CN102007129B

CN102007129B - 用作治疗人类脑疾病的前药的雪花胺衍生物

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Publication number: CN102007129B
Application number: CN200880128608.5A
Authority: CN
Inventors: A·马埃利科
Original assignee: Neurodyn Life Sciences Inc
Current assignee: Neurodyn Life Sciences Inc
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2028-04-14
Also published as: CA2721007A1; CN102007129A; CA2721007C; EP2137192B1; EP2137192B8; JP5504253B2; EP2137192A1; PL2137192T3; DK2137192T3; WO2009127218A1; ES2463715T3; JP2011516588A

Abstract

本发明涉及在人类脑疾病治疗中具有高功效和低副作用的挑选的雪花胺衍生物。

Description

用作治疗人类脑疾病的前药的雪花胺衍生物

本发明涉及与雪花胺(galantamine)相比在人类脑疾病治疗中具有更高功效和更低水平不良副作用的挑选的雪花胺衍生物。

植物生物碱雪花胺被记载为胆碱酯酶抑制剂(ChE-I)和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)敏化剂(APL；变构增强配体)，且已提议将雪花胺用于包括阿尔茨海默氏症(AD)在内的几种人类脑疾病的治疗。目前，阿尔茨海默氏症患者对ChE-I和APL治疗的依从性很低，为20％的级别，主要原因为不良作用恶心、腹泻、呕吐、厌食和肌肉痛性痉挛。就雪花胺而言，大多数这些不良作用归因于药物通过胃肠道时的作用以及其通过血脑屏障(BBB)向大脑的渗透非常有限。为了帮助患者应付雪花胺的不良作用，生产商建议将该药物的每日剂量限制为16-24mg每天，并且从4mg/天开始并在2-3个月的时间内通过逐步增加剂量缓慢达到这一剂量。

当以未修饰的药物给药时，雪花胺在脑中非常低水平的蓄积就该药物的治疗作用(即用于治疗认知障碍，例如AD)而言是非常不利的。如～1.3的脑-血浆比例所示，只有小部分的给药药物到达脑部，其他(外周)组织中高水平的药物引起了绝大多数的(如果不是所有的)所观察到的不良作用。雪花胺的大部分外周作用也显示于其之前在治疗包括重症肌无力和脊髓灰质炎在内的许多神经肌肉障碍的应用中。

WO2007/039138中提到了雪花胺的低疏水性和与之相关的向人类脑中的有限分配，并提出了用于克服预期作用于位于脑中枢神经系统的靶分子的药物的这些缺陷的数种方法。在相同的文件中记载了许多显著改善各自的化合物通过血脑屏障(BBB)的运输的雪花胺衍生物并且提出将它们为治疗与认知缺陷相关的各种疾病的药物。

EP-A 648 771、EP-A 649 846和EP-A 653 427均记载了雪花胺衍生物、其制备方法以及它们作为药物的应用，但这些申请均未考虑提高基础化合物和衍生物通过血脑屏障的渗透性以及脑-血浆比例的方法和手段。

US 6,150,354涉及若干用于治疗阿尔茨海默氏症的雪花胺类似物。然而，其未考虑选择性的化学修饰以提高通过血脑屏障的渗透性。

WO 01/74820、WO 00/32199和WO 2005030333涉及用于治疗多种人类脑疾病和其他疾病以及急性功能性脑损伤的雪花胺衍生物和类似物。然而，并未考虑改善血脑屏障渗透性和脑-血浓度比的选择性化学修饰或其他方法。

WO 88/08708、WO 99/21561、WO 01/43697和US 2003/0162770涉及用于治疗多种认知症状的雪花胺衍生物和类似物。然而，并未考虑改善脑-血浓度比的选择性化学修饰或其他方法。

WO 2005/030713涉及用于由那维啶溴代酰胺(narwedine bromoamide)衍生物合成雪花胺旋光异构体的方法。然而，其并未涉及雪花胺的其他衍生物、或者它们作为药物的应用、或者旨在提高所述化合物的脑-血浓度比的化学修饰。

WO 97/40049记载了可用于治疗阿尔茨海默氏症的苯并氮杂 (benzazepine)和相关化合物的若干衍生物。然而，该申请中并未提供用于增加化合物通过血脑屏障的渗透性和提供高脑-血浓度比的构思。

本发明的目的为提供具有在脑中枢神经系统中的高药效和低外周副作用的可用作前药或用作药物的化合物。

这一目的通过权利要求中提供的化合物和组合物来实现。

将所提出的衍生物设计为前药，因为他们能够有效通过血脑屏障(BBB)，并且在通过BBB之后，它们成为内源性酶的底物，并在酶裂解后产生雪花胺。由于在脑中这些前-雪花胺经酶裂解形成雪花胺，与最初给药相同剂量的雪花胺相比，在脑中达到显著更高的雪花胺局部浓度。通过前-雪花胺给药得到的脑中相对更高的药物浓度会随后引起在给定剂量下的更高效力，而且更好的脑-外周组织分布会引起更少或较不显著的治疗副作用。这些作用是本治疗方案的显著改进，因为未修饰的雪花胺(和目前批准用于这一目的的所有其他ChE-I)治疗脑疾病的功效非常有限，尽管可能由于低剂量而具有统计学显著性。因此，通常仅在小心地(长达数月)增加每日剂量后才达到功效，以维持患者对与ChE-I治疗相关的大量胃肠副作用的足够依从性。

根据本发明，已发现使用雪花胺作为基础结构，仔细选择取代基类型和取代的位置得到非常有效的化合物。使用具有通式I的化合物获得了这些具有良好的血脑屏障通过性质并在通过BBB后被酯酶有效裂解的非常有效的化合物

其中R1为具有特殊的立体化学性质和疏水性质的取代基。

本发明主要涉及雪花胺的酯，因此，它与雪花胺相比具有很少的或不具有作为ChE-I和APL的活性。因此，只要这些化合物保持不被裂解，它们不与通常的雪花胺靶分子相互作用并因此在产生疗效和/或不良作用方面几乎是非活性的。

