CN101239948A

CN101239948A - 格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1及其制备方法

Info

Publication number: CN101239948A
Application number: CNA2007101663420A
Authority: CN
Inventors: 王以光; 邵荣光; 赫卫清; 李永海
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2007-11-07
Filing date: 2007-11-07
Publication date: 2008-08-13

Abstract

本发明涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素C19位进行修饰的新衍生物4，5－双氢－7－氧－脱氨甲酰基－7－羟基－19－氧－甘氨酰格尔德霉素(Gdm－CT－1－1)及其制备方法，通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997中的格尔德霉素生物合成基因gdmN，在其变株发酵液中直接获得Gdm新衍生物，其水溶性比格尔德霉素高500倍，为研制临床疗效更好的药物奠定了基础。

Description

格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1及其制备方法

技术领域：

本发明涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素的新衍生物CT-1-1及其制备方法。

技术背景：

吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从我国土壤中分离到的，经鉴定其可以产生格尔德霉素(geldanamycin，Gdm)。Gdm具有抗原虫、抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种生物学活性[Sasaki K et al.J Antibiot(Tokyo)1979，32(8)：849-51]；[陶佩珍等，中国抗生素杂志，1997，22：368-372]。根据最近报道，Gdm还具有调节上皮氮氧合酶活性以及抗炎等作用[Murphy P et al Journal of Neuroscience Research，2002，67(4)：461-470]。经研究证实，格尔德霉素的特异性作用靶点是热休克蛋白90(heat shockprotein 90，Hsp90)。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子，Gdm通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此，有望成为一种颇具潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。但是Gdm还存在毒性大及水溶性差等缺点，水溶性差会影响其生物利用度，这些缺陷将限制其开发成为有效药物。所以，寻找一种毒性低、水溶性好的衍生物，已成为其深入研究的主要目标。目前，已有两个在C17位进行取代的Gdm衍生物17-AAG和17-DMAG，相继在美国进行II期和I期临床试验[Goetz MP et al J Clin Oncol，2005，23(6)：1078-1087]；[Glaze ER et al.，CancerChemother Pharmacol.2005，56(6)：637-647]。

Gdm的生物合成，是以3-氨基-5-羟基苯甲酸为起始物，2C单位为延伸单位，包括1个丙二酰，4个甲基丙二酰和2个甲氧基丙二酰，在荷载域和7个聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)模块，顺序进行碳链的延伸反应形成聚酮链骨架，再经过酰胺合酶的环化，形成格尔德霉素前体原Gdm。然后通过后修饰过程，包括：C17位的羟基化及氧甲基化、C21位的氧化、C7位的氨甲酰基化和C4，5位的氧化，最终形成Gdm。为了实现对Gdm生物学方法的改造，本实验室从Streptomyces hygroscopicus 17997基因文库中克隆了与Gdm生物合成相关的基因簇[高群杰等，中国抗生素杂志，2002，27(1)：13-27]；[赫卫清，王以光，中国生物工程学报，2006，22：902-906]。通过阻断吸水链霉菌17997中的格尔德霉素生物合成基因-氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的方法，获得一种新的格尔德霉素衍生物4，5-双氢-7-氧-脱氨甲酰基-7-羟基-19-甘氨酰格尔德霉素(4，5-dihydro-7-O-descarbamoyl-7-hydroxy-19-glycylgeldanamycin)，命名为Gdm-CT-1-1。Gdm-CT-1-1水溶性比Gdm增加了500多倍。本发明所述通过基因工程技术在C19位进行修饰获得Gdm新衍生物Gdm-CT-1-1及其制备方法，为制备水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途径。

利用生物学方法在Gdm C19位进行修饰获得新衍生物的研究，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其结构如式(1)所示：

本发明还提供了新衍生物Gdm-CT-1-1的制备方法，具体步骤包括：

1、Gdm生物合成阻断变株的构建

采用具有氨苄青霉素抗性(Amp^R)和硫链丝菌素抗性(Tsr^R)的大肠杆菌和链霉菌的穿梭载体pGH112构建基因阻断载体，以吸水链霉菌17997基因组为模板进行PCR，分别获得与gdmN基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插入阿普拉霉素(apramycin，Am)抗性基因，并与pGH112载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得用于目的基因阻断的重组载体；

将重组载体转化到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，获得转化子，将其与吸水链霉菌17997的新鲜孢子共培养，通过接合转移，将重组载体导入吸水链霉菌中。接合转移子进行传代培养，筛选出Am^R和Tsr^R的突变株CT-1。利用PCR方法鉴定确认，gdmN基因阻断变株是通过同源双交换在其中插入Am抗性基因的结果。

