CN101993388B - 二聚咖萨因生物碱、其制法和其药物组合物与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从格木中分离到的5个二聚咖萨因型生物碱，其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物，及其制备方法，含有这类化合物的药物组合物，以及这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

二聚咖萨因生物碱、其制法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及一类二聚咖萨因型生物碱化合物(1～5)，其制备方法，含有这类化合物的药物组合物，以及这类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

从天然产物中寻找抗癌活性成分并进行新药研制是创制全新结构抗肿瘤药物的重要途径，在已发现的天然抗肿瘤活性成分中，相当一部分是从有毒药用植物资源中获得的。格木(Erthrophleum fordii Oliver)为豆科(Leguminosae)格木属植物，是我国传统草药，该植物种子和茎皮有毒，中毒后产生强烈而持久的局部麻醉。

肿瘤的病因非常复杂，随着肿瘤生物学和相关学科的飞速发展，逐渐认识到癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖。因此从信号转导通路中寻找抗肿瘤作用的生物靶标成为重要的研究方向。目前研究较多的是促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路、转化生长因子-β(TGF-β)通路、磷酸肌醇3激酶(PI-3K)通路等。其中MAPK信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信息，存在于所有真核生物中，在信号传递的过程中占据着相当重要的地位，它能介导细胞增殖、分化和凋亡，其某个环节发生问题可引起细胞生长失控、肿瘤的发生和发展(H.J.Schaeffer等，Molecular and CellularBiology，1999，2435)。MAPK是细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它受到刺激后磷酸化而活化。MAPK家族包括：P38mAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun N末端激酶(JNK)、ERK3、大丝裂原活化蛋白激酶-1(ERK5/BMK1)、ERK-7、NLK和ERK8等八个亚家族。由这些亚家族组成的多条通路中，主要包括P38通路、ERK1/2通路和JNK/SAPK通路。近年来，以不同通路中的蛋白激酶/受体为靶标发现了较多颇有前景的抗肿瘤物质，见表1(数据来源：杨亚平等，国际药学研究杂志2008，178)。

表1.作用于MAPK转导通路的抗肿瘤化合物

通路	靶点	药物	发展阶段	适应症
					ERK1/2	EGFR抑制剂	拉帕替尼(Lapatinib)	2007美国上市	乳腺癌
ERK1/2	Ras蛋白抑制剂	tipifarnib	III期临床	急性非淋巴细胞白血病、乳腺癌、胰腺癌等
					ERK1/2	Raf蛋白抑制剂	索拉非尼(Sorafenib)	2005美国上市	转移性肾癌
JNK	GST-JNK复合物干扰剂	TLK286	III期临床	铂类耐药卵巢癌
					p38MAPK	p38MAPK抑制剂	硼替佐米(bortezomib)	2007美国上市	复发性和难治性多发性骨髓瘤

注：EGFR：表皮生长因子受体；GST：谷胱甘肽转移酶

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一类新的化合物(1～5)及其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物

本发明另一个方面涉及制备化合物(1～5)的方法。

本发明又一个方面涉及涉及一种药物组合物，其包括药物有效剂量的、作为活性成份的化合物(1～5)及制药领域中常用的载体。

本发明再一个方面涉及的化合物(1～5)及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的肿瘤选自结肠癌、肝癌、胃癌、肺腺癌或卵巢癌。

本发明还涉及一种含有药物有效剂量的本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

根据本发明，本发明化合物可以以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。

根据本发明的实施方案，所述的本发明化合物还包括其药效学上可接受的盐、盐的水合物、酯或前体药物。

本发明还涉及含有作为活性成份的本发明化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95重量％的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg，优选的单元剂型含有4～50mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明的化合物的用量为0.001～100mg/Kg体重，可一次服用或分2～4次服用。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。

术语与简称

DEPT    无畸变极化转移增强技术(一种确定碳连接氢数目的核磁共振碳谱)