由以下结果证明前-雪花胺降低的反应性：

1.与雪花胺相比，作为ChE-I的活性显著降低。

2.与雪花胺相比，作为烟碱APL的活性降低。

3.与雪花胺相比，胃肠副作用减少。

所有这些方法已做过研究并解释于实施例中且显示于图中。

根据本发明，已发现一类特殊的雪花胺的酯出人意料地显示高脑-血浓度比(R_{BB-前雪花胺}＞6，相对于R_BB-雪花胺～1.3)，并且在脑中它们相对缓慢地被酶解成雪花胺。因此，如下文更详细地所述，这些前雪花胺特别适用于治疗与胆碱能缺乏相关的人类疾病，例如阿尔茨海默氏症、帕金森病、精神分裂症和许多其他精神病。

本发明涉及的雪花胺的酯具有以下一般结构：

式I

其中R1为CH(C₂H₅)CH₃、CH₂-C(CH₃)₃或环丙烷、或者为任选取代的芳族或杂芳族5-或6-元环。具体而言，如果将它们用作治疗与胆碱能缺乏相关的神经变性疾病或精神病或神经病的药物或前药，这些芳族或杂芳族环包括苯、萘、噻吩、吡咯、咪唑、吡唑、噁唑和噻唑。

这样的疾病优选地选自阿尔茨海默氏症和帕金森病、其他类型的痴呆、精神分裂症、癫痫症、神经炎、各种类型的中毒、感觉缺失、特别是神经安定药感觉缺失、自闭症、脊髓病、炎症、特别是中枢炎性疾病、术后谵妄和/或亚综合征术后谵妄(subsyndromal postoperative delirium)、神经性疼痛、酒精和药物滥用的后果、酒精成瘾和尼古丁嗜欲以及放疗后果。

上文提到的化合物还未被记载用于这些疾病的治疗。而且，就本发明人所知根本未曾记载具有选自不为2-氟苯或3-硝基-4氟苯的取代的苯、任选取代的萘、噻吩、吡咯、咪唑、吡唑、噁唑、噻唑的芳族或杂芳族5-或6-元环；或CH(C₂H₅)CH₃、CH₂-C(CH₃)₃或环丙烷的式I化合物。

在一个优选的实施方案中本发明的化合物选自

式II

其中R2-R6包含选自H、卤素、任选取代的C₁-C₃烷基或环丙基、OH、O-烷基、SH、S-烷基、NH₂、NH-烷基、N-二烷基、任选取代的芳基或杂芳基的任意取代基，其中相邻的取代基可配合形成另外的环。

在本发明另一优选的实施方案中，所述化合物选自附于下文的表A中显示的化合物。

本文中术语“前药”是指雪花胺(基础化合物)的衍生物，其中在所述衍生物到达作用区域或者位置时，所添加或者替代至所述基础化合物上的基团被裂解或者恢复至所述基础化合物中原本包含的羟基。因此，就“前药”而言，有效的药剂作为衍生物(其为所述前药)给药，然而，在脑内的靶点处主要或者唯一有效的化合物是所述药剂本身而不是除其基础化合物之外的衍生的化合物或者代谢产物。

术语“衍生物”是指本申请所定义的基础化合物的任何转变。术语“衍生物”用于描述可以作为前药或者可以本身或者以经衍生的形式作为有效药剂的化合物。

术语“前-雪花胺”用于指代本文所述的任意的可以被酶(酯酶)裂解形成雪花胺的雪花胺衍生物。

术语“敏化剂”和“变构增效配体，APL”是指通过在胆碱能受体处于变构位置相互作用而增强胆碱能神经传递的效应器。

术语“胆碱能增强剂”和“胆碱能剂”是指通过抑制胆碱酯酶、通过变构敏化和/或直接激活胆碱能受体和/或通过由第二信使级联激活/调节相关的细胞内通道而增强/调节胆碱能神经传递的化合物。

根据本发明，如果在向活的有机体给药前药或者衍生物后，更高的量的所述化合物透过该有机体的BBB，则衍生物或者前药具有“增强的血脑屏障渗透性”或者“增强的血脑屏障渗透”。

本发明的化合物提供增加的“脑-血浓度比”或“脑-组织浓度比”，与给药无衍生化的基础化合物相比，引起脑中更高水平的有效药剂。用于测定增强的BBB渗透性的方法公开于WO 2007/039138。

本发明的“基础化合物”和“有效药剂”为雪花胺。该有效药剂通过所述衍生物的(局部)酶解获得。

“logP”定义为分配系数P的常用对数，所述分配系数P为化合物在水相中的浓度与化合物在作为中性分子的不能混溶的溶剂中的浓度的比例。

术语“烷基”应当是指直链、支链或者环状的烷基基团。作为“烷基”，优选C₁-C₁₀烷基基团，更优选C₂-C₈基团且最优选C₂-C₆基团。C₁-C₁₀基团表示具有所示数目的碳原子的烷基。实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、以及直链和支链的戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基…等，或者相应的环烷基。

术语“卤素”应当是指氯、氟、溴和碘。

术语“芳基”应当是指具有0、1、2、3、4或5个独立地选自烷基、烷氧基、烷基羰基、卤素或者三卤代甲基的取代基的苯基。

术语“环烷基”应当是指具有3-10个碳原子的环烷基，并且包括多环烷基如金刚烷基、樟脑基和3-去甲金刚烷基。

在任何情况下，当描述两个界点间的范围时是指公开了该范围内的任何值或者整数。例如“C₁-C₁₀”是指C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀；或者“在0.1和1之间”是指0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1。

所述衍生物的立体化学与雪花胺的相同。

雪花胺的苯甲酰基酯之前记载于WO 9921561 A1 Davis，Bonnie M.中有关用雪花胺、石蒜胺和相关化合物治疗注意力障碍的方法中，但是未提供这些化合物的合成或分析数据或其他数据。

取代的苯甲酰基酯之前已记载于“Synthesis and biological activity of galanthamine derivatives as acetylcholinesterase(AChE)inhibitors”，Han，So Yeop；Mayer，Scott C.；Schweiger，Edwin J.；Davis，Bonnie M.；Joullie，Madeleine M.Dep.Chem.，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters(1991)，1(11)，579-80.CODEN：BMCLE8 ISSN：0960-894X.英文杂志，CAN 116：83569 AN 1992：83569CAPLUS。在这一文件中记载了数种雪花胺的酯和氨基甲酸酯衍生物，并且它提出，基于这些化合物作为AChE抑制剂的性质，它们是阿尔茨海默氏症治疗中潜在的治疗药物。

