CN112913496B - 一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，采集每个材料的一年生休眠枝条，0‑2℃低温保存，取保存的枝条剪成60厘米，在每根枝条上缠绕6‑9圈毛线，饲养桑白蚧雌成虫至产卵，收集橘红色雌卵，将待孵化的卵转移到枝条毛线附近，体式显微镜下记录转移卵的具体数目，枝条放实验室内23±2℃，60±5%RH，14小时光照，10小时黑暗，每周换取烧杯中的水，剪去萌芽，并用凡士林涂抹封闭；卵孵化7天后剪除毛线，记录一龄若虫的定殖数目，桑白蚧二龄以后，引入雄虫与枝条上的雌虫交配；卵孵化40‑45天，记录枝条上活成虫和死虫的数目，根据发育历期、一龄若虫定殖率、成虫期存活率、成虫大小和生殖力评价各材料对桑白蚧的抗性差异。
Description
技术领域
本发明涉及猕猴桃虫害防治领域，具体涉及一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法。
背景技术
猕猴桃(学名：Actinidia chinensis Planch)，也称奇异果，是20世纪新兴水果之一，据检测，每100g猕猴桃鲜果中维生素C的含量棵高达100-400mg，比柑桔高5-10倍，比苹果、桃和葡萄高20-80倍，此外还含维生素B1、B2、B6和E，还含钾、钠、钙、磷、铜、锌、铁等矿物元素和多种氨基酸，是妇女、幼儿和老年人优良的保健、美容果品，被誉为“果中王”。猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)多年生藤本植物，主要分布在马来西亚至俄罗斯西伯利亚东部的广阔地带，中国是猕猴桃的原产地，有59种、43变种(不包括原变种)、7个变型，共计109种(崔致学1993)，主要分布秦岭以南和横断山脉以东的大陆地区。目前作为商业栽培猕猴桃品种可分为三类，美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)，中华猕猴桃(Actinidia chinensis)和红肉猕猴桃(Actinidia chinensis var.rufopulpa C.FLiang et Ferguson)，美味猕猴桃主要分布在四川、重庆、陕西、贵州，其次分布在湖北、河南、湖南、云南、广西等地。中华猕猴桃主要分布在广西、江西、福建、湖南、河南、贵州、湖北等省。河南、贵州、湖南、湖北等为中华猕猴桃和美味猕猴桃的混合分布区。
桑白蚧是一种寄主范围广、食性杂、生殖力强的重要害虫，在猕猴桃上为害成灾，以若虫和雌成虫群集于植株枝干、枝条、叶子上，吸食汁液，降低树体活力，为害污染果实，降低果品等级，影响猕猴桃的商品价值。桑白蚧生殖力较高，发生频率高，种群恢复能力强，常为暴发性害虫等特点。天敌在其大发生之前的控制作用常比较小，一般对其防治策略应以农业防治为基础，化学防治与生物防治并重。单一的防治措施因其局限性均不能取得满意的效果。化学防治应选择初孵若虫出现盛期，尽量选用对天敌昆虫安全性的药剂，兼顾天敌的保护。综合防治的各种技术手段，包括植物检疫、农业防治、生物防治、化学防治、物理机械防治等在实践中完善运用；特别是选育抗病虫品种，利用品种自身抗性抵御病虫害的侵袭是猕猴桃育种的重要方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有材料田间鉴定周期长、结果重复性差等技术的不足，提供一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，本方法以猕猴桃各个种质资源为材料，筛选抗桑白蚧的种质资源及品种，选育抗介壳虫的砧木材料及为培育抗性品种提供亲本材料；介壳虫的蚧壳大小与虫体大小高度相关，介壳虫存活率、介壳大小和生殖力可作为测定寄主感抗性的指标，冬季休眠期剪取一定长度的猕猴桃枝条，在实验室恒温条件下可以维持生长3个月甚至更长时间，枝条可以为介壳虫提供栖息场所生存并生殖从而进行对桑白蚧抗性检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，该检测方法如下：
S1：采集猕猴桃不同种质材料的一年生休眠枝条，用黑色塑料布包裹0-2℃保存备用；
