CN101939649A - 从复杂样品基质中对细胞进行分离和计数 - Google Patents

从复杂样品基质中对细胞进行分离和计数 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于标记、分离、检测并计数生物细胞或者样品中存在的其它目的生物分析物的方法和系统，其中捕获复合体也可作为标记试剂。在一个实施方案中，所述捕获复合体是与抗体偶联的编码磁珠，所述抗体对目的细胞上的细胞表面蛋白具有特异性亲和力。本发明的方法和系统可用于定量或定性检测。

Description

从复杂样品基质中对细胞进行分离和计数
发明背景
本申请要求在2008年1月7日提交的美国临时专利申请系列号61/019,485的优先权。上文提及的公开内容通过引用整体并入本文。
A.发明领域
本发明总体而言涉及生物分析物(如细胞、孢子或细菌)的分离和检测。具体而言，本发明涉及从复杂样品中对生物制剂进行免疫磁性分离。
B.相关领域的描述
对生物细胞的研究、表征和统计总是依赖于成像工具的使用，所述成像工具允许观察到肉眼不能直接看到的东西。自从Robert Hooke在1665年报道了对细胞的第一次科学观察(The Cell-A molecularapproach；Geoffrey M.Cooper.ASM Press.1997)，显微术领域为细胞生物学领域提供了有力的工具。从早期基本的亮视野光学显微镜到近期的扫描电子显微镜，细胞生物学家利用了这些技术越来越高的放大率和分辨率。今天，数字成像与这些强力显微镜的结合甚至已经更广泛地扩展了该领域的范围。显微术现在可以与强大的图像处理技术结合，使得能够快速并自动分析广泛的样品。
虽然显微镜的成像能力已经在几个世纪中有了明显进展，但样品制备一般仍然是成像前进行的一项单独的工作。一般地，对样品中的目的靶成分(细胞核或细胞膜等)着色或染色以使其可见。不存在进行分析所需全部步骤(如制备样品、靶细胞的成像和表征，以及分析样品后成像室的再生)的集成式装置。显微镜的玻璃载玻片和盖玻片因其使用简单并且成本低而仍然广泛用于承载样品。许多芯片式实验室(lab-on-a-chip)技术使用一些形式的显微术(亮视野显微术或荧光显微术)和成像方法作为检测器；然而，在紧凑式成像室方面经常缺少整合。在该方面，许多芯片式实验室设备仍然处于其起步期。扫描电子显微镜(SEM)技术也缺少样品制备方面的自动化，并且需要每一样品单独装到样品台上并在分析前用金属包被。因此，显微术的主要缺点是通量。样品制备、将样品置于焦平面上以及目的区域的定位仍然是繁复的过程。
也可通过流式细胞术完成对细胞(大小、形状)的表征，特别是对细胞表面上标记的表征。该技术在通量方面是一个很大的改进。自从20世纪70年代晚期以来，流式细胞术已经使得科学家能够分析许多细胞类型，并提供许多优于其它基于细胞的技术的优点，包括：速度、细胞生存力和细胞功能的保留以及多个细胞参数的同时测定。
流式细胞术的吸引力来自将荧光技术与该技术的高速和强大数据整合能力相结合的灵活性和灵敏度。流式细胞术目前是最常用于细胞分选和分析的方法和金标准(Bioinformatics Market Research 2006Report#06-030：“influencing brand preference in the flow cytometrymarket”)。虽然流式细胞术赋予细胞分析以许多能力，但它们昂贵并且在技术上难于操作。即便最廉价的流式细胞仪型号定价都超过$100,000，而更高级的型号定价超过$300,000。此外，流式细胞仪需要受过很好训练的操作人员并且对其光学校直的改变非常敏感。因此，这些装置的总体购买和操作费用使得它们难以应用到许多实验室(特别是位于资源贫乏的国家的那些实验室)。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供用于固定并检测样品中生物分析物的方法，其包括：(a)获得第一捕获复合体，其包含与捕获剂偶联的编码磁性颗粒，所述捕获剂对可能在样品中存在的第一生物分析物上的特定表位具有特异性亲和力；(b)使样品与捕获复合体接触；(c)将样品的等分试样引入室中；(d)向室中施加磁场以将捕获复合体吸到室的表面上；和(e)检测通过与捕获复合体结合而固定在室表面上的生物分析物。
在另一实施方案中，本发明提供用于固定和检测样品中一种或多种生物分析物群体的方法：其包括：(a)获得包含第一编码磁性颗粒和第一捕获剂的第一捕获复合体，所述第一捕获剂对可能在样品中存在的第一生物分析物群体上的特定表位具有特异性亲和力；(b)获得包含第二编码磁性颗粒和第二捕获剂的第二捕获复合体，所述第二捕获剂对可能在样品中存在的第二生物分析物群体上的特定表位具有特异性亲和力；(c)使样品与第一捕获复合体和第二捕获复合体接触；(d)将样品的等分试样引入室中；(e)向室中施加磁场以将第一捕获复合体和第二捕获复合体吸到室的表面；和(f)检测通过与第一捕获复合体结合而固定在室表面上的第一生物分析物群体和通过与第二捕获复合体结合而固定在室表面上的第二生物分析物群体。
在一个实施方案中，本发明提供用于固定并检测样品中细胞的方法，其包括：(a)获得第一捕获复合体，其包含与抗体偶联的编码磁珠，所述抗体对可能在样品中存在的第一细胞上的特定表位具有特异性亲和力；(b)使样品与捕获复合体接触；(c)将样品的等分试样引入室中；(d)向室中施加磁场以将捕获复合体吸到室的表面上；和(e)检测通过与捕获复合体结合而固定在室表面上的细胞。
在另一实施方案中，本发明提供用于固定和检测样品中一种或多种细胞群体的方法：其包括：(a)获得包含第一编码磁珠和第一抗体的第一捕获复合体，所述第一抗体对可能在样品中存在的第一细胞群体上的特定表位具有特异性亲和力；(b)获得包含第二编码磁珠和第二抗体的第二捕获复合体，所述第二抗体对可能在样品中存在的第二细胞群体上的特定表位具有特异性亲和力；(c)使样品与第一捕获复合体和第二捕获复合体接触；(d)将样品的等分试样引入室中；(e)向室中施加磁场以将第一捕获复合体和第二捕获复合体吸到室的表面；和(f)检测通过与第一捕获复合体结合而固定在室表面上的第一细胞群体和通过与第二捕获复合体结合而固定在室表面上的第二细胞群体。
可在将样品引入室中之前或在将样品引入室中之后使样品与捕获复合体接触。在本发明的某些方面中，样品可与额外的不同捕获复合体(如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十二、第十五或更多捕获复合体)接触。每一不同的捕获复合体对不同表位具有特异性亲和力并且是独特编码的(例如在光谱学上不同)。
在某些实施方案中，所述方法还包括对室表面上固定的生物分析物(例如细胞)进行计数。所述方法还包括测定在室的表面是否固定了统计学上显著数量的生物分析物，并将样品的一个或多个额外的等分试样引入室中，直至在室的表面上固定了统计学上显著数量的生物分析物。在某些方面中，所述方法还包括将所检测生物分析物的数量与样品中生物分析物的数量相关联。关联可包括例如确定样品中生物分析物的浓度和/或测定样品中生物分析物的总数。在测定两种或更多种不同生物分析物时，所述方法可包括确定第一生物分析物群体与第二生物分析物群体的比值。所述方法还包括测定第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多生物分析物群体的数量、浓度和/或比例。
在本发明的某些方面中，所述编码磁性颗粒是顺磁的或超顺磁的。在一些方面中，所述编码磁性颗粒是编码的磁珠。例如，所述珠子用一种或多种荧光染料编码。在一些实施方案中，所述珠子约为其所结合之细胞的大小。在一些实施方案中，所述珠子的直径为5-8μm、6-8μm或6-7μm。在一个实施方案中，所述珠子的直径约为6.7μm。
在一些实施方案中，所述方法还包括在成像室中对生物分析物进行检测和计数之前进行洗涤步骤，以去除未被磁场固定的样品组分。可在样品加载过程中的每一步检测和计数之前进行所述洗涤步骤，或者仅在最后的检测和计算步骤之前进行。
生物分析物可以是任何目的生物靶标。在一些具体实施方案中，所述生物靶标是细胞。所述细胞例如可以是真核细胞或原核细胞。真核细胞包括但不限于哺乳动物细胞、鱼类细胞、两栖动物细胞、鸟类细胞、爬行动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。在本发明的某些方面中，所述细胞是淋巴细胞、白细胞或单核细胞。所述原核细胞例如可以是细菌细胞或细菌孢子。当生物靶标是细胞时，捕获剂和标记试剂所检测的表位优选为细胞表面的表位。例如，如果所述生物靶标是T细胞，那么所述表位可以是CD3、CD4和/或CD8中的一种或多种。
生物靶标可以是在样品中。样品可以是含有细胞或怀疑含有细胞的任何组合物。在本发明的某些方面中，样品可以是体液(包括但不限于全血、血清、唾液、尿、精液)。在本发明的另一些方面中，样品是环境样品，如土壤、水或空气样品，或在人的周围环境中发现的其它物质。
本发明的方法和系统可用于多种应用，包括但不限于在患者的细菌性脓毒症中检测和鉴定细菌；通过鉴定B细胞和T细胞表面上的抗原决定簇而对白血病/淋巴瘤进行免疫分型；通过检测免疫系统中细胞组分的变化来监测对器官移植的免疫应答；检测并计数CD34+细胞，其通过T细胞受体分析而提供对免疫抑制充分性(adequacy)的度量；使用例如CD42a作为标记来进行血小板检测和计数；通过测定GPI锚定蛋白(CD59、CD55)(其在PNH血细胞表面上缺失)的存在与否来进行PNH(阵发性夜间血红蛋白尿)诊断。本文描述的方法和系统在分析复杂样品如血液中提供了若干优点。例如，本文所述方法和系统无需通过溶解或离心将红细胞从血液样品中去除，因为可通过从成像室中洗去非磁性材料来简单地去除红细胞。此外，可将去除其他不想要的细胞改变成通过其它珠子组来鉴定这些细胞，这由于本文所述方法和系统的多重性能力而成为可能。而且，这种多重性无需使用多种染料基于其颜色和形态来鉴定细胞。
