CN101948530A - 乳清蛋白规模纯化的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种生物医药技术领域的乳清蛋白规模纯化的制备方法。包括如下步骤：合成牛乳β-乳球蛋白专一的亲和分离材料：首先以带氨基的基础层析介质，或对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与三乙烯四胺反应，合成亲和分离材料，即得到α-乳清白蛋白纯品；用制备的仿生亲和分离材料纯化β-乳球蛋白；乳清经加热处理后，用以上制备的仿生亲和分离材料纯化α-乳清白蛋白。本发明克服了α-乳清白蛋白纯化技术中的缺点，减少了α-乳清白蛋白生产中分离纯化步骤，降低了生产成本，提高了生产效率，利用对β-乳球蛋白专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化α-乳清白蛋白。

Description

乳清蛋白规模纯化的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的制备方法。特别是一种乳清蛋白规模纯化的制备方法。

背景技术

α-乳清白蛋白则广泛地存在于所有哺乳动物的乳中，是β-1，4-半乳糖苷转移酶的调节亚基，催化乳糖的合成。乳糖是调控乳渗透压的主要因子。α-乳清白蛋白的氨基酸组成中包含大量的人体营养所必需的氨基酸，因而具有重要的营养价值。此外，人α-乳清白蛋白多聚体或折叠变异体能够诱导肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的临床药物。通过转基因技术，在牛乳腺中特异表达人α-乳清白蛋白，生产重组人α-乳清白蛋白，即可增强其营养价值，又可为获得大量人α-乳清白蛋白提供源料来源，用于临床药物研究和作为各种保健食品添加剂。

经过对专利文献检索发现，中国专利200510012225.X“一种去除乳中β-乳球蛋白，提取高纯度免疫球蛋白的方法”，采用等电点沉淀和离子交换两步法去除β-乳球蛋白，不仅回收率低，且选择性低，纯度也不高；中国专利200710102036“一种从转基因牛乳中纯化重组人α-乳清白蛋白的方法”利用阴离子交换和凝胶过滤结合的方法，先用阴离子交换获得α-乳清白蛋白的粗制品，再通过凝胶过滤精制；该纯化方法步骤较多，操作复杂，凝胶过滤在生产上效率低，成本高。美国专利5,986,063，用了阳离子交换层析和pH梯度洗脱，β-Lg和α-乳清白蛋白的回收率低，纯度有限；美国专利5,503,864是结合了等电点沉淀和膜过滤的方法，虽然操作简便，但是选择性低，产品纯度低。因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的α-乳清白蛋白的生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服α-乳清白蛋白制备方法现有技术的缺点，提供一种乳清蛋白规模纯化的制备方法。本发明以专一性地识别β-乳球蛋白作为基础，将牛乳β-乳球蛋白的亲和分离材料和牛乳β-乳球蛋白、α-乳清白蛋白的亲和纯化，本发明能够快速、简便、低成本、大批量纯化α-乳清白蛋白。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括步骤如下：

第一步，合成牛乳β-乳球蛋白专一的亲和分离材料：首先以带氨基的基础层析介质，或对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与三乙烯四胺反应，合成亲和分离材料，即得到α-乳清白蛋白纯品。

第一步中所述的所述基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中一种。

第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化β-乳球蛋白。

第二步中所述的仿生亲和分离材料的配体中含有三氮嗪和三乙烯四胺的结构。

第二步中所述的纯化β-乳球蛋白，其方法如下：

用合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将牛乳清样品流经该亲和层析柱，牛乳β-乳球蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的牛乳β-乳球蛋白洗脱下来，得到牛乳β-乳球蛋白粗品；

所述的亲和分离材料，其吸附β-乳球蛋白的条件为pH 6.0-7.5，NaCl浓度为0.0-0.2M的NaCl缓冲液。

所述的亲和分离材料，其纯化β-乳球蛋白的洗脱条件为pH 2.0-3.0缓冲液和/或pH 5.0-8.5含0.2-1.0M NaCl的缓冲液。

第三步，乳清经加热处理后，用以上制备的仿生亲和分离材料纯化α-乳清白蛋白。

第三步中乳清经加热处理是指：向去脂乳清中加入盐，混匀、加热并保温后，冷却，然后去除沉淀，收集清液得浓缩β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白。

