CN101962667A - 一种用于检测胃癌易感的基因组合、引物、探针和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测胃癌易感的基因组合、引物、探针和用途，它包括与胃癌关系密切的4个基因的组合：MTHFR基因、CYP2E1代谢酶基因、XRCC1及ADPRT修复酶基因。包括下述SNP位点：MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点。通过检测一组与胃癌易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检人群是否携带“胃癌易感基因”，将胃癌易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

Description

一种用于检测胃癌易感的基因组合、引物、探针和用途

技术领域

本发明涉及一种基因组合、引物、探针和用途，尤其是一种用于检测胃癌易感的基因组合、引物、探针和用途。

背景技术

胃癌是最常见消化道恶性肿瘤肿瘤之一，是严重威胁人类健康生命的常见病、多发病。据统计，全世界每年约有90万人新诊断为胃癌，在我国，胃癌占消化道恶性肿瘤第1位，全身恶性肿瘤第3位。根据卫生部卫生信息统计中心2001年公布的资料，恶性肿瘤是我国城市居民的第1位死因，死亡率为135.59/10万(24.9％)。其中，胃癌在恶性肿瘤死因中居第3位。胃癌的发生、发展同其他恶性肿瘤一样，属多因素、多步骤、多阶段和多基因改变过程。近年来，某些基因的单核苷酸多态性(SNP)在恶性肿瘤易感性研究中倍受关注，研究认为亚甲基四氢叶酸还原酶基因(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)的C677T位点(rs1801133)，CYP2E1的rs2031920位点，X线修复交叉互补基团1(X-ray repaircross-complementing group 1，XRCC1)的Arg399Gln位点(rs25487)及二磷酸腺苷核糖基转移酶(Adenosine diphosphate ribotransferase，ADPRT)的Ala762Val位点(rs1136410)增加个体患胃癌的风险。

MTHFR定位于染色体1p36.3，整个编码区长1980bp，包括11个外显子，其cDNA序列全长2.2Kb。该基因的编码产物是含有656个氨基酸残基、相对分子量大约为150kDa的同源二聚体，其氨基酸序列高度保守。MTHFR基因有多种突变类型，不同的突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响。至今，已发现MTHFR基因上有近30个SNP位点，其中已有18个cSNP在GenBank数据库登陆。1995年，有人发现了MTHFR的C677T位点。该位点位于MTHFR基因第4外显子的叶酸盐结合位点上。MTHFR基因第677位碱基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置换，从而使一个高度保守的丙氨酸(Ala)变成了缬氨酸(Val)。C677T位点位于MTHFR催化区域，该突变直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有耐热性降低。

叶酸是核苷酸DNA合成及甲基化的重要前体物质，叶酸缺乏通过干扰DNA合成和甲基化，进而影响癌症的发生。研究发现人群中MTHFR基因C677T位点变异导致酶活性下降，使总叶酸水平降低，特别是5-甲基四氢叶酸水平降低，5，50-亚基四氢叶酸积聚及细胞内叶酸衍生物构成发生变化。研究表明MTHFR基因677TT基因型多态性是胃癌的危险因素。

大多数化学物质需在代谢酶的作用下活化后才产生致癌效应，主要的代谢酶有氧化酶(I相)，如细胞色素P450氧化酶(CYPs)。前致癌物进入人体内经CYP450催化，转变成亲电子化合物攻击细胞内生物大分子，形成DNA加成物，启动致癌或致突变过程；由于这些酶的基因多态性引起酶分子结构、功能和水平改变，能影响细胞灭活致癌物和诱变剂的能力，进而被认为与肿瘤易感性有关。CYP2E1是其中的一种，编码二甲基亚硝胺D-脱甲基酶(Debri soquine Hydroxylase，DBH)，主要参与食物中亚硝胺及其前体物和低分子量卤代烃类化合物在体内的代谢。该基因定位于人类染色体10q24.3-ter，长11.4kb，含9个外显子。CYP2E1的rs2031920位点，位于5-调控区内由C→T的置换所致，研究认为该位点多态性与CYP2E1代谢酶转录活性增强相关，其突变基因型的表达较野生基因型高，TT基因型增加患食管癌的风险。