与这些文件的教导相反，本发明的雪花胺酯即使有也只有很少的作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性，相反是所述酶的底物(见上文)。

如在图1中有关苯甲酰基衍生物所代表性地例证的，这些酯即使有也只有很少的乙酰胆碱酯酶抑制活性，相反是被乙酰胆碱酯酶水解成雪花胺并因此充当雪花胺的前药。一旦从这些化合物生成雪花胺，如之前所述，雪花胺充当ChE-I和APL。受试衍生物的结构见表A。作为比较衍生物，也试验了不可裂解的雪花胺醚。这样的衍生物得到为负值的抑制。在衍生物Gln 1063中，式I的R1为-O-Si(CH₃)₂-C(CH₃)₂-C(CH₃)₂H。

如图2中所举例说明的，本申请涉及的前-雪花胺不抑制乙酰胆碱酯酶而是该酶的底物。

图1和2的数据证明本发明的前-雪花胺不像如上文论述的以前的文件中所述地那样充当乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂。相反，它们是这些酶的底物。相似地，它们与神经元烟碱乙酰胆碱受体相互作用的程度也与雪花胺不同(图3)。

因此，本发明的前-雪花胺与明确的雪花胺靶分子特别是乙酰胆碱酯酶和神经元烟碱乙酰胆碱受体不相互作用或仅非常有限程度地相互作用。因此与雪花胺相比，它们作为前药即使有也只具有非常有限的认知增强剂功效，并且也仅产生有限的外周和中枢副作用(见下文)。

如小鼠中的药物代谢动力学所例证和证明(图4a和4b，表1)的，R1-苯甲酰基-雪花胺显示出乎意料地高的脑-血浓度比(R_{BB-前雪花胺}＞19)、高脑中起始浓度，且它仅缓慢地被裂解成雪花胺，这从脑和血中雪花胺峰的延迟出现观察到。所述R_BB-值显著大于从logP值预期的值，这很可能归因所述前药于脑中的缓慢裂解和藉此产生的贮库效应。

表1列出了苯甲酰基-雪花胺、数种其他R1-前-雪花胺和雪花胺(用于比较)的关键药物代谢动力学数据

表1：小鼠中数种R1-前-雪花胺的药物代谢动力学数据

Co为i.v.注射3mg/kg前-雪花胺后在小鼠脑中达到的最高前-雪花胺浓度(ng/ml)。R-Pro为这些实验条件下前-雪花胺的脑-血浓度比，R-Gal为这些实验条件下雪花胺的脑-血浓度比。为了比较，也提供了i.v.注射相同量的雪花胺的Co和R-Gal。

这些数据表明只有特别选择的R1取代基才能够产生前-雪花胺的以下有利性质；高脑中起始浓度、大R_BB和缓慢地酶转化为雪花胺。此外(表中未显示)，优选的R1-前药即使有也只显示很少的副作用，因为它们只是非常缓慢地被转化成雪花胺，藉此很大程度上防止当从给药位点转运至脑中的作用位点时它们作为雪花胺发挥作用。

这些性质对这些化合物作为阿尔茨海默氏症和其他脑病的药物的用途具有显著影响。如图5代表性地显示的，本发明的R1-前-雪花胺比雪花胺在雪貂中显示少得多的胃肠副作用。将雪貂用于这些试验是因为已知它们对胃肠副作用特别敏感。除了对雪花胺和其他ChE抑制剂的典型呕吐反应外，我们记录了“无；0”、“中度；0.5”(以低频率和/或低强度观察到的行为)和“强烈；1.0”(频繁和/或持续和/或以高强度观察到的行为)水平的流涎(SA)、战栗(SH)、呼吸问题(RP)和腹泻(DI)，并将这些试验中的四只动物(每个药物剂量使用一只)的评分相加。

图5描述的两种前-雪花胺的数据证明，它们在雪貂中的副作用情形的严重度比与相同剂量的雪花胺低得多(低5-6倍)。该有利的副作用情形很可能归因于这些R1-前-雪花胺与乙酰胆碱酯酶和神经元烟碱乙酰胆碱受体相互作用的亲和力降低(图1，3)。

所挑选的R1-前药通过血脑屏障进入脑的转运增强、在中枢神经系统中靠近靶点处被酶转化成雪花胺以及与这些位点的相互作用的这些优点产生药物诱导的小鼠遗忘症的逆转增强，如图6关于三种前-雪花胺(以及用于比较的雪花胺)所显示的。

图的数据显示，Gln-1062在逆转由东莨菪碱诱导的小鼠遗忘症方面的效力是雪花胺的4倍高。本领域技术人员可以预期，当给药该特定的R1-前-雪花胺而不是雪花胺，在人体中可达到相似的或更大的药效增加。R1-前-雪花胺有利的药物性质(更高功效、更少或强度更小的副作用)也显示于其他动物模型中。

总之，本发明化合物尤其可用作治疗与胆碱能缺乏相关的人类脑疾病，包括神经变性疾病阿尔茨海默氏症和帕金森病以及神经/精神疾病、血管性痴呆、精神分裂症和癫痫症的药物。基于使用各种动物模型的临床前研究，与雪花胺相比，这些化合物具有显著减少的副作用，包括即使有也是更少的呕吐反应、腹泻和呕吐事件。而且，当被酶裂解时，所得雪花胺在脑中显示有利的药物代谢动力学分布，并且由于其在脑中的浓度增加，也显示与位于脑中的靶分子的相互作用方面的功效增强。整体来看，这些性质使得以R1-前药形式给药雪花胺成为上文所述疾病的优选给药方法。

图

图1：雪花胺和数种前-雪花胺对脑酯酶的抑制

使用20％小鼠脑匀浆，加入200μM乙酰硫胆碱作为底物，并根据Riddles PW，Blakeley RL，Zerner B.，“Reassessment of Ellman′s reagent.”Methods Enzymol.1983；91：49-60测量初始反应动力学。如图所示，即使50μM的各种前-雪花胺仍不能达到在大小上与1μM雪花胺可比的脑胆碱酯酶抑制水平。不可裂解的雪花胺衍生物(Gln 1063)产生负值。在衍生物Gln1063中，式I的R1为-O-Si(CH₃)₂-C(CH₃)₂-C(CH₃)₂H。

