CN101981188A - 作为抗疟剂的rna适体的筛选 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1α(DBL1α)区域产生的适体或其活性片段，所述适体具有抗疟疾、特别是严重脑型疟的作用。

Description

作为抗疟剂的RNA适体的筛选

技术领域

本发明涉及用作抗疟剂的针对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)红细胞膜蛋白1(PfEMP1)保守区的特定RNA适体。此外，本发明涉及该适体用于诊断相对于不太严重疟疾的严重疟疾的用途。

发明背景

适体是通过不同于典型沃森-克里克碱基配对的相互作用对分子具有特异结合亲和力的核酸分子。

与通过噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体(“mAb”)一样，适体能够特异性结合到选定的靶，并调节靶的活动或结合相互作用，例如，通过结合适体可以阻断它们的靶发挥作用的能力。通过随机序列寡聚核苷酸库的体外(in vitro)筛选过程而发现，已经产生包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体在内的超过130种蛋白质的适体。典型的适体大小为10-15kDa(20-45核苷酸)，以纳摩尔至亚纳摩尔的亲和力结合其靶，并且区别对待密切相关的靶(例如，适体通常不结合来自相同基因家族的其它蛋白质)。一系列结构研究显示适体能够利用促进抗体-抗原复合物亲和力和特异性的相同类型的结合相互作用(例如，氢键结合、静电互补、疏水接触、空间排斥)。

适体具有许多用作治疗剂和诊断剂所需的特征，包括高特异性和亲和力、生物效能和优异的药代动力学性能，此外，它们提供超过抗体和其它蛋白质生物物质(biology)的特定的竞争优势，例如：

1)速度和控制。适体是通过完全的体外方法生产的，允许起始先导序列(lead)，包括治疗先导序列的快速生产。体外筛选使适体的特异性和亲和力得到严格控制，并允许先导序列，包括抗毒性和非免疫原性靶两者的先导序列的生产。

2)毒性和免疫原性。作为一个类别，适体显示出治疗可接受的毒性并缺乏免疫原性。然而许多单克隆抗体的功效能够受到对抗体自身的免疫反应的严重限制，但引发抗适体的抗体是极其困难的，很可能是由于适体不能经MHC由T细胞递呈和免疫反应通常被训练为不识别核酸片段。

3)施用。尽管多数当前批准的抗体治疗剂通过静脉输注施用(通常地超过2-4小时)，但适体能够通过皮下注射施用(猴子研究中经皮下施用的适体生物利用率为＞80％(Tucker et ah，J.Chromatography B.732：203-212，1999))。具有良好的溶解性(＞150mg/mL)和相对低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，适体一周的剂量可通过以小于0.5mL的体积注射来递送。此外，适体的小尺寸允许其渗入到对抗体或抗体片段不允许渗透的构造收缩区(conformational constriction)，显示出基于适体的治疗或预防的另一优点。

4)可规模化和成本。治疗性适体是化学合成的，因此能够根据需要容易地规模化以满足生产需求。尽管当前规模生产中的困难限制了一些生物物质的利用率，并且大规模蛋白质生产工厂的资本成本是巨大的，但是单个大规模寡核苷酸合成仪能够生产达到100kg/年，并要求相对适中的初期投资。当前对于千克规模的适体合成的产品成本估计为$500/g，与高度优化的抗体的产品成本相当。五年内期望在方法开发方面的持续改善使产品成本降低到＜$100/g。

5)稳定性。治疗性适体是化学稳固的。暴露于因素如热和变性剂后，它们本质上适于恢复活性，并且作为冻干粉末能够在室温下长期储存(＞1年)。[0010]而且，适体发现过程容易地允许先导序列修饰，如适体序列优化和适体长度最小化[Conrad等人，1996，Eaton等人，1997]。此外，可利用2′修饰如2′-氟代和2′-O-Me来稳定化以防核酸酶，而不损害适体与靶的结合相互作用。参见例如Lin等人，Nucleic Acids Res.22，5229-5234(1994)；Jellinek等人，Biochemistry 1995，34，11363-1137；Lin等人，Nucleic AcidsRes.，1994，22，5229-5234；Kubik等人，J Immunol.，1997，159(1)，259-267和Pagratis等人，Nat.Biotechnol.，1997，1，68-73。

严重疟疾几乎完全由恶性疟原虫感染引起，并通常在感染后6-14天发病。如果不经治疗严重疟疾的后果包括昏迷和死亡，幼童和孕妇特别容易感染。可能发生脾肿大(脾脏肿大)、剧烈头痛、脑缺血、肝肿大(肝脏肿大)、低血糖和血红蛋白尿伴随肾衰竭。肾衰竭可引起黑水热，其中来自溶解的红细胞的血红蛋白渗漏到尿中。严重疟疾能够极快速的发展并在数小时或数天内引起死亡。在多数严重病例中的致死率可超过20％，甚至在采取了加强监护和治疗时也是如此。在流行地区，治疗经常是较不令人满意，和对于所有疟疾病例的总致死率可高达十分之一。在较长的时期内，已证明在遭受严重疟疾发作的儿童中存在发育损伤。

恶性疟原虫是人类中严重疟疾的病原体。全世界每年数百万人感染恶性疟原虫，超过一百万死亡，其中多数是撒哈拉以南非洲的小孩。用于疟疾治疗的药物在过去主要选择奎宁和氯奎，并自从20世纪60年代开始为磺胺多辛/乙胺嘧啶(SP)。不幸地是在流行地区已证明了寄生虫对这些药物的抗性。当今作为一线治疗使用的最有效的药物是青蒿素及其衍生物。虽然对于青蒿素还没有显示出临床抗性，但有迹象表明在恶性疟原虫中对该药物发展了体外抗性。已描述了在流行地区内居民中对严重疟疾的非消除性免疫(non-sterile immunity)。这表明寄生虫中抗原同质性的存在，引起严重疟疾。

已知通过形成玫瑰花结(rosetting)和内皮粘着过程负责严重脑型疟的蛋白质是表达于感染的红细胞表面的红细胞膜蛋白1(PfEMP1)。它暴露于感染的红细胞上，结合到许多人细胞表面受体，如硫酸肝素、ICAM-1、CD36、CSA，能够使寄生虫粘着到小血管的内皮内层(细胞粘连)以及粘着到非感染的红细胞(形成玫瑰花结)，由此防止从血流中被脾脏清除。这种隔离的寄生虫造成相当大的组织灌注阻碍。

PfEMP1主要由duffy结合配体结构域(DBL)和结构域间半胱氨酸富含区(ClDR)组成，并且结构域的数量和蛋白质的大小根据60个var-基因的所表达而变化。寄生虫有规律地改变表达的var-基因并因此产生感染的红细胞表面的抗原变异的事实便于寄生虫躲避宿主的免疫系统。虽然由于这种蛋白的粘着功能期望某些序列保守。通过在PfEMP1结构域中具有高度序列保守的N-末端Duffy样结合结构域(DBL1α)调节毒性相关表型(形成玫瑰花结)。虽然在具有相似结构的结构域上已进行了广泛的模拟，但不知道DBL1α的决定性结构。这使得DBL1成为用于开发抗严重疟疾新药的有吸引力的候选物。试图进行对DBL1α中结构保守的表位的抗体识别而没有较大的成就，由于事实上保守区被可变区在某种程度上掩蔽使其难以接近到相对大的抗体。

Chen，Q等人，Vaccine 22(2004)，2701-2712页公开了用PfEMP1-DBL1α免疫产生破坏玫瑰花结并防止感染恶性疟原虫的红细胞的隔离的抗体。使用PfEMP1-DBL1α蛋白产生抗体是次级治疗性治疗，而市场需要直接治疗剂和方法。

Moll，K等人，Inf.Imm.75(1)卷，(2007年1月)，211-219页公开了通过用红细胞膜蛋白1-duffy结合样1α结构域免疫产生抗恶性疟原虫隔离的交叉保护性抗体。同样此工作利用PfEMP1-DBL1α蛋白产生抗体是次级治疗性治疗，而市场需要直接治疗剂和方法。

基于这些特征，本发明人设计了通过指数富集的配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment，SELEX)方法，其可以设计成允许筛选以高亲和力和特异性结合到DBL1α的结构保守部分的RNA适体。

Ulrich，H.等人，J.Biol.Chem，277卷(2002)，20756-20762页描述了用于体外筛选结合到细胞粘着受体克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)并抑制细胞侵袭的RNA适体的SELEX方法。

