CN101972289A

CN101972289A - 具抗病毒活性的滇柴胡地上部分总黄酮的提取富集方法

Info

Publication number: CN101972289A
Application number: CN 201010509485
Authority: CN
Inventors: 王强; 杨杰; 梅赞; 窦洁; 贾贝西; 毛茜
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明提供了一种具有抗病毒活性的滇柴胡地上部分总黄酮的提取富集方法，其提取步骤为：滇柴胡地上部分经过干燥、提取、浓缩至无醇味、沉降过滤、萃取，二次浓缩至干、加水溶解并调节pH值沉降过滤、滤液进行柱吸附解析，解析液浓缩干燥即得滇柴胡地上部分总黄酮。本发明提取富集工艺经过改进后，有选择性的富集活性成分，去除大量杂质，得到的产品总黄酮的含量超过55％，符合中华人民共和国《药品管理法》规定的中药五类新药的原料标准。同时，本方法的重复性，稳定性好，从而保证了疗效的稳定；原料有效成分转移率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产。

Description

具抗病毒活性的滇柴胡地上部分总黄酮的提取富集方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效部位的提取富集工艺，特别是涉及具有抗病毒活性的滇柴胡地上部分总黄酮的提取富集工艺，属中药技术领域。

背景技术

柴胡是伞形科(Umbelliferae)柴胡属Bupleurum植物，为常用的辛凉解表药，已有2000多年的应用历史，《神农本草经》中列为上品。柴胡属植物在全世界约有200多种。目前，中国已报道的柴胡属植物有42种、17变种、7变型。中国药典2010年版收载的柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，作为我国传统的正品柴胡使用，而国内各地区入药的柴胡植物不完全一致，往往取决于当地的资源条件及用药习惯。

滇柴胡(来源为竹叶柴胡Bupleurum marginatum Wall.ex DC.、小柴胡Bupleurum tenue Buch.Ham.ex D.Don和马尾柴胡Bupleurum microcephalum Diels)主要分布于四川北部、陕西南部、湖北西部以及云南、贵州等省，为目前市场上药材柴胡的三大主要来源之一，主流药材为竹叶柴胡。滇柴胡作为西南地区的药用柴胡，以全草入药，疗效显著，且其资源丰富，是一种很有开发价值的柴胡品种。

经检索，目前被报道的柴胡地上部分总黄酮的提取富集方法主要有两种：

方法一：柴胡药材乙醇提取、过滤、上大孔吸附树脂或聚酰胺柱，含水醇洗脱，浓缩，重结晶。(江苏省中国科学院植物研究所.柴胡茎叶提取物及其制备方法和用途[P].中国专利：CN02137936.X，2004-09-15.)

方法二：取柴胡水提取液，调pH2-5、过大孔树脂柱、含水醇洗脱、正丁醇萃取、浓缩。(江苏正大天晴药业股份有限公司.一种抗流感病毒的柴胡黄酮组合物及其制备方法[P].中国专利：CN02137936.X，2003-01-08)

然而，研究表明，滇柴胡中的化学成分与正品柴胡存在差异，且经我们实验证明(见表1)，这两种运用于正品柴胡中总黄酮的提取方法并不适合于滇柴胡地上部分总黄酮的制备。

表1 已报道方法与本发明中方法滇柴胡中总黄酮含量比较

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从滇柴胡地上部分中提取富集滇柴胡总黄酮的方法，工艺简单易行，适合工艺生产，并通过系列药效学实验证明所得滇柴胡总黄酮具有抗病毒活性。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

本发明涉及一种滇柴胡地上部分中总黄酮的提取富集方法，提取物中总黄酮的含量为50％-90％。

提取总黄酮的方法有以下步骤：

滇柴胡地上部分经过干燥、提取、浓缩至无醇味、沉降过滤、萃取，二次浓缩至干、加水溶解并调节pH值沉降过滤、滤液进行柱吸附解析，解析液浓缩干燥即得。

本发明的技术方案为：

1.取滇柴胡地上部分，加50-90％的乙醇8-12倍量热回流提取2-3次，每次2-3h；

2.合并提取液，浓缩至无醇味，置冰箱冷藏，静置24h，沉淀叶绿素，取上清液，用水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，水浴回流至干，加水溶解，加入5％盐酸或5％硫酸，调节pH至1-5，静置，取上清液；

3.上清液过大孔树脂柱，大孔树脂型号为HPD100、HPD300、HPD400或HPD600；然后分别用柱体积的3倍量的水、10％乙醇洗脱，弃去；再用柱体积的3倍量的60-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，喷雾干燥，得总黄酮，所得总黄酮采用UV法测定，含量大于55％。

