CN107873699B - 一种橡胶树叶的保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种橡胶树叶的保存方法，包括树叶采集、上石蜡、捆扎、密封、装箱。采用本方法可使橡胶树叶片样品保存5‑7天，且叶片细胞核较少降解，符合流式细胞术检测的样品标准，解决了距离较远的异地橡胶林中优良单株流式细胞术检测过程中面临的叶样运输和保存问题。可延长用于流式细胞术检测的橡胶树叶样的保存期限，有助于科研人员集中采集橡胶树叶片样品、集中检测，降低了采样过程中的往返成本，且本方法对设施要求简单，操作步骤简单易行，且操作成本较低。

Description

一种橡胶树叶的保存方法
技术领域
本发明属于农林经济作物的叶片样本保存技术，具体涉及一种橡胶树叶片样本保存方法，特别是一种适合长距离运输的用于流式细胞术检测的橡胶树叶样保存方法。
背景技术
橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是大戟科（Euphorbiaceae）重要的热带经济作物之一，也是目前唯一大规模产业化的天然橡胶来源，中国的海南、云南两省是国内天然橡胶的主要产地。由于天然橡胶具有合成橡胶所不能替代的独特物理性能，使其在工业和国防等领域有广泛需求，随着经济和社会的发展天然橡胶需求日益旺盛，但目前国内绝大多数天然橡胶原料依然需要进口，供应形势较为严峻。但由于橡胶树属于典型的热带作物，国内宜植土地有限，只能通过提高单位面积产量的方式来增加供给，而选育优良新品种则是提高橡胶树单位面积产量的关键。当前橡胶树新品种选育最为有效的方法之一是从已经投入生产的橡胶林中筛选优异单株，对优异单株进行鉴定后再进行繁殖和育种利用。
流式细胞术以橡胶树的叶片为材料，既可以快速测定橡胶树的基因组大小，又可以快速鉴定橡胶树的染色体倍性，是橡胶树优异单株筛选、鉴定和优良新品种选育的关键技术之一。流式细胞术检测需要依赖于大型设备流式细胞仪进行，该设备属于精密光学设备，体积较大，价格高昂，无法随身携带或频繁转运，对于异地的样本，只能将样本送至流式细胞仪所在地进行检测，且流式细胞术检测的样品必须是细胞核结构完整的活体样本。而需要进行流式细胞术筛选和鉴定的橡胶树优异单株一般都位于远离流式细胞仪所在地的村寨或农场已经投入生产的橡胶林中，往往交通不便，叶样采集工作一个往返往往需要3至5天，且橡胶树种植地气候炎热，若采用常规方式保存和运输用于流式细胞术检测的橡胶树叶片样本，往往叶样还在途中其细胞核已经降解，导致叶样损坏无法用于检测，这给橡胶树优异单株流式细胞术筛选、鉴定和优良新品种选育造成了阻碍。
采用目前已公开或报道的其他叶样保存方法均无法实现用于流式细胞术检测的橡胶树叶样3天以上的运输和保存，目前也尚未见到用于流式细胞术检测的橡胶树叶样较长期的保存方法，尤其是适合长距离运输的用于流式细胞术检测的橡胶树叶样较长期的保存方法。
发明内容
本发明主要解决的问题是公开一种适合长距离运输的用于流式细胞术检测的橡胶树叶样较长期的保存方法。
为解决本发明上述技术问题，所采用技术方案如下：
一种橡胶树叶样保存方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤（1）、树叶采集：采集橡胶树浅绿色嫩叶，保留小叶叶柄；
步骤（2）、上石蜡：采集后1-2 min内，用吸水纸擦除叶柄下端流出的胶乳，手握叶柄上端将叶柄下端1-1.5 mm处伸入融化的石蜡中蘸0.5-1 s，取出1-3 min待石蜡凝固；
步骤（3）、捆扎：取若干上石蜡后的叶片作为1捆，叶柄处用宽度1-1.5 cm的干燥棉纱布缠绕3-5圈，每捆叶片缠绕纱布后将叶柄部插入EP管中；
步骤（4）、密封：取带盖的离心管，在其底部垫上充分湿润但不滴水的棉纱布，将步骤（3）所述的EP管和树叶放入带盖的离心管中，拧紧离心管盖；
步骤（5）、装箱：在泡沫箱底部铺一层已预冷冻好的冰袋，冰袋上铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，将步骤（4）所述离心管铺在泡沫板上，固定，离心管不接触冰袋；在已固定的离心管上层再铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板上再铺一层已预冷冻好的冰袋，盖好泡沫箱盖子，并密封。固定后的离心管既不随意滚动，也不会接触到冰袋。
