CN101952427A

CN101952427A - 产生流感病毒粒子的线性表达构建体

Info

Publication number: CN101952427A
Application number: CN2008800223549A
Authority: CN
Inventors: 马库斯·沃尔谢克; 安德雷杰·埃戈罗夫; 迈克尔·伯格曼; 托马斯·马斯特; 克里斯琴·斯特尔
Original assignee: Avir Green Hills Biotechnology Research and Development Trade AG
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2011-01-19
Also published as: WO2009000891A3; CA2689569A1; EP2160462B1; EA017456B1; US20100129399A1; EA201000076A1; EP2045323A1; AU2008267180A1; WO2009000891A2; AU2008267180B2; EP2160462A2; CA2689569C; IN2009KN04355A; NZ582102A

Abstract

本发明提供了不含任何常规扩增和/或选择序列的线性表达构建体，其包含RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号，它们插入在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间，用于表达病毒RNA节段，优选流感病毒。本发明的构建体可用于有效快速制备病毒粒子，尤其是制备用于治疗流行性疾病和/或大流行疾病的疫苗配制剂。

Description

产生流感病毒粒子的线性表达构建体

本发明领域涉及表达病毒(优选流感病毒)RNA节段的新线性表达构建体，其不含任何扩增和/或选择序列，含有插在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号。本发明还涉及该表达构建体制备病毒粒子的用途。

背景

负链RNA病毒是一组动物病毒，其中有数种重要的对人致病的病原体，包括流感病毒，麻疹病毒，风疹病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒(Ebola)和汉坦病毒(hantaviruse)。这些RNA病毒的基因组可以是单分子的或分节段的单链负(-)链。这些病毒都必需满足两点：基因组RNA必需有效拷贝成病毒RNA，后者可掺入子代病毒粒子，转录成mRNA，再翻译成病毒蛋白。真核宿主细胞通常不具有复制RNA模板或从负链RNA模板翻译出多肽的机制。因此，负链RNA病毒编码并携带RNA依赖型RNA聚合酶，以催化合成新的基因组RNA装配到子代中，并催化合成mRNA再翻译成病毒蛋白。

为传播病毒，病毒基因组RNA需包裹到病毒粒子中。在RNA病毒内，子代病毒粒子装配过程以及装配期间发生的蛋白/蛋白相互作用都是相似的。病毒粒子的形成确保在单个宿主内或在不同宿主生物之间将RNA基因组从一个宿主细胞有效传播到另一个。

含有单链负链RNA基因组的包膜病毒分为：有非分节段基因组的病毒(副粘病毒科、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、黄病毒科(Filoviridae)和Borna病病毒，披膜病毒科(Togaviridae))，或有分节段基因组的病毒(正粘病毒科、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括，甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto和Dhori病毒和传染性鲑贫血病毒(infectious salmon anemia virus)。

流感病毒体由包容负链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋型核衣壳)、以及被内侧基质蛋白(M1)分隔的外部脂蛋白包膜组成。甲型流感病毒分节段的基因组由8个线性负链单链RNA分子组成，其编码11种(有些甲流病毒株编码10种)多肽，包括：RNA依赖型RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)和核蛋白(NP)，它们形成核衣壳；基质膜蛋白(M1，M2)；两种表面糖蛋白，它们从含脂质的包膜表面向外突出：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核转运蛋白(NEP)。更多的甲流株也编码11种被认为有凋亡前(proapoptotic)特性的蛋白(PB1-F2)。

基因组的转录和复制发生在核中，装配通过从胞质膜出芽而发生。混合感染期间，多个病毒可以重配基因。流感病毒通过HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸化寡糖。内吞病毒体之后，HA在细胞的内体中发生构象改变，这有利于膜融合，从而触发脱壳。核衣壳迁移到核中，在那里，病毒mRNA贝转录。病毒mRNA通过一种独特机制进行转录，在该机制中，病毒内切核酸酶从细胞性异源mRNA切下带帽5′-端，再以其为引物，通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录止于距离模板末端15-22个碱基的位置，在这里，oligo(U)序列作为信号导致添加poly(A)尾。在如此产生的8种病毒RNA分子中，6种为单顺反子信息，被直接翻译成代表HA，NA，NP和病毒聚合酶蛋白，PB2，PB1和PA的蛋白。另两个转录物进行剪接，每个都产生两种mRNA，它们按不同的读框进行翻译，产生M1，M2，NS1和NEP。换而言之，这8种病毒RNA节段编码11种蛋白：9种结构蛋白和2种非结构蛋白(NS1和最近鉴别出的PB1-F2)。

针对流感病毒尤其高致病性禽流感病毒制备流行株疫苗(modernvaccine)，靠的是反遗传学(reverse genetics)的应用，其允许从DNA产生流感病毒。反遗传系统在构建负链RNA流感病毒方面的第一个进展涉及，与体外重建的核糖核蛋白(RNP)复合物混合的单个病毒基因的转染，以及随后与流感病毒辅助病毒一起感染。RNP复合物是这样制得的，将合成的RNA转录物与来自流感病毒的纯化NP和聚合酶蛋白(PB1，PB2和PA)混合，用辅助病毒作为病毒蛋白和其它vRNA的胞内来源(Luytjes et al.，1989，Cell，59，1107-1113)。