S2：实验时，取保存的枝条标记剪去底部放入盛水的玻璃烧杯中，每枝条剪成60厘米，顶端涂抹凡士林；
S3：在每根枝条上缠绕6-9圈毛线，每个种质材料重复3根枝条；
S4：用昆虫针挑开正在产卵的桑白蚧的虫壳，用0号描笔轻轻将橘红色雌卵转移到称量纸上备用；
S5：用0号描笔轻轻将卵转移到枝条毛线附近，体式显微镜下记录转移卵的具体数目，一般300-500个之间，将枝条水平30-50°角度放置以保证卵不会掉落；
S6：枝条放实验室内23±2℃，60±5％RH，14小时光照，10小时黑暗，每周换取烧杯中的水，剪去萌芽，并用凡士林涂抹封闭；
S7：卵孵化7天后剪除毛线，记录一龄若虫的定殖数目，并用记号笔在傍边划线标记，以便将来容易定位观察；卵孵化27天左右，2龄若虫末期，记录二龄若虫的定殖数目。
S8：桑白蚧二龄以后，引入雄虫与枝条上的雌虫交配；
S9：卵孵化40-45天，记录枝条上活成虫和死虫的数目，计算存活率；并用刻有圆形标尺的透明模版测量蚧壳面积，记录介壳面积＞1.2mm2的介壳数目；
S10：生殖力测定：雌成虫开始产卵1-2天后，体式显微镜下记录体外卵的数目，将成虫放入0.9％的生理盐水中，解剖虫体记录体内卵的数目，两者之和即为单个成虫卵的数目，每次至少测定30个雌成虫。
S11：以红阳猕猴桃和海沃德猕猴桃作为对照，计算各材料上桑白蚧发育历期、一龄若虫定殖率、成虫期存活率、成虫大小和生殖力评价各材料对桑白蚧的抗性差异。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S1中每个材料采集的为一年生枝条，尺寸为长1-1.5米，直径1-2厘米。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S4中收集南瓜或马铃薯上桑白蚧的雌卵。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S5中将雌卵转移到枝条毛线附近，转移卵的数目为300-500。
作为本发明的进一步改进，在23±2℃，60±5％RH培养时，所述步骤S7、S9桑白蚧各龄期的测量时间，S9中透明模版面积0.2-1.4mm2，按0.2mm2递增。
本发明的有益效果是：本发明通过分析不同材料对桑白蚧的抗性，从而选择最优的材料作为猕猴桃种质材料，然后进行猕猴桃的控制性杂交，筛选出抗性品种；可对现有猕猴桃品种进行快速鉴定，评估品种田间栽植时桑白蚧危害程度。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，该检测方法具体步骤如下：
1.每个材料采集一年生休眠枝条，枝条要求为长1.0米，直径1厘米，用黑色塑料布包裹保存于0℃冷库或冷藏柜内备用。
2.次年枝条从冷库内移出，枝条标记并剪去底部10厘米放入盛水的玻璃烧杯中，每枝条剪成60厘米长，顶端用凡士林涂抹较少枝条水分蒸发。
3.毛线轻轻缠绕枝条，一枝条缠6圈，为卵和初孵若虫提供定殖地点。每材料重复3次。
4.桑白蚧的室内饲养，实验选用新鲜,无损伤表皮的马铃薯和南瓜(蜜本品种)，接虫前,各材料先用清水洗干净,用40％氟硅唑8000倍液处理果面，防治后期真菌感染腐烂，再用大量水冲去药液,凉干备用。
采用60cm×45cm自制塑料培养箱，上盖用美工刀切除一半，用纱布封闭，以便盒内能有效的通风透气。箱内用塑料网垫起底部，放入南瓜和马铃薯
南瓜套上尼龙丝袜，以便桑白蚧卵的固着和初孵若虫的着生。收集生长在南瓜或马铃薯上桑白蚧的雌卵并在25℃下培育，卵接近孵化时，用昆虫针挑开虫壳，用0号描笔轻轻将卵转移到称量纸上备用。
5.用0号描笔轻轻将雌卵(300-500粒)转移到枝条毛线附近，体式显微镜下记录转移卵的具体数目，将枝条水平30-50°角度放置以保证卵不会掉落。
6.枝条放实验室培养架上23±2℃,60±5％RH，14小时光照，10小时黑暗，每周换取烧杯中的水，剪去萌芽，并用凡士林涂抹封闭。
7.卵孵化7天后剪除毛线，记录crawlers的定殖数目，并用记号笔在傍边划线标记，以便将来容易定位观察。
8.桑白蚧二龄以后，将枝条与饲养桑白蚧的南瓜混放在一起，以便南瓜上的雄虫孵化后能与枝条上的雌虫交配。
9.卵孵化27天左右，二龄若虫末期，记录枝条上活虫和死虫的数目，计算存活率。
