CN101940582A

CN101940582A - 龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎药物中的用途

Info

Publication number: CN101940582A
Application number: CN2009100575737A
Authority: CN
Inventors: 陈长勋; 吕见; 金若敏; 宋纯清
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-07-08
Also published as: CN101940582B

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及中药提取的单体龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎药物中的用途。本发明采用国内外学术界公认的腹腔连续注射雨蛙素致小鼠急性胰腺炎及胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致大鼠急性胰腺炎模型对龙胆苦苷的作用进行研究。实验结果揭示，龙胆苦苷具有明显的抗多种原因所致急性胰腺炎的作用，其抗急性胰腺炎的作用机制与抑制炎症因子的释放、降低血清或组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度，增强血清或胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性，清除自由基、抑制NF-κB P65的表达有关。

Description

龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎药物中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及龙胆苦苷的医药新用途。

背景技术

胰腺炎是指胰腺组织所发生的炎性病变，根据病理变化速度的不同分为急性胰腺炎(acute pancreatitis)和慢性胰腺炎。临床上约有80％左右患者病因明确。由于胰腺与毗邻器官的特殊解剖结构，肝脏、胆道与胰腺的多种病理生理改变与胰腺炎的发病密切相关。胆道疾病、大量饮酒和暴饮暴食、手术创伤及药物等均可诱发胰腺炎。急性胰腺炎发病率高，约为30/100,000，特别是重症急性胰腺炎，占急性胰腺炎病人的15％左右，死亡率高达12％-15％(Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al.A beter model of acute pancreatitisfor evaluating therapy.Ann Surg，1992，215：44-56.；Qin JM，Fu XY，Li SJ，et al.Gene and proteinexpressions of P28 GANK in rat with liver regeneration.World J Gastroenterol，2003，9(11)：2523-2527.)。急性胰腺炎的发病机制一直是众多学者研究的热门课题，并不断取得新的进展，但该病的确切发病机制至今没有被完全阐明。目前，对急性胰腺炎的预防和治疗没有特效的药物，临床上大多采用解痉止疼、补充液体维持有效血容量、胃肠减压预防和治疗肠道衰竭、预防和控制感染及维持水电解质平衡、营养支持、抑制胰腺分泌等对症治疗方法，尚缺乏预防和治疗急性胰腺炎的有效药物。

对急性胰腺炎的发病机制虽然不断取得新的进展，但至今仍不十分明确。目前急性胰腺炎的发病机制有胰酶自身消化学说、氧化应激损伤学说、胰腺微循环障碍学说、胰腺腺泡内钙超载学说、白细胞-内皮细胞相互作用学说、白细胞过度激活-炎性因子级联瀑布效应学说、肠道细菌易位与“二次打击学说、细胞凋亡学说等，相信随着研究的不断深入，还会有不同的学说提出。

龙胆苦苷是单萜类化合物，属裂环环烯醚萜苷结构，为多种龙胆科植物中共有的成分，也是中药龙胆的主要有效成分之一，对防治急、慢性胰腺炎的作用未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供中药单体龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎药物中的新用途。

本发明所述的龙胆苦苷(Gentiopicroside)是龙胆科植物龙胆中的主要有效成分之一，也是多种龙胆科植物中共有的成分。龙胆苦苷为龙胆科多种植物中提取的单体成分，其结构式为

本发明所述的龙胆苦苷的主要理化性质、参数如下：

化学名：5-Ethenyl-6-(β-D-glucopyranosyloxy)-5，6-dihydro-1H，3H-pyrano[3，4-C]pyran-1-one

理化性质：淡黄色固体，有内酯苷类化合物的颜色反应。

分子式：C₁₆H₂₀O₉

分子量：356

Mp：191℃

[α]D：-196.3(H₂O)

UV：λmax 270(MeOH)

本发明涉及的龙胆苦苷为从龙胆科多年生草本植物秦艽(Gentiana macrophyllaPall)中分离提取得到，也可以从龙胆科植物龙胆或多种其他龙胆科植物中提取。