Neumann等(1994，Virology，202，477-479)从鼠RNA聚合酶I启动子应答型质粒表达RNA，成功地在流感病毒感染的细胞中实现了病毒模型RNA的RNP形成。

Pleschka等(1996，J.Virol.，4188-4192)描述了一种方法，其从基于质粒的表达载体重建了RNP复合物。病毒RNA样转录物从含有截短型人聚合酶I(polI)启动子和经自催化切割产生3′端的核酶序列的质粒来表达。这种由polI驱动的质粒与应答polII并表达PB1，PB2，PA和NP蛋白的质粒一起转染到人293细胞中。但转染效率极低，每次转染约10个转染的病毒粒子。此外，这种基于质粒的策略依赖于辅助病毒的帮助。

在WO 01/04333中，分节段的负链RNA病毒用一组12个表达基因组vRNA节段和RNP蛋白的表达质粒来构建。WO 01/04333中所述的载体是基于众所周知的pUC19或pUC18质粒。根据该说明书的描述，此系统需要8种质粒来表达所有8种流感病毒节段，并另外有4个质粒来表达核蛋白和表达RNA依赖型RNA聚合酶(PB1，PB2，PA和NP)的亚单位。

WO 00/60050涵盖一组载体，其中至少两种载体包含与连接转录终止序列的流感病毒节段cDNA(PA，PB1，PB2，HA，NP，NA，M)可操作相连的启动子，还有至少两种载体包含与流感病毒节段DNA(PA，PB1，PB2，NP)可操作相连的启动子。使用大量不同载体，是想避免将病毒RNA合成所需的8种RNA聚合酶I转录盒组合在一个质粒上。

WO 01/83794描述了环状表达质粒，其包含插入在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号。术语“载体”在本申请中是指一种质粒，其通常是双链DNA的自含分子，能接受额外的外来DNA，并可容易地导入合适的宿主细胞。

病毒性疾病的地区流行(Epidemics)和全球大流行(pandemics)仍夺去人的生命，并对全球经济造成影响。流感在全球导致上百万的失业人口和门诊量，成百上千的住院病例(Couch 1993，Ann.NY.Acad.Sci 685；803，)，上万的过多死亡例(Collins&Lehmann 1953 Public Health Monographs 213：1；Glezen 1982 Am.J.Public Health 77：712)以及上亿欧元的健康护理费用(Williams et al.1988，Ann.Intern.Med.108：616)。当健康成人得到免疫后，当前的疫苗在70-90％的病例中阻止临床疾病。该水平在65岁以上年龄组中降至30-70％，在65岁以上的疗养院(nursing homes)人群中降得更低(Strategic Perspective 2001：The Antiviral Market.Datamonitor.p.59)。病毒频繁改变抗原性也造成大量死亡病例，因为即使是每年的预防接种也不能保证保护作用。因此，美国的死亡病例从1976/77年的16,363例到1998/99年增至4倍(Wall Street Journal，Flu-related deaths in US despite vaccineresearches.January 7，2003)。

尤其当病毒性疾病爆发大流行时，最重要的就是提供预防接种或在疾病爆发后立即治疗。

鉴于对病毒性疾病提供有效保护和治疗的紧迫需求，仍非常需要开发经济、快速且有效的表达系统用于病毒生产，以克服现有表达系统的缺点和困难。

发明简述

本发明人意外发现，使用不含任何常规基于质粒的细菌扩增和/或选择序列、但将病毒基因克隆到有RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号的表达盒中、插在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间得到的线性表达构建体，提供高度经济化且有效的快速拯救病毒粒子的工具。与已知技术所用的质粒相反，无需在细菌细胞中进行克隆的步骤。因此，病毒粒子转染和表达所需时间可大大缩短，优选缩短至少数周至数日。

例如，本发明的线性表达构建体可用于开发抗RNA病毒，尤其是抗流感病毒野生株、突变株、或重配株的疫苗。这为流感流行或大流行时需要快速产生任何病毒疫苗提供了工具。

需要时，线性表达构建体可以用短接头序列环化。还可以提供一些方法，用线性表达构建体产生病毒粒子，或者，将完整病毒的一些病毒性基因节段通过环化表达构建体来表达，且至少一种所述基因节段通过本发明的线性表达构建体来表达。

附图

图1示线性双向表达构建体的产生。a)片段F1，F2和F3分别通过PCR扩增来生成。b)片段F4用寡核苷酸P4和P6通过重叠PCR来生成。

发明详述

如背景部分已述，目前使用的分节段RNA病毒的反遗传拯救系统仍需要转染大量的不同质粒，和/或仍需要在细菌细胞中亚克隆病毒基因并随后扩增以得到足量质粒。对每个克隆，都需测序质粒DNA并从细菌中纯化，而后仅能再用于转染动物细胞。此方法耗时、成本高，且难以自动化。

