CN101935642B - 一种蛋白酶复合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白酶复合酶及其应用，制备方法包括：将微生物接种于培养基中，放置在温度为25-40℃，转速为120-200转/分钟的摇床上培养24-96h，酶或超声破壁或不破壁处理，过滤菌体，加入硫酸铵，沉淀蛋白，离心，加入Tris-HCl溶解，透析后冷冻干燥；或将微生物接种于发酵培养基，30℃发酵23-72小时，搅拌速度为120-600rpm，培养24-72小时，终止发酵，过滤或离心菌体。本发明的复合酶，可以直接作用于各类毛纺织物，省去了以往处理过程中的化学试剂前处理，氧化前处理；应用方法简单，适合于与工业化生产；经处理后的毛或毛织物在抗毡缩性和机械强度上均有提高，处理后毛织物毡缩率小于5％。
Description
技术领域
本发明属复合酶及其应用领域，特别是涉及一种蛋白酶复合酶及其应用。
背景技术
羊毛织物是深受人们欢迎的一种高档产品，有其他纤维织物无法比拟的优点，其本身固有的性能使毛织物成为高档纺织品。手感及染色性能是羊毛的重要特性，然而羊毛外层附着有难于处理的致密、疏水的鳞片层，影响羊毛手感及染色着色等多项指标，人们很久以来就开发各种工艺去除鳞片层。在现有工厂化处理工艺中，以化学手段为主，如通过氯水对羊毛表面氧化而提高染色亲和性或柔化剂来改善手感，提高特性。这种处理是表面处理，因为与角质层的反应时间不足10秒钟。氯化作用增加了角质层的表面能量，因此在其后使用的Herosett125聚酰胺上氯醇型聚合物就可以均匀地覆盖在纤维表面上。这种聚合物通常用来增强纸类产品的湿强力，在水中可以膨胀至正常状况厚度的10倍，因此能防止相临纤维的毛鳞片边缘互相作用，在洗涤中产生毡化。这一处理过程通过一个改良的复洗机来完成，每小时可处理羊毛条条子45条，处理羊毛超过500公斤。但是这些处理工艺最大的缺点就是环境污染，如形成AOX，严重污染环境，并会在织物上留有难以完全去除的残留物，危害人体健康。我国拥有世界上最大的纺织工业，其在我国工业体系中占有举足轻重的地位，因此解决纺织工业中的环境污染问题显得十分紧迫，寻找合适的方法 替氯化工艺的研究受到普遍重视。
因此研究者想寻找另外的处理工艺，以等离子及电晕放电处理为代表的物理方法处理羊毛织物，具有无污染，效率高等优点，但此类方法成本高，难以产业化应用。研究和开发羊毛经济可行的除鳞片且强度损失不大的绿色环保工艺对节约能源和提高毛纺织品的质量具有特殊意义，这也是目前羊毛前处理中的难点和热点之一。
酶提高羊毛品质工艺由于其高效无污染特性，越来越受到人们重视，也是完全符合绿色纺织品标准的工艺。目前开发应用于毛织物处理工艺以蛋白酶为主，普通蛋白酶不处理羊毛纤维外层鳞片层中所富含二硫键，因此必需借助于氧化还原前处理。但是通过化学方法处理后，蛋白酶再处理羊毛导致羊毛强度剧烈下降，关于此目前的主要机理是蛋白酶对羊毛的水解是一种“表里竞争”的关系，酶不仅在羊毛表面作用，同时也渗透进羊毛纤维内部作用，导致的最终结果是羊毛纤维强度大大降低。由于毛纤维外层鳞片层中二硫键的特殊稳固性，使用常规的蛋白酶效果很不明显，有时甚至根本毫无作用(樊增禄等，“蛋白酶对羊毛的作用机理研究”，2002，《纺织学报》)，所以，目前国内外的毛纺织物酶 处理往往要采用化学前处理，不仅没有达到不使用化学试剂的目的，而且依然破坏了毛纺织物的内部结构，其实际应用效果仍不理想。2006年《江苏丝绸》第五期上文章“蛋白酶在毛纺织物纤维改性方面的应用”指出利用蛋白酶改性毛纺织物，前处理(氧化或还原)是必须步骤，目前尚未发现不需前处理即能达到毛纺织物抗毡缩效果的蛋白酶。人们也曾开发出树脂法整理工艺来提高纤维强度，但这种工艺造成严重的环境污染，在实践中未见有大量应用。Jason Patrick McDevitt等在专利US006051033A中公开了用蛋白酶处理羊强度降低，然后用转谷氨酰胺酶处理连接蛋白间断裂的肽键，从而提高了蛋白纤维强度，但该工艺增加了处理流程，提高了处理费用，市场前景不大，因此目前也未见有大规模推广应用。因此开发一种一步法处理毛织物鳞片层以降低毛织物毡缩率而不影响其纤维机械强度的新类型蛋白酶及处理工艺具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白酶复合酶及其应用，该复合酶，可以直接作用于各类毛纺织物，省去了以往处理过程中的化学试剂前处理，氧化前处理；应用方法简单，适合于与工业化生产；经处理后的毛或毛织物在抗毡缩性和机械强度上均有提高，处理后毛织物毡缩率小于5％。
本发明的一种蛋白酶复合酶，其制备方法包括：
将微生物接种于培养基中，放置在温度为25-40℃，转速为120-200转/分钟的摇床上培养24-96小时，酶或超声破壁或不破壁处理，过滤菌体，加入硫酸铵10％-40％，搅拌溶化，0℃-4℃放置12-24小时得培养液，10000rpm离心10-20分钟，得沉淀，加入0.05mol/LpH7.8的Tris-HCl溶解，透析后冷冻干燥得蛋白酶复合酶酶粉；
或将微生物接种于发酵培养基，30℃发酵23-72小时，通气量3-5L/min，搅拌速度为120-600rpm，培养24-72小时，测得其角蛋白酶的最高酶活达30.3U/mL；终止发酵，过滤或离心菌体，得到蛋白酶粗酶液。