本发明分别采用国内外学术界已广泛应用的胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠和腹腔连续注射雨蛙素两种方法制备小鼠及大鼠的急性胰腺炎模型。实验结果显示，两种模型动物都出现血清淀粉酶、脂肪酶活性显著增强，胰腺重量系数、胰腺组织含水量显著增加，胰腺组织病理形态学变化明显，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度显著增加，胰腺组织NF-kB p65的表达显著增强等特征，进行龙胆苦苷干预实验，结果证实，龙胆苦苷可明显抑制两种模型动物急性胰腺炎的发展。

本发明通过下述技术方案施行：

按本领域公知技术，大鼠胰胆管内逆行注射逆行注射3％牛黄胆酸钠(0.1ml/100g，0.2ml/min)，制备重症急性胰腺炎模型；小鼠腹腔连续注射雨蛙素素20μg/kg/次，每隔1小时注射一次，连续5次，制备轻症急性胰腺炎模型。重症急性胰腺炎大鼠在造模前和造模后各灌胃给予龙胆苦苷1次；轻症急性胰腺炎小鼠预防给药时分别在造模前和造模后灌胃给予龙胆苦苷1次；轻症急性胰腺炎治疗给药采用小鼠在造模后腹腔注射给予龙胆苦苷3次，模型组动物给予双蒸水，观察动物血清中淀粉酶、脂肪酶活性的变化，胰腺重量系数和胰腺组织含水量的变化，胰腺组织形态学的变化，用放射免疫分析法测定大鼠胰腺组织和小鼠血清中炎症介质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)浓度的变化，用免疫组化法测定大鼠和小鼠胰腺组织中NF-κB P65表达的变化。结果显示：龙胆苦苷可降低血清淀粉酶、脂肪酶活性，降低胰腺系数和胰腺组织含水量，减轻胰腺水肿和坏死、减轻炎症细胞浸润、改善胰腺组织形态学改变，降低血清或组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度，抑制NF-κB P65的表达。

实验证实，龙胆苦苷通过抑制导致急性胰腺炎的有关刺激、介导因素，从而改善急性胰腺炎的症状和胰腺的生物学功能，具有防治急性胰腺炎的作用，可制备防治急性胰腺炎的药物，进而可预防或延缓重症急性胰腺炎的发生、发展，减少急性胰腺炎并发多脏器功能衰竭综合症的发生率。其抗急性胰腺炎的作用机制与抑制炎症因子的释放、降低血清或组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度，增强血清或胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性，清除自由基、抑制NF-κB P65的表达有关。

本发明的有益效果突出体现在：龙胆苦苷提取工艺成熟、药源丰富，具有抗急性胰腺炎，防治急性胰腺炎引起的全身多器官功能衰竭综合症的新作用，未见明显急性毒性，将其进一步开发应用于防治重症急性胰腺炎，对于改善急性胰腺炎患者的症状，降低全身多器官功能衰竭综合症的发生率及远期死亡率具有重要意义。

据统计，在中国急性胰腺炎的发病率约为30/10万，常因多种胆道疾病和不良生活习性引起。急性胰腺炎的发病机制一直是众多学者研究的热门课题，并不断取得新的进展，但该病的确切发病机制至今没有被完全阐明，对急性胰腺炎的预防和治疗没有特效的药物，重症急性胰腺炎患者的病死率仍高达12％-15％。尽早使用具有抑制抑制炎症因子的释放、降低血清或胰腺组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度，增强血清或胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性，清除自由基、抑制NF-κB P65表达作用的龙胆苦苷，对防治急性胰腺炎，防止并发症的发生，具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1

1.龙胆苦苷预防胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致大鼠急性胰腺炎的作用研究

实验动物为雄性SD大鼠，分三批，每批用40只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、龙胆苦苷小(100mg.kg-1)、中(200mg.kg-1)、大(400mg.kg-1)剂量给药组。除假手术组外，各组均行胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠(30μg.kg-1)手术致大鼠急性胰腺炎，假手术组仅开腹拉动胰腺组织。各给药组大鼠在手术前1h和手术后3h各灌胃给药一次，假手术组和模型组给予相同体积的双蒸水。三批实验大鼠分别在造模后6h、12h、24h处理取材进行各项分析。