本发明提供新的线性表达盒，其不含任何常规基于质粒的细菌扩增和/或选择序列，但将病毒基因克隆到有RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号的表达盒中，插在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间，其可用于表达病毒粒子。

“表达盒”是指一种编码表达产物的DNA编码序列或节段(segment)，所述表达产物在指定的限制性位点插入该表达构建体。所述表达盒限制性位点被开发出来是为了确保将所述表达盒插入正确的读框中。

本发明构建体允许将cDNA转录成mRNA和全长负链(有义)vRNA(双向转录(bidirectional transcription))，或转录成mRNA和全长正链(有义)cRNA(单向(unidirectional)转录)。

在单向转录时，将基因置于polI启动子和polII启动子下游。polII启动子产生带帽的正义链病毒mRNA，polI启动子产生不带帽的正义链病毒cRNA。在双向转录时，将基因置于polII启动子上游、polI启动子下游。polII启动子转录产生带帽的正义链病毒mRNA，polI启动子转录产生不带帽的负义链vRNA。

本发明人意外发现，这种创新的线性表达构建体可有效用于转染细胞和表达完整病毒粒子，尽管本领域常有文献说，用线性片段转染动物细胞，可因细胞的内切核酸酶降解作用导致这些片段解体(van der Aa et al.2005，JGene Med.7：208-17)，或导致被转染的细胞的凋亡增加(Yao et al.2001，J BiolChem.276：2905-13)。

所述线性表达构建体不含细菌细胞扩增质粒所需的任何选择或扩增序列。也不含ori(复制起始)序列或抗生素抗性基因或任何其它选择标记。

根据本发明的具体实施方案，所述线性表达构建体可在构建体的N端和/或C端包含额外的保护序列。例如，这些保护序列可以是WO 00/56914所述肽核酸序列(PNA)。这些PNA是核酸类似物，其中完整的脱氧核糖磷酸骨架被换成化学性质完全不同、但结构类似、含2-氨基乙基甘氨酸单元的聚酰胺(肽)骨架。已发现，PNA“钳(clamp)”增加稳定性，在该结构中，两个相同的PNA序列通过含3个8-氨基-3，6-二氧辛酸(dioxaoctanoic acid)单元的柔性发卡接头相连。当PNA与互补同型嘌呤(homopurine)或同型嘧啶(homopyrimidine)DNA靶序列混合时，可形成非常稳定的PNA-DNA-PNA三体(Bentin et al.，1996，Biochemistry，35，8863-8869，Egholm et al.，1995，Nucleic Acids Res.，23，217-222，Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500，Demidov et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，1995，92，2637-2641)。有证据表明，它们耐受核酸酶和蛋白酶消化(Demidov et al.，Biochem.Pharm.，1994，48，1010-1013)。

为了提供抗细胞核酸酶的保护作用，保护序列可以是长度至少20个核酸的任何核酸序列，优选至少50个核酸，更优选至少100个核酸。这些核酸可用核酸酶消化，从而保护表达构建体的核心序列，或推迟其降解，所述核心序列是，启动子序列、病毒序列、和终止序列。

线性表达构建体可包含至少一个插在polI启动子和终止信号之间的病毒性基因节段。

术语“病毒基因”在本发明中是指，编码或对应于具体氨基酸序列的DNA或cDNA序列或RT-PCR扩增产物。术语“基因”还包括，全长基因和其片段、以及包含天然基因序列的修饰的衍生物。这些修饰可以是，缺失，取代或插入核苷酸，导致氨基酸修饰，以及沉默突变，其中一或多个核苷酸的改变未导致该位置编码的氨基酸的变化。修饰还可包括功能保守的突变，其中指定氨基酸残基的改变不引起多肽整体构象和功能的变化。这包括各种突变体，序列保守变体和功能保守的RNA病毒基因节段，优选负链RNA病毒基因节段。修饰可通过随机诱变技术或通过定点诱变技术来引入，如基于PCR的序列修饰。RNA病毒一或多个单独基因节段的修饰可允许开发减毒病毒或复制缺陷病毒。

根据本发明，术语“复制缺陷”是指，用本领域熟知的血凝试验、TCID₅₀试验或空斑试验测得，干扰素感受态(interferon competent)宿主细胞中的复制速率比野生型流感病毒至少低5％，优选低1％，优选低0.1％。

本发明的表达构建体可用于表达分节段的和非分节段的RNA基因组。非分节段的病毒的例子有弹状病毒科或副粘病毒科的病毒。

根据本发明，表达构建体可优选用于表达分节段的RNA病毒。例如，将对应于目标病毒基因组中每一基因的病毒cDNA插入本发明的线性表达构建体，得到一组覆盖整个病毒基因组的线性表达构建体。