已报道了用于其它病原寄生虫的相似策略，其中成功地筛选了抗毒性表面蛋白的适体。在一个报道例子中，筛选了抗布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的可变表面糖蛋白(VSG)的高亲和力RNA适体，证明其能够引导抗体到活锥体虫的表面。其它报道研究使用不同的方法。筛选不是利用来自克氏锥虫的表达的表面蛋白，而是利用4种不同的人表面受体的置换技术进行的(Ulrich，H.等人，上述)。

克氏锥虫引起慢性期心脏问题，由此治疗包括管理该疾病的临床表现。例如，对于一些患有慢性心脏病的病人，用于心律不齐的起搏器和药物处理可能拯救生命，而对于巨型肠(megaintestine)可能需要外科手术。然而，疾病不能在此阶段被治愈。由恰加斯氏病引起的慢性心脏病是现在心脏移植手术的常见原因。然而，直到最近才认为，恰加斯氏病是该操作的禁忌症，因为当外科手术后寄生虫将预期抓住由免疫抑制提供的机会使心脏损伤可能复发。

已显示适体表现出与抗体相同的对其靶的高特异性和亲和力。除了有效结合外，适体还显示对其靶的抑制活性。SELEX方法基于体外筛选循环的重复步骤的反复过程，其中将10¹⁴-10¹⁵个不同分子的初始DNA/RNA文库降低到对相关靶具有高亲和力的大约100个不同分子的更小的库。

Lee，J.F.等人，Curr Opi.Chem.Biol.(2006)，10：282-289是对适体治疗进展的综述。由此讨论了抗HIV-1、抗-VEGF、抗-RET、抗-茶碱和抗肌腱蛋白-C的适体。

Hjalmarsson，K.等人，FOI-R-1216-SE(ISSN1650-1942)讨论了适体-未来用于诊断和治疗的工具，并特别涉及到SELEX方法学。给出了不同适体及其选择性使用的综述。

H.U.等人，Int.J.Parasit.33(2003)，1309-1317公开了对寄生虫靶分子具有高亲和力的核酸配体的体外筛选，并讨论了疟疾，从而作者主要得出结论：由于组分的随机筛选方法在识别抗寄生化合物方面还没有成功，已放缓了开发过程。作者集中讨论了SELEX方法。虽然疟疾是提到的第一个寄生虫，没有暗示使用适体可处理其副作用，但是作者讨论了布氏锥虫引起的睡眠病。

Normark，J.等人，PNAS，(2007)104卷，15835-15840页公开了PfEMP1-DBL1α氨基酸基序存在于恶性疟原虫疟疾的严重病况。该论文没有讨论适体作为由恶性疟原虫引起的严重疟疾治疗的潜在药剂，而是讨论了产生抗体作为可能方案。

Krause，D.R.等人，Inf.Imm.75卷，(2007)5967-5973页公开抗恶性疟原虫的抗体反应，并讨论了来自志愿者的血清抑制复原。作者陈述了该蛋白质(PfEMP1)在寄生虫内和之间的多样性与变体之间的抗原性开关结合，使得PfEMP1特异性免疫的开发研究变得困难。

WO2004/080420(Mota等人)概括地公开了通过向需其的哺乳动物施用抗疟剂而防止或抑制体内(in vivo)疟疾活性的方法，并指出要干扰多条不同的通路。特别地该公开讨论了MET抑制，MET是肝细胞生长因子的受体。该公开甚至提到了适体但没有任何说明。通常该公开是非常概念性而没有提供任何具体解决方案，仅仅是关于治疗疟疾可能路径的想法。

Jayasena，S.D.Clin.Chem.45：9(1999)1628-1650页公开了作为在诊断中与抗体竞争的一类新兴分子的适体。然而，该公开没有给出治疗性适体用于治疗疟疾的说明。

本发明人进一步显示了这些特异性高亲和力结合适体能够结合到活寄生虫表面的PfEMP1，并最终它们具有破坏玫瑰花结的能力。在此，显示了在体外影响玫瑰花结形成的一组适体的特异性结合。进一步提出使用这些适体诊断严重疟疾是否存在，例如，区分疟疾的轻度(或不太严重形式)和严重形式。

发明概述

因此本发明涉及针对PfEMP1产生的作为抗疟剂的某些RNA适体或其活性片段。

发明详述

特别地本发明涉及针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1α(DBL1α)区域产生的某些RNA适体。

在其优选实施方案中，本发明涉及选自由以下组成的组的适体：

UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUAGUCGUAUUGUU(SEQ.ID.NO.1)

UCAUGUGCCAGUGUUUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUGGUGAGCUAGU(SEQ.ID.NO.2)，

CUUCGAACGGCCCUGGUUGUUGGUUUUAAUUCAUUUAUCCGCGUGGUCACGGU(SEQ.ID.NO.3)，

UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ.ID.NO.4)

AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ.ID.NO.5)，和

GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCCGUUCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SEQ.ID.NO.6)

或其活性片段。

在其优选实施方案中，本发明涉及具有序列GACUGAUUACGCCAGCUUGG(SEQ.ID.NO.23)或GAC^FU^FGAU^FU^FAC^FGC^FC^FAGC^FU^FU^FGG(SEQ.ID.NO.24)的适体。

在其更优选的实施方案中，本发明涉及选自由下述组成的氟化适体组成的组的适体：

U^FGC^FC^FAAC^FC^FU^FU^FC^FGAU^FGC^FAAGAU^FAAU^FAC^FU^FU^FU^FU^FGAU^FGGU^FGU^FAGU^FC^FGU^FAU^FU^FGU^FU^F(SEQ.ID.NO.7)，

U^FC^FAU^FGU^FGC^FC^FAGU^FGU^FU^FU^FGAAAAAAC^FGC^FGU^FU^FGAU^FU^FGC^FU^FGGU^FGU^FGGU^FGAGC^FU^FAGU^F(SEQ.ID.NO.8)和

C^FU^FU^FC^FGAAC^FGGC^FC^FC^FU^FGGU^FU^FGU^FU^FGGU^FU^FU^FU^FAAU^FU^FC^FAU^FU^FU^FAU^FC^FC^FGC^FGU^FGGU^FC^FAC^FGGU^F(SEQ.ID.NO.9)，

U^FAGC^FU^FC^FAC^FC^FAC^FAC^FC^FAGC^FAAU^FC^FAAC^FGC^FGU^FU^FU^FU^FU^FU^FC^FAAAC^FAC^FU^FGGC^FAC^FAU^FGA(SEQ.ID.NO.10)

AAC^FAAU^FAC^FGAC^FU^FAC^FAC^FC^FAU^FC^FAAAAGU^FAU^FU^FAU^FC^FU^FU^FGC^FAU^FC^FGAAGGU^FU^FGGC^FA(SEQ.ID.NO.11)

GU^FGAC^FC^FAC^FGC^FGGAU^FAAAU^FGAAU^FC^FAAAAAC^FAAC^FAAC^FC^FAGGGC^FC^FGU^FU^FC^FGAC^FU^FAC^FGC^FU^FAAU^FU^FAU^FC^FC^FC^FG(SEQ.ID.NO.12)

或其活性片段。

本发明的另一方面涉及针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1α(DBL1α)区域产生的一种或多种适体或其活性片段在治疗脑型疟中的用途。

在其优选实施方案中，本发明涉及选自以下组成的组的适体：

UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUAGUCGUAUUGUU(SEQ.ID.NO.1)

UCAUGUGCCAGUGUUUGAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUGGUGAGCUAGU(SEQ.ID.NO.2)，

CUUCGAACGGCCCUGGUUGUUGGUUUUAAUUCAUUUAUCCGCGUGGUCACGGU(SEQ.ID.NO.3)，

TAGCTCACCACACCAGCAATCAACGCGTTTTTTCAAACACTGGCACATGA(SEQ.ID.NO.4)

AACAATACGACTACACCATCAAAAGTATTATCTTGCATCGAAGGTTGGCA(SEQ.ID.NO.5)，和

GTGACCACGCGGATAAATGAATCAAAAACAACAACCAGGGCCGTTCGACTACGCTAATTATCCCG(SEQ.ID.NO.6)。

在其更优选的实施方案中，本发明涉及选自由下述组成的氟化适体组成的组的适体：

U^FGC^FC^FAAC^FC^FU^FU^FC^FGAU^FGC^FAAGAU^FAAU^FAC^FU^FU^FU^FU^FGAU^FGGU^FGU^FAGU^FC^FGU^FAU^FU^FGU^FU^F(SEQ.ID.NO.7)，

U^FC^FAU^FGU^FGC^FC^FAGU^FGU^FU^FU^FGAAAAAAC^FGC^FGU^FU^FGAU^FU^FGC^FU^FGGU^FGU^FGGU^FGAGC^FU^FAGU^F(SEQ.ID.NO.8)