10.卵孵化40-45天，雌成虫期，并用刻有圆形标尺的透明模版测量蚧壳面积。模版标尺面积0.2mm2，记录介壳面积＞1.2mm2的介壳数目。
11.生殖力测定：雌成虫开始产卵1-2天后，体式显微镜下记录体外卵的数目，将成虫放入0.9％的生理盐水中，解剖虫体记录体内卵的数目，两者之和即为单个成虫卵的数目，每次测量30个雌成虫。
12.以红阳猕猴桃和海沃德猕猴桃作为对照，计算各材料上桑白蚧发育历期、一龄若虫定殖率、成虫期存活率、成虫大小和生殖力评价各材料对桑白蚧的抗性差异。
可选的，本发明还提供一种桑白蚧各龄期的界定步骤：桑白蚧自孵化后经过2次蜕皮，分为三个龄期，由于每次蜕皮后，介壳原有的角质层被保留在介壳上，需要解剖昆虫，才能确定蜕皮的准确时间，由于要大量杀死昆虫，这种方法在本研究中被排除。蜕皮后，二龄虫体将旧的角质层推向一边，在解剖镜下可以很清楚看到虫体上透明的月牙状边界，这被用来鉴定第一次蜕皮，定义为二龄初期(一龄末期)。雄成虫出现交配行为发生时间鉴定为成虫初期。以50％出现月牙边界和大量雄虫交配时间定义为一龄末期和二龄末期。交配后至50％雌成虫产卵期间界定为成虫期。
可选的，一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，本发明还提供一种桑白蚧大小测定步骤：各龄期用面积为0.4-1.4mm2的圆形透明标准模版测量，模版标尺面积按0.2mm2递增。当雌虫面积超过1.4mm2时，利用ImageJ软件(version 1.37v)进行测量，用带有标尺的数码相机垂直照像，利用ImageJ软件分析测量桑白蚧介壳的面积。
可选的，一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，本发明还提供一种生殖力测定步骤：雌成虫开始产卵1-2天后，体式显微镜下记录体外卵的数目，将成虫放入0.9％的生理盐水中，解剖虫体记录体内卵的数目，两者之和即为单个成虫卵的数目，每次测量30个雌成虫。
桑白蚧在马铃薯、南瓜两种寄主上的生物学特性。
1.1桑白蚧在两种寄主上的发育历期
桑白蚧卵在马铃薯、南瓜上均能顺利完成世代，在两种寄主上，桑白蚧各龄发育时间几乎一致。完成一个世代，在25℃下50.2-51天；23℃下为58天(表1)。在两种寄主上，雌虫的存活率在一、二龄比较高，二龄末存活率在80.3％-82.2％之间，在成虫期末期存活率在60.4％-67.4％之间(表2)。
表1 23℃和25℃下桑白蚧雌虫在马铃薯和南瓜上的发育历期(天)
注：各龄期以50％种群数目发育情况为测量点，表中数据为3次重复的平均值。
表2桑白蚧孵化定殖到成虫产卵的存活率
注：以桑白蚧初孵若虫定殖后为100％,三次重复，同行相同字母表示在p＜0.05水平上无显著差异(LSD)。
1.2室内桑白蚧发育起点温度和有效积温研究
桑白蚧卵各温度下能正常孵化，卵孵化后的卵壳清晰可见。卵孵化率很高(表3)，孵化率在97.84-100％之间。在培养皿和马铃薯上卵的孵化无显著差异，各温度间无显著差异。以桑白蚧卵的发育起点温度10.75℃为各龄期的起点温度，结合23℃和25℃下雌虫在马铃薯和南瓜上的发育历期(表1)，计算各龄期的有效积温平均值(表4)，卵孵化为一龄若虫需要92日度，一龄为142日度，二龄为205日度，成虫为253日度，完成一个世代需要694日度。
表3桑白蚧卵在20℃、23℃、25℃温度下两种场所的孵化率
表4桑白蚧各龄期的有效积温(日度)
注：以桑白蚧卵的发育起点温度10.75℃为各龄期的起点温度，
2.红阳、海沃德、Hort16A三品种对桑白蚧抗性检测
2.1三品种上的发育历程
桑白蚧在三品种上发育历程基本一致，各阶段无显著差异(表5)，23℃下，卵孵化需要7.2天，一龄需要12.3天，二龄需要19.2天，成虫期需要19.7天，完成一个世代需要58.4天。
表5 23℃条件下雌虫在红阳、海沃特、Hort16A三品种上的发育历程
注：＊雄卵在三品种上孵化一致，可以和三品种上的雌虫交配，无法辨别具体二龄雌虫历程，统一采用平均数据。表中数值为3-5次重复的平均值；同一列相同小写字母表示处理间在p＝0.05水平上差异不显著。
2.2三品种上的定殖率和存活率