为扩增这些表达构建体，可以用本领域已知的PCR技术，避免耗时的在细菌宿主细胞中的克隆、扩增、测序和纯化。根据优选实施方案，所述病毒节段来自正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒科的病毒。更优选地，它们来自甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto和Dhori病毒，和传染性鲑贫血病毒。在流感病毒的例子中，病毒基因节段可选自PA，PB1，PB2，HA，NA，NP，M或NS基因或其一部分。可选地，病毒NS基因节段可编码非功能型NS1蛋白。这可以是在NS基因中的任何修饰，即取代、插入或缺失核酸。优选NS基因的修饰消除或减弱NS基因产物拮抗细胞IFN应答的能力。干扰素拮抗活性降低或缺失的流感病毒的例子详见US 6,669,943或US 6,468,544，它们引入本文做参考。

在优选实施方案中，可提供重配病毒(reassortant viruses)，其中每个病毒节段可选自特定病毒株，例如H1N1、H3N2、甚至H5N1或任何被鉴定为与当季流感最相关的季节株。重配病毒因此可在允许宿主细胞有效生产的背景下携带所需抗原特性。例如，重配的流感病毒将真正的两次爆发之间(interpandemic)的病毒的表面糖蛋白，血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)，的基因与5或6或7个编码减毒主毒株的其它蛋白的RNA节段组合(6/2组合)，或7/1重配体或5/3重配体，分别含不同来源的M基因。

这些重配病毒然后可作为毒种，用于产生病毒体，以制备疫苗。

术语“病毒体”是指病毒粒子，其在转染或与本发明表达系统共转染的宿主细胞中、或从所述宿主细胞首次产生时是具有充分感染性的。这种系统然后产生vRNA和病毒蛋白(来自病毒RNA翻译)，由此导致装配感染性病毒粒子。

本发明的线性表达构建体也可组合成至少两个表达构建体的组合。例如，可提供一组共8个线性表达构建体，其中每一个都含有流感病毒PA，PB1，PB2，HA，NA，NP，M和NS中的一个病毒基因节段或其一部分。

可选地，线性表达构建体可以用接头和/或重叠序列环化。用于环化的各种不同系统都是可能的，象使用带有GGGG延伸的5′oligo和带有CCCC序列的3′oligo。可选地，在有dATP和dTTP存在的情况下经T4DNA聚合酶处理(以产生粘端)，可以使线性表达构建体经由连接作用而环化。

本发明还提供含有至少一个本发明的线性表达构建体的宿主细胞。在本发明范围内，术语″细胞″或“宿主细胞”是指培养的表达病毒的单个细胞、组织、器官、昆虫细胞、禽细胞、哺乳动物细胞、杂交瘤细胞、原代细胞、传代细胞系、和/或遗传改造的细胞，如重组细胞。例如是，BSC-1细胞，LLC-MK细胞，CV-1细胞，CHO细胞，COS细胞，鼠细胞，人细胞，HeLa细胞，293细胞，Vero细胞，MDBK细胞，MDCK细胞，MDOK细胞，CRFK细胞，RAF细胞，TCMK细胞，LLC-PK细胞，PK15细胞，Wl-38细胞，MRC-5细胞，T-FLY细胞，BHK细胞，SP2/0细胞，NS0，PerC6(人视网膜细胞)，鸡胚细胞或其衍生物，含胚的卵细胞，含胚的鸡卵细胞或其衍生物。优选细胞系是Vero细胞系。

除了众所周知的将cDNA序列引入表达系统的方法，本发明还提供了另一种简易构建线性表达构建体的方法，其中，病毒节段与互补序列一起提供，所述互补序列与polI启动子和polI终止子序列重叠。在该例中，三种不同片段组合，退火并经PCR扩增。

应用本发明的线性表达构建体，则无需在细菌细胞中进行质粒的转化和扩增。分别包含流感病毒基因组的至少一个节段或其一部分的所述多个线性片段可直接用于转染宿主细胞。这些线性表达构建体的应用提供了用本发明表达构建体转染和表达病毒粒子的系统，其仅需较少天数就能收获完整病毒粒子。总之，从流感病毒分离物开始，可以在收获病毒的数小时至最多2-3天后进行转染。相反，根据现有技术克隆质粒，不测序的情况下至少需要4-5天。转染可在第5天进行。但对于每个“新”节段，都不得不测试数个细菌克隆，以便优化利用正确质粒的机会。如果每种病毒分离物的序列都是已知的，对每个节段的数个克隆进行测序又将整个过程推迟大约1天。如此一来，转染最早将在第6天进行。在事先不知道序列信息的情况下，全面测序将给寡核苷酸合成过程再加2-3天。

根据另一实施方案，本发明涉及产生线性表达构建体的方法，其中，将包含病毒节段、和同源于polI启动子的序列、和同源于polI终止子的序列的DNA片段，包含保护序列、pol I启动子序列、poly A信号序列和互补于所述病毒节段的至少5个(优选至少10个，优选至少12个)核苷酸的重叠序列的DNA片段，包含保护序列、CMV启动子、pol I终止子序列和互补于所述病毒节段的至少5个(优选至少10个，优选至少12个)核苷酸的重叠序列的DNA片段，都通过重叠PCR融合在一起，并用标准纯化方法进行纯化。

根据另一方法，包含病毒节段、和同源于polI启动子的序列、和同源于pol I终止子的序列的DNA片段可额外包含至少5核苷酸，它们被引入该片段，是作为含PolI终止子和CMV启动子以及PolI启动子和poly A信号的两个片段的互补序列，这些片段通过PCR技术融合在一起。

