CN102010396B

CN102010396B - 具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物

Info

Publication number: CN102010396B
Application number: CN2010105305135A
Authority: CN
Inventors: 张文; 李玲; 卢山; 易杨华; 孙鹏; 汤华; 刘宝姝
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: CN102010396A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是从植物内生真菌Cytospora sp.发酵物中分离得到的16种具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物Cytospolides A～P。体外抗肿瘤试验表明，化合物Cytospolides A～P对HCT116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、QGY-7703(人肝癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)、U937(人白血病细胞)肿瘤细胞株有明显的抑制作用；体外抗菌试验表明，化合物Cytospolides A～P对花药黑粉菌、壳针孢叶枯病菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌有明显的抑菌效果。因此可用于制备抗肿瘤或抗菌的药物。本发明为研制抗肿瘤和抗菌药物提供了新的先导化合物，为开发利用植物内生菌资源具有重要意义。

Description

具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一类从植物内生真菌Cytospora sp.发酵物中分离得到的16种具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物Cytospolides A～P。

背景技术

内生真菌(endophytic fungus)是存在于健康植物的茎叶中，形成不明显侵染的一类真菌。内生真菌作为主要的微生物物种，种类及数量庞大，分布的宿主植物范围广，其所处的微生态系统的多样性，加上宿主植物本身所处生态环境的多样性，因而其次生代谢产物也具有丰富的多样性，能够为天然药物的研究提供丰富的潜在资源。内生真菌Cytospora sp.属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、壳囊孢属(Cytospora)真菌。Cytosporasp.菌株分离自冬青目(Aquifoliales)、冬青科(Aquifoliaceae)、冬青属(Ilex)植物加那利冬青(Ilex canariensis)，加那利冬青是一种常绿灌木，采自西班牙戈梅拉岛(Gomera)。已报道的从壳囊孢属真菌中分离的化合物约有35个。化合物类型有大环内酯类、聚酮类、二蒽醌类、异香豆素类、萘酮类等。部分化合物都具有较强的生物活性，如抗真菌、抗细菌、抗氧化、抗病毒等活性。但至今未见从内生真菌Cytospora sp.中分离到具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物Cytospolides A～P的报道。

发明内容

本发明提供从植物内生真菌Cytospora sp.发酵物中提取分离得到的16种具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类新化合物，分别命名为CytospolidesA～CytospolidesP，化合物编号依次为1～16，它们的化学结构通式如下：

其中，R₁基团为CH₃ R₂基团为OH或＝O或OAc

R₃基团为OH或H或双键 R₄基团为OAc或-O-或双键

R₅基团为OH或H或OAc或-O- R₆基团为OH或H或OAc

R₇基团为H或OAc

所说16种化合物的基团搭配分别如下：

本发明化合物CytospolidesA～P的制备和结构鉴定方法如下：

1.制备化合物Cytospolides A～P

将内生真菌Cytospora sp.发酵物(由德国不伦瑞克大学提供)用少量氯仿完全溶解，用正相硅胶色谱(200～300目)分离，以二氯甲烷∶丙酮体积比为100∶1，80∶20，50∶50，30∶70，1∶100的洗脱液进行梯度洗脱，根据薄层板监测，将各流份按照极性的差别从小到大共收集18个部分洗脱液Fr 1～Fr 18；然后每部分用不同条件的洗脱剂多次进行正向硅胶柱层析或Sephadex LH-20凝胶色谱。经过多次不同条件的分离之后得到一系列单体化合物，根据各种单体化合物的特性，分别再经重结晶或制备型HPLC纯化，最后得16种新化合物Cytospolides A～P。

2.结构鉴定

经NMR、HRMS、CD、UV、IR、X-射线单晶衍射等多种现代光谱技术，以及重结晶、乙酰化、Mosher反应等化学方法进行结构鉴定，确定了16种化合物Cytospolides A～P的化学结构及立体构型：

化合物1、2、3、5、10的绝对构型为(2R，3R，8S，9R)；化合物4的绝对构型为(2S，3R，8S，9R)；化合物6、7、8、9的绝对构型为(2R，3R，8S，9R，13S)；化合物11的绝对构型为(2R，3R，9R)；化合物12的绝对构型为(2R，3R，9R，13S)；化合物13和14的绝对构型为(2R，3S，4R，5R，8S，9R)；化合物15的绝对构型为(2R，5R，8S，9R)；化合物16的绝对构型为(2S，5R，8S，9R)。