所述的加热，其温度至60℃-95℃；保温时间10min-60min；

所述的盐，包括：LiCl、NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、MnCl₂、ZnCl₂和FeCl₃中的一种，浓度：0.15-0.4M。

第三步中所述的纯化α-乳清白蛋白，其方法如下：

用合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将经过加热处理的含有β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白牛乳清样品，流经该亲和层析柱，β-乳球蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合α-乳清白蛋白被洗去，收集流穿，得到α-乳清白蛋白粗品。

所述的β-乳球蛋白和所述的α-乳清白蛋白，原料为普通牛乳和含重组人α-乳清白蛋白的转基因牛乳和人乳中的一种。

本发明将α-乳清白蛋白生产中分离纯化步骤减少到了2步，其中预处理可以实现α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白总含量达到99％以上，亲和处理步骤取得了β-乳球蛋白纯度98％，α-乳清白蛋白纯度90％；因而能够可快速、简便、低成本、大批量纯化α-乳清白蛋白，降低生产成本，提高了生产效率。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，如起始材料NH₂-Sepharose可以更换成葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶等，这些等价形式同样属于本发明的范围。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

取-70℃冻存的转基因牛乳样品，37℃水浴融化，离心脱脂，取乳清分装成多份，分别调CaCl₂终浓度0.0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4M，然后分别在温度：70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃下加热10min，20min，30min，40min，50min，60min；反应完毕后，将各管于4℃，12000rpm，离心10min，上清转移至新管并透析除去CaCl₂，沉淀用10mM磷酸钠缓冲液，PH 7.0洗涤三次后各用200mL磷酸钠缓冲液，PH 7.0溶起。13.5％SDS-PAGE分析上清和沉淀蛋白组成，同时对上清进行蛋白定量。浓缩样品总α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白总含量最高可达到99％以上。表1显示了不同浓度CaCl₂加热95℃处理5min效果；表2显示了0.2M CaCl₂条件下加热不同温度处理20min的富集效果；表3显示了加热保温不同时间的效果。具体如下表：

表1

表2

表3

实施例2

从-70℃冰箱中取出人乳、普通牛乳和羊乳样品，4℃中融化，离心脱脂肪，收集乳清，分别取加入氯化钙至终浓度0.2M，加热至75℃，保温30min，冷却至室温后，12000rpm离心20min，收集上清，透析过夜，沉淀用10mM磷酸钠缓冲液pH 7.0洗涤三次，合并清液，电泳分析α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白含量，280nm吸光度估算蛋白浓度。浓缩样品总α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白总含量最高可达到88％以上。表4显示了人乳、普通牛乳和羊乳样品的热处理效果，如下表所示：

表4

实施例3

从-70℃冰箱中取出转基因牛乳样品，4℃中融化，离心脱脂肪，收集乳清，分别取加入氯化锂，氯化钠，氯化钾，氯化锰和氯化镁至终浓度0.2M，加热至75℃，保温30min，冷却至室温后，12000rpm离心20min，收集上清，透析过夜，沉淀用10mM磷酸钠缓冲液pH 7.0洗涤三次，合并清液，电泳分析α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白含量，280nm吸光度估算蛋白浓度。浓缩样品总α-乳清白蛋白和β-乳球蛋白总含量最高可达到99％以上。表5显示了不同金属盐对乳样品热处理的影响，如下表所示：

表5

实施例4

仿生亲和分离材料制备：量取三乙烯四胺(200ml)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF，200ml)及双蒸水(100ml)溶解，调pH12，与环氧基-Sepharose(500ml)，在60℃，反应过夜，取出后依次用3x10倍体积的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到仿生亲和分离材料L19(450ml)，用30％乙醇储存待用。