图2：酶裂解前-雪花胺生成雪花胺

使用25单位/ml的丁酰胆碱酯酶。反应温度为37℃。通过荧光检测测定荧光反应产物雪花胺的出现。

图3：雪花胺和前-雪花胺与异位表达于HEK-293细胞中的a4β2神经元烟碱乙酰胆碱受体的相互作用

通过全细胞膜片钳记录测定分别在雪花胺和Gln-1062存在下对乙酰胆碱响应的增加。雪花胺达到～40％的最大响应增强而前-雪花胺达到仅～17％的最大增强。

图4：前-雪花胺Gln-1062(3mg/kg)在小鼠中的药物代谢动力学

图4a显示了所施用的前-雪花胺的可测量浓度和脑中通过裂解前-雪花胺得到的雪花胺的浓度。以最高浓度起始的曲线指的是脑中的衍生物GLN-1062，其为苯甲酰基-雪花胺。图4b为图4a的节选(“放大”)，更详细地显示0.00和1.00μg/g(物质/体重)之间的浓度范围。在图4b中，上面的曲线指脑中所得雪花胺的浓度，中间的曲线显示血中的雪花胺浓度，以约0.3μg/g浓度起始并降低的曲线指血中的GLN-1062浓度。

图5：分别施用雪花胺和数种R1-前-雪花胺后在雪貂中的胃肠副作用行为指数

图6：分别存在雪花胺和数种R1-前-雪花胺时小鼠中东莨菪碱诱导的遗忘症的逆转。

东莨菪碱诱导的记忆缺失，该记忆缺失可通过在T-迷宫试验中交替的增加来测量。在T-迷宫试验前20分钟，将认知增强药物以数种不同剂量与东莨菪碱一起i.p.注射。测量恢复，为剂量的函数，并且测定每种药物的EC₅₀。

实施例

衍生物的化学合成和化学性质的实施例

缩写：DCM：二氯甲烷；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DCC：二环己基碳二亚胺；DCHU：二环己基脲

一般方法1

向(-)-氢溴酸雪花胺(1.0摩尔)和三乙胺(4.0mol)的DCM(30mL)溶液中加入DMAP(0.5mol)，然后加入相应的酰基氯或酸酐(1.2mol)。将该混合物于室温下在氩气下搅拌过夜。以10％NaHCO₃和盐水洗涤该反应混合物，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。通过柱色谱法或重结晶纯化获得的粗品化合物得到纯净产物。

使用该方法获得以下化合物：

实施例1：O-苯甲酰基雪花胺(=(4aS,6R,8aS)-4a,5,9,10,11,12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a,3,2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇,苯甲酸酯(酯));产率：78%

实施例2：O-3,4-二氯苯甲酰基雪花胺(=(4aS,6R,8aS)-4a,5,9,10,11,12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a,3,2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇,3,4-二氯苯甲酸酯(酯));灰白色固体；mp.69-70℃。

[0087] ¹H NMR(200MHz,CDCl₃)δ(ppm)8.02(d,J=1.88Hz,1H),7.81(dd,J=1.88Hz,J=8.38Hz,1H),7.38(d,J=8.32Hz,1H),6.62(d,J=8.18Hz,1H),6.52(d,J=8.18Hz,1H),6.32(d,J=10.34Hz,1H),5.89-5.97(m,1H),5.51(t,J=4.43Hz,1H),4.58(s,1H),4.07(d,J=15.16Hz,1H),3.18(s,3H),3.61(d,J=15.16Hz,1H),3.21-3.45(m,1H),2.96-3.05(m,1H),2.66-2.76(m,1H),2.34(s,3H),2.0-2.19(m,2H),1.51-1.59(m,1H)。

[0088] 实施例3：O-4-甲氧基苯甲酰基雪花胺(=(4aS,6R,8aS)-4a,5,9,10,11,12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a,3,2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇,4-甲氧基苯甲酸酯(酯));灰白色固体；mp.183-184°C。

¹H NMR(200MHz,CDCl₃)δ(ppm)8.01(d,J=9.0Hz,2H),8.56(d,J=8.86Hz,2H),6.69(d,J=8.18Hz,1H),6.58(d,J=8.2Hz,1H),6.35(d,J=10.2Hz,1H),6.0-6.07(m,1H),5.56(t,J=4.49Hz,1H),4.66(s,1H),4.15(d,J=15.18Hz,1H),3.89(s,3H),3.84(s,3H),3.68(d,J=15.18Hz,1H),3.29-3.53 (m，1H)，3.04-3.12(m，1H)，2.73-2.81(m，1H)，2.41(s，3H)，2.08-2.26(m，2H)，1.58-1.66(m，1H)。

实施例4：O-4-甲基苯甲酰基雪花胺(＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇，4-甲基苯甲酸酯(酯))；灰白色固体；mp.71-72℃。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.94(d，J＝8.18Hz，2H)，7.17(d，J＝8.06Hz，2H)，6.69(d，J＝8.18Hz，1H)，6.58(d，J＝8.2Hz，1H)，6.35(d，J＝9.52Hz，1H)，6.0-6.08(m，1H)，5.57(t，J＝4.43Hz，1H)，4.66(s，1H)，4.17(d，J＝15.18Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.70(d，J＝15.18Hz，1H)，3.31-3.43(m，1H)，3.06-3.13(m，1H)，2.74-2.83(m，1H)，2.42(s，3H)，2.38(s，3H)，2.08-2.26(m，2H)，1.59-1.67(m，1H)。

实施例5：O-4-氯苯甲酰基雪花胺(＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇，4-氯苯甲酸酯(酯))；灰白色固体；mp.72-74℃。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.91(d，J＝8.74Hz，2H)，7.27(d，J＝8.72Hz，2H)，6.62(d，J＝8.2Hz，1H)，6.52(d，J＝8.2Hz，1H)，6.30(d，J＝10.34Hz，1H)，5.92-6.0(m，1H)，5.5(t，J＝4.36Hz，1H)，4.59(s，1H)，4.09(d，J＝15.18Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.63(d，J＝15.18Hz，1H)，3.23-3.46(m，1H)，2.99-3.06(m，1H)，2.66-2.76(m，1H)，2.35(s，3H)，2.0-2.2(m，2H)，1.52-1.6(m，1H)。