2、格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的获得

将CT-1变株进行发酵培养，用等量乙酸己酯萃取发酵液上清，乙酸己酯萃取液经薄膜浓缩获得粗品，在硅胶柱用二氯甲烷洗脱，分部收集，以TLC或HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1纯品。

3、格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的结构鉴定及水溶性测定

经高分辨质谱确定Gdm-CT-1-1的分子量和分子式，经¹H和¹³C NMR分析，并通过化学结构解析，确定Gdm-CT-1-1的结构为4，5-双氢-7-氧-脱氨甲酰基-7-羟基-19-氧-甘氨酰格尔德霉素。测试结果表明，Gdm-CT-1-1的水溶性比Gdm提高500倍。

发明效果：

本发明通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997中的格尔德霉素生物合成基因gdmN，在其变株发酵液中直接获得Gdm在C19位进行修饰的新衍生物Gdm-CT-1-1，且其水溶性比格尔德霉素高出500倍，为提供临床疗效更好的药物奠定了基础。

附图说明：

图1：gdmN基因阻断载体的构建

其中：Am^R-阿普拉霉素抗性基因；

tsr-硫链丝菌素抗性基因；

Amp-氨苄青霉素抗性基因；

B-BamHI；

Bg-BglII；

E-EcoRI；

P-pstI；

S-SacI；

X-XbaI。

图2：PCR产物电泳

其中：M-λHind III； 1-17997原株； 2-CT-1。

图3：gdmN变株发酵产生的Gdm-CT-1-1HPLC检测图

其中：A-吸水链霉菌17997；保留时间为24.863分钟，

B-Gdm-CT-1-1，保留时间为12.925分钟。

图4：Gdm-CT-1-1高分辨质谱图谱

图5：Gdm-CT-1-¹1H氢谱

图6：Gdm-CT-1-1¹³C碳谱

实施方案：

以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>gdmN基因阻断重组载体的构建

根据gdmN基因序列(Genbank DQ914285)设计引物(N1-N4)，提取吸水链霉菌17997(中国微生物菌种保藏委员会药学微生物菌种保藏中心，保藏号CPHCC200178)基因组DNA，以此作为模板进行常规PCR。在本实验中采用以下引物及设计的酶切位点，但不限于所说的引物序列和酶切位点。

上游引物(N1)：5’-CCGGAATTCACGGCCTTGGCCAGATCC-3’带有EcoRI酶切位点；

下游引物(N2)：5’-CGCGGATCCATCCACCCCGCCTCGCAC-3’带有BamHI酶切位点；扩增949bp片段1。

上游引物(N3)：5’-AAAACTGCAGGCCGTTGAGGCTGGAGTT-3’带有PstI酶切位点；

下游引物(N4)：5’-CTAGTCTAGACCGACTGGTTTGGGTGAT-3’带有XbaI酶切位点；扩增963 bp片段2。

回收PCR产物片段1和2，在其中间以BamHI-PstI酶切位点插入Am抗性基因，[来源于质粒载体pKC1139(Kieser T.et al.practical Streptomyces genetics.Norwich：John Innes Foundation.2000)]，并以EcoRI-XbaI酶切位点与携带硫链丝菌素抗性的pGH112载体(莫宏波等生物工程学报，2004；20：662-666)相应酶切位点进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取转化子DNA，经酶切证明，获得基因阻断重组载体pGHEX-gdmN(图1)。

<实施例2>gdmN变株的基因鉴定

gdmN变株的筛选按照文献[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]进行。将构建的基因阻断重组载体pGHEX-gdmN通过能与吸水链霉菌进行接合转移的大肠杆菌，如大肠杆菌ET12567/pUZ8002[Kieser T.et al.practicalStreptomyces genetics.Norwich：John Innes Foundation.2000]导入到吸水链霉菌17997中，并在MY培养基[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]中传3～4代后，再进行单克隆分离，筛选获得Am^R、Tsr^S gdmN变株。对gdmN变株(CT-1)在基因整合水平进行PCR验证。以原株和CT-1变株的基因组为模板，选取gdmN基因两翼外测序列设计引物Pr1和Pr2(图1)进行PCR。结果表明，使用引物Pr1和Pr2原株基因组PCR产物大小约3.1kb左右，而在CT-1变株中扩增出将近4.5kb特异性条带(图2)。