捕获剂可以是抗体、适配体、核酸探针(例如但不限于DNA或RNA)、蛋白质，或者特异性结合目的生物分析物的任何其它天然的或合成的分子。捕获复合体由于包含磁性颗粒而具有磁响应性。多个单位的捕获复合体可结合单个生物分析物，以产生磁响应性聚集体或者被装置磁场吸引的簇。因为磁性颗粒(例如珠子)本身带有标记(即被编码)，所以不需要额外的标记试剂来检测和鉴定与捕获复合体结合的生物分析物。检测过程可包括表征与生物分析物结合的捕获剂的平均荧光强度(MFI)的分类(classification)步骤。在本发明的某些实施方案中，可使用使任何细胞膜染色的通用报告染料(例如革兰氏染料)或使任何细胞核染色的通用报告染料(例如DAPI)来标记目的细胞，以将目的细胞周围的珠子簇从非特异性珠子簇(簇中没有捕获细胞)中区分出来。在该实施方案中，检测过程可包括表征簇的平均荧光强度(MFI)的分类步骤和保证细胞位于簇中的报告步骤。
在另一实施方案中，本发明提供用于在细菌性脓毒症患者中检测并鉴定细菌的方法，其包括：(a)从怀疑患细菌性脓毒症的患者中获得样品(例如血样)；(b)获得多种不同的捕获复合体，每一不同的捕获复合体包含独特编码的磁珠以及对可能在样品中存在的细菌上的特定表位具有特异性亲和力的抗体；(c)使样品与所述多种捕获复合体接触；(d)将样品的等分试样引入室中；(e)向室中施加磁场以将捕获复合体吸到室的表面；和(f)检测通过与捕获复合体结合而固定到室表面上的细菌。在某些实施方案中，所述方法还包括计数并鉴定所述细菌。可通过与细菌结合的独特编码的磁珠来测定细菌的身份。在一个实施方案中，用于在细菌性脓毒症患者中检测并鉴定细菌的方法还包括获得包含独特编码磁珠和对血小板具有特异性亲和力的抗体的捕获复合体，以及使所述样品与该捕获复合体接触，以便能够检测和鉴定血小板。通过检测样品中的血小板，可通过将样品中的细菌数量或浓度与样品中血小板的数量或浓度进行比较而确定细菌性脓毒症的程度。在某些实施方案中，所述方法可用于固定、检测并鉴定以下细菌中的一种或更多种：大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。尽管上述方法在细菌性脓毒症的背景中进行了描述，但它也适于通过从相关体液或组织中获得样品并使所述样品与捕获复合体接触来检测和或鉴定其它细菌感染(例如细菌性脑膜炎)，所述捕获复合体对怀疑在样品中存在的细菌具有特异性亲和力。
本发明还提供试剂盒，所述试剂盒提供可与本文所公开方法结合使用的多种组分。在一个实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种捕获复合体。在某些方面中，所述试剂盒包含与抗体偶联的一种或多种不同的编码磁珠群体，所述抗体对生物分析物上的特定表位具有特异性亲和力。在一个实施方案中，本发明提供用于在患者中检测细菌性脓毒症的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于以下细菌的一种或更多种的捕获复合体：大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎萘瑟氏菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、绿脓假单胞菌和酿脓链球菌。
在一个实施方案中，本发明提供用于进行免疫原性捕获和生物靶标成像的系统。在某些方面中，该系统包括：成像系统；适合引入该成像系统中的编码磁性捕获复合体，所述捕获复合体对生物靶标上的特定表位具有特异性亲和力；用于向成像系统中选择性引入磁场以固定捕获复合体以及与其结合的任何生物靶标的磁体。
已经考虑到，本文描述的任何方法或组合物可应用于本文描述的任何其他方法或组合物。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅表示择一选择，或者可选项是互斥的，但公开内容支持仅表示择一和“和/或”的定义。
在本申请全文中，术语“约”用于表示，数值包括用来测定该值的设备或方法的误差标准差。
根据现行专利法，当在权利要求或说明书中与词语“包含”结合使用时，无数量词修饰的词语表示一个或多个，除非明确指出。
本发明的其它目的、特征和优点从以下详细描述中将是很明显的。然而，应理解，尽管指出了本发明的具体实施方案，但详细描述和具体实施例仅用于说明，因为基于这些详细描述，本发明精神和范围内的改变和修改对本领域技术人员来说将是很明显的。
附图简述
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图的一幅或多幅并结合本文所示具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1显示了含有多个不同细胞群体的样品的图示。不同的细胞群体表示为白色细胞、黑色细胞、条纹细胞和方格细胞。
图2展示了靶向四个不同细胞群体的四个珠子组(珠子组A(白色)、B(黑色)、C(方格)、和D(条纹))。当存在靶细胞时，在靶细胞与结合靶细胞的珠子之间形成复合体。一些珠子可能仍然是单个珠子或处于非特异性簇中。
图3展示了一个实施方案，其中细胞被一般性染色(例如核酸染色)(虚线细胞)，以帮助在不含细胞的非特异性珠子簇与包含细胞的特异性珠子复合体之间进行区分。
图4A和4B.图4A展示了成像室的视野，其中存在特异性簇(细胞+珠子)以及非特异性珠子簇和单个珠子。特异性簇在图4A中被圈出。图4B显示了使用每一簇的平均荧光强度(MFI)产生的分类图。图的每一区域是珠子组特异性的，并对应于靶细胞的表面标记。
图5A、5B和5C显示了流体处理系统的框图。
图6显示了成像装置的光学构造框图。
图7显示了成像系统的框图。
图8显示了成像系统的框图。
图9显示了成像系统的框图。
图10是图解成像系统侧视图的示意图。
图11显示了孵育1小时和5小时后靶珠子和阴性对照的捕获效率。
示例性实施方案的描述
本发明涉及用于标记、分离、检测和计数生物细胞或者样品中存在的其它目的生物分析物的方法，其中捕获剂也可作为标记试剂。可利用成像系统(例如本文描述的那些)和在标题为“Systems and methods forperforming measurements of one or more materials”(通过引用并入本文)的申请序列号11/757,841中描述的装置实施所述方法。本发明的方法和系统也可用于定性检测，其中不需要对靶细胞、细菌或孢子计数，而仅关注分析物的存在与否。
通过免疫磁性分离将目的靶生物细胞从样品混合物的其它组分中分离出来，其中与抗体偶联的磁性微球将结合细胞，所述抗体对目的细胞表面上的特定蛋白质具有特异性亲和力。该结合步骤产生了被装置磁场吸引的磁响应聚集体。将样品引入成像室中后，聚集体因磁场的存在而将停留在室中，而其余的样品将被洗掉。
对捕获磁性微球进行编码，例如用Chandler等(美国专利6,773,812和美国申请序列号11/335,139，均通过参考并入本文)描述的内部荧光染料，从而产生多组不同的(例如光谱上不同的)微球。捕获颗粒也可以是其它磁响应纳米颗粒、含有磁石的聚苯乙烯珠子、含有磁石的乳胶珠子，以及本领域技术人员已知的任何其它磁响应颗粒。捕获颗粒的大小例如可为例如10纳米至100微米。使用具有不同编码的磁性颗粒组可以产生可区分的聚集体，并对同一样品内的不同细胞或生物分析物进行多重检测。例如，如图1和2所示，可使用靶向不同细胞群体的珠子组捕获样品中多个不同的细胞群体。在靶细胞与结合所述靶细胞的珠子间形成复合体(参阅例如图2)。珠子的分类可用于鉴定所述靶细胞，对不同种类复合体的统计可用于计数不同的靶细胞(参阅例如图4A和4B)。令人惊奇的是，分辨率允许区分与同一细胞结合的许多单个珠子。例如，2、3或4种不同标记的珠子可用于标记单个细胞表面上的2、3或4种不同的抗原。这极大地提高了测定的多重性能力。而且，这使得进行常规方法所需的在分析前从样品中除去非预期细胞类型的耗时过程不再必需。磁场的去除允许对成像室进行彻底洗涤和再生。例如可通过将磁体从室中移开，或(如果磁体是电磁体)可通过关闭磁体而从室中撤除磁场。
为了从非特异性珠子簇(簇中没有捕获细胞)中区分目的细胞周围的珠子簇，可在所述方法中包括使用通用报告染料，所述染料对任何细胞膜(例如革兰氏染料)或细胞核(例如DAPI)进行染色(参阅例如图3)。在该实施方案中，检测过程将包括表征簇的平均荧光强度(MFI)的分类步骤以及保证细胞位于簇内的报告步骤。
磁性微球对靶生物分析物的特异性亲和力是由于与微球表面上偶联的活性部分(如抗体)所致。可使用的具有特异性亲和力的其它试剂包括适配体、核酸探针(如DNA或RNA)、蛋白质，或任何其它特异性结合目的靶分析物并且为本领域技术人员所知的天然的或合成的分子。
如果珠子以过高浓度加入样品和/或珠子与样品孵育的时间过长，那么与每个细胞结合的珠子的数量将变得太多，以至于不能区分每一单个的珠子。如果细胞要与两种或更多种不同标记的珠子结合，那么应该调整测定条件，例如降低珠子的浓度和/或减少孵育时间，直至可检测到个体珠子。另一方面，如果测定被设置成使得每一细胞类型仅结合一种珠子类型，那么特异性鉴定每个珠子的能力就不必要了，因为被捕获的簇可作为聚集体进行分析。因为这些捕获簇并不完全相同，而是由细胞(或细菌或孢子)周围不同数量的珠子组成，所以每种簇群体的MFI的CV可以相当大，并因此需要分类图中的一个宽区域。鉴定、成像和表征的对象不是细胞本身，而是由细胞周围的多个编码珠子组成的簇。可根据其荧光特征来鉴定所形成的簇。分类模式的两个实例是LuminexxMAP分类作图法(基于2种颜色和多个强度进行分类)和多颜色分类法(仅基于颜色进行分类)。利用Luminex xMAP分类作图法，用于在靶细胞周围形成簇的磁珠可以是Luminex MagPlex珠子。个体珠子使用不同比例的两种染料进行编码，并可利用已有的Luminex MagPlex对其进行分类。与一种类型的珠子形成的簇根据形成簇的珠子数仍然可以表达宽范围的荧光强度。例如，6个珠子形成的簇显示低荧光强度，而与10到15个珠子形成的簇可显示强得多的荧光。因此，仅由一种珠子类型形成的簇的可能荧光强度的范围将是非常大的。
可通过2维图来展示将簇分成2个荧光检测通道，其中每个轴代表一个检测通道。每一簇将在两个检测通道的每一通道中发荧光，并将具有确定的荧光强度。每一簇的可能强度范围将定义图中的区域。该方法的多重性能力在于能够定义图中的不同区域，每一区域代表不同的簇。