Cytospolides A：C₁₇H₂₈O₅，淡黄色针状结晶。-119.25(c0.187，CHCl₃)；m.p.121-123℃；IR(film)v_max＝3506，2930，2859，1741，1670，1510，1459，1376，1238，1177，1107，1066，1020，989，912cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：221(2455)nm；CD(CH₃CN，c 2.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝196(-18.27)nm，224.5(+0.99)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₇H₂₈O₅Na：335.1834；found：335.1837[M+Na]⁺。¹H and ¹³C NMR数据见表1。

Cytospolide B：C₁₉H₃₀O₆，无色油状物。

-54.76(c 0.042，CHCl₃)；IR(film)v_max＝2928，2856，1740，1454，1372，1236，1169，1108，1064，1022cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：216(1581)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₉H₃₀O₆Na，377.1940；found：377.1941[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表1。

Cytospolide C：C₁₅H₂₆O₄，无色油状物。-89.53(c 0.382，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 2.4×10^-4)：λ_max(Δε)＝195(-10.19)nm；IR(film)v_max＝3436，2954，2929，2861，1718，1456，1375，1181，1101，1067，989，910cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：222(2276)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₆O₄Na，293.1729；found：293.1731[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表2。

Cytospolide D：C₁₅H₂₆O₄，白色晶体。+33.33(c 0.093，CHCl₃)；m.p.124-125℃；CD(CH₃CN，c 2.2×10^-4)：λ_max(Δε)＝200(+10.03)nm；IR(film)v_max＝3360，3193，3003，2924，2854，1706，1660，1634，1463，1416，1265，1020，976cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：221(2280)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₆O₄Na，293.1729；found：293.1728[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表3。

Cytospolide E：C₁₇H₂₈O₅，无色油状物。

-75.0(c 0.112，CHCl₃)；IR(film)v_max＝3360，3196，2926，2854，1736，1664，1633，1461，1372，1238，1169，1102，1026，978cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：221(2156)，246v(1418)，256(1491)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₇H₂₈O₅Na，335.1834；found：335.1831[M+Na]⁺。¹H and¹³CNMR数据见表2。

Cytospolide F：C₁₅H₂₆O₅，无色油状物。

-72.73(c 0.077，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 2.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝195(-11.48)nm；IR(film)v_max＝3415，3004，2920，1716，1656，1436，1410，1317，1185，1022，953，903，707cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：219(2449)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₆O₅Na，309.1678；found：309.1675[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表4。

Cytospolide G：C₁₇H₂₈O₆，无色油状物。

-53.71(c 0.054，CHCl₃)；IR(film)v_max＝3406，2930，2857，1737，1670，1457，1375，1240，1180，1106，1065，1024，990，943cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：221(1797)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₇H₂₈O₆Na，351.1784；found：351.1785[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见Table 4。

Cytospolide H：C₁₉H₃₀O₇，无色油状物。

-88.89(c0.009，CHCl₃)；IR(film)v_max＝3454，3360，3197，2924，2853，1736，1662，1462，1440，1375，1242，1176，1107，1065，1023，989cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：215(1829)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₉H₃₀O₇Na，393.1889；found：393.1887[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见Table 5。

Cytospolide I and J(混合物)：C₁₇H₂₈O₆，无色油状物。-80.33(c0.061，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 2.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝196(-15.16)nm；IR(film)v_max＝3443，2929，2855，1728，1668，1453，1373，1247，1177，1101，1068，1043，989cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：220(2413)nm；ESIMS：m/z：351.13[M+Na]⁺。¹H and¹³CNMR数据见表5和表6。

Cytospolide K：C₁₅H₂₆O₄，无色油状物。

-40.91(c 0.066，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 2.2×10^-4)：λ_max(Δε)＝195(-10.90)nm；IR(film)v_max＝3429，2927，2856，1714，1455，1375，1242，1181，1101，1029，979，916cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：221(1110)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₆O₄Na，293.1729；found：293.1727[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表7。

Cytospolide L：C₁₇H₂₈O₅，无色油状物。-75.0(c 0.012，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 2.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝196(-14.48)nm；IR(film)v_max＝3358，3196，2924，2853，1731，1660，1633，1463，1374，1245，1177，1135，1099cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：219(1133)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₇H₂₈O₅Na，335.1834；found：335.1831[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表7。

Cytospolide M：C₁₅H₂₆O₅，白色晶体。

-25.53(c0.094，CHCl₃)；m.p.136-137℃；CD(CH₃CN，c 5.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝190(+2.35)，214(-3.07)nm；IR(film)v_max＝3346，2928，2856，1731，1665，1459，1377，1184，1131，1098，1064，992，934cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：219(1828)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₆O₅Na，309.1678；found：309.1677[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表8。