两种用于扩增病毒节段的寡核苷酸都可被设计成，包含与含CMV启动子和PolI终止子的DNA片段互补、以及与含PolI启动子和poly A信号的DNA片段互补的序列(见图1的F2，F3)。如此，病毒基因节段(见图1的F1)与含CMV启动子和PolI终止子的DNA片段、以及病毒基因节段与含PolI启动子和poly A信号的DNA片段之间的重叠区的长度增加，这有利于第二个PCR步骤，该步骤中，病毒基因节段与含CMV启动子和PolI终止子的DNA片段、以及含PolI启动子和poly A信号的DNA片段融合。

本发明还涉及产生负链病毒粒子的方法，包括在允许产生病毒蛋白和vRNA或cRNA的条件下培养宿主细胞。例如，含有全部的病毒基因节段的线性表达构建体可用于转染宿主细胞。

然后在培养基中维持细胞，可从培养上清液中分离并纯化得到病毒粒子。

可选地，可包括第二个纯化步骤以增加表达构建体的纯度，降低转染至宿主细胞中的毒性。

商购PCR清洁试剂盒(cleaning kit)通常依赖DNA与硅化膜(silicamembrane)在高盐条件下的结合。本发明人意外发现，经商购纯化试剂盒一步纯化的PCR片段转染至Vero细胞中表现出高毒性，可阻止病毒拯救(rescue)。当PCR产物再经历一个依赖于阴离子交换树脂的纯化步骤后，其纯度增加，能以更高效率进行病毒拯救。可选地，进行基于阴离子交换树脂的单个纯化步骤。

根据具体实施方案，Taq聚合酶和校正聚合酶(如Pfu聚合酶)的混合物可用于所有PCR扩增步骤。如此一来，可将PCR衍生的突变减至最少。此外，消除了将额外的胸苷碱基掺入含CMV启动子和PolI终止子的DNA片段、以及病毒基因节段和含PolI启动子和poly A信号的DNA片段的需求。

本发明涵盖产生流感病毒粒子的方法，其中至少一种线性表达构建体被直接转染到宿主细胞中，所述宿主细胞在表达流感病毒的条件下培养，收集病毒粒子并纯化。

进一步地，本发明涵盖一种方法，其中可选将病毒粒子在减毒或灭活后与可药用载体和/或佐剂一起掺入药物组合物中，作为治疗或预防药物。优选的，用所述病毒粒子产生用于治疗性或预防性处理传染病(therapeutic orprophylyactic treatment)的药物制剂，如疫苗制剂。

引入方法包括但不限于，肌肉内，腹腔内(intraperitoneal)，静脉内，鼻内，硬膜外(epidural)或口腔途径。优选鼻内引入。在优选实施方案中，可能希望将药物制剂经任何合适途径进入肺。肺给药也可以采用例如吸入器或喷雾器(nebulizer)，或将其与雾化剂(aerosolizing agent)一起吸入。

药物制剂也可通过控释系统如泵来运送。

本发明的药物可包含治疗有效量的复制缺陷病毒和可药用载体。“可药用”是指，由管理部门如FDA或EMEA批准。术语“载体”是指，稀释剂、辅助剂、赋形剂或运载剂，它们与所述制剂一起施用。盐水溶液，葡萄糖(dextrose)和甘油溶液(作为载液)或赋形剂象葡萄糖(glucose)，乳糖，蔗糖，或本领域已知可用于药物制剂的其它赋形剂都可以使用。此外，也可以包括稳定剂，以增加药物的货架期。优选地，提供即用型(ready-to-use)输注液。可选地，可将所述制剂配制成粉末，临用前再溶于合适的水溶液中。

本发明药物制剂治疗具体疾病的有效量取决于该疾病的特性，可通过标准临床技术来确定。此外，可选采用体外实验帮助鉴定最佳剂量范围。配制剂中的精确用量取决于给药途径和疾病严重性，应根据医生的判断和每个患者的环境来决定。但合适的给药剂量范围通常最多8logs(10⁴-5×10⁶pfu)复制缺陷病毒，可以给药一次，或有间隔地给药多次，次数根据需要来定。

包含10⁴-5×10⁶pfu复制缺陷的减毒病毒的本发明药物制剂可经鼻内、气管内、肌肉内或皮下给药。有效剂量可从体外或动物模型测试系统获得的剂量应答曲线外推得出。

根据本发明，术语“疫苗”是一种制剂，当给予受试者后，可激发抗RNA病毒的保护性免疫力。它是指含有病毒，灭活病毒，减毒病毒，拆分的(split)病毒或病毒蛋白，象表面抗原之类，能用于在受试者中诱导保护性免疫力的制剂。疫苗都给予保护性剂量，这是单独或与一或多种已知增加免疫原性的佐剂一起给药、足以导致保护性免疫应答的疫苗量。

参考下列实施例将更全面理解以上描述。但这些实施例仅代表实施本发明一或多个实施方案的方法，不应将它们理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：制备线性H3N2HA表达构建体