利用多颜色分类法，仅通过颜色(光谱特征)而不通过强度来区分珠子。多重性水平将由硬件可实现的检测通道数来限定。该方法将能够鉴定包含不同种类珠子的簇。每一种颜色(或检测通道)将代表一个维度。根据每一检测通道中的荧光(或没有荧光)来鉴定(表征)簇(或靶细胞)。在该方法中，由于多维(n＞3)表征图的缘故，无法将簇分成确定的二维区域(图)。仅根据其在每一通道中的响应(二元响应，如阳性或阴性，1或0等)对簇进行分类。
可改进并优化成像仪器的放大率，以用于检测不同大小的细胞、孢子或细菌：分析物越大，所需的放大率越小。检测靶标的限制因素是总光路的分辨率。因为珠子簇的大小通常至少为单个珠子的3倍，因此与设计成对个体珠子成像的系统相比，可降低成像系统的放大率。降低的放大率使得能够具有更大的视野、更大的测定样品，并因此具有更准确的计数结果。当不同标记的珠子靶向细胞上的多种分析物时，则优选设计用于对个体珠子成像的系统。
可从成像室的视野内簇的数量、装置中装载的样品总体积、视野面积与成像室总面积的比例和捕获效率来计算样品中细胞的浓度。一旦将簇装载到成像室中，它们将由于存在磁场而被捕获。对于特定应用，应该以这样的方式表征系统和方法，即装置对簇的捕获效率是已知的。此外，也应该以这样的方式全面表征成像室，即成像视野将代表室的总表面积的已知分数。图像处理算法使得能够计数视野内的簇，并将该数量与引入的样品体积相关联。基于样品体积和簇的统计数据来计算浓度。
装载到室中样品的总体积可通过例如使用精确的注射器泵将样品拉进样品环中并将其注射到主要驱动流体线路中来获得。这种双线路方法使得能够实时稀释样品以减缓进样，也降低样品的粘度并提高捕获效率。驱动流体处于能够稀释样品的缓冲液中。驱动流体可以是与洗涤缓冲液相同的缓冲液。通过将样品线路合并到主驱动流体线路中，驱动流体将有效地稀释样品并携带样品进入成像室。改变样品合并进主要驱动流体线路中的速度将产生不同的稀释因数。这使得能够有效装载不同体积的样品，尤其是小体积的样品。捕获效率代表了室内从装载到室内的细胞总数中被捕获的细胞的百分比。有若干因素影响捕获效率，包括：目的细胞表面上可用的受体(或标记)数；目的细胞周围磁珠的数量，这与可用的受体数有关；抗体对特定受体的亲和力以及孵育时间，试剂浓度等；磁场强度；室的大小和深度；样品的粘度；和样品流经室时的速度。有两个与捕获效率相关的独立目标：最大化和表征。
如本文所用，“捕获效率”定义为比值：检测到的细胞数/实际装载细胞数。使捕获效率最大化将能够使用更少的样品大小。这将降低用于定性测定(如检测环境样品中的炭疽孢子)的检出限，所述定性测定的目标是检测特定细胞、细菌或孢子的存在与否，而不是对样品内的浓度进行定量。通过迫使样品进入更小的成像室，提高了视野中存在目的分析物的可能性，并因此提高了检出限。影响捕获效率的其它因素包括用于形成簇的磁珠的大小。大的珠子将含有更多的磁体矿，但在向成像表面移动时也将承受更强的剪切力。更小的珠子将含有更少的磁体矿，然而更小的位阻将允许更多珠子围绕在细胞周围并且使这些珠子更有效地堆积。这会导致细胞周围有更多的磁体矿和更紧密的簇。
对于定量测定，输出的测量值将包括样品中细胞的浓度。在该情况下，捕获效率需要进行表征并且一致，以能够将检测到的细胞数量与样品中细胞的实际数量相关联。可如下表征并测定细胞的捕获效率：使用具有已知数量细胞的标准样品、将样品装载到成像室中并测定可检测到多少细胞。然后将检测的细胞数量与细胞的实际数量比较来计算捕获效率。基于“加入体积”的常规分析方法的另一方法包括制备样品的等分试样并在任何样品加工步骤之前向每一次级样品加入已知量的标准溶液。每一次级样品的测定结果将能够产生标准曲线，所述标准曲线的内在参数将包括捕获效率(以及在样品加工方案中或来自样品基质的任何其它变量)。从标准曲线外推至没有添加标准溶液的样品得到样品中的细胞浓度。对于细胞浓度太低以致于装载全部样品也不能捕获统计学显著的足够细胞的样品，这一方法特别有意义。通过加入已知量的细胞并产生标准曲线，该方法能够测定低于更为常规的方法所定义阈值的浓度。
成像室也对有效捕获生物靶标的能力有影响，并且可根据特定应用对其设计进行修改。对于总样品量少并且待捕获的生物靶标可能数量也少的应用，可通过使用具有尺寸尽可能小的成像室来提高捕获效率。小的室宽和室长意味着被捕获的生物靶标将分散在更小的成像表面，这将增加视野内细胞的密度。此外，小的室深度将使生物靶标承受的磁力梯度更小，并将保持样品总体上更接近磁体。生物靶标越接近磁体，磁场的吸引力就越强，并且捕获效率就会变得越高。因此，尺寸尽可能小的成像室将会是这样大小的室，其使得视野中生物靶标的密度尽可能大，并使室内样品受到磁场最强的吸引力，但其尺寸又不至于使得所捕获的生物靶标无法容纳在室内。例如，如果预计簇(例如细胞加珠子)直径大约是20nm，那么尺寸尽可能小的成像室将具有大约50到100nm的深度(其中深度指该室与磁体垂直的尺寸)。此外，该室的宽度将是至少约50nm。对于样品量非常大并且定性响应足够的应用，可将成像室设计成更大的尺寸，以在相同时间内处理更多的样品，而不需要提高样品引入的速度。例如，可使用具有约400nm×400nm的深度和宽度的成像室。
图像处理算法将视野的原始图像转化成许多生物靶标。视野中每一荧光目标将针对背景信号进行鉴定。然后可对每一目标在大小(像素宽数和像素长数)、圆度(定义为目标周长的平方除以(4×π×目标面积)所得的比值)、和/或其它认为必需的目的测定(直径、面积、半径等)方面进行表征。利用该方法，可从总数中排除随机大小和形状的非特异性荧光目标。所有剩余的目标均包括在生物靶标计数内。
一旦进行了最初的检测和计数过程，就可在计算样品中细胞最终浓度之前进行反复过程。这样，所计数的细胞数量可高于认为是统计学显著的某一阈值。因为可对大于30个细胞的样品量进行正态分布统计分析，所以经常使用30作为阈值下限。然而，也可使用其它阈值下限如35、40、45或50个细胞，以使图像处理和测定误差的影响降至最低。作为上限，阈值可由预定的生物靶标数量，如100、200、300、400、500或1000个细胞来定义。也可根据视野中存在的双联体的数量来定义阈值：随着视野中生物靶标的数量增加，两个生物靶标重叠的可能性增加，双联体会突然越来越多地出现。当双联体的群体不再与装载的样品量呈线性时，可定义达到了阈值上限。
当生物靶标数量低于阈值下限时，图像处理算法将需要装载额外的样品。然后所述算法将重新开始计数步骤。这种重复过程将进行至视野中生物靶标的数量达到预定的阈值下限，但不高于阈值上限。或者，可保存来自各次计数的数目(在计数之间进行成像室的彻底洗涤)，然后进行加和直至达到最小阈值。如果超过了阈值上限，那么可从成像室中撤除磁场，洗涤成像室(例如通过旁侧线路推进驱动/洗涤流体并经过室)，并将更少的样品等分试样装载到成像室中。最后的计数步骤将作为任何进一步计算细胞浓度的基础。
如果同时分析生物靶标的多个群体和/或亚群，则针对所用的每一检测通道和编码颗粒的每一群体重复前文段落中描述的计算。在每一计算中，生物靶标的捕获效率可以相同或不同。在任何情况下(例如在单独模式中)，都需要表征捕获效率，以使得能够计算样品中生物靶标的浓度。
A.成像系统
图5-10展示了可用于进行本文所述方法的多种装置。值得注意的是，该图并未按比例绘制。尤其是，放大了图中一些元件的比例以强调元件的特征。在多于一个图中显示的构造相似的元件用相同的附图标记来表示。还需要注意的是，对这些装置的描述仅是示例性的，并用于教导本领域技术人员进行本发明一般方式。根据该描述，其它修改和替代性实施方案对本领域技术人员将是很明显的。
图5A-C和6中展示的实施方案一般涉及设置成用于将一种或多种材料从一个或多个存储容器转移到测定装置的成像室中的系统。所述系统具有三个主要组件：流体处理、光学构造和颗粒固定亚系统。图5A-C显示了三种构造中流体处理亚系统的功能组件，而图6展示了光学亚系统的功能组件。
在图5A-C的流体处理亚系统中，样品从样品存储容器12转移到测定装置的成像空间10中。成像空间可设置成成像室10，其可具有本领域已知的任何合适的构造。存储容器12可设置成Vacutainer、离心管、注射器、微量滴定板或本领域已知的任何其它合适的样品容器。
所述系统还包括设置成用于将流体吸进存储容器中并稍后将流体从存储容器中排到室10的成像空间中的双向泵14。泵14可具有本领域已知的任何合适的构造。因为如本文进一步描述，在接触过程中珠子/生物靶标簇基本被固定，所以不需要如从昂贵的注射器泵获得的无脉动流。在泵14和样品阀18之间一定长度的管道16可形成足够的容器。该容器通常称为“样品环(sample loop)”。管道可具有任何合适的构造。进样阀18的功能是当从样品存储容器12中进行抽吸时将样品探头15与容器(样品环16)连接，而当分配时将容器与成像室10连接。进样阀18可包括本领域已知的任何合适的阀。
在存储容器(样品环16)的泵端使用泵阀20。在图5A中，泵阀20连接驱动溶液存储容器和洗涤溶液存储容器。如果期望驱动溶液和洗涤溶液的组成不同，就可使用该构造。然而，可使用同一溶液作为驱动溶液和洗涤溶液，在该情况下可使用一个存储溶液。图5B和5C显示了连接驱动/洗涤溶液存储容器的泵阀20。图5C显示了旁路线路17，其允许在引入一部分样品后洗涤成像室10，而不必使用存储剩余样品的样品环16。旁路线路因此使得能够在样品环16中连续装载来自同一样品的小的等分试样，以调节不同的样品浓度并扩展方法的动态范围。在没有旁路线路17的情况下，洗涤成像室10中然后装载额外的样品包括彻底冲洗样品环16，然后进一步从样品存储容器12中获得样品来重新装载样品环16--虽然该方法是有功能的，但其效率却更低并且与使用旁路线路相比会浪费更多的样品。泵阀20可包括本领域已知的任何合适的阀。在一些替代实施方案中，泵阀和洗涤阀可合并成一个阀。泵14也可设置成将成像室10内的一种或更多材料和任何其它流体转移到废物容器24。废物容器24可具有本领域已知的任何合适的构造。