Cytospolide N：C₁₇H₂₈O₇，白色晶体。

-60.0(c0.010，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c5.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝207(-3.01)nm；IR(film)v_max＝3359，3205，2925，2854，1733，1661，1633，1462，1371，1241，1179，1099，1059，1028，989，935cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：214(1130)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₇H₂₈O₇Na，367.1733；found：367.1732[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表6。

Cytospolide O：C₁₅H₂₄O₄，白色晶体。

-6.35(c0.063，CHCl₃)；CD(CH₃CN，c 5.0×10^-4)：λ_max(Δε)＝189(-6.63)，216(-1.83)，296(+1.14)nm；IR(film)v_max＝3359，3194，2922，2852，1658，1633，1465，1416cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：226(2569)，251(390)，278(707)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcd for C₁₅H₂₄O₄Na，291.1572；found：291.1570[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表9。

Cytospolide P：C₁₇H₂₈O₆，无色油状物。

-105.88(c 0.017，CHCl₃)m.p.103-104℃；CD(CH₃CN，c 1.0×10^-3)：λ_max(Δε)＝198(-1.94)，213(-1.57)，290(-0.88)nm；IR(film)v_max＝3408，2926，2855，1736，1708，1669，1459，1372，1242，1073，1030，987，953，890cm^-1；UV(CH₃CN)：λ_max(ε)：223(2558)nm；HRMS(ESI)：m/z：calcdfor C₁₇H₂₈O₆Na，351.1784；found：351.1787[M+Na]⁺。¹H and¹³C NMR数据见表9。

表1.化合物cytospolide A和cytospolide B的核磁共振数据

表2.化合物cytospolide C和cytospolideE的核磁共振数据

表3.化合物Cytospolides D(a)和Cytospolides D(b)的核磁共振数据

表4.化合物Cytospolide F and Cytospolide G的核磁共振数据

表5.化合物Cytospolide H和Cytospolide I的核磁共振数据

表6.化合物Cytospolide J和Cytospolide N的核磁共振数据

表7.化合物Cytospolide K和Cytospolide L的核磁共振数据

表8.化合物Cytospolide M的核磁共振数据

表9.化合物Cytospolide O和Cytospolide P的核磁共振数据

经体外抗肿瘤试验表明，化合物Cytospolides A～P对HCT116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、QGY-7703(人肝癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)、U937(人白血病细胞)肿瘤细胞株有明显的抑制作用；经体外抗菌试验，表明化合物Cytospolides A～P对花药黑粉菌、壳针孢叶枯病菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌有明显的抑菌效果，因此可用于制备抗肿瘤或抗菌药物。

本发明为研制抗肿瘤和抗菌药物提供了新的先导化合物，为开发利用植物内生菌资源具有重要意义。

具体实施方式

实施例1.制备化合物Cytospolides A～P

将18.7g内生真菌Cytospora sp.发酵物(由德国不伦瑞克大学提供)用10ml氯仿完全溶解，按常规用正相硅胶色谱(200～300目)分离，以二氯甲烷∶丙酮体积比为100∶1，80∶20，50∶50，30∶70，1∶100的洗脱液进行梯度洗脱，根据薄层板监测，按照极性的差别从小到大共收集18个部分洗脱液Fr 1～Fr18。各部分再分别通过正相硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20和HPLC等多种现代色谱分离技术，得16种新化合物：Cytospolide A(5.0mg)、Cytospolide B(2.4mg)、Cytospolide C(600.0mg)、Cytospolides D(9.3mg)、Cytospolide E(6.0mg)、Cytospolide F(10.0mg)、Cytospolide G(5.4mg)、Cytospolide H(0.9mg)、CytospolideI and J(6.1mg)、Cytospolide K(6.6mg)、Cytospolide L(1.7mg)、Cytospolide M(9.4mg)、Cytospolide N(1.0mg)、Cytospolide O(4.0mg)、Cytospolide P(1.0mg)。

化合物Cytospolides A～P抗肿瘤药理实验：

一、实验方法

对本发明的化合物Cytospolides A～P进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。

1.实验用细胞株：HCT116(人结肠癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、QGY-7703(人肝癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)、U937(人白血病细胞)，均由中国科学院细胞所提供。

2.实验试剂、耗材和仪器：

DMEM培养液、1640培养液、McCoy′s 5a、血清和胰酶(均为Invitrigen公司产品)；

DMSO和MTT(sigma公司)；

CCK8(日本同仁)；

培养皿、移液管和96孔板(Corning公司)；

CO₂孵箱(SANYO公司)；酶标仪(Biotek76833)

3.实验用药：

样品：化合物CytospolidesA～P由实施例1制备

阳性对照品：阿霉素(Adriamycin公司)

4.细胞培养

人结肠癌细胞(HCT116)，用含有10％胎牛血清的McCoy′s 5a培养液中，37℃5％CO₂条件下培养，待细胞铺满培养皿底70％-80％后，用0.25％的胰酶进行消化，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18-24h后进行实验。