实施例6：O-2-噻吩甲酰雪花胺(＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇，噻吩-2-羧酸酯(酯))；灰白色固体；mp.115-116℃。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.78(dd，J＝1.2Hz，J＝3.8Hz，1H)，7.51(dd，J＝1.34Hz，J＝4.96Hz，1H)，7.04(dd，J＝3.76Hz，J＝4.98Hz，1H)，6.69(d，J＝8.18Hz，1H)，6.59(d，J＝8.04Hz，1H)，6.35(d，J＝10.2Hz，1H)，6.02(dd，J＝4.7Hz，J＝10.2Hz，1H)，5.54(t，J＝4.49Hz，1H)，4.63(s，1H)，4.18(d，J＝15.02Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.71(d，J＝15.18Hz，1H)，3.31-3.5(m， 1H)，3.07-3.14(m，1H)，2.73-2.83(m，1H)，2.42(s，3H)，2.04-2.26(m，2H)，1.6-1.68(m，1H)。

实施例7：O-5-氯-2-噻吩甲酰雪花胺(＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂 -6-醇，5-氯噻吩-2-羧酸酯(酯))；灰白色固体；mp.58-59℃。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃δ(ppm)7.5(d，J＝4.04Hz，1H)，7.80(d，J＝4.02Hz，1H)，6.62(d，J＝8.04Hz，1H)，6.52(d，J＝8.06Hz，1H)，6.31(d，J＝10.2Hz，1H)，5.92(dd，J＝4.57Hz，J＝10.2Hz，1H)，5.45(t，J＝4.36Hz，1H)，4.56(s，1H)，4.08(d，J＝15.16Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.61(d，J＝15.18Hz，1H)，3.21-3.34(m，1H)，2.97-3.04(m，1H)，2.64-2.74(m，1H)，2.34(s，3H)，1.97-2.19(m，2H)，1.5-1.57(m，1H)。

一般方法2

向对应的酸(13.87g，135.8mmol)在DCM(250mL)中的溶液加入DCC(33.62g，162.9mmol)，然后加入DMAP(3.32g，27.15mmol)，室温下将反应混合物再搅拌30分钟。向其中加入(-)-氢溴酸雪花胺(10.0g，27.15mmol)和三乙胺(4.6mL，32.59mmol)，将该混合物于室温下在氩气下搅拌过夜。过滤去除沉淀的DCHU，并蒸发滤液。通过接着以冷乙酸乙酯研磨和过滤去除另外的DCHU。将乙酸乙酯溶液旋转蒸发并通过柱色谱法纯化获得的粗产物得到期望的产物。

实施例8：

使用一般方法2以53％的产率获得固体2-甲基丁酰基雪花胺(＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇，2-甲基丁酸酯(酯))。

使用一般方法1也获得在各方面一致(HPLC、m.p.、1H-NMR)的相同产物，产率为58％。

实施例9：

使用一般方法1以63％的产率获得固体2-甲基丙酰基雪花胺 (＝(4aS，6R，8aS)-4a，5，9，10，11，12-六氢-3-甲氧基-11-甲基-6H-苯并呋喃[3a，3，2-ef][2]苯并氮杂

-6-醇，2-甲基丙酸酯(酯))。

实施例10：

2-甲基丙酰基雪花胺盐酸盐

于0℃向2-甲基丙酰基雪花胺(150mg，0.43mmol)的乙酸乙酯(5mL)溶液中边搅拌边缓慢加入用HCl饱和的乙酸乙酯(5mL)。在室温下将该反应混合物搅拌1h。将溶剂蒸发并以干乙醚洗涤获得的剩余物并在高真空下干燥，得到164mg(97％)期望的产物，为灰白色固体。

C₂₁H₂₇NO₄(1.5HCl)理论元素分析：C，61.2；H，6.97；N，3.40.测量值：C，61.62；H，6.95；N，3.91.

实施例11：

2-甲基丙酰基雪花胺柠檬酸盐

于室温下向2-甲基丙酰基雪花胺(150mg，0.43mmol)的甲醇(5mL)溶液中边搅拌边缓慢加入柠檬酸的甲醇(5mL)溶液。室温下将该反应混合物搅拌1h。将溶剂蒸发并从甲醇-乙醚中沉淀出所得剩余物，并在高真空下干燥，得到187mg(81％)期望的产物，为灰白色固体。

C₂₇H₃₅NO₁₁(1.0H₂O)理论元素分析：C，57.14；H，6.57；N，2.47.测量值：C，57.43；H，6.48；N，2.53.

一般方法3

于0℃在氮气下向搅拌的(-)-氢溴酸雪花胺(1.10mmol)的吡啶(6mL)溶液中加入对应的酰基氯(2.2mmol)，并搅拌混合物直至TLC显示反应完全。接着加入CH₂CL₂(10mL)和水(10mL)并继续搅拌30min。分离有机层，用水(2×10mL)洗涤，在无水MgSO₄上干燥并去除溶剂。通过快速色谱法纯化剩余物，得到在所有方面与实施例1的产物相同的产物。