经Vero细胞培养的甲流H3N2病毒的HA节段用寡核苷酸P1和P2(图1a的F1)进行PCR扩增。随后，将来自pHW2000(Hoffmann et al.2000，ProcNatl Acad Sci U S A.97：6108-13)的两个DNA片段(图1的F2和F3)与HAPCR产物通过重叠PCR进行融合(见图1b)。第一个DNA片段(F2)含CMV启动子和PolI终止子，第二个(F3)含人PolI启动子和BGH polyA信号。为有利于产生重叠PCR产物，用于HA扩增的寡核苷酸在其5’端延伸，使P1包含与PolI终止子互补的序列，使P2包含与PolI启动子互补的序列(见图1a)。同样地，用于产生片段F1和F2的引物P3和P5在其5’端延伸，以包含与HA的5’和3’端互补的序列(见图1a)。片段F2和F3包含来自pHW2000骨架的保护序列。这些序列不直接参与mRNA和vRNA转录，但减少外切核酸酶对双向表达盒的降解。

病毒RNA从Vero细胞培养的甲流H3N2病毒用Qiagen ViralAmp试剂盒提取，按文献(Hoffmann et al.2001，Arch Virol.146：2275-89)所述用Uni12寡核苷酸进行逆转录。HA节段用表1所示寡核苷酸、以及Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物进行扩增。

表1：

对应于H3序列的核苷酸用粗斜体表示，同源于PolI终止子(P1)和PolI启动子(P2)的核苷酸用标准大写字母表示。

HA F4PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。PCR片段F2和F3从pHW2000质粒DNA进行扩增，分别使用引物对P3+P4和P5+P6(见表2和图1a)，并用到Pfu Turbo DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶的混合物。PCR产物F2和F3用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。

表2：

对应于H3序列的P3和P5核苷酸用粗斜体表示，互补于pHW2000的核苷酸用标准大写字母表示。对于P4和P6，除了5’端4个核苷酸以外的所有核苷酸都对应于pHW2000。

为产生含HA的全长PCR产物(F4)，将CMV启动子、PolI终止子、PolI启动子和BGH polyA信号、片段F1、F2和F3组合在一起，用引物P4和P6、以及Pfu Turbo DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶的混合物，通过重叠PCR选行扩增。

图1显示线性双向表达构建体的产生。图1a)示分别经PCR扩增产生的片段F1，F2和F3。片段F1含各自的病毒节段，并包含与PolI启动子和PolI终止子互补的延伸序列。片段F2含CMV启动子和PolI终止子、以及与各自病毒节段互补的延伸序列。片段F3含PolI启动子和BGH聚腺苷酸化信号、以及与各自病毒节段互补的延伸序列。用于PCR扩增F1片段的寡核苷酸P1和P2都与各自病毒节段互补。P1包含与PolI终止子互补的5’延伸序列，P2包含与PolI启动子互补的5’延伸序列。寡核苷酸P3和P4用于PCR扩增F2片段，其中P3包含与各自病毒节段互补的5’延伸序列。寡核苷酸P5和P6用于PCR扩增F3片段，其中P5包含与各自病毒节段互补的5’延伸序列。保护序列都来自pHW2000骨架，不含有直接参与mRNA或vRNA转录的序列。

实施例2：用线性HA表达构建体拯救甲流病毒

甲流H3N2病毒的6种分离物在MDCK细胞上培养。HA节段用PCR扩增(图1的F1)，在琼脂糖凝胶电泳上用Qiaex II试剂盒(Qiagen)纯化。按实施例1所述，将片段F2和F3与F1融合，产生全长表达构建体F4。经琼脂糖凝胶电泳纯化后，片段F4经PCR再扩增，产生足量DNA用于转染。最后，用F4HA DNA片段和7个质粒(pHW2000衍生物)在Vero细胞上进行病毒拯救，所述质粒含有适应了Vero的甲流H1N1 delNS1病毒株(GHB01)的剩余节段。图1b显示了用寡核苷酸P4和P6经重叠PCR产生的片段F4。

F4HA DNA片段的产生类似于实施例1描述的过程。对每一种病毒分离物，总量10-20μg的F4HA DNA首先用Qiaquick试剂盒(Qiagen)纯化，然后用Qiagen Endofree质粒试剂盒纯化。

当PCR产物仅用PCR纯化试剂盒(Qiaquick，Qiagen)在单个步骤中纯化时，转染Vero细胞后观察到高毒性，导致阻止病毒拯救。

Vero细胞在含10％胎牛血清和1％Glutamax-I添加物的DMEM/F12培养基中37℃予以维持。为产生病毒，针对pHW2000的公开序列(Hoffmannet al.，见上文)产生7种衍生物，它们包含来自GHB01的节段PA，PB1，PB2，NA，M，NP和delNS1，将它们以及编码甲流病毒PR8NS 1的蛋白表达质粒(pCAGGS-NS1(SAM)；(Salvatore et al.2002，J Virol.76：1206-12))与各自F4HA DNA片段一起用于共转染Vero细胞。转染后，为支持病毒复制，将Vero细胞在不含血清的培养基(Opti-Pro；Invitrogen)中含5μg/ml胰蛋白酶的条件下进行培养。转染的3-4天后，观察到50-100％CPE，将拯救的病毒冻存，或进一步在Vero细胞上扩增。