本发明所述的一种具抗病毒活性的滇柴胡地上部分总黄酮的提取富集方法其优点在于：

(1)改进后的方法与现有方法相比，滇柴胡提取物中总黄酮的含量提高了2.8和1.6倍。得到的产品采用UV法测定的总黄酮含量大于55％，符合中华人民共和国《药品管理法》规定的中药二类的原料标准。同时，本方法的重复性、稳定性好，从而保证了疗效的稳定；原料有效成分转移率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产。

(2)通过一系列的药效学实验证明本发明所得总黄酮具有较明显的抗病毒作用。实验如下：

【实验例一】滇柴胡总黄酮对小鼠流感病毒感染模型的死亡保护作用：

一、实验目的

用小鼠感染模型对滇柴胡的体内抗流感病毒作用进行研究，为滇柴胡的临床应用提供实验依据。

二、实验材料

1.受试药物

配制方法：称取10mg滇柴胡总黄酮，加入120ml水中溶解，即为滇柴胡药物原液。

2.病毒株及菌株

流感病毒鼠肺适应株A/FM1/1/47/(H1N1)，接种鸡胚，收集尿囊液保存。副流感病毒仙台株，接种鸡胚，收集尿囊液保存。

3.实验动物

ICR小鼠，体重18～22g，购自南通大学实验动物中心，小鼠采用苦味酸标记，给药期间自由进食、饮水(Co⁶⁰照射饲料和灭菌水)，每天12小时光照，12小时黑暗，温度22±2℃，湿度55-70％。

4.阳性对照

双黄连口服液，哈药集团三精制药有限公司生产。批号：07072924。临用前以文火煮沸消毒30分钟。

利巴韦林颗粒，中国药科大学制药有限公司生产，规格50mg，批号070401。临用前以生理盐水配制成5mg/ml浓度，以孔径0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

三、实验方法

ICR小鼠，♀♂各半，随机分为7组：滇柴胡总黄酮高剂量组(42mg/kg)、滇柴胡总黄酮中剂量组(21mg/kg)、滇柴胡总黄酮低剂量(10.5mg/kg)，双黄连口服液10ml/kg，利巴韦林(400mg/kg)，正常对照组和病毒对照组，每组6只。适应性培养2天后，开始实验。

给药方法：每天给药两次，共给药4d，给药体积100μl，病毒对照组及正常对照组同法给予等体积生理盐水。

感染方法：给药第二天开始接种病毒，除正常对照组以外，其它各组小鼠用乙醚轻度麻醉，鼻腔内接种相当于5LD₅₀的含流感病毒的鸡胚尿囊液200μl/只。

自感染次日起，连续14d，每日观察并记录小鼠死亡数，计算死亡保护率和平均存活时间。

死亡保护率(％)＝对照组死亡率(％)-实验组死亡率(％)

存活时间＝同组内每只动物生存日数相加/实验动物数

四、实验结果

与病毒对照组相比较，滇柴胡各剂量组均能显著降低流感病毒感染所致的小鼠死亡率，延长平均存活时间，以42mg/kg剂量组的作用最为显著。

表2 滇柴胡对A/FM1/1/47/(H1N1)感染小鼠的死亡保护作用(n＝6)

【实验例二】滇柴胡总黄酮对小鼠副流感病毒感染模型的死亡保护作用

一、实验目的

用小鼠感染模型对滇柴胡的体内抗副流感病毒作用进行研究，为滇柴胡的临床应用提供实验依据。

二、实验材料

1.受试药物

2.病毒株及菌株

3.实验动物

4.阳性对照

三、实验方法

ICR小鼠，♀♂各半，随机分为7组：滇柴胡高剂量组(42mg/kg)、滇柴胡中剂量组(21mg/kg)、滇柴胡低剂量(10.5mg/kg)，双黄连口服液10ml/kg，利巴韦林(400mg/kg)，正常对照组和病毒对照组，每组6只。适应性培养2天后，开始实验。

感染方法：给药第二天开始接种病毒，除正常对照组以外，其它各组小鼠用乙醚轻度麻醉，鼻腔内接种相当于5LD₅₀的含副流感病毒的鸡胚尿囊液100μl/只。

死亡保护率(％)＝对照组死亡率(％)-实验组死亡率(％)

