

采用大肠杆菌和链霉菌的穿梭载体构建基因阻断载体，以吸水链霉菌17997基因组为模板进行PCR，分别获得与gdmP基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插入选择性标记如卡那霉素(kanamycin，Km)抗性基因，并与穿梭载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得用于目的基因阻断的重组载体；

通过接合转移，将重组载体导入吸水链霉菌17997中，获得接合转移子进行传代培养，利用PCR方法鉴定确认gdmP基因阻断变株；

2、4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素新化合物的发酵、提取

将gdmP基因阻断变株进行发酵培养，用等量乙酸乙酯萃取发酵液上清，乙酸乙酯萃取液经薄膜浓缩获得粗品，以TLC或HPLC进行检测，通过硅胶柱初步分离目的产物，再经制备型HPLC获得纯品。

3、4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的结构鉴定

经高分辨质谱确定4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素分子量和分子式，经元素分析并通过HRFAB-MS、¹H-NMR and ¹³C-NMR的解析，确定其结构。

本发明还提供了4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的生物活性试验，具体采用疱疹病毒HSV-1感染猴肾细胞，实验以Gdm为对照，评价了4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的抗病毒活性，结果表明，4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素具有抗病毒活性。

本发明以光吸收值为基准，建立了4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素浓度标准曲线，测定了其在水中的溶解度，并与Gdm进行了比较。

发明效果：

本发明通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997中的格尔德霉素生物合成基因gdmP，在其变株发酵液中获得了Gdm新衍生物4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素，所说衍生物不仅具有抗病毒活性，且水溶性比格尔德霉素提高33倍，显示其可望开发成为临床有应用前景的药物。

附图说明：

图1：gdmP基因阻断载体的构建

其中：P1-P6 PCR引物

oriT/RK2-大肠杆菌质粒RK2转移起始位点

SCP2*/ori-SCP2*质粒复制起始位点

Amp-氨苄青霉素抗性基因；

tsr-硫链丝菌素抗性基因；

km-卡那霉素抗性基因。

图2：PCR产物电泳

其中：M-λDNA Hind III酶切Maker；1-17997原株；2-gdmP基因阻断变株。

图3：gdmP变株发酵产生4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的HPLC检测

其中：A-吸水链霉菌17997；1-格尔德霉素出峰保留时间为26.6分钟；

B-gdmP变株；2-4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素出峰保留时间为12.2分钟；3-4，5双氢格尔德霉素出峰保留时间为26.3分钟。

图4：4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素高分辨质谱图谱

图5：4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素¹H氢谱

图6：4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素¹³C碳谱

实施方案：

以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>gdmP基因阻断重组载体的构建

根据gdm基因序列(Genbank DQ914285)设计引物(P1-P4)，提取吸水链霉菌17997(中国微生物菌种保藏委员会药学微生物菌种保藏中心，保藏号CPHCC200178)基因组DNA，以此作为模板进行常规PCR。在本实验中，设计采用但不限于以下的引物序列和酶切位点：

上游引物(P1)：5’-CCGGAATTCCGACGAGCGAGGGCACTTT-3’，带有EcoRI酶切位点；

下游引物(P2)：5’-CGGGGTACCCGAGACCACGGCCAACATG-3’，带有KpnI酶切位点；扩增1031bp片段1。

上游引物(P3)：5’-AAAACTGCAGGCCGTTGAGGCTGGAGTT-3’，带有PstI酶切位点；

下游引物(P4)：5’-CTAGTCTAGAGGTATCTGCGTTACTGGGTG-3’，带有XbaI酶切位点；扩增1236bp片段2。

回收PCR产物片段1和2，在其中间插入选择性标记，如以kpnI-PstI酶切位点插入Km抗性基因，其来源于质粒载体pUC119[李开等微生物学报2007，47(2)：191-196]，并以EcoRI-XbaI酶切位点与携带硫链丝菌素抗性的pGH112载体[莫宏波等，生物工程学报，2004；20：662-666]相应酶切位点进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取转化子DNA，经酶切证明，获得基因阻断重组载体pGHEXP(图1)。