1.1大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定

大鼠用25％乌拉坦麻醉后，腹主动脉取血，室温放置1h左右，放低温离心机中4000r·min-1离心10min，取上清，即所需血清。按试剂盒说明测定造模后6h、12h、24h血清中淀粉酶、脂肪酶活性，12h、24h谷胱甘肽过氧化物酶活性。具体方法及操作按试剂盒说明书进行。

与假手术组比较，各时间点内模型组血清淀粉酶活性显著增强；各剂量给药组与模型组比较，血清淀粉酶活性减弱，其中，6h、12h小剂量组，12h、24h中剂量组，各时间点内大剂量给药组与模型组比较有显著性差异。(见表1)

表1.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠血清淀粉酶活性的影响

注：与模型组比较，^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001。术后24h大剂量组n＝6，其他n＝8。

与假手术组比较，各时间点内模型组血清脂肪酶活性显著增强；各剂量给药组与模型组比较，血清脂肪酶活性减弱，其中，12h小剂量组，24h中剂量组，各时间点内大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表2)

表2.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠血清脂肪酶活性的影响

注：与模型组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***p＜0.001。术后24h大剂量组n＝6，其他n＝8。

与假手术组比较，12h、24h时间点内模型组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著减弱；各给药组与模型组比较血清谷胱甘肽过氧化物酶活性增强，其中，术后12h中剂量组，两时间点内大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表3)

表3.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

注：与模型组比较，^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001.术后24h大剂量组n＝6，其他n＝8。

1.2大鼠胰腺重量系数和胰腺组织含水量的测定

取血后迅速完整摘取大鼠胰腺组织，用滤纸吸干表面血迹及水分，用电子天平称量胰腺组织重量，计算术后6h、12h、24h胰腺湿重/体重，即胰腺重量系数。切取适量胰腺组织，用电子天平准确称重，再放烘箱80℃烘12小时，用电子天平称烘干胰腺组织重量。计算术后6h、12h(胰腺湿重-胰腺干重)/胰腺湿重×100％，即胰腺组织含水量。

与假手术组比较，各时间点内模型组胰腺重量系数显著增加；各剂量给药组与模型组比较，胰腺重量系数减小，其中，小剂量给药组，24h中剂量给药组，各时间点内大剂量给药组与模型组比较有显著性差异。(见表4)

表4.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠胰腺重量系数的影响

注：与模型组比较^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001。术后24h大剂量组n＝6，其他n＝8.

与假手术组比较，模型组胰腺组织含水量显著增高；各剂量给药组与模型组比较，胰腺组织含水量降低，其中，6h小剂量给药组、两时间点大剂给药量组与模型组比较有显著性差异。(见表5)

表5.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠胰腺组织含水量的影响

注：与模型组比较^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001。n＝8.

1.3大鼠胰腺中TNF-α、IL-1β浓度的测定

术后12h取大鼠胰腺相同部位的适量胰腺组织迅速放液氮中速冻，24h后从液氮中取出，放-70℃低温冰箱保存备用。测试时从低温冰箱中取出胰腺组织，称量400mg左右放入10ml离心管中，再向离心管中加入1ml的生理盐水，用高速分散匀浆机匀浆。匀浆后用低温离心机4000r·min-1离心10min，取上清，即为约30％胰腺组织匀浆液。用放射免疫法测定胰腺组织中TNF-α、IL-1β浓度，经预测试发现用30％左右胰腺组织匀浆液测定结果符合试剂盒标准曲线线性关系，故用30％胰腺组织匀浆液测定。具体方法和操作步骤按试剂盒说明书进行。再取30％匀浆液15倍稀释成2％胰腺组织匀浆液，测蛋白含量。TNF-α、IL-1β浓度用每毫克组织蛋白中含TNF-α、IL-1β量表示。

模型组大鼠与假手术组比较TNF-α浓度显著增高；各剂量给药组与模型组比较TNF-α浓度降低，其中，中剂量组、大剂量组与模型组比有显著性差异。模型组与假手术组比较IL-1β浓度显著增高；各剂量给药组与模型组比较IL-1β浓度显著降低。(见表6)

表6.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠胰腺组织中TNF-α和IL-1β浓度的影响

注：与模型组比较，^*表示p＜0.05；^**表示p＜0.01；^***表示p＜0.001.