C^FU^FU^FC^FGAAC^FGGC^FC^FC^FU^FGGU^FU^FGU^FU^FGGU^FU^FU^FU^FAAU^FU^FC^FAU^FU^FU^FAU^FC^FC^FGC^FGU^FGGU^FC^FAC^FGGU^F(SEQ.ID.NO.9)

U^FAGC^FU^FC^FAC^FC^FAC^FAC^FC^FAGC^FAAU^FC^FAAC^FGC^FGU^FU^FU^FU^FU^FU^FC^FAAAC^FAC^FU^FGGC^FAC^FAU^FGA(SEQ.ID.NO.10)

AAC^FAAU^FAC^FGAC^FU^FAC^FAC^FC^FAU^FC^FAAAAGU^FAU^FU^FAU^FC^FU^FU^FGC^FAU^FC^FGAAGGU^FU^FGGC^FA(SEQ.ID.NO.11)

GU^FGAC^FC^FAC^FGC^FGGAU^FAAAU^FGAAU^FC^FAAAAAC^FAAC^FAAC^FC^FAGGGC^FC^FGU^FU^FC^FGAC^FU^FAC^FGC^FU^FAAU^FU^FAU^FC^FC^FC^FG(SEQ.ID.NO.12)。

本发明更进一步的方面涉及通过确定血液样品对针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1α(DBL1α)区域产生的适体的反应来确定存在严重疟疾的诊断工具。

本发明更进一步的方面涉及预防性地和/或治疗性地治疗严重疟疾的方法，该方法是通过向正在遭受严重疟疾或有遭受严重疟疾风险的人施用治疗有效量的针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1α(DBL1α)区域产生的适体。

参考进行的实验，将本发明描述如下。这些实验涉及某些RNA适体的分离以及这类某些RNA适体对形成玫瑰花结事件的生物作用。

DBL1α在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中的蛋白质表达。来自FCR3S1.2的重组DBL1^his表达如下，将来自Qiagen含有质粒pQE-TriSystem His-Strep 2(DBL 1^his)或pQE-60(DBL1^his)的SG13009(pREP4)细胞[22]在22℃或37℃生长于含氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(30μg/mL)的LB培养基中。在OD₆₀₀＝0.8时，用0.1mM IPTG诱导细胞3小时；收获1升细胞悬液(4℃，25分钟，3000g)并再悬浮于25mL裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄/NaOH pH 7.4，300mMNaCl，1mMPMSF(Sigma)0.05％Triton x-100，10mM咪唑)。将细胞用溶菌酶在冰上孵育30分钟并超声降解。通过离心(4℃，30分钟，18.000g)除去不溶性细胞碎片。用DNA酶处理上清液，并在轻轻搅拌下用1mL Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)在4℃孵育2小时。珠在100×g下沉淀3分钟，并用15mL洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄/NaOH pH 7.4、300mMNaCl、0.05％Triton x-100、30mM咪唑)洗涤3次。用400mM咪唑(Sigma)、50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl洗脱结合的蛋白质，随后通过在4℃用具有0.05％Triton X-100的PBS缓冲液透析18小时除去400mM咪唑(Sigma)、50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl。通过将样品在10％SDS-PAGE上电泳估计蛋白纯度，并最终测定蛋白浓度(Bradford 1976)。可选择地，在FPLC上纯化His标记的DBL1。将大肠杆菌提取的可溶性级分以0.5mL/min的流速加载到FPLC(AmershamBiosciences)的Ni-柱上。用5-70mM咪唑梯度(60mL以1mL/min)洗涤结合蛋白质。用400mM咪唑洗脱并如前所述分析蛋白质。所有化学制品获自Sigma。

考虑到大肠杆菌中表达的密码子使用，优化来自FCR3S1.2的DBL1α整个序列(Moll K，Pettersson F，Vogt AM，Jonsson C，Rasti N等人(2007)Generation of cross-protective antibodies against Plasmodium falciparum sequestration by immunization with an erythrocyte membrane protein 1-duffy binding-like 1 alpha domain(使用红细胞膜蛋白1-duffy结合样1α结构域的免疫产生抗恶性疟原虫隔离的交叉保护性抗体).Infect lmmun 75：211-219)。通过His-标记高亲和力纯化，纯化可溶性DBL1α(图1)。以使用His-标记或DBL1α特异性抗体的蛋白印迹确认DBL1α^His。通过其对肝素(DBL1α的主要靶之一)的亲和力分析重组结构域的“活性”。重组结构域结合自由形式和在肝素柱上的肝素。

DBL1α特异性RNA适体的筛选

对于体外筛选，使用5×10¹⁴随机选择RNA序列的组合文库。该文库由具有50个核苷酸大小的序列组成，这些序列在侧端有20个核苷酸的引物结合位点，产生90个核苷酸的RNA分子。T7 RNA转录在2′F-修饰的嘧啶核苷酸存在时进行以筛选血清稳定适体。策略是富集对来自高玫瑰花结株FCR3S1.2的重组DBL1α结构域具有亲和力的适体。对预先结合到镍珠的DBL1α进行八轮筛选和扩增。通过测定在每个SELEX轮次中结合RNA的百分数来监测实验过程(图2)。通过筛选轮次观察到RNA回收的增加，并且在第8轮中达到具有大约58％RNA回收的最大结合。为避免非特异性结合到Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)基质，在每个筛选轮次前对纯基质进行预筛选。将来自第8轮的扩增DNA库克隆到TA载体，并测定70个单独克隆的核苷酸序列。利用MEME/MAST的生物信息数据显示，克隆聚类成几个保守组。

利用MEME/MAST将测序的克隆分组

基序搜索产生了在几个不同保守组中的克隆分类。最保守组(A)包含6个成员。组(B)到(D)具有统计值，而最后两个大组具有低程度的保守性。在数据集中识别了具有3-4个所列成员的大量较小但保守很好的组。表1右列是70个测试的克隆内共有序列出现的频率。将几个克隆如g06和g07分成两个组(A和D)。当使用mfold(电脑免费软件)在富G-T组(E)内的克隆的随机区预测二级结构时，检测到感兴趣的观察。这些克隆构建具有低ΔG值和55℃以上熔点的相当稳定的结构。与组(E)的克隆相反，组(F)的克隆在随机区进行mfold预测时没有稳定的二级结构。最后在70个克隆中存在大量孤儿克隆(orphan)。

表1.由MEME/MAST软件在来自对DBL1α^His体外筛选的70个测序的克隆上产生的分离的多级共有序列。

(组)和多级共有序列	MEME概率评分	发生
			(A)：GACTGATTACGCCAGCTTGG	(E＝7.9×10-20)	8.6％
(B)：CACACTGGCGGCCGCTCGAG	(E＝2.0×10-7)	5.7％
			(C)：AATTCGCCCTTGCCG	(E＝3.9×10-6)	12.9％
(D)：AGCTCGGATCCACTAATAA	(E＝1.6×10-4)	12.9％
			(E)：GTTGTTGGTTTGGCTTGTT	(E＝6.2×100)	25.7％
(F)：AACACCAACACCAACA	(E＝3.0×103)	18.6％

在重组DBL1α^His上测试单个适体。测试大量克隆对DBL1α^His的结合。以来自库0的未筛选RNA作为阴性对照，在DBL1α^His上分析放射标记克隆的回收。以这种方式可以观察到不同克隆间结合亲和力的变化。将显示较高程度结合的克隆用于进一步研究。在图3显示的实验中蛋白质的浓度为350-400nM，RNA为40nM。克隆b02、d12、e05具有相似的回收水平(70％)，而来自库0的未筛选RNA具有11.7％的回收率。代表最后SELEX筛选库的库8具有51％的回收率。克隆e11具有低于b02、d12、e05的回收水平，表示更低的结合亲和力。进行了几种其它结合实验(数据未显示)，并且筛选的克隆的RNA回收水平通常低于70％，但总是明显高于(2-5倍)未筛选的RNA。从进行的实验得出如下结论：DBL1α^His和RNA之间的比率对回收水平具有最深远的影响。RNA/DBL1α^His在1∶9通常产生高的回收率，而RNA/DBL1α1^His在1∶3的比率产生低水平的回收(筛选克隆为12-25％的回收，未筛选的RNA为1-4％的回收)。选择显示较高回收率的克隆用于电泳迁移率变动测定并在活细胞测定中测试。