DMSO    二甲基亚砜

ED₅₀    半数有效剂量

EGFR    表皮生长因子受体

ERK     胞外信号调节激酶

ESI-MS  电喷雾质谱

GST     谷胱甘肽转移酶

HMBC    异核多键相关(一种测定分子中远程氢碳连接关系的二维核磁共振谱)

HPLC    高效液相色谱

HR-MS   高分辨质谱

HSQC    异核单量子相关(一种测定分子中氢碳直接相连关系的二维核磁共振谱)

IC₅₀    半数抑制剂量

IR      红外光谱

JNK     c-Jun(蛋白)氨基端激酶

MAPK    丝裂原活化蛋白激酶

MTT     3-(4，5-二甲基-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物

NMR     核磁共振

NOESY   二维核Overhauser效应(一种测定分子中氢原子空间位置临近关系的二维核磁共

        振谱)

SAPK    应激活化蛋白激酶

TLC     薄层色谱

UV      紫外光谱

附图说明

图1格木叶的提取分离流程图

具体实施方式

实施例1：化合物(1～5)的提取分离。

取干燥格木叶5.2kg，粉碎，用95％EtOH(乙醇)回流提取3次，每次3小时，提取液减压浓缩得到806g浸膏(提取率15.5％)。溶于甲醇部分的浸膏(670g)用硅藻土拌样，装于索氏提取器中，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取，得到石油醚(90g)，乙酸乙酯(45g)和甲醇(532g)提取物。

乙酸乙酯提取物经聚酰胺(30～60目)柱色谱，分别以H₂O、30％EtOH、60％EtOH和90％EtOH洗脱，得到H₂O洗脱部分(PA，20g)、30％EtOH洗脱部分(PB，7.6g)、60％EtOH洗脱部分(PC，5.1g)和90％EtOH洗脱部分(PD，1.6g)。组分PA和组分PB分别经Sephadex LH-20柱色谱和ODS柱色谱反复纯化，合并得到总生物碱ET-Ery(17.8g)。

总生物碱ET-Ery(17.8g)经ODS(50μ，250g)柱色谱，用MeOH(甲醇)/H₂O梯度洗脱(5％-100％)，经分析液相检测和TLC检识合并成12个组分(A-L)，[A(6.122g)，B(1.054g)，C(1.934g)，D(1.092g)，E(1.092g)，F(1.443g)，G(1.495g)，H(1.665g)，I(1.119g)，J(0.254g)，K(0.275g)，L(0.077g)]。

组分J(0.254g)经制备型HPLC[CH₃CN/H₂O(48.5:51.5)，4mL/min，220nm]分离得到化合物(1～5)。

格木叶经95％EtOH提取、分离流程图如附图1所示。

化合物(1～5)的结构式及鉴定方法：

化合物(1～5)的波谱数据和理化性质

1.格木碱A(1)

白色粉末；[α]_D ²⁰：-65.3°(c0.083，EtOH)；m.p.194-196℃；UV(EtOH)：λ_max＝222，306nm；IR(KBr)：v_max＝3383，2937，1721，1693，1660，1633，1537，1466，1393，1374，1275，1257，1206，1165，1122，1042，1026，969，868，837，821，766，735，702，628，610cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝798.5[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝798.4429[M+H]⁺(计算为C₄₄H₆₃NO₁₂)；¹H NMR数据见表1；¹³C-NMR数据见表2。

2.格木碱B(2)

白色粉末；[α]_D ²⁰：-81.18°(c0.083，EtOH)；m.p.174-176℃；UV(EtOH)：λ_max＝222，307nm；IR(KBr)：v_max＝3436 2942 1717 1645 1608 1458 1394 1374 1256 1163 1122 10801042 969 868 818 763 731 701 673 613cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝812.5[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝812.4597[M+H]⁺(计算为C₄₅H₆₅NO₁₂)；¹H NMR数据见表1；¹³C-NMR数据见表2。

3.格木碱C(3)