1.4大鼠胰腺组织形态学检查

取术后12h处理的大鼠胰腺相同部位的组织固定于10％福尔马林溶液中，经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋、切片，进行常规HE染色，200倍镜下观察病理改变，并按照镜下病理评分标准^[1]根据水肿、炎症、出血、坏死程度不同按0-4分做胰腺组织病理评分.(见表7)

表7.胰腺组织病理评分标准

假手术组胰腺组织正常；模型组大鼠胰岛组织中见大片出血；小剂量给药组仅见一小团出血、胰腺间质充血水肿、少量炎细胞浸润；中剂量组仅见胰腺组织小灶性坏死、充血、水肿、少量炎细胞浸润；大剂量组仅见局部间质轻度充血、水肿、少量炎细胞浸润。与假手术组比较，模型组胰腺组织病理变化明显，两组间比较有显著性差异；与模型组比较，小剂量组病理变化有改善，但统计分析差异不明显，中、大剂量组病理变化则有明显改善(见表8)。

表8.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠胰腺组织病理变化的影响

注：^*表示与模型组比较，差异有统计学意义。

1.5大鼠胰腺组织中NF-κB p65表达的测定

用免疫组织化学方法测定术后12h处理的大鼠胰腺组织NF-kB p65的表达，具体操作步骤按试剂盒说明进行：切片在Olympus BX51型显微镜下观察并摄片。染色结果判定标准参照Fromowitz^[2]阳性细胞半定量分级法。在高倍镜下对细胞核内反应作如下评分：①无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②阳性范围：＜5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。两项结果相加＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)，其中-～+视为低表达，++～+++视为过表达.

与假手术组比较，模型组胰腺组织NF-KB p65表达增强，差别有统计学意义；与模型组比较，小、中剂量组胰腺组织NF-KB p65表达减弱，但差别没有统计学意义；大剂量组胰腺组织NF-κB p65表达减弱，差异有统计学意义。(见表9)

表9.龙胆苦苷对胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠致急性胰腺炎大鼠胰腺组织NF-KB p65表达的影响

注：^*表示与模型组比较，差异有统计学意义。

2.龙胆苦苷抗雨蛙素致小鼠急性胰腺炎的作用研究

2.1龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致小鼠急性胰腺炎的作用研究

实验动物分为二批，造模前12h禁食不禁水，称量小鼠体重，按体重小鼠腹腔注射雨蛙素，注射剂量为20μg.kg-1，容量为10ml.kg-1。每隔1h小鼠腹腔注射雨蛙素1次，共5次。造模后小鼠继续禁食不禁水。正常组每次注射等容量的生理盐水。每批均采用20-25g雄性昆明种小鼠60只，分为正常组、模型组、高、中、低三个剂量给药组。高、中、低三个剂量给药组给药剂量分别为600mg.kg-1、300mg.kg-1、150mg.kg-1，给药途径为灌胃给药，给药容量为10ml.kg-1，给药时间为首次注射雨蛙素前1h、首次注射后3h各给药一次。初次注射雨蛙素后12h、24h取材，测定下列指标：

2.1.1小鼠血清中淀粉酶、脂肪酶活性及TNF-α、IL-1β浓度的测定

小鼠颈总动脉取血后，室温放置1h左右，放低温离心机中4000r·min-1离心10min，取血清。按试剂盒说明书测定血清中12h、24h淀粉酶活性、12h脂肪酶活性。部分血清放-20℃冰箱冻存备用。测定前常温下复融，低温离心机中2000r·min-1离心5min，用放射免疫法测定血清中TNF-α、IL-1β浓度。具体方法和操作步骤按试剂盒说明书进行。

与假手术组比较，各时间点内模型组血清淀粉酶活性显著增强；与模型组比较，各时间点内各给药组血清淀粉酶活性显著减弱。(见表10)

表10.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠血清淀粉酶活性的影响

注：与模型组比较^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001。24h大剂量组n＝11，其余n＝12.