分别确定克隆d12，b02和e05的核酸序列，并由下列RNA序列表示：

d12/1，2

UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUAGUCGUAUUGUU(SEQ.ID.NO.1)

UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ.ID.NO.4)

b02/1，2

UCAUGUGCCAGUGUUUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUGGUGAGCUAGU(SEQ.ID.NO.2)

AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ.ID.NO.5)，

e05/1，2

CUUCGAACGGCCCUGGUUGUUGGUUUUAAUUCAUUUAUCCGCGUGGUCACGGU(SEQ.ID.NO.3)。

GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCCGUUCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SEQ.ID.NO.6)

为提高适体在血液中的半衰期和稳定性，可以将其在一个或多个碳原子优选全部碳原子上氟化。然后从上述公开的适体中获得下列适体：

U^FGC^FC^FAAC^FC^FU^FU^FC^FGAU^FGC^FAAGAU^FAAU^FAC^FU^FU^FU^FU^FGAU^FGGU^FGU^FAGU^FC^FGU^FAU^FU^FGU^FU^F(SEQ.ID.NO.7)，

U^FC^FAU^FGU^FGC^FC^FAGU^FGU^FU^FU^FGAAAAAAC^FGC^FGU^FU^FGAU^FU^FGC^FU^FGGU^FGU^FGGU^FGAGC^FU^FAGU^F(SEQ.ID.NO.8)和

C^FU^FU^FC^FGAAC^FGGC^FC^FC^FU^FGGU^FU^FGU^FU^FGGU^FU^FU^FU^FAAU^FU^FC^FAU^FU^FU^FAU^FC^FC^FGC^FGU^FGGU^FC^FAC^FGGU^F(SEQ.ID.NO.9)，

U^FAGC^FU^FC^FAC^FC^FAC^FAC^FC^FAGC^FAAU^FC^FAAC^FGC^FGU^FU^FU^FU^FU^FU^FC^FAAAC^FAC^FU^FGGC^FAC^FAU^FGA(SEQ.ID.NO.10)

AAC^FAAU^FAC^FGAC^FU^FAC^FAC^FC^FAU^FC^FAAAAGU^FAU^FU^FAU^FC^FU^FU^FGC^FAU^FC^FGAAGGU^FU^FGGC^FA(SEQ.ID.NO.11)

GU^FGAC^FC^FAC^FGC^FGGAU^FAAAU^FGAAU^FC^FAAAAAC^FAAC^FAAC^FC^FAGGGC^FC^FGU^FU^FC^FGAC^FU^FAC^FGC^FU^FAAU^FU^FAU^FC^FC^FC^FG(SEQ.ID.NO.12)

或其活性片段。

此外，可以通过去除上述各序列的部分获得适体的活性片段。

电泳迁移率变动测定

为研究溶液中RNA/DBL1α^His相互作用，进行了大量实验。用于这些实验的蛋白质是从Ni-NTA珠上新鲜洗脱的，以避免在溶液中长期储存和冷冻，从而防止DBL1α^His沉淀。用³²P-ATP内部标记RNA，用DBL1α^His或BSA孵育后在10％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析迁移。在图4显示的上部带(177个核苷酸长度的RNA)是源自较长转录模板的T7转录的不正确产物。该模板是在前面PCR反应中产生的产物(PCR引物结合到TOPO-载体中外部T7位点)。随着向RNA克隆b02和e05加入DBL1α^His，90nt的主要产物显著地降低，而上部带(177nt)保持不变，表明177nt RNA分子不与DBL1α^His相互作用。甚至克隆d12和一定程度的f11也显示当与DBL1α^His孵育时90nt RNA分子降低。通常在Ni-NTA珠上体外结合到DBL1α^His中显示低回收率的克隆b03显示非常低的90nt RNA的量的变化。进行EMSA实验过程中，没有观察到真实带位移(结合到蛋白质的RNA分子具有较慢的迁移)。图5中见到的克隆e05的90nt RNA的主带位移在凝胶中没有迁移，而保持于凝胶顶部上样孔下面。

结合到活寄生虫的适体

为了验证适体表面结合到活寄生虫，用荧光素标记的适体进行活细胞测定。荧光素标记的核苷酸被共转录掺入到RNA适体中。用荧光显微法检测表面结合适体。结果总结于图6中。使用来自未筛选库0的荧光素标记的适体RNA作为该实验过程中的对照。这些结果显示在特异性单个RNA适体及从库8筛选的RNA和寄生虫感染的红细胞之间的显著缔合。

RNA适体对体外FCR3S1.2中形成玫瑰花结的影响

由于利用荧光素标记的RNA适体的活细胞测定显示缔合到被感染的红细胞，下一步分析该相互作用是否能够影响高度玫瑰花结和多粘着的克隆FCR3S1.2的血液培养物的玫瑰花结状况。FCR3S1.2的玫瑰花结和细胞粘连对肝素和硫酸肝素敏感，并且能够在具有5％寄生虫血症的5％血细胞比容培养物中添加100μg/mL肝素来破坏玫瑰花结。认为该破坏是由DBL1α结合的硫酸肝素样GAG(DBL1α-bound heparin sulphate-like GAG)和溶液中添加的肝素之间的竞争引起的。以类似方式调查是否SELEX筛选的RNA适体能够破坏在结合的未感染的红细胞上DBL1α和GAG之间的相互作用。用浓度为2μg/mL(65nM)至12μg/mL(387nM)的来自库0的未筛选RNA作为阴性对照在血液培养物中测试适体。对于克隆b02、d12和e05在12μg/mL看到完全破坏，并且在8μg/mL(258nM)观察到相对于对照降低到35％的玫瑰花结形成率(图7将玫瑰花结状况计算(med)为浓度的函数)。随着巨大玫瑰花结降低到较小玫瑰花结，在65nM浓度处能够看到影响(图8)。来自库0的RNA在该浓度范围内(65-387nM)没有破坏玫瑰花结，但在650nM至850nM的未筛选RNA浓度处观察到轻度的破坏(比未经处理的细胞低5-10％)。测试血液/血清培养物中2′F修饰的适体的稳定性。孵育3小时后，当在10％尿素(UREA)-PAGE上跑样品时没有观察到明显的降解(数据未显示)。这与之前用2′F修饰的RNA在血液中进行的工作相关，其中RNA的半衰期大约为15小时。

普遍接受的是严重疟疾很可能是由感染的红细胞隔离引起的，然而至今没有可用的特异抗隔离的药物。PfEMP1是被恶性疟原虫利用通过许多途径与人类寄主相互作用的关键分子。该蛋白的粘着功能可以使寄生虫可能粘着到内皮衬里(endothelial lining)，将寄生虫感染的红细胞从外周循环中去除，并因此避免脾清除。

适体能够以极高的亲和力结合其靶，并且暗示它们甚至比抗体更特异。由于抗体必须生物学生产，其涉及昂贵的细胞培养和最终的动物模型，适体由于其能够完全在试管中生产而具有明显的优点。与使用特异性抗体相比，使用适体的另一个优点是大小的不同。由于其更小，RNA适体具有巨大的潜力到达由于空间位阻抗体不能接近的更深埋藏的结构。另外RNA适体容易被化学修饰并在治疗应用中很少或没有引起免疫原性。通过SELEX技术已针对PfEMP1的半保守DBL1α区产生适体。在该方案中致力于产生RNA适体，测试不同RNA适体对重组His-标记的DBL1α的结合容量，并检验玫瑰花结破坏的能力。还报道以类似方式在体外利用噬菌体展示技术在间日疟原虫(P.vivax)、恶性疟原虫的表面蛋白质上筛选肽-或单-链抗体片段。