桑白蚧初孵若虫在三品种上的定殖率均较低(表6)，在三品种上的定殖率在11.49-36％之间。红阳和Hort16A之间无显著差异，定殖率在17.86-36％之间；海沃特初孵若虫的定殖率为11.49-22.77％，与在红阳和Hort16A两者均呈显著差异。一旦定殖，桑白蚧固定不动，只至完成整个世代，三品种上桑白蚧一龄期间存活率在红阳品种上最低，平均为62.7％，海沃特和Hort16A品种上存活率相近(分别为76.9％和74.5％)，无显著差异。桑白蚧二龄期间存活率较高，在海沃特品种上桑白蚧存活率高(73.4％)与在红阳上(49.4％)呈显著差异。完成一个世代，桑白蚧在海沃特品种上存活率达57.1％，与在红阳(31.6％)呈显著差异,在Hort16A品种上存活率为44.7％(表6)。
表6室内23℃桑白蚧在红阳、海沃特、Hort16A三品种上的定殖率和存活率
注：＊：以定殖后的蚧壳数目为100％，表中数值为3-5次重复的平均值；同一列相同小写字母表示处理间在p＝0.05水平上差异不显著。
2.3雌虫在三品种上各龄期蚧壳面积和生殖力
室内测定桑白蚧一龄末期面积非常小，均低于0.4mm2，二龄末期，在各品种上大小为0.82mm2，无显著差异，进入成虫后，蚧壳面积迅速增大，各品种上成虫面积在2.68-2.99mm2之间，无显著差异；桑白蚧在三品种上呈显著差异，在海沃特上生殖力最低，每雌虫平均产65.1个卵；红阳上生殖力最高，每雌虫平均产139个卵(表7)。
田间成虫介壳面积有所差异，比室内培养介壳面积大，蚧壳面积在海沃特品种上最小，平均蚧壳面积为2.86mm2,与生长在Hort16A的蚧壳面积呈显著性差异。生长在不同品种上的桑白蚧平均生殖力差异很大，生长在海沃特上单个雌虫为129个，与生长在红阳(226个/雌)和Hort16A(194个/雌)上的桑白蚧呈显著性差异(表7)。
表7桑白蚧在红阳、海沃特、Hort16A三品种上各龄期的蚧壳面积和生殖力
注：表中数值为30次重复的平均值；同一列相同小写字母表示处理间在p＝0.05水平上差异不显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，如接种介壳虫的卵还是一龄若虫，测定龄期时间等因素，都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种猕猴桃种质材料对桑白蚧抗性的快速检测方法，其特征在于，该检测方法如下：
S1：采集猕猴桃不同种质材料的一年生休眠枝条，用黑色塑料布包裹0-2℃保存备用；采集时，每个材料采集一年生春梢，尺寸为长1-1.5米、直径1-2厘米；
S2：实验时，取保存的枝条标记剪去底部放入盛水的玻璃烧杯中，每枝条剪成60厘米，顶端涂抹凡士林；
S3：在每根枝条上缠绕6-9圈毛线，每个种质材料重复3根枝条；
S4：卵接近孵化时，用昆虫针挑开桑白蚧虫壳，用0号描笔轻轻将橘红色雌卵转移到称量纸上备用；
S5：用0号描笔轻轻将雌卵转移到枝条毛线附近，体式显微镜下记录转移雌卵的具体数目，一般300-500个之间，将枝条水平30-50°角度放置以保证卵不会掉落；
S6：枝条放实验室内23±2℃，60±5 % RH，14小时光照，10小时黑暗，每周换取烧杯中的水，剪去萌芽，并用凡士林涂抹封闭；
S7：卵孵化7天后剪除毛线，记录一龄若虫的定殖数目，并用记号笔在旁边划线标记，以便将来容易定位观察；桑白蚧二龄以后，引入雄虫与枝条上的雌虫交配；
S8：卵孵化27天左右，处于二龄若虫末期，记录枝条上活虫和死虫的数目，计算存活率；
S9：卵孵化40-45天，处于成虫期，记录枝条上活成虫和死虫的数目，计算成虫存活率；并用刻有圆形标尺的透明模板测量蚧壳面积，记录介壳面积＞1.2mm2 的介壳数目；透明模板面积0.4-1.4 mm 2，按0.2mm2递增；
S10：生殖力测定：雌成虫开始产卵1-2天后，体式显微镜下记录体外卵的数目，将成虫放入0.9%的生理盐水中，解剖虫体记录体内卵的数目，两者之和即为单个成虫卵的数目，每次至少测定30个雌成虫；
S11:根据发育历期、一龄若虫定殖率、成虫期存活率、成虫大小和生殖力，评价各材料对桑白蚧的抗性差异。
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