近年来，DNA修复基因在恶性肿瘤易感性研究中倍受关注。DNA损伤修复是一个多种酶和蛋白质参与的复杂过程，一旦相关基因发生突变，就会导致整个基因组DNA修复能力下降，可能引起包括胃癌在内的恶性肿瘤的发生和发展。X线修复交叉互补基因1(X-ray repair cross-complementinggroup 1，XRCC1)是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，它广泛参与DNA损伤的修复，是目前研究较多的一种DNA修复基因。XRCC1定位于人类染色体19q 13.2-13.3，大小为33kb，包含17个外显子，编码1个由633个氨基酸组成的70kD的蛋白质。XRCC1作为脚手架蛋白，通过直接与DNA聚合酶β、DNA连接酶III和多聚二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复，对维持基因的稳定性发挥十分关键的作用。XRCC1基因的rs25487位点，导致相应氨基酸残基Arg399Gln(G→A)的改变，该多态性使XRCC1蛋白质的活性发生改变，突变基因型AA被认为与胃癌的发病相关。

ADPRT是碱基切除修复(BER)系统的核心蛋白成员。ADPRT作为一种DNA结合蛋白，通过识别DNA链断裂并使多种核受体蛋白(包括自身)发生多聚ADP核糖化，从而参与BER过程。当ADPRT结合于DNA链断裂处，会引发自身多聚ADP核糖化而激活。激活的ADPRT与蛋白支架XRCC1相互作用，募集DNA聚合酶-β和DNA连接酶III形成复合体完成DNA损伤修复过程。ADPRT有多个多态性位点，以rs1136410位点的研究最多。XRCC1的rs25487多态位点恰好位于与ADPRT相互作用的BRCT-结构域，因此这种基因-基因的交互作用具有生物学依据，ADPRT的rs1136410多态位点和XRCC1的rs25487多态位点变异具有交互作用，两者同时变异降低碱基切除修复功能，影响个体对癌症的易感性。

现有技术检测胃癌易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用taqman探针，该方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法，虽准确率高，但其成本高、同样不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基因筛选的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过检测一组与胃癌易感性相关的基因及位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检人群是否携带“胃癌易感基因”，将胃癌易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测胃癌易感的基因组合，它包括与胃癌关系密切的4个基因的组合：MTHFR基因、CYP2E1代谢酶基因、XRCC1及ADPRT修复酶基因。

包括下述SNP位点：MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点。

所述的用于检测胃癌易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

所述的用于检测胃癌易感的基因组合设计的特异性引物，所述的特异性引物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述4个位点的基因片段：

针对rs1801133位点：ATGTCRGTGCAYGCCTTC

AGCTTTGAGGCTGACCTGA

针对rs2031920位点：ATGACTTTTATTTTCTTCATTTCTCATC

TAACTGGCAATATATAGRAGTTCTTAATTC

针对rs25478位点：RTGCGTAAGGAGTGGGTG

TGTGTTCTCCGCTGGCAG

针对rs1136410位点：CACCTGGGTGAGTCTGTCTC

TATCATCAGACCCTCCCCT。

所述的用于检测胃癌易感的基因组合设计的特异性探针，所述的特异性探针序列如下，能同时对4个位点进行检测分型：

针对rs1801133位点：GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG

针对rs2031920位点：AAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA

针对rs25478位点：CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC

针对rs1136410位点：TTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG。

所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出胃癌病易感基因。

本发明的有益效果是：(1)分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；(2)同时检测多个SNP位点，检测成本低；(3)通量高，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便；(5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％。

具体实施方式

本发明一种用于检测胃癌易感的基因组合，它包括与胃癌关系密切的4个基因的组合：MTHFR基因、CYP2E1代谢酶基因、XRCC1及ADPRT修复酶基因。包括下述SNP位点：MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点。

所述的用于检测胃癌易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

本发明所述的引物是针对MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点而设计，可用于进行多重PCR扩增，可同时扩增出上述4个位点的基因片段。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选的，本发明中所述引物为具有如下序列：

针对rs1801133位点：ATGTCRGTGCAYGCCTTC

AGCTTTGAGGCTGACCTGA

针对rs2031920位点：ATGACTTTTATTTTCTTCATTTCTCATC

TAACTGGCAATATATAGRAGTTCTTAATTC

针对rs25478位点：RTGCGTAAGGAGTGGGTG

TGTGTTCTCCGCTGGCAG

针对rs1136410位点：CACCTGGGTGAGTCTGTCTC

TATCATCAGACCCTCCCCT。

特异性引物可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这4条引物对。

本发明所述探针，是针对MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点而设计，可同时对3个位点进行检测分型。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选的，本发明中所述探针为具有如下序列：