已证明生产用于筛选的DBL1α靶是一项艰难的工作。进行了改变诱导时间、温度和IPTG浓度的一系列不同优化实验，但是上述提到因素似乎没有一个对产量具有显著的影响。溶液中DBL1α^His蛋白质的量总是相当有限，并且发现多数蛋白在不溶性级分中。已通过结合到配体肝素来测试来自可溶性级分的纯化蛋白的质量评价。通过对重组DBL1α^His的八轮筛选观察到RNA回收的大幅增加，并且对70个克隆测序并分析以考察在筛选的RNA内的保守基序。不幸地，MEME/MAST搜索的结果显示了大量的更小的保守组。最小化组数的策略是通过降低随后筛选轮次中RNA和DBL1α^His的浓度来增加筛选压力，因此抛弃对靶具有低亲和力的RNA适体。结果是RNA结合物的更同源的库。不幸的是由于洗涤和透析后DBL1α^His的质量和溶解性显示差，蛋白质浓度保持在～1μM。增加亲和力并更重要地获得生物相关适体的另一方法是于活的感染的红细胞上淘选DBL1α^His筛选的适体。通过将FCR3S1.2(70-80％寄生虫血症)的富集培养物与库8的RNA一起孵育，并由胰蛋白酶(trypsine)消化分离表面结合RNA来测试该方法。然而结果不令人满意，并放弃了该方法。在70个测序的克隆中的变化和大量孤儿克隆可以是由于DBL1α的硫酸肝素结合位点和全部正电荷引起了其“粘着”性。当RNA分子采用稳定的双链体发夹结构(duplex hairpin)加上RNA分子负电荷性质时，可以理论上以肝素分子的糖骨架和负电荷的硫酸酯代替RNA的磷酸酯来模仿肝素分子，并以相同方式以低K_D常数结合到DBL1α的GAG结合结构域。在测试的克隆中，b02、d12和e05似乎在结合到DBL1α^His方面稳定。当与DBL1α^His在400nM浓度孵育时这些适体显示出与蛋白质的缔合，这与在EMSA实验过程中获得的结果相互关联。在这些实验中时常观察到的带位移显示在DBL1α^His存在时RNA保持在凝胶的顶部。据认为由于DBL蛋白质的正电荷和低溶解度，RNA结合到巨大的非迁移复合物中的DBL上。

为了验证RNA/蛋白质结合是否具有任何生物学相关性，将三个克隆用荧光素标记，并用活FCR3S1.2寄生物孵育。将荧光素图像与用DAPI染色的细胞核图像合并。结果显示了荧光素标记的RNA和DAP1染色的细胞核之间的共定位。从该测定收集的结果显示，与未筛选的RNA和感染的红细胞之间的关联相比，在筛选的适体克隆和感染的红细胞表面之间的显著的特异性。对于基于荧光的活细胞测定可替换的方法是用生物素末端标记2′F修饰的适体，由此保持在UTP和CTP上的修饰。这极大地增强了在血液/血清培养物中的稳定性。将2′F-d(CU)TP与(CU)TP交换也可以在RNA中施加小构象变化，从而与原2′F修饰的RNA相比降低亲和力。2′F原子通过与DBL1α中的氨基酸残基相互作用在结合中起直接作用。当进行活细胞测定时，在添加适体之前玫瑰花结并不是人工破坏的。由于DBL1α蛋白质被结合并且空间被GAG分子占据，形成玫瑰花结可以防止标记的适体结合到暴露于表面的DBL1α上。然而，如果适体具有比GAG分子对DBL1α更高的亲和力，它们也许能够竞争结合，从而排除并破坏GAG/DBL1α的相互作用，可视化为破坏玫瑰花结。测试了三个SELEX筛选的克隆b02、d12和e05。它们全都能破坏FCR3S1.2的体外培养物中的玫瑰花结。低至65nM的浓度对玫瑰花结形成率本身具有有限的作用，然而它对降低玫瑰花结大小确实具有明显的作用。如果将包括玫瑰花结的大小作为培养物中玫瑰花结状态的指标，该作用变得更加明显。在260nM的适体浓度下，玫瑰花结形成率降低至对照的大约35％，并且387nM的浓度足以将玫瑰花结完全破坏为单个感染的红细胞而没有结合的红细胞。未筛选的RNA在这些浓度下不具有任何作用，但增加至650-850nM时显示了轻度作用(5-10％破坏)。该作用的原因从未被研究过。在肝素能够破坏FCR3S1.2的玫瑰花结的情况下，在vogt等人的工作中，在100μg/mL，大约为7μM(肝素～15kDa)，的浓度观察到从100％降低至20％。筛选的RNA在低于肝素浓度15倍下能够破坏玫瑰花结。测试了克隆e02破坏玫瑰花结的能力。该克隆在260nM处对玫瑰花结状态具有最小的作用。关于该克隆的有趣的事实是在50nt的随机区域完成的MFold预测不具有二级结构，而克隆b02、d12和e05显示复杂的二级结构。在该研究中测试的适体是具有大约31kDa重量的90nt。用于T7RNA转录和引物结合的2×20nt固定的侧翼区包括在该结构中。认为这些对于结合并不是重要的，因此该研究中分离的活性适体可以在进行进一步的工作以阐明对于结合是重要的适体区域之后被截短至40-50nt或更小。适体的给定结构仅仅是理论上的，并且必须进行RNA指纹识别以验证给定RNA的二级结构。总而言之，所述结果证明DBL1特异性适体具有定位DBL1至感染的红细胞表面以IFA成像的潜力。更重要地，可以将适体用作新的抗玫瑰花结药物。下一步是在动物模型如大鼠中测试适体破坏玫瑰花结和寄生虫隔离以观察适体是否在体内是活性的。由于适体作为治疗药物的领域在扩展，已获得大量关于如何增加体内适体稳定性和活性的知识。这极大促进在体内情形下对适体进行的任何未来工作的成功。最后须注意实验方法可能具有更广大的应用领域，特别是在不需要穿过膜递送药物的胞外病原体的情形。

恶性疟原虫的培养

根据标准方法用添加有10％AB⁺Rh⁺血清的缓冲培养基(补充有羟乙基哌嗪乙磺酸、庆大霉素和碳酸氢钠的RPMI)培养恶性疟原虫株FCR3S1.2的血液期寄生虫。

在大肠杆菌中的蛋白质表达

来自FCR3S1.2的重组DBL1α^His表达如下，将来自Qiagen的含有质粒pQE-TriSystem His-Strep 2(DBL1α^His)或pQE-60(DBL1α^His)的SG13009(pREP4)细胞在或22℃或37℃生长于含氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(30μg/mL)的LB培养基中。在OD₆₀₀＝0.8时用0.1mM IPTG诱导细胞3小时；收获1升细胞悬液(4℃，25min，3000g)，并再悬浮于25mL裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄/NaOH pH 7.4，300mM NaCl，1mMPMSF(Sigma)0.05％Triton x-100，10mM咪唑)。在冰上用溶菌酶孵育细胞30分钟，并超声处理。通过离心(4℃，30min，18.000g)除去不溶的细胞碎片。DNA酶处理上清液，并用1mL Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)在4℃轻轻搅拌下孵育2小时。以100×g沉淀珠子3分钟，并用15mL洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄/NaOH pH 7.4，300mM NaCl，0.05％Tritonx-100，30mM咪唑)洗涤3次。用400mM咪唑(Sigma)、50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl洗脱结合蛋白质，随后通过针对具有0.05％Triton X-100的PBS缓冲液在4℃透析18小时除去咪唑(Sigma)、NaH₂PO₄、NaCl。通过将样品在10％SDS-PAGE上电泳估计蛋白纯度，最后测定蛋白质浓度(Bradford 1976)。可选择地，在FPLC上纯化His-标记的DBL1α。将大肠杆菌提取的可溶级分以0.5mL/min的流速装载到FPLC上的Ni柱。用5-70mM咪唑梯度(60mL以1mL/min)洗涤结合蛋白质。用400mM咪唑洗脱并如前所述分析蛋白质。所有化学制品均得自Sigma。

体外筛选-SELEX

用寡核苷酸B(5′-CGACTGCAGAGCTTGCTACG(N)₅₀GGTACCGAGCTCGAATTCCC-3’)(SEQ.ID.NO.19)和寡核苷酸A(5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCGAGCTCGGTACC-3’)(SEQ.ID.NO.20)(标下划线的是用于T7启动子的序列)产生上述DNA文库。寡核苷酸是合成的并购买自IBA，德国。寡核苷酸B包含50个随机核苷酸的中央序列，其侧端有用于与寡核苷酸A退火的恒定区和用于反转录的引物位点。双链DNA文库通过以下构建：将3μM寡核苷酸A和寡核苷酸B退火(95℃5min并在25℃冷却15min)，随后在37℃添加在Klenow缓冲液(Fermentas)中的Klenow片段(Fermentas)2小时。通过microcon Ym-30柱(Millipore)纯化dsDNA，并在30μ1无RNA酶的水中洗脱。2′F修饰的文库通过以下构建：使用在提供的转录缓冲液中的T7聚合酶(Epicentre)，添加DTT(Epicentre)至10mM，ATP、GTP、2′F-dCTP、2′F-dUTP(Epicentre)至1.25mM，对40μg模板进行T7RNA转录。通过向20μl反应体积中添加0.37MBq[α-³²P]-ATP(Amersham Biosciences)标记RNA。反应在37℃下进行5小时，并用0.2MNaOAc、70％EtOH沉淀DNA/RNA。样品在10％8M尿素PAGE上进行电泳，从胶中切下放射性RNA，并通过压碎和用1M NaOAc(pH＝4.7)浸泡过夜纯化。玻璃棉离心后沉淀RNA(70％EtOH和糖原0.05％)。

