CN102007902A

CN102007902A - 用于dna提取的橡胶树叶片组织保存方法

Info

Publication number: CN102007902A
Application number: CN2010105491548A
Authority: CN
Inventors: 吴春太; 黄华孙; 李维国; 高新生; 张晓飞
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-11-08
Also published as: CN102007902B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，是将采集的橡胶树叶片放入预冷研钵中，利用液氮研磨，至叶片成粉末状；然后将粉末状叶片组织转移到含有储藏缓冲液的离心管里中，混匀后置于低温环境中进行保存。本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现长时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，具有工艺简单、成本低、效果好等特点。

Description

用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种叶片组织保存方法，具体是一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brailiensis)，大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)，为热带地区产胶乔木，是一类重要的经济作物。从上世纪90年代开始，随着分子生物学的迅速发展，橡胶树的研究也逐渐进入分子水平。从分子水平上对橡胶树的遗传基础和基因资源进行研究，是橡胶树属种质资源开发利用、品种鉴定、辅助育种等工作的一种重要手段，而获取高质量的总DNA是开展分子生物学研究的基础。

目前提取橡胶树叶片基因组DNA的常规方法主要有CTAB法和SDS法，两种方法所提DNA浓度和纯度均能达到后续的酶切或PCR扩增等分子生物学实验的要求。CTAB法和SDS法所采用的原理都是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

在提取植物叶片DNA的研究中，常规方法多采用新鲜或冷冻的材料(植物叶片)。提取DNA的材料应当尽量保持新鲜，样品保存的好坏，将直接影响DNA的提取效果。在胶园采集新鲜材料(橡胶叶片)时最好都携带液氮罐、干冰箱、冰盒或冰桶，样品运回实验室后应及时提取DNA。但在实际工作中，有时由于远距离采样或试验上的安排无法对新鲜材料及时提取DNA，此时植物样品的保存成为决定其中的DNA的结构保持完整与否的一个关键步骤。

冷冻是保持组织成分最有效的方式之一，目前叶片组织的冷冻主要集中在超低温保存，-80℃冰箱保存的样品所提的总DNA的质量和数量都与新鲜叶片相当。但超低温冰箱因价格昂贵、净重大、噪音大、耗电量高、散热量高、工作室温要求16～32℃等缺点，携带不方便，成本高，未能达到节约日常开支的效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，其利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现长时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存。

本发明所采用的技术原理：利用Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；利用EDTA螯合Mg²⁺或Mn²⁺离子，抑制DNase活性；PVP是一种高分子合成树脂，可溶于水、乙醇及氯仿，工业上常用作澄清剂、稳定剂，能络合多酚类物质，防止多酚物质氧化成醌类物质，避免溶液变褐而具有抗氧化作用；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止橡胶树叶片中酚类物质的氧化，避免褐变，有助于酚的去除；葡萄糖增稠，使悬浮后的叶片组织不会快速沉积。

本发明所采用的技术方案：

一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，其步骤如下：

1、采样与处理：采集处于古铜期、变色期或淡绿期的橡胶树叶片，装入取样袋中后快速置于冰盒或冰桶中带回实验室，并将叶片放入预冷研钵中，采用液氮研磨，至叶片成粉末状；与液氮挥发的同时，加入储藏缓冲液到离心管中，然后将粉末状叶片组织转移到离心管中，混匀，待用。所述储藏缓冲液是将Tris-HCl、Na-EDTA、PVP、B-Me和葡萄糖加入到无菌水中配制而成，其中各组分的含量为：Tris-HCl 0.05～0.15M、Na-EDTA 5～15mM、PVP 2～4％(质量百分比)、B-Me 1～3％(V/V)、葡萄糖(Glucose)0.35～0.45M。

2、保存：将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物置于低温环境中进行保存。

所述低温环境是指装有冰块或冰袋的容器。将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物放置于配备冰块或冰袋的泡沫箱里，盖严箱子，用胶带密封，一周内，待测样品仍然保持绿色。

所述低温环境是指温度为-10～-35℃的冷冻环境。将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物放置于-10～-35℃的冷冻环境中保藏即可达到长期保存目的，样品随时可取用，具备-80℃保存或新鲜叶片同样的效果。

本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现长时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，具有工艺简单、成本低、效果好等特点。

附图说明

图1为分别用CTAB、SDS提取的橡胶基因组DNA电泳图谱。

图中：1为采用CTAB法，2为SDS法，3为DNA 10000marker。

图2为分别用CTAB法提取的DNA酶切效果图。

图中：1为反应体系中未加内切酶的对照，2为Pst I单酶切，3为Mse I单酶切，4为Pst I+Mse I双酶切，3为DNA 10000marker。

具体实施方式

下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。

一、储藏缓冲液调配：为提高储藏缓冲液的质量，储藏缓冲液需要调配，对配方中五个主要因素各按三个水平进行试验(见下表)。寻求到最佳的水平组合，保证缓冲液有效、经济。采用该组配方配制储藏缓冲液。

二、DNA提取：

实施例一

1.将经过短期或长期保存的样品取出，室温下融化，用剪去前端部分的1ml枪头转移一部分液态样品到1.5ml离心管，4℃，12000rpm离心15min。

2.弃上清，沉淀中加入65℃预热的650ul 2×CTAB提取缓冲液(2×CTAB提取缓冲液组成：0.1M Tris-HCl，20mM Na-EDTA，1.4MNaCl，2％CTAB，2％PVP，1％(V/V)B-Me)，涡旋混匀或用干净牙签将沉淀搅匀，65℃温浴30～60分钟(温浴的时间可以长至几个小时)。