<实施例2>gdmP阻断变株的构建及鉴定

gdmP变株的筛选按照文献[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]进行。将构建的基因阻断重组载体pGHEXP，通过能与吸水链霉菌进行接合转移的大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002[Kieser T.et al.practical Streptomycesgenetics.Norwich：John Innes Foundation.2000]导入到吸水链霉菌17997中，并在MY培养基[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]中传3～4代后，再进行单克隆分离，筛选获得Km^R、Tsr^S的gdmP变株。对gdmP变株在基因整合水平进行PCR验证。以原株和变株的基因组为模板，选取gdmP基因两翼外测序列设计引物P5和P6(图1)进行PCR。结果表明，使用引物P5和P6原株基因组PCR产物大小约3.3kb左右，而在变株中扩增出将近3.7kb特异性条带(0.8kb的Km片段置换下0.4kb左右的gdmP基因)(图2)。

P5上游引物：5’-CCCTCGGGCAGATTCAC-3，

P6下游引物：5’-GTCGCACTCCAACCATTTC-3，

PCR结果揭示，在同源基因片段之间，插入了0.8kb左右的Km抗性基因，符合预期结果。gdmP变株在不加药连续传代中，Km抗性表型很稳定，说明该变株中确实发生了DNA同源重组双交换所造成的Km抗性基因插入，并使gdmP基因受到破坏。

<实施例3> 4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的制备

gdmP变株在MY固体培养基(酵母粉0.4％，麦芽提取物1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂粉1.5％。并加入卡那霉素至终浓度50μg/ml))上培养7天，接种种子培养基(葡萄糖0.5％，酵母提取物0.4％，玉米浆0.5％，棉子饼粉0.25％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄0.05％，CaCO₃ 0.3％)50ml于250ml三角瓶，28℃摇床200rpm振荡培养2天，以5-10％接种量转种发酵培养基(淀粉2％，棉子饼粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米浆1.0％，酵母粉0.5％，CaCO₃ 0.2％)50ml(500ml三角瓶)或1000ml(5000ml)28℃摇床200rpm振荡培养3天[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]。发酵液过滤后，用滤液二分之一体积的乙酸乙酯提取，薄膜浓缩后上硅胶柱，以二氯甲烷∶甲醇19∶1进行洗脱，分部收集洗脱液，用岛津LC-10Avp高压液相色谱仪，SPD-M10AvP二极管阵列检测器，CLASS-VP工作站，以254nm进行HPLC检测(图3)，汇总含4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素化合物部分洗脱液，浓缩后用制备型HPLC，ODS-C18柱(柱体积150×20毫米)，甲醇∶水9∶11(v/v)，流量每分钟5毫升，获得4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素纯品。

<实施例4>4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素结构的确定

ESI-MS给出该新化合物的分子量为635[(M+Na)⁺为658；(M+K)⁺为674]；硫元素测试实验确证，该化合物含硫为4.65％，理论计算值为5.04％，误差主要是由于一般样品含有结晶水造成的影响，可以确定该化合物含有一个硫原子；HR-ESIMS给出的精确分子量为658.2963(含钠，理论计算值为635.2877)(图4)，初步确定其分子式为C31H43N3O9SNa，较4，5双氢-GDM多出C2H3ONS部分。本发明分别用d6-DMSO和CD₃OD作为溶剂，进行NMR测试[NMR数据见表1，图谱见图5、6(CD₃OD)]。综合分析获得的NMR谱图，发现该化合物的结构较4，5-双氢GDM变化只发生在苯醌环上，多出2个碳原子的C22和C23化学位移值分别为30.50ppm和166.85ppm。C18和C21的化学位移有通常的184.02ppm和184.87ppm明显位移至高场，分别为120.67和150.08；亚甲基蓝显色反应提示该化合物含有酚羟基，初步推测C21由原来的羰基变成了羟基。在HMBC谱上，C22上的两个氢原子(δH 3.21/3.45)与C19和C23存在明显相关性；同时，一个重要的活泼氢信号(δH 9.51)与C22、C23，C18、C17和C19存在相关性；综合以上信息，可以断定，C19和一个S原子直接相连，而C21则与一个N原子直接相连，这两者之间形成了一个噻嗪酮环，所以，该新化合物的结构式为4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素。