模型组与假手术组比较血清脂肪酶活性显著增强；各剂量给药组与模型组比较血清脂肪酶活性减弱，其中，中、大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表11)

表11.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠血清脂肪酶活性的影响

注：与模型组比较^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001。

与正常组比较，各时间点内模型组血清TNF-α浓度显著增高；与模型组比较，各剂量给药组血清TNF-α浓度显著降低。(见表12)

表12.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠血清TNF-α浓度的影响

与正常组比较，各时间点内模型组血清IL-1β浓度显著增高；与模型组比较，各剂量给药组血清IL-1β浓度除24h小剂量组外与模型组比较均显著降低。(见表13)

表13.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠血清IL-1β浓度的影响

2.1.2小鼠胰腺重量系数、胰腺组织含水量的测定

取血后迅速完整摘取小鼠胰腺组织，用滤纸吸干胰腺表面血迹和水分，电子天平称量胰腺组织重量。计算胰腺湿重/体重，即小鼠胰腺重量系数。切取相同部位适量胰腺组织，称量湿重，再放烘箱80℃烘12h，称量烘干胰腺组织重量。计算12h处理小鼠(胰腺湿重-胰腺干重)/胰腺湿重×100％，即得胰腺组织含水量。

与正常组比较，各时间点内模型组胰腺重量系数显著升高；各剂量给药组与模型组比较胰腺重量系数降低，其中，12h中剂量组、各时间点24h大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表14)

表14.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠胰腺重量系数的影响

2.1.3小鼠胰腺组织谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定

取适量首次腹腔注射后24h处理小鼠胰腺组织，放液氮中速冻。24h后取出放-70℃低温冰箱中保存备用。测定时取出胰腺组织，称取40mg，加4℃生理盐水制备成2％组织匀浆，测定谷胱甘肽过氧化物酶活性；同时用考马斯亮蓝法测胰腺组织蛋白含量。胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性用每毫克组织蛋白含量表示。具体方法和操作步骤按试剂盒说明书进行。

与正常组比较，模型组胰腺组织含水量显著增加；各剂量给药组与模型组比较胰腺组织含水量降低，其中，中剂量组、大剂量组与模型组比较有显著性差异。与正常组比较，模型组谷胱甘肽过氧化物酶活性显著减弱；各剂量给药组与模型组比较谷胱甘肽过氧化物酶活性增强，其中，中剂量组、大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表15)

表15.龙胆苦苷预防给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠胰腺组织含水量、胰腺组织谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

2.2龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素致小鼠急性胰腺炎的影响

采用20-25g雄性昆明种小鼠60只，分为正常组、模型组、高、中、低三个剂量给药组。高、中、低三个剂量给药组给药剂量分别为400mg.kg-1、200mg.kg-1、100mg.kg-1，给药途径为腹腔注射给药，给药容量为10ml.kg-1，给药时间为首次注射雨蛙素损伤胰腺后1h、5h、9h各给药一次，正常组和模型组每次给予等容量的生理盐水。

2.2.1小鼠血清中淀粉酶、脂肪酶活性及TNF-α、IL-1β浓度的测定

方法同2.1.1。

模型组与正常组比较血清淀粉酶活性显著增强；各剂量给药组与模型组比较血清淀粉酶活性显著减弱。模型组与正常组比较血清脂肪酶活性显著增强；各剂量给药组与模型组比较血清脂肪酶活性显著减弱。(见表16)

表16.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素法致急性胰腺炎小鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性的影响

模型组与正常组比较血清TNF-α浓度显著升高；各剂量给药组与模型组比较血清TNF-α浓度显著降低。模型组与正常组比较血清IL-1β浓度显著升高；各剂量给药组与模型组比较血清IL-1β浓度显著降低。(见表17)

表17.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素法致急性胰腺炎小鼠血清TNF-α、IL-1β浓度的影响

2.2.2小鼠胰腺重量系数的测定

方法同2.1.2。

模型组与正常组比较胰腺系数显著增加；各剂量给药组与模型组比较胰腺系数显著减小。(见表18)

表18.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素法致急性胰腺炎小鼠胰腺重量系数的影响

注：与模型组比较^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^***表示p＜0.001

2.2.3小鼠胰腺组织谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定

方法同2.1.3。

模型组与正常组比较谷胱甘肽过氧化物酶活性显著较弱；各剂量给药组与模型组比较谷胱甘肽过氧化物酶活性增强，其中，大剂量组与模型组比较有显著性差异。(见表19)

表19.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素法致急性胰腺炎小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