实施例12：

合成R1-吡啶甲酰基雪花胺

除了上文提供的实施例，通过所描述的一般方法制备了以下化合物：

表2

MF MW 取代基R1

C₂₁H₂₅NO₄ 355.43 环丙烷羧酸酯

C₂₄H₂₃Cl₂NO₄ 460.3 3，4-二氯苯甲酸酯

C₂₈H₃₃NO₄ 447.57 4-叔丁基苯甲酸酯

C₂₅H₂₃ClF₃NO₄ 493.91 4-氯-3-(三氟甲基)苯甲酸酯

C₂₅H₂₃F₃N₂O₆ 504.46 4-硝基-3-(三氟甲基)苯甲酸酯

C₂₅H₂₄F₃NO₄ 459.47 4-(三氟甲基)苯甲酸酯

C₂₄H₂₃Cl₂NO₄ 460.36 2，4-二氯苯甲酸酯

C₂₄H₂₄N₂O₆ 436.47 4-硝基苯甲酸酯

C₂₄H₂₄ClNO₄ 425.92 3-氯苯甲酸酯

C₂₅H₂₄F₃NO₄ 459.47 3-(三氟甲基)苯甲酸酯

C₂₄H₂₄N₂O₆ 436.47 3-硝基苯甲酸酯

C₂₄H₂₃Cl₂NO₄ 460.36 3，5-二氯苯甲酸酯

C₂₆H₃₀N₂O₄ 434.54 3-(二甲基氨基)苯甲酸酯

C₂₅H₂₇NO₄ 405.50 3-甲基苯甲酸酯

C₂₄H₂₄ClNO₄ 425.92 2-氯苯甲酸酯

C₂₄H₂₃F₂NO₄ 427.45 2，4-二氟苯甲酸酯

C₂₄H₂₃Cl₂NO₄ 460.36 2，5-二氯苯甲酸酯

C₂₄H₂₄FNO₄ 409.46 4-氟苯甲酸酯

C₂₆H₃₀N₂O₄ 434.54 4-(二甲基氨基)苯甲酸酯

C₂₄H₂₆N₂O₄ 406.49 4-氨基苯甲酸酯

C₂₇H₃₂N₂O₄ 448.57 4-(二甲基氨基)-3-苯甲酸甲酯

C₂₅H₂₅NO₆ 435.48 2H-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-羧酸酯

C₂₆H₂₇NO₅ 433.51 4-乙酰基苯甲酸酯

C₂₂H₂₃NO₄S 397.50 噻吩-3-羧酸酯

C₂₁H₂₃N₃O₄ 381.44 1H-咪唑-5-羧酸酯

C₂₁H₂₂N₂O₅ 382.42 1，3-噁唑-5-羧酸酯

C₂₁H₂₂N₂O₄S 398.48 1，3-噻唑-5-羧酸酯

C₂₁H₂₂N₂O₄S 398.48 1，3-噻唑-2-羧酸酯

C₂₆H₂₇NO₆ 449.51 2-(乙酰氧基)苯甲酸酯

实施例13

小鼠脑匀浆的制备

将脑从动物(小鼠)中取出，快速冷冻在液氮中并保存于-80℃直至使用。在制备该提取物之前，将冰冻的脑在冰上融化并测定重量。将冰冷缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、2.5mM CaCl₂、1mM MgCl₂、5mM葡萄糖、5mM HEPES，pH 7.4)加到已融化的小鼠脑(重量体积比为1∶4，得到20％脑匀浆)。然后在位于冰上的波特匀浆器中将组织匀浆，以240rpm上下移动活塞11次。将新鲜制备的小鼠脑匀浆分成等分部分。

实施例14

用于测量脑酯酶的抑制的方法。结果显示于图1。

使用修改的Ellmann酯酶试验。简而言之，该方法依赖于裂解底物乙酰硫胆碱生成醋酸盐和硫胆碱。后者与DNTB(5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸))反应得到黄色化合物，其可经光谱测定法定量。温育缓冲液包含51mmol/l磷酸钠缓冲液和0.05％Tween 20，pH 7.2，并添加了100mg/l DTNB和0.2％小鼠脑匀浆(按照实施例13所述制备)。将待研究的化合物加入至所需浓度。使混合物处于37℃并通过加入200μM乙酰硫胆碱起始反应。在酶标仪中以1s间隔测量A₄₀₅，持续40s。吸收-时间曲线的线性部分表示酶反应的起始速度并用于反应速度的计算。曲线的斜率对应反应速度。根据下列等式将抑制表示为未抑制的反应的百分数：

％抑制＝100*(1-(斜率_抑制/斜率_未抑制))

实施例15

在小鼠脑匀浆中测定前药裂解的方法

向根据实施例13制备的等分小鼠脑匀浆等分部分中加入前-雪花胺衍生物并调节至10μM的前药终浓度。在温育时间结束时，向0.1ml反应混合物中加入12μl 0.1M NaOH和100μl饱和的KCl并充分混匀。以200μl甲苯萃取剩余的前药和释放的雪花胺。使用150μl甲苯重复甲苯萃取步骤两次并将所得萃取物合并、干燥、溶于50％甲醇中并用于后续的HPLC分析。

实施例16

通过电生理学研究候选药物对表达于HEK-293细胞的烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的变构调节作用。结果显示于图3。

在测量之前将表达人α4β2、人α3β4或嵌合鸡α7(无小鼠5HT₃)nAChR的单一HEK-293细胞接种于纤连蛋白包被的盖玻片上，保持3天。将所选择的包含nAChR的细胞置于记录槽中，充满胞外缓冲液(145mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、2mM CaCl₂、10mM D-葡萄糖、10mM HEPES，pH 7.3，约300mOsm)。膜片钳系统由倒置显微镜(Zeiss，Germany)、计算机控制的具有PatchMaster软件的膜片钳放大器(HEKA，Germany)、输液管灌流系统(ALA，USA)与U-形管施用器(IMM，Germany)和双显微操作仪组成。膜片电极(pipette)从经火焰抛光的、长100mm和宽1.5mm的单根硼硅玻璃毛细管(WPI，Germany)拉制成。使用程序控制的拉制仪(Sutter，USA)制备完全相同的一对即用型电极。每个膜片电极(阻抗4-8MΩ)仅使用一次。电极充满内缓冲液(140mM CsCl、11mM EGTA、10mM HEPES、2mM MgCl₂，pH 7.3，约300mOsm)并与工作电极相连。用于实验的工作电极和参比电极由每日更换的新鲜氯化的银丝(40mm x 0.4mm)制成并与膜片钳放大器的探头电路(headstage circuit)连接。使用振幅为-1mV持续时间为20ms的矩形试验脉冲进行膜片形成。吉欧封口形成后立即向膜片电极施加-70mV的钳制电压，并通过使用负压脉冲建立全细胞记录。对于快速和慢速膜电容的所有必要补偿以及系列电阻瞬态均在PatchMaster软件内自动设定。通过以对各种适当的nAChR亚型的EC₅₀(α4β2和α3β4EC₅₀＝30μM，嵌合α7EC₅₀＝3μM)施加烟碱来激发全细胞电流。为了评价所选化合物对各亚型的nAChR的变构增效配体(APL)作用，将它们以下列浓度加入以刺激烟碱溶液：1、5、10、50、100、500、1000、5000和10000nM，并通过所述U形管在500ms脉冲过程中将溶液施加至细胞表面，接着记录被数字化至10kHz的对应的电流，持续10s。以2min间隔进行持续的电流刺激以避免nAChR脱敏并确保刺激溶液的完全交换。将在所选化合物浓度存在下测量的电流的平均峰值与在不存在化合物(对照)下测定的那些平均峰值进行比较，并将它们计算为对照％。特定化合物的APL效力的测量最少在五个细胞上重复进行以获得平均值+/-SD。未超过15％的所观察到的APL效力的平均值被认为是非显著性的。为了表现特定化合物的浓度-依赖性 APL效力，将对应的对照％值+/-SD对所使用的浓度作图。