在图5A-C中展示了操作流体处理亚系统以在成像室10中装载样品的三种初级模式，即，有样品洗涤的装载过程、无样品洗涤的装载过程和反复装载过程。在图5A所示的流体处理亚系统中，无样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18从位置1移到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室，以清洁室10。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1移到2。
5)使探头15下降进入样品存储容器12中。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀18并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向成像室10。
10)将样品从样品环16推进成像室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1移到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5A所示的流体处理亚系统中，具有样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
预装载洗涤溶液：
1)泵阀20到位置b。
2)装载洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)推动洗涤溶液经过室。
6)进样阀18，从位置1到2。
7)推动洗涤溶液经过探头15(用洗涤溶液预装载样品环16和探头15)。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)推动样品环16中的洗涤溶液在样品后经过捕获复合体，以“洗涤”所述捕获复合体。
12)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5A所示的流体处理亚系统中，反复装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
预装载洗涤溶液：
1)泵阀20到位置b。
2)装载洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)推动洗涤溶液经过室。
6)进样阀18，从位置1到2。
7)推动洗涤溶液经过探头15(用洗涤溶液预装载样品环16和探头15)。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)推动样品环16中的洗涤溶液在样品后经过捕获复合体，以“洗涤”所述捕获复合体。
12)对固定的捕获复合体照相。
13)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要装载额外的样品。如果需要装载额外的样品，那么重新启动步骤1的装载顺序。如果不需要额外的样品，那么继续进行“清洁系统”程序。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5B所示的流体处理亚系统中，没有样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1移到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室，以洗涤室10。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入样品存储容器12中。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀18并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5B所示的流体处理亚系统中，有样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)推动样品环16中的驱动/洗涤溶液在样品后经过捕获复合体，以“洗涤”所述捕获复合体。
12)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5B所示的流体处理亚系统中，反复装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)推动样品环16中的驱动/洗涤溶液在样品后经过捕获复合体，以“洗涤”所述捕获复合体。
12)对固定的捕获复合体照相。
13)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要装载额外的样品。如果需要装载额外的样品，那么重新启动步骤1的装载顺序。如果不需要额外的样品，那么继续进行“清洁系统”顺序。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5C所示的流体处理亚系统中，没有样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1移到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入样品存储容器12中。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀18并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5C所示的流体处理亚系统中，有样品洗涤的装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)泵阀20到位置a。
12)装载驱动/洗涤溶液。
13)泵阀20到位置b。
14)推动驱动/洗涤溶液通过旁路线路17并经过成像室10中的捕获复合体，来“洗涤”所述捕获复合体。
15)对固定的捕获复合体照相。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动溶液经过探头15，以清洁探头。
在图5C所示的流体处理亚系统中，反复装载过程一般如下进行：
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液经过室10，以清洁室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液经过探头15，以清洁探头。
装载样品：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到2。
5)使探头15下降进入孔12。
6)向样品环16中装载样品。
7)升高探头15，并拉至空气进入进样阀并且全部样品位于样品环16中。
8)进样阀18，从位置1到3。
9)将磁体262移向室10。
10)将样品从样品环16推进室10中，捕获磁性捕获剂和任何生物靶标以及与其结合的检测剂(捕获复合体)。
11)泵阀20到位置a。
12)装载驱动/洗涤溶液。
13)泵阀20到位置b。
14)推动驱动/洗涤溶液通过旁路线路17并经过成像室10中的捕获复合体，来“洗涤”所述捕获复合体。
15)对固定的捕获复合体照相。
16)使用图像分析算法处理图像并确定是否需要装载额外的样品。如果需要在室10中装载额外的样品，那么如果样品环16中仍然含有额外的样品则重新启动步骤10的装载顺序，如果首先需要将额外样品装载进样品环16中则启动步骤1。如果在室10不需要额外的样品，那么继续进行“清洁系统”顺序。
清洁系统：
1)泵阀20到位置a。
2)装载驱动/洗涤溶液。
3)泵阀20到位置c。
4)进样阀18，从位置1到3。
5)将磁体262从成像室10移开。
6)推动驱动/洗涤溶液通过室10来洗涤室。
7)进样阀18，从位置1到2。
8)推动驱动/洗涤溶液通过探头15来洗涤探头。
使用其中“洗涤”样品的第二和第三个装载程序的优点是从样品周围溶液中去除未被磁场固定的组分。为了加工的便利，一些测定不进行洗涤步骤。
在图6中宽泛地展示了光学亚系统8。亚系统8包括定位在成像室10光学装置对侧的磁性元件262。磁性元件262可包括本领域已知的任何合适的磁性元件，如可用于产生合适磁场的永磁体或电磁体。这样，使用室一侧的磁性元件262产生的磁场可以将结合磁性颗粒的生物靶标基本上固定在成像室10中。尽管在图6中显示磁性元件262靠近成像室10，但磁性元件也可与成像室10偶联、整合到成像室10中或者与成像室分开。此外，尽管图6显示了定位靠近成像室的一个磁性元件，但应理解，所述系统可包括多于一个磁性元件。
通过测定装置获得信号后，可撤除磁场(例如通过使用螺线管撤除永久磁体或通过开关打开和关闭电磁体)，于是生物靶标和磁珠可离开成像室10。
最简单的成像室10设计是这样的成像室，其在靠近磁性元件的成像室一侧具有相对平滑的内表面，使得珠子由于磁体262将其拉向表面而随机分布在该内表面上。然而，也可将成像室10设计成在施加磁场时“把持”捕获复合体，特别是点，如本文更详细所述。
随着捕获复合体固定到室10中，操纵照明模块(LED 44、46)以激发编码磁珠，其在该实施方案中固有地用荧光团标记。成像传感器72(CCD)捕获图像，并加工图像(参阅例如Roth在2006年9月21日提交的命名为“Methods and Systems for Image Data Processing”美国专利申请序列号11/534,166，本文引入作为参考)。磁体262释放样品，洗涤装置。
可根据本发明调整成像传感器72相对于LED 44、46、室10和磁体262的位置，用于对生物靶标成像。在该实施方案中，珠子具有不同的特征，即不同的波长和固有荧光染料强度，其无偏好方向地(在所有角度上均一地)吸收并再发射光子。选择LED 44、46照明和影像传感器(CCD 72)的位置，以优化影像传感器(CCD 72)的视野(FOV)中结合生物靶标的任何珠子的“角度空间”。因为磁体262位于室10的背侧，可用于照明和成像系统的角度空间是磁体上方的半球体。照明光学件(LED 44、46)在该照明角度空间上的覆盖范围越广，成像过程中传递给珠子的能量就越大。类似地，照明角度空间中采集角度(数值孔径)越大，成像透镜52(图6)可采集并向成像传感器72(CCD检测器)传送的通量就越大。必须在分配给成像传感器和照明系统的角度之间做出平衡。