因此，用一个被线性PCR产物替换的双向表达质粒来拯救甲流病毒是可行的。

实施例3：从线性表达构建体完全拯救甲流病毒

针对适应了Vero细胞的甲流H1N1 delNS1病毒(GHB01)，通过PCR扩增产生8种线性表达构建体(F4)。用8种含GHB01节段的pHW2000衍生物作为PCR模板。针对每种节段产生足量F4片段，再用于在Vero细胞上进行病毒拯救。

针对8种节段，通过直接PCR扩增每一种节段的完整双向表达盒，产生F4DNA片段，所述表达盒包含各自的流感病毒节段，用相应的pHW2000衍生物作为模板。PCR扩增用寡核苷酸P4和P6(见表3)、以及Pfu DNATurbo聚合酶与Taq DNA聚合酶的混合物进行。

表3：

P4	5’-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3’(SEQ ID No.4)
		P6	5’-CCCCTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGTTC3’(SEQ ID No.6)

针对每一种节段产生足量F4PCR产物(10-20μ)，先用Qiaquick试剂盒(Qiagen)纯化，再经Qiagen Endofree质粒试剂盒纯化。

Vero细胞用等量的8种F4 DNA片段和NS1表达质粒pCAGGS-NS1(SAM)转染。之后，为支持病毒复制，将Vero细胞在不含血清的培养基(Opti-Pro；Invitrogen)中含5μg/ml胰蛋白酶的条件下进行培养。转染的4天后，观察到彻底的CPE。因此，仅从线性双向甲流表达构建体进行病毒拯救是可行的。

与WO 00/56914相反，用于扩增病毒节段的两种寡核苷酸都被设计成含有互补于F2和F3的区域。因此，F1和F2之间、以及F1和F3之间重叠区的长度增加，这有利于第二个PCR步骤，其中F1与F2和F3融合。

商购PCR清洁试剂盒(如Qiagen)通常依赖DNA与硅化膜在高盐条件下的结合。经Qiagen PCR纯化试剂盒纯化的PCR片段转染至Vero细胞后表现出高毒性，导致阻止病毒拯救。当PCR产物在第二个纯化步骤中用依赖于阴离子交换树脂的Qiagen质粒纯化试剂盒(如Qiagen Endofree质粒试剂盒)纯化后，PCR产物被发现具有足以允许病毒拯救的纯度。与WO00/56914相反，本发明中，Taq聚合酶和校正聚合酶(如Pfu聚合酶)用于所有PCR扩增步骤。因此，PCR衍生的突变被减至最少。还消除了将额外的胸苷碱基掺入F2和F3(WO00/56914中的图2，第0021和0022段描述的F1和F2)的需求。

序列表

<110>阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司

(AVIR Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG)

<120>产生流感病毒粒子的线性表达构建体

<130>PCRF/EP

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>1

cgaagttggg ggggagcaaa agcaggggat aattctatta ac 42

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>2

gccgccgggt tattagtaga aacaagggtg tttttaatta atgc 44

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>3

cctgcttttg ctccccccca acttcggagg tc 32

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggggtatcag ggttattgtc tcatgagcgg atac 34