表1 4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的¹H和¹³C NMR数据

<实施例5>4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的抗病毒活性测定

1.细胞培养：在长满猴肾细胞(VERO，上海坤肯生物化工有限公司)的培养瓶内加0.25％胰酶0.1ml，0.02％EDTA 5ml，37℃消化20～25min，废弃消化液，加Eagle’s MEM培养液(上海典微生物技术公司)吹打，1∶3传代，3d长满，配制成每毫升20～30万个细胞，接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO₂培养24h，细胞长成单层后进行实验。

2.对疱疹病毒的抑制试验：以每毫升20～30万个VERO细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO₂培养24小时，弃培养液，加入适量病毒，吸附1h后，弃病毒液，加入样品，进行3倍系列稀释，设8个稀释度，每浓度2孔，37℃5％CO₂培养。48h观察细胞病变，完全破坏100％为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。设细胞对照、病毒对照和阳性对照(阿西洛韦ACV)。按Reed & Muench法计算样品半数有效浓度(IC₅₀)。

4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的抗疱疹病毒HSV-1活性IC₅₀(μmol/L)为0.2520，结果见表2。

<实施例6>4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的水溶性测定

先准确称取一定量4，5双氢噻嗪格尔德霉素或对照格尔德霉素，分别溶解于甲醇，用甲醇进行系列稀释，分别测定其在OD₂₅₁及OD₃₀₄光吸收值，建立4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素或格尔德霉素浓度与光吸收值的标准曲线。称取过量4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素或对照格尔德霉素在pH7.0的磷酸缓冲液中避光搅拌过夜12h，然后离心10,000g 10min.。采用BECKMAN DU 800核酸/蛋白分析仪测定4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素OD₂₅₁或格尔德霉素OD₃₀₄值。根据标准曲线测定磷酸缓冲液饱和液中两者的浓度。4，5双氢噻嗪格尔德霉素在水中的溶解度为0.573(mg/ml)，非常明显高于格尔德霉素，结果见表2。

表2 4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素抗病毒活性及水溶性

Claims

1.一种格尔德霉素基因工程衍生物，其特征是，所述衍生物4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的化学结构如式(1)所示：

2.制备权利要求1所述衍生物的方法，其特征是，该方法的主要步骤依次为：

吸水链霉菌17997 P450单加氧酶基因(gdmP)阻断变株的构建；

4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素的发酵、提取。

3.权利要求2所述的制备方法，其特征是，产生4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素所用变株的构建是，根据GenBank DQ914285 gdmP基因序列设计引物，以吸水链霉菌17997基因组为模板，进行PCR，分别获得与gdmP基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插入选择性标记基因，并通过构建大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒获得用于gdmP基因阻断的重组载体；将重组载体导入吸水链霉菌17997中，根据选择性标记筛选转化子；利用PCR方法鉴定确认，gdmP基因序列中插入了选择性标记基因，从而获得吸水链霉菌17997gdmP基因阻断变株。

4.权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，在新鲜培养的吸水链霉菌17997gdmP基因阻断变株斜面或平板培养基中加入卡那霉素，挖块接种于液体种子培养基中，28℃振荡培养24-48h；5％转种量接种于液体发酵培养基，28℃继续振荡培养，至120-144h，获得吸水链霉菌17997gdmP基因阻断变株的发酵培养液；发酵液过滤后，用滤液二分之一体积的乙酸乙酯提取，薄膜浓缩后上硅胶柱，以二氯甲烷∶甲醇19∶1进行洗脱，分部收集洗脱液，用岛津LC-10Avp高压液相色谱仪，SPD-M10AvP二极管阵列检测器，CLASS-VP工作站，以254nm进行HPLC检测，汇总含4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素化合物部分洗脱液，浓缩后用制备型HPLC，ODS-C18柱，甲醇∶水9∶11(v/v)，流量每分钟5毫升，获得4，5双氢噻嗪酮格尔德霉素纯品。

5.权利要求1所述衍生物在制备抗病毒药物中的应用。

6.权利要求1所述衍生物的药物组合物，系以所述衍生物为有效成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

7.权利要求6所述组合物在制备抗病毒药物中的应用。