进一步地，步骤（5）中，每隔24-36h需更换一次冰袋，更换后密封泡沫箱。最多可更换4-5次冰袋，可使橡胶树叶片样品保存4-7天，且符合流式细胞术检测的样品标准。
进一步地，步骤（5）中，泡沫箱深度为30-40cm，口径大小根据样品数量决定。
进一步地，薄泡沫板的厚度为1-2cm。
进一步地，EP管为2.5ml的去除盖子的EP管；带盖的离心管为50 ml。
进一步地，步骤（3）中，取3个上石蜡的叶片作为一捆。
进一步地，充分湿润但不滴水的棉纱布的厚度为1-1.5cm。
本发明的有益效果是：
（1）采用本方法可使橡胶树叶片样品保存5-7天，且叶片细胞核较少降解，符合流式细胞术检测的样品标准，解决了距离较远的异地橡胶林中优良单株流式细胞术检测过程中面临的叶样运输和保存问题。
（2）采用本方法可延长用于流式细胞术检测的橡胶树叶样的保存期限，有助于科研人员集中采集橡胶树叶片样品、集中检测，降低了采样过程中的往返成本，且本方法对设施要求简单，操作步骤简单易行，且操作成本较低。其中，蘸取融化的石蜡可有效避免橡胶树叶片叶柄截口处失水，造成叶片萎蔫和细胞核降解；离心管底部垫上厚度为1.5 cm的充分湿润但不滴水的棉纱布可避免离心管中的空气湿度过小，导致部分橡胶树叶片失水，造成叶片萎蔫和细胞核降解；冰袋上铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板可避免离心管与冰袋直接接触，导致部分橡胶树叶片冻伤，造成叶片损坏和细胞核降解；隔一段时间更换一次冰袋，可防止泡沫箱中的温度过高，导致橡胶树叶片失水，造成叶片萎蔫和细胞核降解。
附图说明
图1为符合流式细胞术检测的样品标准的检测结果；
图2为不符合流式细胞术检测的样品标准的检测结果；
其中，X轴为荧光强度、Y轴为监测到的细胞核数量。
具体实施方式
下面将结合实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是对本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的对云南耿马、芒市、墨江、绿春共4个橡胶树种植区的拟检测的橡胶树单株进行了叶样采集、保存、运输和检测。
包括下列步骤：
步骤（1）、树叶采集：采集橡胶树浅绿色嫩叶，保留小叶叶柄，每个待检测单株采集。
步骤（2）、上石蜡：采集后1.5min内，用吸水纸擦除叶柄下端流出的胶乳，手握叶柄上端将叶柄下端1 mm处伸入融化的石蜡中蘸1 s，取出2 min待石蜡凝固。
步骤（3）、捆扎：取3个上石蜡后的叶片作为1捆，叶柄处用宽度1.5 cm的干燥棉纱布缠绕3圈，每捆叶片缠绕纱布后将叶柄部插入EP管中；EP管为2.5ml的去除盖子的EP管。
步骤（4）、密封：取带盖的离心管，在其底部垫上充分湿润但不滴水的棉纱布，厚度为1.5cm，将步骤（3）所述的EP管和树叶放入带盖的离心管中，拧紧离心管盖；带盖的离心管为50 ml。
步骤（5）、装箱：在泡沫箱底部铺一层已预冷冻好的冰袋，冰袋上铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板的厚度为1cm，将步骤（4）所述离心管铺在泡沫板上，用揉搓后的报纸固定，使50 ml离心管既不随意滚动，也不会接触到冰袋；在已用报纸固定的离心管上层再铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板上再铺一层已预冷冻好的冰袋，盖好泡沫箱盖子，并密封。固定后的离心管既不随意滚动，也不会接触到冰袋。每隔36h需更换一次冰袋，更换后用宽胶带密封泡沫箱。更换4次冰袋。泡沫箱深度为35cm，口径大小根据样品数量决定。
7天后进行常规的流式细胞术检测，发现极大部分样品符合流式细胞术检测的样品标准，可以用于基因组大小测定和染色体倍性鉴定。
极大部分的结果如图1所示，从图1可以看出，样品峰清晰，样品峰的横轴位置容易判断，是符合流式细胞术检测的样品标准的检测结果。
极少部分的结果如图2所示，从图2可以看出，样品峰不清晰，无法判断样品峰的横轴位置，是不符合流式细胞术检测的样品标准的检测结果。
采用上述方法实现了云南省内距离较远的耿马、芒市、墨江、绿春4个橡胶树种植区不同橡胶树单株的集中采样、保存和运输，采样完毕后集中检测，本实施例的方法避免了以往采样过程中因样品不能长期保存导致的多次往返，比以往节省时间4天，节约采样成本0.6万元。
实施例2
对云南耿马、芒市、墨江共3个橡胶树种植区的拟检测的橡胶树单株进行了叶样采集、保存、运输和检测。