用30μg(1nmol)放射标记的2′F-RNA和最低量60μg(1，3nmol)的纯化DBL1α进行第一个筛选循环。用大约300pmol RNA和从20μg到60μg变化量的蛋白质进行随后的循环。将His标记的DBL1α在循环1-4和7-8中结合到Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，并在循环5和6中结合到Ni-NTA磁性珠(Qiagen)。以RNA/蛋白质的变化比率(1∶1-4)，蛋白质和RNA的浓度为800nM至1.2μM。选择该浓度范围，因为假定以相类似方式起作用的其它分子，如硫酸肝素在10倍更高浓度中产生相同的值。在用DBL1α孵育前每个循环进行100μl Ni-NTA琼脂糖中的预筛选，以避免基质结合物的富集。在37℃轻轻搅拌下用DBL1α进行RNA孵育，起始循环中孵育60分钟，随后循环为孵育20分钟。用2×500μl PBSM洗涤珠子并用7M尿素、400mM咪唑、50mMNaH₂PO₄(pH＝7.4)洗脱RNA/蛋白质。用苯酚/氯仿抽提RNA，并用NaOAc/EtOH沉淀。通过使用闪烁器测量实验过程中所有收集级分的放射性来测定每个循环中的RNA回收。

用Nanodrop估计RNA的浓度并通过添加过量的引物B(5′-CGACTGCAGAGCTTGCTACG-3′)和提供的缓冲液中的20单位的M-MuLV-RT(Fermentas)以及1mM dNTP产生ssDNA。在37℃反应2小时。通过在37℃添加0.1M NaOH部分地降解2′F-RNA 30分钟。用Ym-30microcon柱纯化ssDNA，并用Nanodrop测定浓度。以1∶1比例向ssDNA中添加寡核苷酸A。两种寡核苷酸退火后，通过Klenow补足产生全长dsDNA。通过以下条件的PCR扩增dsDNA：使用Taq DNA聚合酶(Fermentas)，具有使用引物A(5′-GCGTAATACGACTCACTATAG-3′)和引物B的最多14个循环。将PCR产物汇集和纯化，并用作下一SELEX循环的模板。

RNA适体的克隆和测序

将从库8中PCR扩增的dsDNA克隆到来自Invitrogen的TOPO载体pCR4或pCR

2.1，并转化到大肠杆菌株Top10(Invitrogen)。将细胞涂布到具有100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基--b-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的LB琼脂上。分离白色菌落，通过使用M13反向和正向引物的菌落PCR确认插入。将阳性克隆划线到96孔板并送到AGOWA(德国)用M13引物测序。比对70个序列并用MEME/MAST系统基序发现检索版本3.5.4.(http://meme.sdsc.edu/meme)筛选保守基序。

单个适体的转录及其对DBL1α^His的结合

从LB-amp平板中挑取单个大肠杆菌克隆，并在37℃过夜生长于5mLLB-amp(100μg/mL)中。使用小量提取试剂盒(miniprep kit，Sigma)在3mL细胞培养物中分离质粒。在100μl水中洗脱质粒。使用用于PCR的引物A和引物B产生转录模板。在PCR扩增之前，用NotI切割载体，以避免不正确PCR产物的产生。通过在Ym-30柱(Millipore)上离心纯化PCR产物。500ng dsDNA模板的T7转录在20μl具有1.25mM 2′F-dNTP(Epicentre)和NTP(Fermentas)，10mM DTT(Epicentre)，0.37Mbq[(α-³²P]-ATP(Amersham Bioscience)的反应液中，于37℃反应3小时完成。将模板用1单位DNA酶在37℃消化15分钟。用MICROCON

纯化RNA。用NanoDrop测定RNA浓度。

电泳迁移率变动测定

将25-30ng内部³²P-[α-ATP]标记的RNA孵育于18μl具有4-5μl(～300ng)新洗脱DBL1α^His的体积内，并将3μg酵母RNA添加到PBSM。将没有DBL1α^His的样品在10μg BSA存在下孵育，并将4-5μl 400mM咪唑洗脱缓冲液添加到BSA样品，因此，对照与用DBL1α孵育的样品相同。将样品在37℃孵育10分钟，并添加6×上样缓冲液(Maniatis)。将10μl样品加载到1mm厚度的10％PAA凝胶，并在80V电泳30分钟，然后在200V电泳直到低分子量迁移染料(lower migration dye)(溴酚蓝)跑出凝胶为至。将磷光成像板(商标)曝光过夜，并在Storm磷光成像仪上分析成像板。

荧光素标记适体

用荧光素共转录地标记适体RNA。转录混合物在每20μl反应中含有NTP标记混合物(10mM ATP，10mM CTP，10mM GTP，6.5mM UTP和3.5mM荧光素-12-UTP，pH 7.5)(Roche Applied Science)、5×T7转录缓冲液、2μl T7聚合酶(50U/μl，Fermentas)、无菌无RNA酶的dH₂O(Fluka)和200ng模板DNA。在37℃进行反应2小时。转录产物用DNA酶处理(New England BioLabs Inc)；EtOH/NaOAc沉淀两次，并用MICROCON

(MILLIPORE)纯化。

活细胞分析，荧光显微法和成像(Imagin)

将恶性疟原虫寄生虫(株FCR3S1.2)培养到营养体阶段(trophozoite stage)并调整到4-5％的寄生虫血症。用无菌PBS洗涤寄生虫感染的红细胞(parasitized erythrocytes，PE)两次，弃去上清液，并将沉淀重悬于大约200μl无菌PBS。对于活细胞分析，根据制造商的方案在粘着载玻片(Marienfeld Glassware)上制备单层。基于静电粘着而没有其它固定步骤将负电性的细胞结合到这些载玻片，允许研究活晚期寄生虫感染的红细胞。用无菌PBS洗涤细胞，添加溶解于20μl PBS 1％BSA的500ng RNA样品，并允许孵育30分钟。作为该实验中的阴性对照，使用来自库0的适体RNA。通过用无菌PBS洗涤除去未结合的RNA，并添加含有DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)(载体)的Vectasheild

Mounting培养基。所有孵育在室温潮湿箱中进行。用尼康Optiphot 2 UV显微镜中的100×油浸镜头分析载玻片。

玫瑰花结破坏分析

将用于破坏分析的RNA样品用水和1mM MgCl₂洗涤。使用烛罐技术(参见Vogt)将恶性疟原虫株FCR3S1.2培养到5％血细胞比容的4-5％的寄生虫血症。将细胞培养物与RNA样品混合到从130nM至750nM浓度的最终100μl体积。添加水/MgCl₂或用从未筛选库0dsDNA的T7转录产生的未筛选RNA进行阴性对照。将寄生虫在室温轻轻搅拌下孵育1到2.5小时。将培养物与RPMI/吖啶橙混合，并使用显微镜分析玫瑰花结情况。盲法无偏见进行计数，对于每个样品最小计数400个寄生虫。将玫瑰花结寄生虫定义为具有大于2个附着未感染红细胞的感染红细胞。当自动凝集时，将簇中的每个单一寄生虫计数为玫瑰花结寄生虫。将玫瑰花结形成率计算为(玫瑰花结寄生虫/(玫瑰花结寄生虫+非玫瑰花结寄生虫)×100。

我们已能够显示这些SELEX-适体在33nM浓度的玫瑰花结破坏能力，显示在387nM具有100％破坏。而且，它们在血清中具有20小时的半衰期。

适体结合到GST-DBL1α。设计另外的实验以证实新适体与蛋白质的相互作用是特异性的。非标记RNA与放射性5′标记的RNA竞争结合到GST-DBL1α融合蛋白。随着30倍摩尔过量的非标记RNA的添加，标记的RNA的回收减少40％。如果与b02、d12、e05相比，实验中两个阴性对照，未筛选的RNA(库0)和e02产生85-90％更低的回收。