转基因重组α-乳清白蛋白牛乳中从-70℃取出，37℃水浴融化，离心脱脂，取清乳液，加入氯化钙使其终浓度为0.2M，加热到80℃保温15min，置于冰浴中降温，12000rpm离心10min去除沉淀，透析上清除氯化钙，分别调pH至5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，加NaCl至分别至NaCl浓度为0.05，0.1，0.15，0.2和0.3M，以相应条件的缓冲液平衡装亲和分离材料L19的层析柱后，将各条件下的样品分别加到层析柱上，用各相应平衡液洗去未吸附蛋白，再分别以0.1M，pH 2.0Gly-HCl缓冲液洗脱吸附蛋白。收集流穿液和洗脱组分，15％SDS-PAGE电泳分析。数据显示，当pH值在6.0～7.0之间时，NaCl浓度低于0.10M的吸附条件下，仿生亲和分离材料L19对β-乳球蛋白相对吸附量最大，专一性可达到96％。表6显示了吸附pH条件对β-乳球蛋白吸附专一性的影响；表7显示了吸附盐浓度条件对β-乳球蛋白吸附专一性的影响，如下表所示：

表6

pH	5.0	6.0	6.5	7.0	7.5	8.0	9.0
								专一性(％)	85.1	95.9	96.0	96.5	78.6	80.9	95

表7

NaCl(M)	0.00	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30
							专一性(％)	84	94.0	95.7	93.5	86.5	40
相对吸附量(％)	94.1	100.0	95.5	74.6	41.6	21.6

实施例5

普通牛乳中α-乳清白蛋白纯化：取-70℃冻存的普通牛乳样品，37℃水浴融化，离心脱脂脂，取中间层透明脱脂乳清，加入适量氯化钙使其终浓度为0.2M，80℃热处理15min，立即置于冰浴中终止反应，4℃，12000rpm离心10min取上清透析除去氯化钙，以1M HCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至15.6ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(150mMNaCl，10mM磷酸钠，pH7.0，电导率15.6ms/cm)平衡好的装有按实例1步骤一制备仿生亲和分离材料L19的层析柱(1x5cm)中，循环3次后再用1倍柱体积的磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7.0，电导率15.6ms/cm)洗柱，收集合并所有流穿后以SDS-PAGE鉴定分析α-乳清白蛋白纯度为95％。

实施例6

取转基因牛奶粉样品，按1∶20(w/v)加入去离子水，4℃下8,000rpm离心，弃去上层凝固乳脂和底部酪蛋白沉淀，取中间层透明液体即为脱脂乳清，加入适量氯化钙使其终浓度为0.2M，80℃热处理15min，立即置于冰浴中终止反应，4℃，12000rpm离心10min取上清透析除去氯化钙，以1MHCl调节pH至7.0，以饱和NaCl溶液将其电导率调至15.6ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(150mM NaCl，10mM磷酸钠，pH7.0，电导率15.6ms/cm)平衡好的装有按实例1步骤一仿生亲和分离材料L19的层析柱(1x5cm)中，循环3次后再用1倍柱体积的磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7.0，电导率15.6ms/cm)洗柱，收集合并所有流穿后以SDS-PAGE鉴定分析β-乳球蛋白纯度为98.50％，α-乳清白蛋白纯度为88％。

实施例7

取转基因牛奶粉样品，按1∶10(w/v)加入去离子水溶解，离心，弃去上层凝固乳脂和底部酪蛋白沉淀，取透明脱脂乳清，加入氯化钙使其终浓度为0.2M，75℃热处理20min，水浴降温后，4℃，12000rpm离心10min，取上清透析除去氯化钙，调节pH至6.5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至10.0ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(150mM NaCl，10mM磷酸钠，pH6.5，电导率10.0ms/cm)平衡好的装有按实例1步骤一仿生亲和分离材料L19的层析柱(2.5x5cm)中，循环3次后再用1倍柱体积的磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 6.5，电导率10.0ms/cm)洗柱，收集合并所有流穿后以SDS-PAGE鉴定分析β-乳球蛋白纯度＞99％，α-乳清白蛋白纯度为90％。