对于低成本可制造性，成像透镜52数值孔径的实际限制对于4的放大率来说是0.3左右。对于更高的放大率，成像透镜52数值孔径可以增大，而维持相同的成本指导方针。影响透镜52成本的其它因素是视野和波段宽度。0.3的数值孔径大概是35度的全角。
对于照明模块(例如LED 44、46)的位置，限制因素可能是LED的亮度以及激发滤光片47的成本。LED的集光率将决定需要多大的检测剂角度空间以在视野(FOV)中提供最大LED通量。(集光率是源的面积乘以源的立体角：其定义了发射通量的几何学特征)。如果FOV相对大，所需的角度空间将更低，并因此可使用更多的LED。
图7中显示了本发明这种系统的另一实施方案。在该实施方案中，样品从存储容器12中转移到成像室10中。所述系统还包括单个双向泵14，其被设置成将流体引入存储容器，并稍后将流体从存储容器排到成像空间中。泵14可具有本领域已知的任何合适的构造。因为如本文进一步描述，捕获复合体在接触时间内基本上固定，所以本文描述的系统实施方案不需要例如从昂贵注射器泵获得的无脉动流。泵14与进样阀18之间的一定长度的管道16可形成足够的容器。该容器通常称为“样品环”。在存储容器的泵端使用洗涤阀20，以允许新鲜的水(或其它合适的试剂)从存储容器22中流进成像室。洗涤阀20可包括本领域已知的任何合适的阀。应注意，样品阀和洗涤阀可组合成单个阀(未显示)。也可将泵14设置成将成像空间10中的一种或更多材料和任何其它流体转移到废物容器24中。废物容器24可具有本领域已知的任何合适的构造。
在图8中显示了设置成将一种或更多材料从一个或多个存储容器转移到测定设备成像室中的另一系统实施方案。在该构造中，所述系统包括设置成将液体从样品容器12直接引入成像室10，然后引入废物容器24中的泵26。泵26可包括本领域已知的任何合适的泵，如振动泵。可如上所述设置成像室10、样品容器12和废物容器24。样品容器12与洗涤流体容器22之间任选的阀28可设置成根据样品是否要转移到成像空间或洗涤流体是否要转移到成像空间(例如如果要进行洗涤功能)而改变位置。阀28可包括本领域已知的任何合适的阀。此外，可如上所述构造存储容器22。图8所示实施方案与图7中所示实施方案的区别在于前者不包括临时容器，包括的阀少一个，并利用设置成仅在一个方向移动流体的泵。
图9中显示了设置成将一种或更多材料从一个或多个存储容器转移到测定装置成像空间中的额外的系统实施方案。该实施方案具有与图8所示实施方案构造类似的构造，只是图8所示实施方案的进样阀/洗涤阀被替换成两个阀30和32。阀30和32可包括本领域已知的任何合适的阀。例如，阀30和32可包括设置成分别和同时允许流体分别从存储容器12和22转移到成像空间10的开/关型阀。可如本文描述构造存储容器12和22以及成像空间10。
以这种方式提供单独的洗涤和进样途径(即，一条途径是从存储容器12到成像空间10，另一条单独的途径是从存储容器22到成像空间10)，以使得能够实现图8所示实施方案的所有方面，并增加随着样品转移到成像空间10中而将洗涤流体和/或一种或更多试剂与待测样品混合的能力。可以随着样品转移到成像空间中而将洗涤和/或一种或更多试剂与样品混合，以稀释样品，使得捕获复合体在成像空间内分得更开(例如在成像室表面上分得更开)。
图10展示了设置成在测定装置的成像空间中对一种或多种材料进行成像的系统的一个实施方案。该系统实施方案包括检测器34、36和38。检测器34、36和38可以是CCD照相机或本领域已知的任何其它合适的成像设备。每一检测器可具有相同的构造或不同的构造。可将每一检测器设置成检测不同波长或波段的光(例如由成像室10所限定的成像空间中的捕获复合体40发出的荧光)。此外，可将每一检测器设置成在成像室10中产生捕获复合体40的图像或“捕获荧光图像”。
系统还包括设置成发射具有不同波长或不同波段的光的光源44和46(例如一个光源可设置成发射红光，另一个光源设置成发射绿光)。光源44和46发射的光可包括例如可见波长谱的任何部分中的光。光源44和46可包括LED或本领域已知的任何其它合适的光源。光源44和46排列在成像室10周围上方。此外，光源排列在成像室上方，以便每一光源以不同方向指引光到达成像室10中的捕获复合体40上。
系统还包括分别与光源44和46偶联的滤光片48和50。滤光片48和50可以是带通滤光片或本领域已知的任何其它合适的滤光片。这样，系统可利用光源44和46以及滤光片48和50，依次以不同波长或不同波段的光来照亮捕获复合体。
系统还包括定位在照明“环”中央(或大致中央)的透镜52。透镜52可包括本领域已知的任何合适的折射光学元件。透镜52设置成将捕获复合体散射的光和/或发出的荧光通过一个或多个光学元件成像到一个或多个单色CCD检测器(例如检测器34、36和38)上，所述光学元件可包括一个或多个二色性滤光片以及一个或多个光学带通滤光片。例如，从透镜52发出的光指向二色性滤光片54，其可包括本领域已知的任何合适二色性光学元件。二色性滤光片54设置成反射一个波长或波段的光，并透射其它波长或波段的光。被二色性滤光片54反射的光指向滤光片56，其可以是带通滤光片或其它合适的滤光片。从滤光片56发出的光指向检测器34。
透镜52透射的光也可指向二色性滤光片58，其可包括本领域已知的任何合适的二色性光学元件。二色性滤光片58可设置成反射一个波长或波段的光，而透射其它波长或波段的光。二色性滤光片58透射的光指向滤光片60，其可以是带通滤光片或其它合适的滤光片。从滤光片60发出的光指向检测器36。二色性滤光片58反射的光指向滤光片62，其可以是带通滤光片或其它合适的滤光片。从滤光片62发出的光指向检测器38。此外，尽管图10所示的系统包括两个光源，但应理解，所述系统可包括任何合适数量的光源。另外，尽管图10所示的系统包括设置成在不同波长或波段对从捕获复合体散射的光或发出的荧光进行成像的三个检测器，但应理解，所述系统可包括两个或更多个检测器。例如，所述系统可包括两个或更多个CCD检测器(和任选地固定滤光片)，其可用于同时测定分类通道和报告通道，由此为测定提供更高的通量。
因此，图10中所示的系统设置成产生代表捕获复合体40在若干目的波长下的荧光发射的多个或一系列图像。此外，所述系统可设置成向处理器(即，处理引擎)提供代表捕获复合体荧光发射的多个或一系列数字图像。所述系统可包括或不包括处理器(未显示)。所述处理器可设置成从检测器34、36和38获得(例如接收)图像数据。例如，所述处理器可与检测器34、36和38以本领域已知的任何合适方式偶联(例如通过传输介质(未显示)，每一介质将检测器之一与处理器偶联，通过一个或多个电子元件(未显示)，如模拟数字转换器等，每一转换器将检测器之一与处理器偶联)。
处理器可设置成处理并分析这些图像，例如用于分类并计数所捕获的生物靶标。处理器可以以任何合适形式输出该信息，如具有获得每一捕获复合体每一波长荧光强度之条目的数据阵列。特别地，所述处理器可设置成实施处理并分析图像之方法的一个或多个步骤。用于处理并分析图10系统所产生图像的方法的实例描述于例如2006年9月21日Roth提交的命名为“Methods and Systems for Image Data Processing”的美国专利申请序列号11/534,166(通过参考并入本文)。可进一步如本专利申请中描述构造本文描述的系统。此外，本文描述的方法可包括本专利申请中描述的任何方法的任何步骤。
例如，在一个实施方案中，处理器可设置成对图像进行分析，以检测并计数通过结合编码磁珠而被标记并固定在室表面上的生物靶标(例如细胞)，并确定在室表面上是否固定了统计学显著数量的标记生物靶标。所述处理器设置成如果在室表面上没有固定统计学显著数量的标记生物靶标，其随后会提示向室内添加更多的样品。所述处理器重复进行检测、计数、测定和样品添加过程，直至在室表面上固定了统计学显著数量的标记生物靶标。该处理器然后继续进一步处理并分析图像。如上所述，所述处理器设置成如果在室表面上没有固定统计学显著数量的标记生物靶标，其随后会提示向室内添加更多的样品。所述处理器可通过提示(如通过听觉或视觉信号)使用者手动注射或操作泵向室内递送额外的样品来提示添加更多的样品。或者，泵可处于处理器的控制之下，使得该泵接受处理器的信号而运行，以向室内递送额外的样品。
处理器可以是典型个人电脑、大型计算机系统、工作站等中通常包括的那些处理器。一般地，可广泛地定义术语“计算机系统”，以包括具有一个或多个处理器的任何设备，所述处理器执行来自存储介质的指令。处理器可由任何其它适当的功能硬件来执行。例如，处理器可包括在固件中具有固定程序的数字信号处理器(DSP)、可现场编程门阵列(FPGA)或者使用高级编程语言(如极高速集成电路(VHSIC)硬件描述语言(VHDL))“编写”的顺序逻辑的其它可编辑逻辑设备(PLD)。在另一实例中，可在高级语言如C#(适当时C++)、ActiveX controls，JavaBeans，Microsoft Foundation Classes(“MFC”)，或需要时其它技术或方法中来编写可在处理器上执行以实施上述专利申请中所述计算机执行方法的一个或多个步骤的编程指令(未显示)。程序指令可以任何不同方式实施，包括基于程序的技术、基于组件的技术，和/或面向对象的技术等。
实施上述专利申请中所述方法的程序指令可包含在计算机可读介质(如只读存储器、随机存取存储器、磁盘或光盘或磁带)中。
B.抗体
用于制备和表征抗体的方法为本领域所熟知。简言之，通过用包含目的多肽的免疫原免疫动物并从该免疫动物中收集抗血清来制备多克隆抗体。许多动物种类可用于制备抗血清。通常，用于制备抗血清的动物是非人动物，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪或马。由于兔的血量相对大，因此兔成为用于制备多克隆抗体的优选选择。