人肺腺癌细胞(A549)和人黑色素瘤细胞(A375)均用含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃5％CO₂条件下培养，待细胞铺满培养皿底70％-80％后，用0.25％的胰酶进行消化，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18-24h后进行实验。

人肝癌细胞(QGY-7703)，用含有10％胎牛血清的1640培养液中，37℃5％CO₂条件下培养，待细胞铺满培养皿底70％-80％后，用0.25％的胰酶进行消化，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18-24h后进行实验。

人白血病细胞(U937)，用含有10％胎牛血清的1640培养液中，37℃5％CO₂条件下培养，待细胞达到10⁶个/ml左右时，1000rpm 5min离心、传代，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，于18-24h后进行实验。5.细胞活力检测实验

HCT116、A549、A375和QGY-7703细胞活力检测实验：于实验前24h以10⁴个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl，终浓度分别达到30ug/ml和3μg/ml，同时设立复孔、DMSO对照和阿霉素(0.4μg/ml)阳性对照。给药后，37℃5％CO₂条件下共孵育24h。每孔加入10μl 5mg/ml MTT(噻唑蓝)，37℃5％CO₂条件下共孵育4h。吸去培养板中的细胞培养液。每孔加入150μl DMSO溶液，于37℃下摇床震荡15min。用酶标仪检测570nm下的OD值。

U937细胞活力检测实验：于实验前24h以10⁴个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl，终浓度分别达到30μg/ml和3μg/ml，同时设立复孔、DMSO对照和阿霉素(0.4μg/ml)阳性对照。给药后，37℃5％CO₂条件下共孵育24h。向每孔加入10ml的CCK-8溶液，37℃5％CO₂条件下共孵育2h。用酶标仪检测450nm下的OD值。

二、实验结果

通过MTT法测定化合物Cytospolides A～P体外细胞毒活性，各化合物的肿瘤细胞抑制率见表10。

表10.化合物Cytospolides A～P的肿瘤细胞增殖抑制试验^a

^a样品浓度为3μg/ml，阿霉素浓度为0.4μg/ml。抑制率单位为％。

Cytospolides A～P抗菌药理实验

一、实验方法

对本发明化合物Cytospolides A～P进行了体外抗菌试验，试验方法采用琼脂扩散试验法。

1.实验用菌

真菌：花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、壳针孢叶枯病菌(Septoria tritici)

细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

2.实验用药

样品：化合物1～16(Cytospolides A～P)由实施例1制备

阳性对照药：青霉素、链霉素、酮康唑

阴性对照品：丙酮

3.实验步骤

将青霉素、链霉素、酮康唑和化合物Cytospolides A～P分别用丙酮配制成浓度为1mg/ml的溶液，单次测试用量50μl。将上述3种真菌、2种细菌和1种藻类按无菌操作的要求分别用7ml灭菌水配制成菌液，各用喷雾器取4ml菌液，分别均匀喷洒于各自培养皿的培养基表面，再在每个培养皿内分别放置直径约1cm灭菌滤纸两块，覆盖于培养基表面，然后分别取上述配制的药液50μl滴于滤纸上，盖上培养基盖子进行培养。各培养皿盖子上均注明相应培养基种类、菌种、化合物名称、接种时间。花药黑粉菌室温4天，壳针孢叶枯病菌20℃4天，大肠杆菌37℃24小时，巨大芽孢杆菌37℃24小时。按时观察结果，测量抑菌圈的大小(直径)，平行试验3次，结果见表11。

表11.琼脂扩散实验活性筛选(mm)

由表10可见，化合物6对HCT116(人结肠癌细胞)有明显的抑制作用；化合物4、6、11、13、14、16对A549(人肺癌细胞)有明显的抑制作用；化合物12对A375(人黑色素瘤细胞)有一定的抑制作用。

由表11可见，化合物5对花药黑粉菌有明显的抑制作用；化合物4、11、12对大肠杆菌有明显的抑制作用；化合物15对巨大芽孢杆菌有明显的抑制作用。

上述活性实验结果表明，本发明化合物Cytospolides A～P具有较好的抗肿瘤活性和抗菌活性，故可用于制备抗肿瘤和抗菌药物。本发明为深入研究和开发新的抗肿瘤和抗菌药物开辟了新的途径。

Claims

1.十元环内酯类化合物Cytospolides A～P，其特征在于化学结构通式如下：

16种化合物Cytospolides A～P的基团搭配分别如下：

2.权利要求1所述的十元环内酯类化合物Cytospolides A～P在制备抗肿瘤药物或抗菌药物中的应用。