将放射性标记的d12在存在30倍摩尔过量的e02和库0下孵育，以进一步证实观察的降低是特异性的。随着来自这两个库的RNA的添加，没有观察到降低。而且，当添加45倍摩尔过量的非标记d12 RNA时，标记RNA显示出从40％至60％的额外的降低。

适体结合到感染的红细胞表面。随着筛选的适体结合到重组DBL1α结构域，下一步是验证是否它们能够关联到感染的红细胞表面。将这些适体中的两种与来自库0的未筛选的RNA以及非结合适体e02比较。将等摩尔量的RNA用³²P末端标记并用FCR3S1.2的5％寄生虫血症的培养物孵育。结果显示筛选的RNA保持比来自未筛选库的RNA或非结合适体e02高4倍。

本发明的治疗性或药理组合物将通常包括溶解或分散于药学可接受介质的有效量的治疗活性组分。药学可接受介质或载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂及类似物。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用在本领域是熟知的。本发明的治疗组合物还可以掺入辅助活性成分。

根据本公开，本领域的技术人员了解药物或药理组合物的制备。通常地，该组合物可制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；适于在注射前溶解或悬浮于液体的固体形式；作为片剂或其它用于口服的固体；作为定时释放胶囊(time release capsule)；或任何其它当前使用的形式，包括滴剂、乳剂、洗剂、膏剂、吸入剂及类似物。外科医生、内科医师或护理工作者使用无菌制剂(例如基于盐水的洗剂)以处理手术区中特定区域也可特别有用。组合物也可经由微装置、微颗粒或海绵递送。

配制后，治疗剂以与剂量制剂相容的方式，并以药理学有效的量施用。制剂容易以各种剂型，如上述可注射溶液的类型施用，但也可采用药物释放胶囊及类似物。

本文中，待施用的活性成分的量和组合物的体积取决于待治疗的宿主动物。需要施用的活性物质的准确量取决于医生的判断并因各个体而异。

通常地使用分散活性化合物所需的组合物的最小体积。用于施用的适合方案也是可变化的，但典型为起始施用化合物并监视结果，然后以进一步的间隔给予进一步控制的剂量。

例如，对于以片剂或胶囊(如，明胶胶囊)形式的口服施用，活性药物组分可以与口服非毒性药学可接受惰性载体如乙醇、甘油、水及类似物组合。而且，当需要或必要时，也可将适当的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物。适当粘合剂包括淀粉、硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖类，如葡萄糖或β-乳糖；玉米甜味剂；天然和合成胶如阿拉伯胶、黄芪胶或海藻酸钠、聚乙二醇、蜡及类似物。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇及类似物。崩解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物、及类似物。稀释剂包括如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸。

本发明的化合物还可以诸如定时释放和持续释放的片剂或胶囊、药丸、粉末、颗粒、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆和乳状液的口服剂型施用。

可注射组合物优选为含水的等渗溶液或悬浮液，从脂肪性乳状液或悬浮液有利地制备栓剂。组合物可以是无菌的和/或包含佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂，溶解促进剂，用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可包含其它治疗有用物质。分别根据常规混合、造粒或包衣法制备组合物，通常地包含约0.1％至75％，优选约1％至50％的活性成分。

液体特别是可注射组合物例如可以通过溶解、分散等制备。将活性化合物溶解于或与药学纯溶剂，如水、盐水、右旋糖水溶液(aqueous dextrose)、甘油、乙醇及类似物混合，由此形成可注射溶液或悬浮液。另外，可配制在注射前适于溶解于液体的固体形式。

本发明的化合物可以以静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下或肌内形式施用，全部使用对药学领域的普通技术人员是熟知的形式。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液。

而且，本发明优选的化合物可以以鼻内形式经由局部使用适当鼻内载体、吸入剂、或经由经皮路径使用本领域普通技术人员熟知的经皮皮肤贴剂的那些形式施用。以经皮递送系统形式施用，在整个剂量方案中剂量施用当然是连续性，而不是间歇性的。其它优选局部制剂包括乳剂、软膏剂、洗剂、气溶胶喷雾和凝胶，其中活性成分的浓度通常地在从0.01％至15％(w/w或w/v)的范围内。

对于固体组合物，可以使用赋形剂，包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁及类似物。以上定义的活性化合物也可配制为栓剂，使用例如聚亚烃基二醇(polyalkylene glycol)，如丙二醇作为载体。在一些实施方案中，从脂肪性乳状液或悬浮液有利地制备栓剂。

本发明的化合物还可以以脂质体递送系统，如小单层囊泡(vesicle)、大单层囊泡和多层囊泡的形式施用。可由包含胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱的各种磷脂形成脂质体，在一些实施方案中，如美国专利第5,262,564号所述，脂质组分的薄层与药物的水溶液水合成封装有药物的脂质层。例如，此处所述的适体分子可以提供为与利用本领域已知的方法构造的亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物的复合物。核酸相关复合物的实例提供于美国专利第6,011,020号。

本发明的化合物还可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。该聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或用十六酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸(polyethyleneoxidepolylysine)。而且，本发明的化合物可偶联到一类用于实现药物的控制释放的可生物降解的聚合物，如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟丁酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。

本发明的化合物还可通过到组织的全身血液和体液而递送到组织，所以通过肠胃外全身注射、通过静脉内、肌内或皮下递送路径施用。本发明的药物组合物通过注射施用可用作对全身施用治疗疟疾和/或有这种表现的全身性疾病治疗剂的补充。

本发明的化合物也可以储库或持续释放凝胶或聚合物制剂通过下列施用至组织：手术移植可生物降解的微小尺寸聚合物系统(如微装置、微颗粒或海绵，或者其它缓释经巩膜装置)，在疾病治疗过程中移植；或通过递送装置，如聚合物持续递送装置。本发明的化合物也可局部施用到组织，如以注入本发明的化合物的滴剂，或通过使用电流驱动药物从表面到组织的离子电渗疗法。

如果需要，待施用的药学组合物也可包含少量非毒性辅助物质，如润湿或乳化剂，pH缓冲剂和其它物质例如，乙酸钠和油酸三乙醇胺。

使用适体的剂量方案根据多种因素来选择，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、重量、性别和医学病况；待治疗病况的严重度；施用途径；患者的肾和肝功能；和采用的特定适体或其盐。普通熟练医师可以容易地决定和开出防止、阻碍或阻止病况进展所需的药物有效量。

当为指定效果使用时，本发明适体组合物的口服剂量范围为每天口服约0.05到7500mg。优选以带刻痕片剂的形式提供组合物，该带刻痕片剂包含0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1000.0mg的活性成分。本发明的化合物可以单一日剂量施用，或以每天二、三或四次分剂量施用总的日剂量。

本发明适体组合物的输注剂量、鼻内剂量和经皮剂量范围为每天0.05到7500mg。本发明适体组合物的皮下、静脉内和会阴内剂量范围为每天0.05到3800mg。

本发明适体组合物的脑内剂量在0.001到10mg之间，例如通过从一周一次到每三个月一次的注射或通过持续释放装置或制剂施用。

本发明适体化合物的有效血浆水平在0.002mg/mL到50mg/mL的范围内。本发明适体化合物的有效脑内水平可以在从20nM到250μM的范围内。对于适体SEQ.ID.NO 6到9及相应的氟化适体SEQ.ID.NO 10到12来说，33nM的浓度对于提供破坏能力是足够的，而380nM将提供100％的破坏。

附图说明

图1.在大肠杆菌中表达的His-标记的DBL1α的Ni-NTA琼脂糖纯化。用100μM IPTG在OD₆₀₀＝1.2时诱导细胞，并生长三个小时。在10mM咪唑和0.1％TritonX-100中用超声处理裂解细胞。用20mM到90mM咪唑洗涤Ni-NTA琼脂糖珠，在具有400mM咪唑的磷酸盐缓冲液中洗脱结合蛋白质。

图2.使用具有在UTP和CTP上的2′-F取代的序列的随机RNA文库在结合到Ni-NTA琼脂糖或者Ni-NTA磁性珠的纯化DBL1α上的体外筛选。在包含1mM MgCl₂、具有大约1μM比率为2∶1的蛋白质和RNA的PBS缓冲液中，在37℃和孵育30分钟，进行筛选。用苯酚-氯仿抽提结合的RNA，并通过反转录和Klenow补全反应转变为dsDNA，随后PCR扩增。