可使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强特定免疫原组合物的免疫原性。示例性佐剂包括完全弗氏佐剂(免疫应答的非特异性刺激物，含有已灭活结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于制备多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质和用于免疫的动物而不同。多种途径可用于施用免疫原(皮下、肌内、真皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫后多个点上对免疫动物采血来监测多克隆抗体的产生。也可以给予第二次加强剂注射。重复加强和滴定的过程，直至达到合适的效价。当获得期望水平的免疫原性时，可对免疫动物放血，分离并存储血清，和/或动物可用于产生mAb。
可通过众所周知的技术，如美国专利4,196,265(通过参考并入本文)中示例的那些来容易地制备mAb。通常，该技术涉及用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。以有效刺激抗体产生细胞的方式施用免疫组合物。啮齿类动物如小鼠和大鼠通常用于单克隆抗体的制备。
免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，尤其是B淋巴细胞(B细胞)用于mAb产生方案中。可从活检的脾、扁桃体或淋巴结或外周血样品中获得这些细胞。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为它们是抗体产生细胞(分裂的浆母细胞阶段)的丰富来源，后者是因为外周血容易得到。经常地，免疫一组动物，取出具有最大抗体效价的动物的脾，并通过注射器将脾匀浆而获得脾淋巴细胞。通常，来自免疫小鼠的脾含有大约5×107到2×108个淋巴细胞。
接着，将来自免疫动物的抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(通常是与免疫动物相同物种的骨髓瘤细胞)融合。适用于产生杂交瘤的融合方法中的骨髓瘤细胞系优选不产生抗体，具有高融合效率，以及酶缺陷，这使得它们不能够在仅支持期望融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择性培养基上生长。
用于产生抗体产生脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法一般包括以2∶1的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，尽管所述比例在存在促进细胞膜融合的试剂(化学试剂或电试剂)的情况下可以分别为约20∶1至约1∶1不等。融合方法一般以低频率产生有活力的杂交体。然而，这并不成为一个问题，因为可通过在选择性培养基中培养而将有活力的融合杂交体从亲本未融合细胞(特别是将正常连续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)中区分出来。选择性培养基一般是在组织培养基中含有阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性试剂是氨基喋呤、氨甲喋呤和偶氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。使用氨基喋呤或氨甲喋呤时，向培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源(HAT培养基)。使用偶氮丝氨酸时，向培养基中补充次黄嘌呤。
这种培养提供了从中选择特异性杂交瘤的杂交瘤群体。通常，通过在微量滴定板中单克隆稀释培养细胞，然后通过检测各克隆上清液(约两周到三周后)的期望反应性来进行杂交瘤的选择。测定应该灵敏、简单并快速，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。
然后连续稀释所选的杂交瘤并将其克隆成个体抗体产生细胞系，所述克隆然后可以无限繁殖以提供mAb。可以两种基本方式将细胞系用于mAb制备。杂交瘤样品可注射(经常注射到腹膜腔内)到提供体细胞和骨髓瘤细胞进行最初融合的类型的组织相容性动物中。注射后的动物产生肿瘤，其分泌由融合的细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体。然后获得动物的体液(如血清或腹水)，以提供高浓度的mAb。也可在体外培养个体细胞系，其中mAb天然分泌到培养基中，从所述培养基中可容易地获得高浓度的mAb。需要时，可使用过滤、离心和多种色谱方法(如HPLC或亲和色谱)进一步纯化通过任一手段产生的mAb。
C.适配体
适配体是通过多轮选择而设计成与不同分子靶标(如小分子、蛋白质、核酸，甚至是细胞、组织和器官)结合的核酸序列。适配体提供与抗体相当的分子识别特性。此外，适配体提供优于抗体的优点，因为它们可以完全在体外进行设计，并可以容易地通过化学合成产生，还具有理想的存储特性。通常通过SELEX(Systematic Evolution of Ligandsby Exponential Enrichment)方法及其变体产生适配体。SELEX方法描述于例如在美国专利号5,270,163和5,475,096(均通过参考并入本文)。
D.免疫磁性分离
免疫磁性分离(IMS)是用于从其基质中分离生物细胞的技术。该技术使用具有选择性附着靶细胞的抗体的磁性微球。然后通过磁场从样品基质中选择性地移出微球与细胞形成的复合体。IMS可用于除去样品中的特定细胞类型，或从样品中选择特定细胞类型。该方法也可用于浓缩含有靶细胞类型的样品。例如，利用常规测定从感染了HIV的患者的外周血中计数CD4T细胞时，需要从血样中除去也在其表面上携带CD4蛋白并且将错误地增加CD4T淋巴细胞数的单核细胞群。通过使用与单核细胞特异性抗CD14抗体偶联的磁珠进行选择性分离来实现单核细胞的除去。IMS应用的另一实例是从进行自体骨髓移植的患者的骨髓中去除肿瘤细胞。Olsvik Orjan等在“Magnetic separationtechniques in diagnostic microbiology”，Clinical Microbiology reviews，1994年1月，43-54页中描述了IMS的其它实例。
Figure BPA00001190303300381
是用于包括细胞分离(正分离或负分离)、细胞扩增、蛋白质样品制备、蛋白质分离等广泛应用的超顺磁性颗粒成熟产品线。
Figure BPA00001190303300382
可用于直接方法或间接方法。在直接方法中，靶细胞将通过与珠子偶联的特异性抗体直接附着到珠子上。在间接方法中，细胞首先与靶标特异性的游离一抗形成复合体。然后，使用与靶向一抗的二抗偶联的珠子捕获所述复合体。间接方法的优点是：首先，通过利用小抗体使得能够更好地结合一抗，并避免了由于珠子的大小带来的位阻；其次，通过使用具有高亲和常数的复合体(如生物素-亲和素)补偿因磁珠的大小引起位阻的缺点，以在二抗和一抗之间形成结合。间接方法的不便是需要两次孵育，而不是直接方法的一次孵育。而且，因为二抗对靶细胞(例如CD4)并不特异，而是对一抗的物种(小鼠、山羊等)特异，所以所述方法不适合于多重检测方案。
Dynalbeads使得能够对细胞进行正分离，其中靶细胞首先被磁珠捕获，然后通过特异性试剂被释放。该方法导致细胞被分离，而同时维持其完整性并使其适合于进一步的下游应用。其它类型的分离包括负分离或排除，其中通过去除部分或所有其它细胞类型来纯化靶细胞。Dynalbeads的应用包括分离人细胞亚群，如B淋巴细胞、上皮细胞、粒细胞、造血祖细胞、Langherhans细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞(包括CD3、CD4和CD8T细胞)。Dynal：“Cell separationand protein purification”Dynal Technical Handbook；第2版，1996。然而，
Figure BPA00001190303300391
不用于鉴定它们附着的细胞。因此Dynal技术没有多重性能力。
E.编码的磁性颗粒
尽管本文针对编码微球(即珠子)描述了一些实施方案，但应理解，照明子系统、系统和方法也可与其它编码磁性颗粒一起使用。颗粒优选为超顺磁的。编码微球、珠子和颗粒的的实例描述于Fulton的美国专利号5,736,330，Chandler等的5,981,180，Fulton的6,057,107，Chandler等的6,268,222，Chandler等的6,449,562，Chandler等的6,514,295，Chandler等的6,524,793，和Chandler的6,528,165(通过参考并入本文)。可通过激光、二极管、弧光灯、热、放射性发射、化学发光、电发光、化学电发光或本领域技术人员已知的任何其它方法完成对编码颗粒内或表面上染料或荧光染料的激发。
在一些实施方案中，本发明与
Figure BPA00001190303300392
和MagPlexTM技术结合使用。Luminex xMAP技术允许检测固定在荧光编码的微球上的核酸产物。通过用两种光谱不同的荧光染料的各10种不同强度染色微球，产生了荧光有差异的100个微球群体。数字信号处理技术允许将信号转换成实时定量数据。Luminex技术描述于例如美国专利5,736,330、5,981,180和6,057,107，其全部通过参考明确并入本文。
Figure BPA00001190303300393
MagPlexTM微球是使用上文讨论的
Figure BPA00001190303300394
技术荧光编码的超顺磁微球。该微球含有用于共价附着生物分子的表面羧基。
F.试剂盒