实施例8

取转基因牛奶粉样品，按1∶10(w/v)加入去离子水溶解，离心，弃去上层凝固乳脂和底部酪蛋白沉淀，取透明脱脂乳清，加入氯化钙使其终浓度为0.25M，90℃热处理10min，水浴降至室温后，离心去沉淀，上清液超滤除去氯化钙，调节pH至7.5，以饱和NaCl溶液将其电导率调至12.0ms/cm，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(50mM NaCl，10mM磷酸钠，pH7.5，电导率12.0ms/cm)平衡好的装有按实例1步骤一仿生亲和分离材料L19的层析柱(5x10cm)中，循环3次后再用1倍柱体积的10mM pH7.5磷酸钠缓冲液含50mM NaCl，电导率12.0ms/cm洗柱，收集合并所有流穿后以SDS-PAGE鉴定分析α-乳清白蛋白纯度为86％。

实施例9

称取2.4g转基因牛乳冻干粉，用去离子水定容至20ml，磁力搅拌器搅拌30min使奶粉充分溶解，离心，弃去上层凝固乳脂和底部酪蛋白沉淀，取淡黄色透明脱脂乳清，加入氯化钙使其终浓度为0.20M，75℃热处理30min，水浴降至室温后，离心去沉淀，上清液超滤除去氯化钙，调节pH和离子强度接近10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡缓冲液，上样至预平衡装有按实例1步骤一制备的仿生亲和分离材料L19的层析柱(1x5cm)中，循环6次，收集5倍柱体积的流穿，再用10倍柱体积洗杂，用3倍柱体积0.1M Gly-HCl pH2.5缓冲液洗脱，收集合并所有流穿后进行SDS-PAGE和Native-PAGE鉴定，α-乳清白蛋白纯度为95％，其中含重组人α-乳清白蛋白占66％。

Claims (10)

1.一种乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，合成牛乳β-乳球蛋白专一的亲和分离材料：首先以带氨基的基础层析介质，或对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与三乙烯四胺反应，合成亲和分离材料，即得到α-乳清白蛋白纯品；

第二步，用制备的仿生亲和分离材料纯化β-乳球蛋白；

第三步，乳清经加热处理后，用以上制备的仿生亲和分离材料纯化α-乳清白蛋白。

2.根据权利要求1所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，第一步中所述的基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中一种。

3.根据权利要求1所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，第二步中所述的仿生亲和分离材料的配体中含有三氮嗪和三乙烯四胺的结构。

4.根据权利要求1所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，第二步中所述的纯化β-乳球蛋白，其方法如下：

用合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将牛乳清样品流经该亲和层析柱，牛乳β-乳球蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变缓冲液条件将结合的牛乳β-乳球蛋白洗脱下来，得到牛乳β-乳球蛋白粗品；

5.根据权利要求1或者3或者4所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，所述的亲和分离材料，其吸附β-乳球蛋白的条件为pH 6.0-7.5，NaCl浓度为0.0-0.2M的NaCl缓冲液。

6.根据权利要求5所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，所述的亲和分离材料，其纯化β-乳球蛋白的洗脱条件为pH 2.0-3.0缓冲液和/或pH 5.0-8.5含0.2-1.0MNaCl的缓冲液。

7.根据权利要求1所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，第三步中乳清经加热处理是指：向去脂乳清中加入盐，混匀、加热并保温后，冷却，然后去除沉淀，收集清液得浓缩β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白；其加热温度至60℃-95℃；保温时间10min-60min。

8.根据权利要求7所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，所述的盐，包括：LiCl、NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、MnCl₂、ZnCl₂和FeCl₃中的一种，浓度：0.15-0.4M。

9.根据权利要求1所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，第三步中所述的纯化α-乳清白蛋白，其方法如下：

用合成的亲和分离材料制备成亲和层析柱，将经过加热处理的含有β-乳球蛋白和α-乳清白蛋白牛乳清样品，流经该亲和层析柱，β-乳球蛋白吸附在亲和层析柱上，未结合α-乳清白蛋白被洗去，收集流穿，得到α-乳清白蛋白粗品。

10.根据权利要求9所述的乳清蛋白规模纯化的制备方法，其特征是，所述的β-乳球蛋白和所述的α-乳清白蛋白，原料为普通牛乳和含重组人α-乳清白蛋白的转基因牛乳和人乳中的一种。