图3.放射性标记RNA在大肠杆菌纯化的DBL1α^His上的结合。在提供有600μg酵母RNA的800μl PBSM中，在37℃搅拌下将40nM ³²P-标记的2′F-RNA与350-400nM DBL1α^His孵育45分钟。用2×1mL PBS洗涤珠子，用500mM咪唑洗脱结合的RNA/DBL1α^His。收集所有级分，并通过闪烁计数估计RNA回收。

图4.在DBL1α^His存在下孵育的筛选的克隆的迁移率变动测定。将25-30ng内部³²P-[αATP]标记的RNA用～300ng DBL1α^His孵育10分钟，在10％TBE-缓冲的PAA凝胶(+)上电泳。在阴性对照(-)中将25-30ng内部³²P-[αATP]用10μg BSA孵育并加载到凝胶上。

图5.筛选的克隆e05的迁移率变动测定。将～30ng内部³²P-[αATP]标记的RNA用～300-400ng DBL1α^His孵育10分钟，并与在存在10μg BSA下孵育的阴性对照(-)一起上样到10％TBE缓冲的PAA凝胶(+)。

图6.在荧光显微术中活细胞检测的分析。(a)荧光素标记的来自库8的RNA缔合到DAPI染色的寄生虫感染的红细胞。相同的荧光素标记的RNA与未感染寄生虫的红细胞(显示为黑色小块)结合并不明显。(b)从前面的图中剪出图(cut out)。(c)虽然荧光素标记的来自库0的RNA在一定程度上缔合到DAPI染色的寄生虫感染的红细胞，但不如寄生虫和库8RNA之间的缔合那样显著。

图7与未筛选的库0RNA相比，克隆e05和b02的玫瑰花结破坏作用的初步图。在最终图中显示在x轴上的适体浓度为1或2-4-8-12μg/mL和包括e02作为没有明显作用的适体。

图8.显示了对照的状态和破坏的玫瑰花结的状态。FCR3S1.2的玫瑰花结破坏。用吖啶橙染色的细胞的荧光显微检查，使用40×或20×的放大率。图像(a)和(c)是用在98μl细胞中与2μl水孵育一小时的对照细胞。(b)和(d)是用来自SELEX克隆d12的2μl(800ng)2′F-RNA处理的细胞。在图像(c)中，巨大的玫瑰花结圈于圆内。

Claims (11)

1.一种适体或其活性片段，其针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1PfEMP1的半保守的duffy结合配体结构域1αDBL1α区域而产生。

2.根据权利要求1所述的适体，其中所述适体选自由以下组成的组：

UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUAGUCGUAUUGUU(SEQ.ID.NO.1)

UCAUGUGCCAGUGUUUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUGGUGAGCUAGU(SEQ.ID.NO.2)，

CUUCGAACGGCCCUGGUUGUUGGUUUUAAUUCAUUUAUCCGCGUGGUACGGU(SEQ.ID.NO.3)，

UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ.ID.NO.4)

AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ.ID.NO.5)，和

GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCCGUUCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SEQ.ID.NO.6)

或其活性片段。

3.根据权利要求1或2所述的适体，其中所述适体选自由以下组成的氟化适体SEQ.ID.NO.1至6组成的组：

U^FGC^FC^FAAC^FC^FU^FU^FC^FGAU^FGC^FAAGAU^FAAU^FAC^FU^FU^FU^FU^FGAU^FGGU^FGU^FAGU^FC^FGU^FAU^FU^FGU^FU^F(SEQ.ID.NO.7)，

U^FC^FAU^FGU^FGC^FC^FAGU^FGU^FU^FU^FGAAAAAAC^FGC^FGU^FU^FGAU^FU^FGC^FU^FGGU^FGU^FGGU^FGAGC^FU^FAGU^F(SEQ.ID.NO.8)

C^FU^FU^FC^FGAAC^FGGC^FC^FC^FU^FGGU^FU^FGU^FU^FGGU^FU^FU^FU^FAAU^FU^FC^FAU^FU^FU^FAU^FC^FC^FGC^FGU^FGGU^FC^FAC^FGGU^F(SEQ.ID.NO.9)，

U^FAGC^FU^FC^FAC^FC^FAC^FAC^FC^FAGC^FAAU^FC^FAAC^FGC^FGU^FU^FU^FU^FU^FU^FC^FAAAC^FAC^FU^FGGC^FAC^FAU^FGA(SEQ.ID.NO.10)

AAC^FAAU^FAC^FGAC^FU^FAC^FAC^FC^FAU^FC^FAAAAGU^FAU^FU^FAU^FC^FU^FU^FGC^FAU^FC^FGAAGGU^FU^FGGC^FA(SEQ.ID.NO.11)

GU^FGAC^FC^FAC^FGC^FGGAU^FAAAU^FGAAU^FC^FAAAAAC^FAAC^FAAC^FC^FAGGGC^FC^FGU^FU^FC^FGAC^FU^FAC^FGC^FU^FAAU^FU^FAU^FC^FC^FC^FG(SEQ.ID.NO.12)

或其活性片段。

4.根据权利要求2或3所述的适体，其中所述适体由序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SE Q.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11或SEQ.ID.NO.12的任一个组成。

5.根据权利要求1所述的适体，其中所述适体由序列GACUGAUUACGCCAGCUUGG(SEQ.ID.NO.23)或GAC^FU^FGAU^FU^FAC^FGC^FC^FAGC^FU^FU^FGG(SEQ.ID.NO.24)的任一个组成。

6.一种或多种适体或其活性片段在治疗脑型疟中的用途，其中所述适体或其活性片段针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy结合配体结构域1αDBL1α区域产生。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述适体选自由以下组成的组：

UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUAGUCGUAUUGUU(SEQ.ID.NO.1)

UCAUGUGCCAGUGUUUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUGGUGAGCUAGU(SEQ.ID.NO.2)，

CUUCGAACGGCCCUGGUUGUUGGUUUUAAUUCAUUUAUCCGCGUGGUCACGGU(SEQ.ID.NO.3)

UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ.ID.NO.4)

AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ.ID.NO.5)，和

 GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCCGUUCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SEQ.ID.NO.6)。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述适体选自由以下组成的氟化适体组成的组：

U^FGC^FC^FAAC^FC^FU^FU^FC^FGAU^FGC^FAAGAUFAAU^FACFU^FU^FU^FU^FGAU^FGGU^FGU^FAGU^FC^FGU^FAU^FU^FGU^FU^F(SEQ.ID.NO.7)，

U^FC^FAU^FGU^FGC^FC^FAGU^FGU^FU^FU^FGAAAAAAC^FGC^FGU^FU^FGAU^FU^FGC^FU^FGGU^FGU^FGGU^FGAGC^FU^FAGU^F(SEQ.ID.NO.8)，

C^FU^FU^FC^FGAAC^FGGC^FC^FC^FU^FGGU^FU^FGU^FU^FGGU^FU^FU^FU^FAAU^FU^FC^FAU^FU^FU^FAU^FC^FC^FGC^FGU^FGGU^FCFAC^FGGU^F(SEQ.ID.NO.9)

U^FAGC^FU^FC^FAC^FC^FAC^FAC^FC^FAGC^FAAU^FC^FAAC^FGC^FGU^FU^FU^FU^FU^FU^FC^FAAAC^FAC^FU^FGGC^FAC^FAU^FGA(SEQ.ID.NO.10)

AAC^FAAU^FAC^FGAC^FU^FAC^FAC^FC^FAU^FC^FAAAAGU^FAU^FU^FAU^FC^FU^FU^FGC^FAU^FC^FGAAGGU^FU^FGGC^FA(SEQ.ID.NO.11)

GU^FGAC^FC^FAC^FGC^FGGAU^FAAAU^FGAAU^FC^FAAAAAC^FAAC^FAAC^FC^FAGGGC^FC^FGU^FU^FC^FGAC^FU^FAC^FGC^FU^FAAU^FU^FAU^FC^FC^FC^FG(SEQ.ID.NO.12)。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述适体由序列GACUGAUUACGCCAGCUUGG(SEQ.ID.NO.23)或GAC^FU^FGAU^FU^FAC^FGC^FC^FAGC^FU^FU^FGG(SEQ.ID.NO.24)的任一个组成。

10.一种用于确定存在严重疟疾的诊断，该诊断是通过确定血液样品对针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1PfEMP1的半保守duffy结合配体结构域1α，DBL1α区域产生的适体的反应。

11.一种用于预防性地和/或治疗性地治疗严重疟疾的方法，该方法是通过施用治疗活性量的针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白1PfEMP1的半保守duffy配体结合结构域1αDBL1α区域产生的适体。

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