存活时间＝同组内每只动物生存日数相加/实验动物数

四、实验结果

与病毒对照组相比较，滇柴胡各剂量组均能显著降低副流感病毒感染所致的小鼠死亡率，延长平均存活时间。

表3 滇柴胡对副流感病毒仙台株感染小鼠的死亡保护作用(n＝6)

以上实验证明本发明所得的柴胡总黄酮对流感病毒、副流感病毒仙台株体内感染均有较好的抑制作用。其中对流感病毒的抑制作用优于副流感病毒。

具体实施方式

实施例中，所用的滇柴胡产于云南大理的竹叶柴胡，对照品芦丁为国家药品生物制品检定所提供，大孔树脂购于沧州宝恩化工有限公司。

测定原料中总黄酮的方法，依照中国药典2010版一部附录VB中的比色法。

实施例1

取滇柴胡地上部分粗粉10kg，加重量为滇柴胡地上部分5倍、浓度为50％的乙醇热回流提取3次，每次2h；合并提取液，浓缩至无醇味，置冰箱冷藏，静置24h，沉淀叶绿素，取上清液，用水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，水浴回流至干，加水溶解，加入5％HCl，调节pH至2-3，静置，取上清液；上清液过HPD-100型大孔树脂柱，大孔树脂分别用柱体积的3倍量的水、10％乙醇洗脱，弃去；再用柱体积的3倍量的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，喷雾干燥，得总黄酮137g，含量为55.7％。

实施例2

取滇柴胡地上部分粗粉10kg，加重量为滇柴胡地上部分10倍、浓度为30％的乙醇热回流提取3次，每次1.5h；合并提取液，浓缩至无醇味，置冰箱冷藏，静置24h，沉淀叶绿素，取上清液，用水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，水浴回流至干，加水溶解，加入5％HCl，调节pH至1-5，静置，取上清液；上清液过HPD-400型大孔树脂柱，大孔树脂分别用柱体积的4倍量的水、10％乙醇洗脱，弃去；再用柱体积的2倍量的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，喷雾干燥，得总黄酮119g，含量为50.1％。

实施例3

取滇柴胡地上部分粗粉10kg，加重量为滇柴胡地上部分8倍、浓度为75％的乙醇热回流提取3次，每次1h；合并提取液，浓缩至无醇味，置冰箱冷藏，静置24h，沉淀叶绿素，取上清液，用水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，水浴回流至干，加水溶解，加入5％HCl，调节pH至1-5，静置，取上清液；上清液过HPD-600型大孔树脂柱，大孔树脂分别用柱体积的5倍量的水、10％乙醇洗脱，弃去；再用柱体积的1倍量的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，喷雾干燥，得总黄酮101g，含量为50.5％。

实施例4

取滇柴胡地上部分粗粉10kg，加重量为滇柴胡地上部分12倍、浓度为90％的乙醇热回流提取3次，每次2.5h；合并提取液，浓缩至无醇味，置冰箱冷藏，静置24h，沉淀叶绿素，取上清液，用水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，水浴回流至干，加水溶解，加入5％HCl，调节pH至2-3，静置，取上清液；上清液过HPD-300型大孔树脂柱，大孔树脂分别用柱体积的2倍量的水、10％乙醇洗脱，弃去；再用柱体积的4倍量的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇味，喷雾干燥，得总黄酮108g，含量为51.8％。

Claims

1.一种滇柴胡地上部分提取物，其特征是：提取物中具有抗病毒活性的主要活性部位滇柴胡总黄酮的含量为50-90％。

2.根据权利1所述的提取物，其特征是经过以下提取方法获得：滇柴胡地上部分用浓度为50-90％的低级醇提取、浓缩、沉降过滤、用水饱和正丁醇萃取，二次浓缩、加水溶解并调节pH值1-5，沉降过滤、滤液上大孔树脂柱，然后用0-10％乙醇洗脱，弃去；再60-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得总黄酮。

3.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是所述的提取液优选5-12倍量的浓度为50％-90％的乙醇水溶液。

4.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是提取液回流提取3次，每次1-2.5小时。

5.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是所述的萃取液优选水饱和后的正丁醇溶液。

6.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是加入稀盐酸或稀硫酸调节pH至1-5。

7.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是用型号分别为HPD100、HPD300、HPD400、HPD600的大孔树脂分离提纯。

8.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是使用2-5倍大孔树脂柱体积量的纯水洗涤、10％乙醇水溶液洗脱。

9.根据权利要求2所述的从滇柴胡地上部分提取富集具有抗病毒活性总黄酮的方法，其特征是解析溶剂优选为3倍大孔树脂柱体积量的浓度为60％-90％的乙醇水溶液。