本文描述的任何组合物均可包含在试剂盒中。试剂盒可包含适当分装的偶联抗体(或其它捕获剂)的编码磁珠，可用于分离、分开或检测靶细胞或细胞群体。试剂盒的组分可包装在水介质中或者低压冻干的形式。试剂盒还可包括一种或更多缓冲液，如杂交缓冲液或洗涤缓冲液。试剂盒的容器装置一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，可向其中放置(并优选适当分装的)组分。当试剂盒中具有多于一种组分时，所述试剂盒一般还包含第二、第三个或其它额外的容器，向其中可单独放置额外的组分。然而，小瓶中也可包含组分的多种组合。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳与抗体(例如其它捕获剂)偶联的编码磁珠的装置，以及紧凑包装以用于商业出售的任何其它试剂容器。此类容器可包括厚纸板或者注塑或吹塑的塑性容器，其中放置期望的小瓶、瓶子等。
当以一种或更多液体溶液提供试剂盒的组分时，所述液体溶液可以是水溶液，特别优选无菌水溶液。
然而，试剂盒的一些组分可以干粉提供。当试剂和/或组分以干粉提供时，所述粉末可通过加入合适的溶剂来重建。还考虑到可在另一容器工具中提供溶剂。
试剂盒还可包括使用试剂盒组分的说明书。说明书可包括可实施的变化。
G.实施例
包括以下实施例来展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明实践中功能良好的技术，并因此可认为构成了其优选实施模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在所公开的特定实施方案中可进行许多改变，并仍然获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
对CD4和CD8淋巴细胞的进行计数
在本实施例中，首先使用抗CD14抗体从全血样品中除去其单核细胞群体。然后使用两组Luminex MagPlex磁珠，在仪器的成像室中对CD4细胞和CD8细胞进行免疫磁性分离，并与样品的其余部分分离。随后对簇的检测和分析使得能够对捕获的细胞进行表征和计数。
收集全血样品并储存在含有2mM EDTA作为抗凝血剂的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)中。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，用抗CD4抗体包被Luminex MagPlex珠子(组1)。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，用抗CD8抗体包被Luminex MagPlex珠子(组2)。
使用标准免疫磁性分离技术和抗CD14抗体从血样中除去单核细胞。将20μL样品移入1.5mL离心管中。来自组1的500,000MagPlex珠子当量(对CD4细胞特异)直接加入样品中。来自组2的500,000个MagPlex珠子当量(对CD8细胞特异)直接加入样品中。加入核酸染料对细胞染色。使用移液器进行一定程度的混合。将样品孵育20分钟，而没有进一步的混合步骤。
使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释样品，并转移至成像装置的注射器中。将样品的等分试样注射到成像室内。一开始引入样品就打开装置的磁场。连续观察样品并引入新的样品等分试样，这使得能够判断是继续装载更多的样品等分试样还是结束该步骤。一旦装载步骤完成，就使用图像处理算法分析视野内的单个珠子和珠子簇。根据其形状、大小和荧光强度鉴别单个珠子。单个珠子是所用捕获剂过量及其与靶细胞的偶联效率的特征。珠子相比于细胞数量是过量的，这保证实际上一个珠子不会同时结合多个细胞。
通过其荧光信号鉴定珠子和有核细胞。分辨率使得能够对每个细胞和结合细胞的所有珠子逐一进行鉴定。然而一些情况下，结合单个细胞的珠子数量可能太大，以至于仅能观察到珠子簇。这在每一细胞类型仅结合一种珠子类型的研究中不是问题，因为可根据其大小和形状鉴定珠子簇。目的簇具有15到24微米的大小，接近1的圆度，并显示分类图中区域1或2中的中值荧光强度。这些簇包括在对其靶细胞的计数中。其它非特异性珠子聚集体(如双联体、三联体或非特异性多联体)显示随机的大小、形状和中值荧光强度。这些非特异性聚集体将从任何细胞计数中舍去。
实施例2
脓毒症患者中病原体的计数和分类
在本实施例中，收集来自疑似脓毒症患者的全血样品。使用与细菌种类特异性捕获抗体偶联的一系列Luminex MagPlex珠子，在仪器的成像室中分离血液中存在的细菌细胞，并与其余样品分离。鉴定并计数捕获的细胞。
收集全血样品并储存在含有2mM EDTA作为抗凝血剂的BDVacutainer(BD Biosciences#366452)中。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，利用针对以下细菌的抗体包被LuminexMagPlex珠子组1-8：大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、脑膜炎萘瑟氏菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、绿脓假单胞菌和酿脓链球菌。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，利用抗CD61抗体(血小板细胞表面标记)包被Luminex MagPlex珠子(组9)。
使用标准免疫磁性分离技术和抗CD14抗体从血样中除去单核细胞。将50μL样品吸入1.5mL离心管中。来自每一组的100,000个MagPlex珠子当量直接加入样品中。样品在温和混合(颠倒)下孵育20分钟。使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释样品，并转移至读数原型的注射器中。将样品的等分试样注射到成像室中。开始引入样品时就施加装置的磁场。在视野中的细胞密度和分离方面优化样品装载量。应用样品后，使洗涤流体流过样品环并流经固定样品以除去碎片。一旦装载步骤完成，使用图像处理算法分析视野内的单个珠子和珠子簇。将细菌细胞的鉴定和计数与血小板计数进行比较，以确定细菌负荷。
实施例3
在不除去单核细胞的情况下对CD4和CD8淋巴细胞进行计数
在本实施例中，在不事先除去单核细胞群体的情况下分析全血样品中的CD4和CD8淋巴细胞。收集全血样品并储存在含有2mM EDTA作为抗凝血剂的BD Vacutainer(BD Biosciences#366452)中。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，用抗CD4抗体包被Luminex MagPlex珠子(组1)。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，用抗CD8抗体包被Luminex MagPlex珠子(组2)。根据生产商的说明书，使用两步式碳二亚胺偶联方案，用抗CD14抗体包被Luminex MagPlex珠子(组3)。
将20μL样品吸入1.5mL离心管中。来自组1(对CD4细胞特异)、组2(对CD8细胞特异)和组3(对CD14细胞特异)的500,000个MagPlex珠子当量直接加入样品中。使用移液器进行一定程度的混合。将样品孵育20分钟而不进一步混合。
使用1mL PBS/BSA溶液(预包装的PBS/BSA：Sigma P3688)稀释样品，并转移到成像装置的注射器中。将样品的等分试样注射到成像室内。一开始引入样品就打开装置的磁场。连续观察样品并引入新的样品等分试样，使得能够判断是继续装载更多的样品等分试样还是结束该步骤。一旦装载步骤完成，使用图像处理算法分析视野内的单个珠子和珠子簇。根据其形状、大小和荧光强度鉴别单个珠子。相应地，通过其与组1和2的结合鉴别CD4和CD8淋巴细胞。因为单核细胞也可以结合珠子组3(对CD14特异)，所以同样表达CD4的单核细胞可以与CD4淋巴细胞区分开来。
实施例4
捕获特异性、效率和多重性能力
进行了模拟细胞捕获，其中与一个Luminex MagPlex珠子区域偶联的抗体是捕获剂，第二珠子区域是靶标实体。通过使用磁珠而非细胞作为靶标实体，“未捕获”靶标(定义为未结合捕获珠子的靶标珠子)也可以被分离并鉴定，可用于测定捕获效率。使用对照评估捕获的特异性，在所述对照中靶标实体是与无关蛋白和无关靶标牛血清白蛋白(BSA)偶联的磁珠。
将捕获珠子和靶标珠子在4℃温和旋转下一起孵育。对于每一测定，在孵育一小时后分析一份等分试样，并在孵育5小时后分析另一份等分试样。利用Nikon 2000荧光显微镜分析样品，其中使用底部白光照明和荧光激发的组合。在图像分析过程中，珠子分类如下：
附着多至4个捕获珠子的单个靶标归类为“捕获靶标”。
不附着任何珠子的单个靶标归类为“未捕获靶标”。
与多个捕获珠子聚簇的单个或多个靶标被认为是“未分开的聚集体”。
捕获效率定义为“捕获靶标”除以“未捕获和捕获靶标”的总数。捕获效率不考虑形成未分开聚集体的靶标珠子，而仅考虑可单独鉴定并计数的那些靶标珠子。该实验的结果显示，在孵育1小时后的捕获效率是54％，在孵育5小时后的捕获效率是74％(图11)。
通过比较阳性模拟实验与阴性对照实验来证明捕获特异性。在孵育1小时后，在模拟模型中捕获了多于50％的靶标珠子，但在阴性对照中仅捕获了它们的6％。孵育5小时后，观察到了相似的特异性(图11)。
为了实现多重性潜力，测定条件需要使得最佳数量的珠子结合在靶细胞周围。细胞周围的微球不够(每个细胞少于1个微球)会导致许多细胞不被捕获，并且不被计算在内。尽管这在仅试图确定样品中特定种类细胞、细菌或孢子存在(“是”或“否”的测定)的诊断性测定中是可接受的，但低捕获效率将不适合于需要对靶细胞进行完全统计的应用。另一方面，细胞周围的微球过多将在靶细胞周围形成大的珠子簇，或形成多个细胞和珠子构成的大聚集体。这会使对单个珠子的解码变得复杂得多，并会降低方法的多重性能力。因此，对于多重应用，靶细胞周围微球的最佳数量是使得可以对每一微球单独进行分析和分类。
进行了对簇组成(包括至少一个靶实体)的分析。通过靶实体周围捕获珠子的数目“n”来鉴定簇。仅显示了阳性测定的结果(表1)。
表1.