实施例17

前-雪花胺Gln-1062(3mg/kg)在小鼠中的药物代谢动力学，结果显示于图4。

研究目的

测定Gln-1062及其裂解产物雪花胺在血和脑中的药物代谢动力学分布。测定Gln-1062及其裂解产物雪花胺的脑-血浓度比并评价血-脑屏障渗透能力。

研究计划

生物分析

使用LC/MS/MS评价用于估算Gln-1062的分析方法的线性、精确度&准确度以及在SAM血和脑匀浆中的回收。

LC/MS/MS参数

用于Gln-1062和雪花胺分析的色谱条件和萃取条件参数为

色谱参数：

色谱柱：Phenomenex Synergi，Polar-RP 80A，C18，

75x2.0mm，4μ

流动相

流动相缓冲液：40mM甲酸铵，pH 3.5

水相储液瓶(A) ：10％缓冲液，90％水

有机相储液瓶(B) ：10％缓冲液，90％乙腈

流速：0.450mL/min

梯度程序：

3	1	0	100
				3.1	1	100	0
5	1	100	0

转向阀时间表

运行时间：5.0min

柱加热器温度：环境温度

自动进样器温度：环境温度

自动进样器洗涤：水∶乙腈∶含0.2％甲酸的异丙醇，1∶1∶1(v/v/v)

保留时间：Gln-1062 ：3.33±0.05min.

雪花胺：2.44±0.05min

美托洛尔：2.80±0.05min.

质谱参数(API 3200)：

模式：MRM

极性：正极

离子源：涡轮喷雾

分析物：Gln-1062(Q1质量392.4；Q3质量213.2)

雪花胺(Q1质量288.3；Q3质量213.1)

ISTD：美托洛尔(Q1质量268.4；Q3质量116.2)

源/气体参数

帘气(CUR)10

碰撞气体

(碰撞相关解离)CAD 5

离子喷雾电压(IS) 5500V

温度(TEM)575℃

GS1 55

GS2 45

Ihe 开

化合物参数

参数	雪花胺	美托洛尔	Gln-1062
				去簇电压(V)	45	35	50
入口电压(V)	10	10	10
				碰撞池入口电压(V)	20	20	20.00
碰撞能量(eV)	32	26	32
				碰撞池出口电压(V)	4.5	2	5
停留时间(milliSec)	200	200	200

提取方法：

A STD、QC和试验样品的制备

向50μL血/脑匀浆研究/加标样品中加入150μL含

美托洛尔(100.03ng/mL)的冷乙腈

↓

涡旋30秒

↓

于4℃下以13000rpm离心10min

↓

用100μL milli-Q水稀释100μL上清

↓

涡旋并转移至预标记的自动进样器小瓶中

B用于回收的校正曲线标准品的制备

向50μL空白血/脑匀浆中加入150μL含

美托洛尔(100.03ng/mL)的冷乙腈

↓

涡旋30秒

↓

于4℃下以13000rpm离心10min

↓

分离上清

↓

向198μL上述上清中加入2μL标记溶液-II并涡旋

↓

用100μL milli-Q水稀释100μL以上混合物

↓

涡旋并转移至预标记的自动进样器小瓶中

方法评价

评价该方法的线性、精确度&准确度以及Gln-1062在SAM血和脑匀浆中的回收。

A.线性、精确度&准确度

提取并分析单一标准曲线和三个质量控制(QC)水平的各六次重复(共18个QC)。通过加权最小二乘回归分析测定校正曲线的线性。

接受标准

i.九个标准品中的至少六个具有标准值±15％的准确度，除了在定量下限(LLOQ)处±20％是可接受的。

ii.批QC的三分之二和各水平QC的至少一半必须具有标准值±15％的理论准确度。

iii.批内平均精确度和准确度

1.六个QC中的四个必须可用于测定准确度和精确度。

2.各QC水平的批内变异系数(％CV)不得超15％且每次验证的平均值的准确度应是可接受的。

血和脑匀浆基质中的Gln-1062线性、精确度和准确度分别显示于表1&2。

B.回收

也评价了Gln-1062从血和脑匀浆基质的回收。

用在如5.3B所述的提取后(空白提取物)样品基质中制备的标准曲线，通过定量提取过的基质QC样品中的分析物的浓度，来测定回收率。

血和脑匀浆基质中的Gln-1062回收率分别显示于表3&4。动物试验

试验设计

样品采集

血液采集：

从眼眶后静脉丛采集血样。将0.5ml血采集到预标记的包含柠檬酸钠作为抗凝剂的聚丙烯微量离心管中并保存在冰上。

将血和抗凝剂轻轻混合，并如章节5.3A所述立即沉淀50μL的等分血样。将各时间点剩余体积的血样在干冰上冷冻。

将所有血样转移到分析部并冷冻于-80±10℃直到使用。

脑采集：

抽血后立即用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌注脑，摘除并在干冰上冷冻。

将所有的脑样品转移到分析部并冷冻于-80℃直到分析。

脑匀浆制备：

将脑样品在冰上融化并称重。加入适当体积的冰冷匀浆介质(甲醇∶水：20∶80，v/v)。在冰上，用polytron匀浆器将脑样品匀浆并用匀浆介质补足体积得到每4mL匀浆1gm脑。匀浆后，立即将脑匀浆样品冷冻于-80℃直到分析。

实施例18

分别给药雪花胺和数种R1-前-雪花胺后，在雪貂中的胃肠副作用的行为指数。结果显示于图5。

试验系统

在本研究中使用14只成年雄性蒙眼貂(Putoris furo)雪貂(Marshall BioResources(North Rose，USA))，其在实验日的体重为750-1000克。与资助者达成一致，将14只动物中的4只包括于两个试验组中(表3和4，雪貂#1、2、3和4)。

动物饲养

动物适应至少持续5天。接收时，将动物集体饲养在Syncrosome的房屋内的笼子中。它们可以自由获取食物和随便饮水。

试验项目和参比化合物

在该研究中，试验了一种参比化合物(雪花胺)和一种Galantos候选化合物(GLN979)，各两个剂量。以表1详细记载的剂量和浓度I.P.给药两种化合物。

不同化合物装运的详细信息显示于表2。

按照资助者的要求，将相同的溶媒(15％2-羟丙基-β-环糊精/96mM NaCl)用于雪花胺制剂和GLN979制剂二者。Galantos通过邮件向Syncrosome寄送了详细的增溶方案并于2007年11月5日收到该方案。

受试化合物(GLN979)

性质 GLN979.