3.加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)后来回颠倒50次以上，室温静置10min，15℃或常温下，10000rpm离心15分钟，小心吸取上清液转入一新的离心管中(应注意防DNA过多断裂)。

4.加2/3体积预冷的异丙醇，来回颠倒至析出絮状DNA沉淀。4℃，12000rpm离心15分钟，离心管底部可见灰白色DNA小团，弃上清，离心管在室温下倒置20分钟以风干DNA，此时的DNA小团边缘可见晶状透明物。

5.加700ulTE缓冲液，65℃培养至DNA小团溶解。

6.重复第3步1至2次，至上清与氯仿之间的杂质层几乎不见。

7.上清小心转入一新离心管，加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)后加等体积的异丙醇，来回颠倒至析出白色DNA絮状沉淀，4℃，12000rpm离心15分钟，离心管底部可见灰白色DNA小团，弃上清，加600ul 70％乙醇洗DNA小团5分钟(DNA可在70％乙醇中长期保存)，小心倒去乙醇，风干DNA。

8.加TE缓冲液(PH8.0)，水浴30min左右，加RNA酶5μl左右，37℃放置30min，重复5、6、7步，酌量加50～100ul灭菌的TE缓冲液溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。

实施例二

1.将样品从邮寄过来的泡沫盒或-20℃冰箱中取出，经室温融化后，用剪去前端部分的蓝色枪头转移一部分液态样品到10ml离心管，冰浴10min后，4℃，10000rpm离心20min，弃去上清。

2.于沉淀中加入3ml 65℃预热的2％SDS提取缓冲液(2％SDS提取缓冲液组成：100mM Tris-HCl，PH 8.0，50mM EDTA，PH 8.0，100mMNaCl，2％SDS，1％(V/V)B-Me)，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30～45min(水浴时间不可太长，太长易降解)。

3.加入3ml氯仿∶异戊醇(24∶1)翻转50次以上，室温静置10min，15℃，10,000rpm离心20min将上清转入10ml离心管(注意拿时小心轻放，以防DNA过多断裂)。

4.加入0.6V的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4℃，10,000rpm离心20min，弃上清，于沉淀中加入2ml 70％的乙醇洗涤(勿晃动)，并转入5ml的离心管(不转管，可减少DNA损失)，4℃，10,000rpm离心5min，倒去上清，通风干燥20min。

5.加入2ml TE-Buffer，65℃培养30min(时间可视量增减)。

6.加入等V的氯仿∶异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒50次混匀，室温静置5min，15℃，10,000rpm离心10min。

7.上清转入5ml离心管中，加入0.1V的3M醋酸钠(PH5.2)后，加入等V异丙醇后翻转30次，放置30min，4℃，10,000rpm离心10min。弃上清，加入1ml 70％乙醇，洗DNA小团，转入1.5ml的离心管中，10,000rpm，5min，弃上清，自然通风干燥DNA小团。

8.加TE缓冲液(PH8.0)，水浴30min左右，加RNA酶15～20μl左右37℃振荡30～60min重复5、6、7步，后保存。

三DNA纯度和浓度的测定：

①紫外光吸收检测：取1ul DNA稀释至200ul，在紫外分光光度计上测定总DNA在260nm和280nm处的吸光值，根据A260/A280确定DNA纯度。根据260nm处测定的光吸收值估测样品DNA的浓度。

②琼脂糖凝胶电泳检测：取1ul样品在含溴化乙锭(EB)的0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE，泳动速率为7V/cm，紫外灯下观察DNA的质量和大致分子量。

③酶切基因组DNA：用限制性内切酶Pst I、Mse I对基因组总DNA进行消化。酶切反应总体积为20ul，含2.5ul DNA，0.75μl的内切酶和2μl的10×反应缓冲液。37℃水浴4h后，65℃水浴20min终止反应，取10μl酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。

紫外分光仪分析表明来自新鲜叶片的DNA在260nm、280nm、320nm的光吸收值分别为0.151、0.084、0.002，本方法保存样品所得DNA在260nm、280nm、320nm下的吸光值分别为0.347、0.195、0.004，A260/A280，前者为1.798，后者为1.779，两者间无显著差异。基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，Pst I与Mse I酶切效果见图2。

Claims

1.一种用于DNA提取的橡胶树叶片组织保存方法，其特征是其步骤如下：

1)、采样与处理：采集处于古铜期、变色期或淡绿期的橡胶树叶片，装入取样袋中后快速置于冰盒或冰桶中带回实验室，并将叶片放入预冷研钵中，采用液氮研磨，至叶片成粉末状；与液氮挥发的同时，加入储藏缓冲液到离心管中，然后将粉末状叶片组织转移到离心管中，混匀，待用；所述储藏缓冲液是将Tris-HCl、Na-EDTA、PVP、B-Me和葡萄糖加入到无菌水中配制而成，其中各组分的含量为：Tris-HCl 0.05～0.15M、Na-EDTA 5～15mM、PVP 2～4％、B-Me 1～3％、葡萄糖0.35～0.45M；

2)、保存：将处理好的粉末状叶片组织与储藏缓冲液的混合物置于低温环境中进行保存。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述低温环境是指装有冰块或冰袋的容器。

3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述低温环境是指温度为-10～-35℃的冷冻环境。