Pr1上游引物：5’CCCAAGCTTCTCGTGGACGGGTTGCT3’(HindIII)

Pr2下游引物：5’CTAGTCTAGATCGAACGCCTCCACCTC3’(XbaI)

PCR结果揭示，在同源基因片段之间，插入了1.5 kb左右的Am抗性基因，符合预期结果。gdmN变株在不加药连续传代中，Am抗性表型很稳定，说明该变株中确实发生了DNA同源重组双交换所造成的Am抗性基因插入，并使gdmN基因由于阻断而受到破坏。

<实施例3> Gdm-CT-1-1的制备

gdmN变株在MY固体培养基上培养7天，接种种子培养基50ml于250ml三角瓶，28℃摇床200rpm振荡培养2天，以5-10％接种量转种发酵培养基50ml(500ml三角瓶)或1000ml(5000ml)28℃摇床200rpm振荡培养3天[赫卫清等中国抗生素杂志，2006，31(3)：168-171]。发酵液过滤后，用滤液二分之一体积的乙酸乙酯提取，薄膜浓缩后上硅胶柱，以二氯甲烷∶甲醇19-1进行洗脱，分部收集洗脱液，用岛津LC-10Avp高压液相色谱仪，SPD-M10AvP二极管阵列检测器，CLASS-VP工作站，以254nm进行HPLC检测(图3)，汇总含Gdm-CT-1-1化合物部分洗脱液，浓缩后用制备型HPLC，ODS-C18柱(柱体积150×20毫米)，甲醇∶水14∶11(v/v)，流量每分钟5毫升，获得Gdm-CT-1-1纯品。

<实施例4>Gdm-CT-1-1结构的确定

Gdm-CT-1-1纯品经高分辨质谱分析，结果见图4，确定其分子量为615.2896(含钠)，实际分子量为592，分子式为C₃₀H₄₄N₂O₁₄。¹H和¹³C NMR数据见表1，图谱见图5，图6。

表1 Gdm-CT-1-1化合物的¹H和¹³C NMR数据

位置	δH	δC
位置	δH	δC	122-CH₃34566-OCH₃788-CH₃91010-CH₃111212-OCH₃131414-CH₃15161717-OCH₃1819202119-OCOCH₂NH₂19-OCOCH₂NH₂	--1.805.621.99/2.050.98/1.083.063.443.37-.455.042.451.083.653.143.330.98/1.762.050.73.06/2.58--3.69-----3.55/3.33	176.2129.212.21133.423.429.981.957.5879.69133.410.41130.734.7417.3372.9481.2455.432.231.316.429.9120.04146.7060.01120.03123.2117.9148.6165.5229.21

化学解析结果表明，Gdm-CT-1-1的结构如式(1)所示：

<实施例5> Gdm-CT-1-1的水溶性测定

分别将Gdm-CT-1-1和Gdm在50mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液中溶解，在室温闭光的情况下搅拌12小时，测定它们的溶解度。结果表明，Gdm的溶解度为每毫升0.007毫克，而Gdm-CT-1-1的溶解度为每毫升4.02毫克，化合物Gdm-CT-1-1比Gdm的水溶性高500多倍。

Claims

1、一种格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其结构如式(1)所示。

2、制备权利要求1所述新衍生物Gdm-CT-1-1的方法，具体包括以下步骤：

A.Gdm生物合成阻断变株的构建；

B.Gdm生物合成阻断变株的发酵及Gdm-CT-1-1的提取和纯化。

3、如权利要求2所述的方法，其特征是，所说阻断变株的构建，是根据gdmN基因序列(Genbank DQ914285)设计引物，以吸水链霉菌17997基因组为模板，进行PCR，分别获得与gdmN基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插入选择性标记基因，并与可转入吸水链霉菌17997的质粒载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得用于目的基因阻断的重组载体；将重组载体导入吸水链霉菌中；根据选择性标记筛选转化子；利用PCR方法鉴定确认gdmN基因序列插入了选择性标记基因，使gdmN基因遭到破坏，从而获得Gdm生物合成阻断变株CT-1-1。

4、如权利要求2所述的方法，其特征是，新衍生物Gdm-CT-1-1的制备是将CT-1变株直接进行发酵培养，用等量乙酸己酯萃取发酵液上清，乙酸己酯萃取液经薄膜浓缩获得粗品，在硅胶柱上用二氯甲烷洗脱，分部收集，以TLC或HPLC进行检测，再经制备型HPLC得到格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1纯品。

5、格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1作为先导化合物在开发制备有效药物中的应用。