包括下列步骤：
步骤（1）、树叶采集：采集橡胶树浅绿色嫩叶，保留小叶叶柄，每个待检测单株采集。
步骤（2）、上石蜡：采集后2min内，用吸水纸擦除叶柄下端流出的胶乳，手握叶柄上端将叶柄下端1mm处伸入融化的石蜡中蘸0.5 s，取出2 min待石蜡凝固。
步骤（3）、捆扎：取3个上石蜡后的叶片作为1捆，叶柄处用宽度1.5 cm的干燥棉纱布缠绕5圈，每捆叶片缠绕纱布后将叶柄部插入EP管中；EP管为2.5ml的去除盖子的EP管。
步骤（4）、密封：取带盖的离心管，在其底部垫上充分湿润但不滴水的棉纱布，厚度为1.5cm，将步骤（3）所述的EP管和树叶放入带盖的离心管中，拧紧离心管盖；带盖的离心管为50 ml。
步骤（5）、装箱：在泡沫箱底部铺一层已预冷冻好的冰袋，冰袋上铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板的厚度为1.5cm，将步骤（4）所述离心管铺在泡沫板上，用揉搓后的报纸固定，使50 ml离心管既不随意滚动，也不会接触到冰袋；在已用报纸固定的离心管上层再铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板上再铺一层已预冷冻好的冰袋，盖好泡沫箱盖子，并密封。固定后的离心管既不随意滚动，也不会接触到冰袋。每隔24h需更换一次冰袋，更换后用宽胶带密封泡沫箱。更换4次冰袋。泡沫箱深度为35cm，口径大小根据样品数量决定。
5天后进行流式细胞术检测，发现样品符合流式细胞术检测的样品标准，可以用于基因组大小测定和染色体倍性鉴定。
采用上述方法实现了云南省内距离较远的耿马、芒市、墨江3个橡胶树种植区不同橡胶树单株的集中采样、保存和运输，采样完毕后集中检测，避免了以往采样过程中因样品不能长期保存导致的多次往返，比以往节省时间3天，节约采样成本0.45万元。其余与实施例1相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于流式细胞术检测的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤（1）、树叶采集：采集橡胶树浅绿色嫩叶，保留小叶叶柄；
步骤（2）、上石蜡：采集后1-2 min内，用吸水纸擦除叶柄下端流出的胶乳，手握叶柄上端，将叶柄下端1-1.5 mm处伸入融化的石蜡中蘸0.5-1s，取出1-3min待石蜡凝固；
步骤（3）、捆扎：取若干上石蜡后的叶片作为1捆，叶柄处用宽度1-1.5 cm的干燥棉纱布缠绕3-5圈，每捆叶片缠绕纱布后将叶柄部插入EP管中；
步骤（4）、密封：取带盖的离心管，在其底部垫上充分湿润但不滴水的棉纱布，将步骤（3）的EP管和树叶放入带盖的离心管中，拧紧离心管盖；
步骤（5）、装箱：在泡沫箱底部铺一层已预冷冻好的冰袋，冰袋上铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，将步骤（4）所述离心管铺在泡沫板上，固定，离心管不接触冰袋；在已固定的离心管上层再铺一层与泡沫箱口径相同的薄泡沫板，薄泡沫板上再铺一层已预冷冻好的冰袋，盖好泡沫箱盖子，并密封。
2.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：步骤（5）中，每隔24-36h需更换一次冰袋，更换后密封泡沫箱。
3.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：步骤（5）中，泡沫箱深度为30-40cm，口径大小根据样品数量决定。
4.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：薄泡沫板的厚度为1-2cm。
5.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：EP管为2.5ml的去除盖子的EP管；带盖的离心管体积为50 ml。
6.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：步骤（3）中，取3个上石蜡的叶片作为一捆。
7.根据权利要求1所述的橡胶树叶的保存方法，其特征在于：充分湿润但不滴水的棉纱布的厚度为1-1.5 cm。
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