2.2.4小鼠胰腺组织形态学检查

方法同第一部分1.4。

正常组胰腺正常；模型组小鼠胰腺组织局部坏死、充血、水肿、伴炎细胞浸润；小剂量组小鼠胰腺间质轻度水肿、少量炎症细胞浸润；中剂量组胰腺间质轻微充血、水肿、少量炎细胞浸润；大剂量组小鼠胰腺间质轻度水肿、极少量炎症细胞浸润。与正常组比较，模型组胰腺组织病理变化明显，两组间比较有显著性差异；与模型组比较，小、中剂量组病理变化有改善，但统计分析差异不明显，大剂量组病理变化则有明显改善。(见表20)

表20.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素法致急性胰腺炎小鼠胰腺组织病理变化的影响

注：^*表示与模型组比较，差异有统计学意义。

2.2.5小鼠胰腺组织中NF-KB p65表达

方法同第一部分1.5。

模型组与正常组比较，NF-κB p65表达增强，差异有统计学意义；各剂量给药组与模型组比较，NF-κB p65表达减弱，其中，大剂量组与模型组比较，差异有统计学意义。(见表21)

表21.龙胆苦苷治疗给药对腹腔连续注射雨蛙素致急性胰腺炎小鼠胰腺组织NF-κB p65表达的影响

注：^*表示与模型组比较，差异有统计学意义。

3.急性毒性实验：

3.1急性毒性实验方法：取昆明种小鼠雌雄各半，实验前预适应饲养3天，正式实验时称量体重18～22g。实验小鼠禁食不禁水12h，分为5组，每组10只，雌雄各半。取龙胆苦苷粉用水调成0.6g/ml的浓度，第1组小鼠口服0.6g/ml的龙胆苦苷混悬液0.3ml/10g，实际给药量为18g/kg。第2、3、4、5组小鼠的给药浓度和给药量按0.85系数依次递减，给药容积不变。动物给药后自由进水进食观察14天，记录各组小鼠的死亡率，行为活动情况，取死亡小鼠解剖，肉眼观察脏器外观情况。

急性毒性实验结果：小鼠口服龙胆苦苷后排出稀便增加，活动减少，形态倦怠，不同剂量组有不同数目的小鼠死亡，随剂量增加，小鼠的死亡率增加(见表22)。大部分小鼠死亡时间在灌服药液后12～36h。对死亡小鼠肉眼尸检未发现心、肺、脾、肝、肾等有明显病变，但胃肠道残留药物较多，胃肠道呈现膨胀状。用Bliss法计算其LD₅₀及95％可信限为12.97±1.43g/kg

表22.龙胆苦苷对小鼠急性毒性死亡率的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数	死亡数	死亡率(％)
					1	18.0	10	10	100
2	15.3	10	7	70
					3	13.0	10	6	60
4	11.05	10	3	30
					5	9.4	10	1	10

3.2急性毒性实验结论：

口服龙胆苦苷的LD₅₀为12.97±1.43g/kg。

龙胆苦苷抗急性胰腺炎有效剂量为100mg.kg-1～600mg.kg-1。LD₅₀剂量为抗急性胰腺炎有效剂量的21.6～129.7倍，安全范围较大。

结论

上述实施例表明，龙胆苦苷具有预防和治疗多种原因引起的急性胰腺炎的作用，其作用表现为降低血清淀粉酶、脂肪酶活性，降低胰腺系数和胰腺组织含水量，抑制消化酶在胰腺腺胞内激活、减轻胰腺水肿和坏死、减轻炎症细胞浸润、改善胰腺组织形态学改变。其抗急性胰腺炎的作用机制与抑制炎症因子的释放、降低血清或组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β浓度，增强血清或胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性，清除自由基、抑制NF-κB P65的表达有关。

不同的给药途径均具有抗急性胰腺炎的作用，腹腔注射给药比口服给药效果更好。

Claims

1.龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎药物中的用途。

2.龙胆苦苷在制备防治急性胰腺炎口服、注射药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是，小鼠口服龙胆苦苷的LD₅₀为12.97±1.43g/kg。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征是，龙胆苦苷防治小鼠、大鼠急性胰腺炎的有效剂量为100mg.kg-1～600mg.kg-1。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征是，龙胆苦苷的临床有效剂量为5～60mg/kg。