摩尔质量 U.I.

给药剂量 20和40mg/kg B.W.

给药途径 I.P.

溶媒 15％2-羟丙基-β-环糊精/96mM NaCl.

参比化合物(雪花胺)

性质雪花胺

摩尔质量 U.I.

给药剂量 3和20mg/kg B.W.

给药途径 I.P.

溶媒 15％2-羟丙基-β-环糊精/96mM NaCl.

I.P.给药

对于4个实验组，在未麻醉的动物中通过I.P.途径在T₀时进行给药(图1)。各组的给药体积详述于表1。

呕吐试验

将化合物溶液I.P.给药后，由经过培训的技术人员连续观察动物四小时。在这一阶段，记录呕吐发作的次数(导致一部分胃肠内容物排出的连续干呕)。

行为观察

在4个小时的观察阶段中，也观察到数种副作用(流涎、战栗、呼吸问题和腹泻)。对于每一种这些行为，由资助者确定评分方法。根据其严重度，将每一参数量化为：

-“无”(无)：未观察到行为

-“中度”(Mod.)：以低频率和/或低强度观察到了行为

-“强烈”(Int.)：频繁和/或持续和/或以高强度观察到了行为

选择标准

所有接受参比或受试化合物的I.P.给药的动物均包括于本研究中，与它们的呕吐反应和行为二者的类型无关。

实施例19

东莨菪碱诱导的小鼠遗忘症的逆转，结果显示于图6。

药物制备

将Gln 1062、Gln 0979和雪花胺溶解于由资助者提供的96mM NaCl(等渗的)中的15％2-羟丙基-β-环糊精中。使用浓度为0.01、0.03、0.1和0.2mg/ml的Gln 1062和Gln 0979，当以10ml/kg的体积给予时，它们分别得到0.1、0.3、1和2mg/kg的i.p.剂量。使用浓度为0.03、0.1、0.2和0.5mg/ml的雪花胺，当以10ml/kg的体积给予时，它们分别得到0.3、1、2和5mg/kg的i.p.剂量。对照动物接受作为溶媒的96mM NaCl(等渗的)注射液中的15％2-羟丙基-β-环糊精。

将烟碱((-)-烟碱酒石酸氢盐，Sigma，France)、东莨菪碱(-(-)东莨菪碱盐酸盐，Sigma，France)分别以0.04和0.1mg/ml的浓度溶解于盐水(0.9％NaCl，Aguettant，France)中。将它们以10ml/kg的剂量体积给药以分别达到0.4和1mg/kg的剂量。

实验动物

将四到五周龄的雄性CD-1小鼠(Janvier；Le Genest St Isle-France)用于本研究。

将它们分组饲养(每笼10只小鼠)并维持在具有受控温度(21-22℃)和逆转的光-暗周期(12h/12h；开灯：17:30-05:30；关灯：05:30-17:30)的房间里，可随意获取食物和水。

实验设计

在相同的试验条件下在T-迷宫交替模型中，在东莨菪碱-处理的小鼠中评价Gln 1062、Gln 0979和雪花胺潜在的认知增强性质。以0.1、0.3、1和2mg/kg i.p.剂量试验Gln 1062和Gln 0979二者。以0.1、0.3、1，2和5mg/kgi.p.剂量试验雪花胺。以0.4mg/kg i.p.剂量试验烟碱。在i.p.注射1mg/kg用于诱导记忆缺失的东莨菪碱后(T-迷宫试验前20分钟)立即给予所有这些化合物。

通过T迷宫中自发交替的百分数评价记忆能力。将注射盐水的小鼠的交替数量用作未改变的记忆能力的基础水平。

每笼饲养10只小鼠。通过用不退色的墨水写在尾巴上的唯一数字(1至10)将笼中的每只小鼠随机分配。

使用不同的动物在三组实验中分别检测Gln1062、Gln0979和雪花胺。将每一组实验分为总是包含盐水/溶媒、东莨菪碱/溶媒和东莨菪碱/烟碱(0.4mg/kg)组中每一组的至少一个代表的每日实验系列。

测量

T迷宫装置由灰色的Plexiglas制成，具有一个主干(55cm长×10cm宽×20cm高)和位于主干的左边和右边90度角的两个臂(30cm长×10cm宽×20cm高)。通过闸门将起始箱(15cm长×10cm宽)与主干隔开。在强制选择交替任务中用水平门关闭具体的臂。

实验方案由单独的一轮组成，其起始于1次“强制选择”试验，之后为14次“自由选择”试验。在首先的“强制选择”试验中，将动物限制在起始臂中5s，接着在左边或者右边的目标臂被水平门封闭时将它们释放。将小鼠释放后，它将穿过迷宫，并最终进入开放的目标臂并回到起始位置。当动物回到起始位置后立即打开关闭的目标门，此时动物可在左和右目标臂之间自由选自(“自由选择试验”)。当动物将其四只爪子放入臂中时认为它已进入。进行了14次自由选择试验或经过了10分钟后，不论哪一个事件先发生，立即终止一轮并将动物移出。试验的平均持续时间为6min。

在每只动物之间用酒精(70°)清洗装置。将尿液和粪便从迷宫清除。

在这些试验中，尽可能减少动物处理和操作者的可见度。

测定每一只小鼠在14次自由选择试验中的交替百分数并用作工作记忆能力的指数。将这一百分数定义为在连续试验中进入T-迷宫不同的臂(即，左-右-左-右，等)。

统计学分析

对结果数据进行方差分析(ANOVA)。将Fisher保护最小显著差数法用于成对比较。p值≤0.05被认为是显著的。通过分别将盐水/溶媒组的响应设置为100％逆转并东莨菪碱/溶媒组设置为0％逆转，计算东莨菪碱诱导的记忆缺失的药物诱导逆转。

为了测定每一种药物的EC₅₀，按照S型剂量-响应模型进行恢复能力作图(graphpad软件)。从曲线拟合表上读取ED₅₀并表示与50％响应相关的有效剂量。

表A