白色粉末；[α]_D ²⁰：-58.4°(c0.083，EtOH)；m.p.178-180℃；UV(EtOH)：λ_max＝223，309nm；IR(KBr)：v_max＝3378 2941 2875 1714 1642 1532 1460 1391 1321 1258 11971157 1125 1078 1042 967 936 868 748 732 699 678 613cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝740.5[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝740.4401[M+H]⁺(计算为C₄₂H₆₁NO₁₀)；¹H NMR数据见表1；¹³C-NMR数据见表2。

4.格木碱D(4)

白色粉末；[α]_D ²⁰：-63.4°(c0.083，EtOH)；m.p.164-166℃；UV(EtOH)：λ_max＝221，306nm；IR(KBr)：v_max＝3419 2941 2876 1714 1646 1607 1460 1393  1257 1196 1156.21124 1080 1044 1025 968 937 867 818 791  763 732 701  624 501cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝754.5[M+H]⁺；HR-ESI-MS：m/z＝754.4564[M+H]⁺(计算为C₄₃H₆₃NO₁₀)；¹HNMR数据见表1；¹³C-NMR数据见表2。

5.格木碱E(5)

白色粉末；[α]_D ²⁰：-57.12°(c0.065，EtOH)；m.p.162-164℃；UV(EtOH)：λ_max＝222，311nm；IR(KBr)：v_max＝3381 2942 2880 1714 1641 1533 1457 1393 1321.1 1257 12271199 1156 1126 1081 1041 1013 870 720cm^-1；(+)ESI-MS：m/z＝798.4[M+H]⁺；HR-EI-MS：m/z＝798.4405[M+H]⁺(计算为C₄₄H₆₃NO₁₂)；¹H NMR数据见表1；¹³C-NMR数据见表2。

表1.化合物(1～5)的¹H NMR光谱数据(CDCl₃，500MHz)

注：化合物原子编号如下。

表2.化合物(1～5)的¹³C NMR和DEPT光谱数据(CDCl₃，125MHz)

注：化合物原子编号如下。

格木碱A(1)

格木碱化合物的原子编号

药理实验

实验例1：化合物1-5体外抗肿瘤活性测定。

实验方法：

培养正常生长的肿瘤细胞，以1×10⁴cell/mL接种到96孔板中(每孔100μL)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时，然后加入被试药物，复筛给药培养5天，然后弃除培养液，每孔加入0.04％MTT 100μL(培养液配制)，同样条件下培养4小时。弃培养液，加入DMSO 150μL/孔。混合后于测定波长570nm，参比波长450nm，比色记录光吸收度，按下式计算药物对癌细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率＝(对照A-给药A)/A×100％。作标准曲线，计算IC₅₀。

判断标准复筛计算IC₅₀，对于粗品，以IC₅₀＞50μg/mL为无效；以50μg/mL＞IC₅₀＞5μg/mL为弱效；以5μg/mL＞IC₅₀＞0.5μg/mL为有效；以IC₅₀＜0.5μg/mL为强效。对于单体化合物，以IC₅₀＞10μM为无效；以10μM＞IC₅₀＞1μM为弱效；以1μM＞IC₅₀＞0.1μM为有效；以IC₅₀＜0.1μM为强效。

表3MTT法测定活性强度判断标准

单体化合物(1～5)的细胞毒活性研究

化合物(1～5)，分别对其进行细胞毒活性测定，发现化合物(1，3，4，5)具有抑制肿瘤细胞的活性，测定结果如表4所示。

表4.化合物(1～5)的细胞毒活性测定结果

注：HCT-8：人结肠癌细胞；Bel-7402：人肝癌细胞；BGC-823：人胃癌细胞；A549：人肺腺癌细胞；；A2780：人卵巢癌细胞

Claims (4)

1.如化合物结构式1、3、5所示二聚咖萨因型生物碱化合物1、3、5

2.一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的权利要求1所述的化合物1、3、5中至少一种，以及药效学上可接受的载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂或微粒给药系统。

4.权利要求1所述的二聚咖萨因型生物碱化合物在制备抗卵巢癌药物中的应用。

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