  孵育1小时   孵育5小时
  n＝0   2％   3％
  n＝1   79％   44％
  n＝2   16％   24％
  n＝3   1％   9％
n＝4 0％ 3％
  未分开的聚集体   2％   16％
随着孵育时间增加，簇的大小也增加。孵育一小时后，79％的捕获靶实体仅与一个捕获珠子接触，16％与两个捕获珠子接触。孵育5小时后，小簇的比例降低，而更大的簇(靶实体周围3和4个捕获珠子)开始更为多见。
根据本公开内容，可以制备和实施本文公开并要求保护的所有组合物和方法而无需过度实验。尽管在优选实施方案方面已经描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，可对组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤序列中进行更改，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地，本文所述试剂显然可替换成某些化学和生理相关的试剂，而仍将达到相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这些相似的替换和修饰均认为在如所附权利要求定义的本发明精神、范围和概念之中。
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以下参考文献明确地通过参考并入本文，其程度为提供补充本文阐释内容的示例性方法和其它详细内容。
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Claims (33)

1.用于固定和检测样品中的细胞的方法，其包括：
(a)获得第一捕获复合体，其包含与抗体偶联的编码磁珠，所述抗体对可能存在于样品中的第一细胞上的特定表位具有特异性亲和力；
(b)使所述样品与所述捕获复合体接触；
(c)将样品的等分试样引入室中；
(d)向所述室施加磁场，以将所述捕获复合体吸到该室的表面；和
(e)检测通过与所述捕获复合体结合而固定在所述室表面上的细胞。
2.权利要求1的方法，其还包括对固定在室表面上的细胞进行计数。
3.权利要求2的方法，其还包括确定是否有统计学显著数量的细胞被固定在所述室表面上，并将样品的另外一个或多个等分试样引入室内，直至有统计学显著数量的细胞被固定到该室表面上。
4.权利要求3的方法，其还包括测定样品中细胞的浓度。
5.权利要求1的方法，其中所述样品是体液。
6.权利要求1的方法，其中所述样品是环境样品。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞是淋巴细胞、白细胞或单核细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞是细菌细胞、孢子或真菌细胞。
9.权利要求1的方法，其中在将样品引入室中之前使所述样品与捕获复合体接触。
10.权利要求1的方法，其中在将样品引入室中之后使所述样品与捕获复合体接触。
11.权利要求1的方法，其中所述编码磁珠以一种或多种荧光染料进行编码。
12.权利要求1的方法，其还包括使样品与包含与抗体偶联的编码磁珠的第二捕获复合体接触，其中所述第二捕获复合体中的编码磁珠与第一捕获复合体中的编码磁珠在光谱上不同，并且其中所述第二捕获复合体中的抗体对不同于第一细胞的第二细胞上的特定表位具有特异性亲和力。
13.权利要求1的方法，其还包括使样品与包含与抗体偶联的编码磁珠的第二捕获复合体接触，其中所述第二捕获复合体中的编码磁珠与第一捕获复合体中的编码磁珠在光谱上不同，并且其中所述第二捕获复合体中的抗体对第一细胞上的第二表位具有特异性亲和力。
14.权利要求1的方法，其还包括用对细胞膜染色的通用报告染料或对细胞核染色的通用报告染料对细胞进行染色。
15.权利要求14的方法，其中对细胞的检测包括获得分类图像以检测来自编码磁珠的信号，并获得报告图像以检测来自染色细胞的通用报告染料的信号。
16.用于固定和检测样品中的一个或多个细胞群的方法，其包括：
(a)获得第一捕获复合体，其包含第一编码磁珠以及对可能存在于样品中的第一细胞群上的特定表位具有特异性亲和力的第一抗体；
(b)获得第二捕获复合体，其包含第二编码磁珠以及对可能存在于样品中的第二细胞群上的特定表位具有特异性亲和力的第二抗体；
(c)使所述样品与第一捕获复合体和第二捕获复合体接触；
(d)将样品的等分试样引入室中；
(e)向所述室施加磁场，以将第一捕获复合体和第二捕获复合体吸到该室的表面上；和
(f)检测通过与第一捕获复合体结合而固定在室表面上的第一细胞群以及通过与第二捕获复合体结合而固定在室表面上的第二细胞群。
17.权利要求16的方法，其还包括对第一和第二细胞群进行计数。
18.权利要求17的方法，其还包括确定是否有统计学显著数量的第一和第二细胞群被固定在所述室表面上，并将样品的另外一个或多个等分试样引入室中，直至有统计学显著数量的第一和第二细胞群被固定到室表面上。
19.权利要求18的方法，其还包括确定第一细胞群与第二细胞群的比例。
20.权利要求18的方法，其还包括确定样品中第一细胞群的浓度。
21.权利要求18的方法，其还包括确定样品中第二细胞群的浓度。
22.权利要求18的方法，其还包括确定样品中第一和第二细胞群的浓度。
23.权利要求16的方法，其还包括用对细胞膜染色的通用报告染料或对细胞核染色的通用报告染料对细胞群进行染色。
24.权利要求23的方法，其中对细胞群的检测包括获得第一分类图像以检测来自第一捕获复合体中编码磁珠的信号，获得第二分类图像以检测来自第二捕获复合体中编码磁珠的信号，以及获得报告图像以检测来自对细胞群进行染色的通用报告染料的信号。
25.用于固定和检测样品中一个或多个细胞群的方法，其包括
(a)获得第一捕获复合体，其包含第一编码磁珠以及对可能存在于样品中的第一细胞群上的第一表位具有特异性亲和力的第一抗体；
(b)获得第二捕获复合体，其包含第二编码磁珠以及对可能存在于样品中的第一细胞群上的第二表位具有特异性亲和力的第二抗体；
(c)使所述样品与第一捕获复合体和第二捕获复合体接触；
(d)将样品的等分试样引入室中；
(e)向所述室施加磁场，以将第一捕获复合体和第二捕获复合体吸到该室的表面上；和
(f)检测通过与第一捕获复合体和第二捕获复合体结合而固定在室表面上的第一细胞群。
26.权利要求25的方法，其还包括对第一细胞群进行计数。
27.权利要求26的方法，其还包括确定是否有统计学显著数量的第一细胞群被固定在室表面上，并将样品的另外一个或多个等分试样引入室中，直至有统计学显著数量的第一和第二细胞群体被固定到室表面上。
28.权利要求25的方法，其还包括使样品与第三捕获复合体接触，所述第三捕获复合体包含第三编码磁珠以及对可能存在于样品中的第二细胞群上的第三表位具有特异性亲和力的第三抗体，并对通过与所述第三捕获复合体结合而固定到室表面上的第二细胞群进行检测和计数。
29.权利要求28的方法，其还包括确定第一细胞群与第二细胞群的比值。
30.权利要求27的方法，其还包括确定样品中第一细胞群的浓度。
31.权利要求28的方法，其还包括确定样品中第二细胞群的浓度。
32.权利要求25的方法，其还包括用对细胞膜染色的通用报告染料或对细胞核染色的通用报告染料对细胞群进行染色。
33.权利要求32的方法，其中对细胞群的检测包括获得第一分类图像以检测来自第一捕获复合体中编码磁珠的信号，获得第二分类图像以检测来自第二捕获复合体中编码磁珠的信号，以及获得报告图像以检测来自对细胞群染色的通用报告染料的信号。
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