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>5

ccttgtttct actaataacc cggcggccca aaatgc 36

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒序列

<400>6

ccccttggcc gattcattaa tgcagctggt tc 32

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>修饰的甲型流感病毒HA切割位点

<400>7

Pro Ser Ile Gln Pro Ile Gly Leu Phe Gly Ala

1 5 10

<210>8

<211>1775

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>8

agcaaaagca ggggaaaata aaaacaacca aaatgaaagc aaaactactg gtcctgttat 60

gtacatttac agctacatat gcagacacaa tatgtatagg ctaccatgcc aacaactcaa 120

ccgacactgt tgacacagta cttgagaaga atgtgacagt gacacactct gtcaacctac 180

ttgaggacag tcacaatgga aaactatgtc tactaaaagg aatagcccca ctacaattgg 240

gtaattgcag cgttgccgga tggatcttag gaaacccaga atgcgaatta ctgatttcca 300

aggaatcatg gtcctacatt gtagaaacac caaatcctga gaatggaaca tgttacccag 360

ggtatttcgc cgactatgag gaactgaggg agcaattgag ttcagtatct tcatttgaga 420

gattcgaaat attccccaaa gaaagctcat ggcccaacca caccgtaacc ggagtatcag 480

catcatgctc ccataatggg aaaagcagtt tttacagaaa tttgctatgg ctgacgggga 540

agaatggttt gtacccaaac ctgagcaagt cctatgtaaa caacaaagag aaagaagtcc 600

ttgtactatg gggtgttcat cacccgccta acatagggaa ccaaagggcc ctctatcata 660

cagaaaatgc ttatgtctct gtagtgtctt cacattatag cagaagattc accccagaaa 720

tagccaaaag acccaaagta agagatcagg aaggaagaat caactactac tggactctgc 780

tggaacctgg ggatacaata atatttgagg caaatggaaa tctaatagcg ccatggtatg 840

cttttgcact gagtagaggc tttggatcag gaatcatcac ctcaaatgca ccaatggatg 900

aatgtgatgc gaagtgtcaa acacctcagg gagctataaa cagcagtctt cctttccaga 960

atgtacaccc agtcacaata ggagagtgtc caaagtatgt caggagtgca aaattaagga 1020

tggttacagg actaaggaac atcccatcca ttcaacccat tggtttgttt ggagccattg 1080

ccggtttcat tgaagggggg tggactggaa tggtagatgg gtggtatggt tatcatcatc 1140

agaatgagca aggatctggc tatgctgcag atcaaaaaag tacacaaaat gccattaacg 1200

ggattacaaa caaggtgaat tctgtaattg agaaaatgaa cactcaattc acagctgtgg 1260

gcaaagaatt caacaaattg gaaagaagga tggaaaactt aaataaaaaa gttgatgatg 1320

ggtttctaga catttggaca tataatgcag aattgttggt tctactggaa aatgaaagga 1380

ctttggattt ccatgacttc aatgtgaaga atctgtatga gaaagtaaaa agccaattaa 1440

agaataatgc caaagaaata ggaaacgggt gttttgaatt ctatcacaag tgtaacaatg 1500

aatgcatgga gagtgtgaaa aatggaactt atgactatcc aaaatattcc gaagaatcaa 1560

agttaaacag ggagaaaatt gatggagtga aattggaatc aatgggagtc tatcagattc 1620

tggcgatcta ctcaactgtc gccagttccc tggttctttt ggtctccctg ggggcaatca 1680

gcttctggat gtgttccaat gggtctttgc agtgtagaat atgcatctga gaccagaatt 1740

tcagaaatat aagaaaaaac acccttgttt ctact 1775

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>甲型流感病毒

<400>9

ccatccattc aacccattgg tttgtttgga gcc 33

Claims

1.线性表达构建体，不含任何扩增和/或选择序列，含RNA聚合酶I(polI)启动子和polI终止信号，它们插在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间。

2.权利要求1的线性表达构建体，在所述构建体的N-端和/或C-端含有额外的保护序列。

3.权利要求1或2的线性表达构建体，其中所述保护序列可以是不直接参与病毒RNA转录的任何序列。

4.权利要求1-3之一的线性表达构建体，有至少一个病毒基因节段插在polI启动子和polI终止信号之间。

5.权利要求4的线性表达构建体，其中所述病毒节段来自甲、乙、或丙型流感病毒。

6.权利要求4或5的线性表达构建体，其中所述病毒基因节段选自流感病毒的PA，PB1，PB2，HA，NA，NP，M，NS基因节段或其一部分。

7.权利要求4-6之一的线性表达构建体，其中所述病毒NS基因节段表达非功能型NS1蛋白。

8.权利要求4-7之一的线性表达构建体，其中所述病毒基因节段是所述节段的cDNA拷贝或RT-PCR扩增产物。

9.一组线性表达构建体，含有至少两个按照权利要求1-8之一所述的表达构建体。

10.权利要求9的一组线性表达构建体，有8个构建体，每个构建体含有至少一个流感病毒基因节段或其一部分，所述节段是指PA，PB1，PB2，HA，NA，NP，M和NS基因节段。

11.宿主细胞，含有至少一个按照权利要求1-10之一所述的线性表达构建体。

12.产生权利要求1-8之一的线性表达构建体的方法，其中，将包含病毒节段、和同源于pol I启动子的序列、和同源于pol I终止子的序列的DNA片段，包含保护序列、pol I启动子序列、poly A信号序列和互补于所述病毒节段的至少5个核苷酸的重叠序列的DNA片段，包含保护序列、CMV启动子、pol I终止子序列和互补于所述病毒节段的至少5个核苷酸的重叠序列的DNA片段，都通过重叠PCR融合在一起，并纯化。

13.产生负链RNA病毒体的方法，包括，在允许产生病毒蛋白和vRNA或cRNA的条件下，培养权利要求11的宿主细胞。

14.产生流感病毒粒子的方法，其中将至少一种线性表达构建体直接转染动物宿主细胞，并且，在表达流感病毒的条件下培养所述宿主细胞，收集病毒粒子，并纯化。

15.权利要求12或13的方法，包括至少两个纯化步骤。

16.权利要求12-14之一的方法，其中所述病毒粒子任选在减毒或灭活后，与可药用载体一起掺入药物组合物中。

17.权利要求1-8之一的表达构建体产生的病毒粒子的用途，是用于制备治疗性处理或预防性处理传染病的医学制剂。

18.对受试者进行预防接种使之抵抗负链RNA病毒感染的方法，包括对该受试者鼻内或胃肠外施用保护剂量的药物组合物，所述药物组合物含有根据权利要求14制得的流感病毒粒子。