针对rs1801133位点：GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG

针对rs2031920位点：AAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA

针对rs25478位点：CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC

针对rs1136410位点：TTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG。

特异性探针可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性探针不限于这4条探针。

本发明中所述探针特指单核苷酸延伸技术中的延伸引物，下面实施例中将叙述为延伸引物。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

1DNA的提取：

取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65℃孵育10分钟，异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。

2PCR扩增

取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增：

反应总体积5ul，其中10M mol/L dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer0.5ul，25mmol/L MgCl₂1ul，模板DNA 30ng，6重引物混合液10uM/Leach0.025ul，Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上反应：预变性94℃1min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，40个循环；Hold 4℃。

扩增引物：

1F  ATGTCRGTGCAYGCCTTC

1R  AGCTTTGAGGCTGACCTGA

2F  ATGACTTTTATTTTCTTCATTTCTCATC

2R  TAACTGGCAATATATAGRAGTTCTTAATTC

3F  RTGCGTAAGGAGTGGGTG

3R  TGTGTTCTCCGCTGGCAG

4F  CACCTGGGTGAGTCTGTCTC

4R  TATCATCAGACCCTCCCCT

3纯化

在PCR扩增产物中加入2ul Exo I-SAP-IT纯化试剂(购自USB)。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序：37℃30min，96℃10min，Hold4℃。

4引物延伸反应

纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer3.76ul，延伸引物混合液(1010uM/L each)0.03ul，20×Extension Mix 0.2ul，DNA聚合酶0.02ul，补足水到7ul。将装有延伸反应混合物的96孔板再次放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序：Hold 96℃3min；94℃20sec，40℃11sec，46个循环；Hold 4℃。

延伸引物序列：

1P  GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG

2P  AAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA

3P  CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC

4P TTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG

以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。

5延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。

孵育温度42℃，孵育时间2小时。

6激光扫描检测荧光信号

本发明将上述4个与胃癌易感、发生密切相关的基因进行组合，通过大量的筛选数据表明所述4个基因及位点：MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25487位点，ADPRT基因的rs1136410位点，如4个基因都有位点发生突变，则患胃癌的概率最高；三个基因发生突变次之；两个或一个发生突变，患股骨头坏死的概率较小。

本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法，针对上述4个位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP位点的4个基因片段，根据SNP位点上游5’端23-25bp的序列设计寡核苷酸探针，此探针与序列杂交后3’末端位于snp5’端上游1bp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，与微阵列芯片上对应的序列互补，延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交，不同的探针结合在芯片的不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。

疾病的发生是一个十分复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，其中任何一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检者不能全面的了解自身疾病的易感情况。

本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。

由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对胃癌不同的患病途径的关键酶基因寻找挑选了4个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％，同时检测上述4个基因对检测、比较个体的胃癌易感性具有重要意义。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.一种用于检测胃癌易感的基因组合，其特征在于，它包括与胃癌关系密切的4个基因的组合：MTHFR基因、CYP2E1代谢酶基因、XRCC1及ADPRT修复酶基因。

2.根据权利要求1所述的用于检测胃癌易感的基因组合，其特征在于，包括下述SNP位点：MTHFR基因的rs1801133位点，CYP2E1的rs2031920位点，XRCC1基因的rs25478位点，ADPRT基因的rs1136410位点。

3.如权利要求2所述的用于检测胃癌易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

4.如权利要求2所述的用于检测胃癌易感的基因组合设计的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述4个位点的基因片段：

针对rs1801133位点：ATGTCRGTGCAYGCCTTC

AGCTTTGAGGCTGACCTGA

针对rs2031920位点：ATGACTTTTATTTTCTTCATTTCTCATC

TAACTGGCAATATATAGRAGTTCTTAATTC

针对rs25478位点：RTGCGTAAGGAGTGGGTG

TGTGTTCTCCGCTGGCAG

针对rs1136410位点：CACCTGGGTGAGTCTGTCTC

TATCATCAGACCCTCCCCT。

5.如权利要求2所述的用于检测胃癌易感的基因组合设计的特异性探针，其特征在于，所述的特异性探针序列如下，能同时对4个位点进行检测分型：

针对rs1801133位点：GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG

针对rs 2031920位点：AAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA

针对rs25478位点：CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC

针对rs1136410位点：TTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG。

6.如权利要求4或5所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出胃癌病易感基因。