所述的微生物为细菌，放线菌或真菌。
所述的微生物为假单胞菌(Pseudomonas)3096-4(CGMCC No.3888)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ CGMCC No.2231、橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivaceus(Waksman)Waksman et Henrici)CGMCC No.4.943或肉色曲霉(Aspergill 
carneus(Van.Teighem)Blochwitz)CGMCC No.3.3920。
所述的假单胞菌(Pseudomonas)3096-4(CGMCC No.3888)的保藏证明原件在名称为：一种降解羊毛鳞片层的菌株中已提交。
假单胞菌(Pseudomonas)3096-4已于2010年6月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3888。
所述的培养基碳源为葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖等。
所述的培养基，每100ml含蛋白粉1-4g，KCl 0.01～0.1g、NaCl 0.01～0.1g、吐温800.2～1.0g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.1～1.0g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.01～0.1g，pH为6.2-7.8。
所述的培养基，每100ml含羊毛粉2g、KCl 0.05g、NaCl 0.05g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.5g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.05g、水100ml，pH7.5。、
所述的培养基，每100ml含可溶性淀粉2g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl 0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.05g、水100ml，pH6.5。
所述的培养基，每100ml含蔗糖2.0g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl 0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.1g、水100ml，pH 6.2。
所述的发酵培养基，每100mL含葡萄糖1g、羊毛粉2.0g、干酪素0.2g、KCl 0.0373g、NaCl 0.0294g、吐温800.4g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.03g，pH 7.4-7.8。
所述Tris-HCl与培养液体积比为1-4∶1。
所述的蛋白酶粗酶液在pH 6.5-8.0，5℃-30℃酶活稳定。
本发明的蛋白酶复合酶由微生物产生，可为胞外酶，也可为胞内酶；该酶具有蛋白酶活性，同时具有二硫键还原酶活性。蛋白酶复合酶为诱导酶，可由多种蛋白诱导表达，所述蛋白包括哺乳动物毛发，禽类羽毛，大豆粉，用量为每100mL培养基中添加1-4g。
本发明的一种蛋白酶复合酶用于羊毛织物抗毡缩处理，处理方法包括：
将毛或毛织物加入0.05mol/LTris-HCl(pH7.8)中，再加入权利要求1所述的蛋白酶复酶酶粉，调pH值为5.0-8.0，在温度28-50℃，震荡0.5-10小时；所述毛或毛织物与Tris-HCl的比例为1∶10-40，每公斤毛织物中酶粉用量为0.002-20g；
或将权利要求1所述蛋白酶粗酶液或稀释2-10倍后的蛋白酶粗酶液，放入毛或毛织物，浴比为1∶20-40，pH为7.0-8.0，温度为20-35℃，作用时间为30分钟至4小时。
所述蛋白酶粗酶液低温干燥后处理毛或毛织物时酶溶解浓度为0.1-0.5％。
所述毛或毛织物，包括了多种哺乳动物原毛及其通过各种工艺生产的成品、半成品、混纺或原料纺织品。
所述的毛或毛织物为羊毛、羊毛织物或兔毛织物。
为了更好说明本发明，先对下面涉及的一些专业名词作一定义。
二硫键还原酶：能够催化二硫键加氢形成两个巯基的一类酶。
蛋白酶：水解蛋白质肽键的一类酶，能将蛋白质大分子内部肽键切断，形成分子量较小的肽或氨基酸。
毡缩率：水洗毡缩率，纺织物水洗后面积减少量占水洗前面积量的比率。纤维强度：纤维抗拉强度，指每平方毫米粗细的纤维或其他织物所能承受的而不被破坏的拉力。通常纤维的抗拉强度达数百牛顿每平方毫米，性能良好的可达数千牛顿每平方毫米，是纤维机械性能的一个指标。。
手感：对纤维和织物用手触摸的感觉。包括纤维和织物的厚度、表观比重、表面平滑度、触感冷暖、柔软程度等因素的综合感觉。
蛋白酶活性测定方法：在0.05mol/LpH 10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，将1mT待测样品溶液与1mL酪蛋白溶液在40℃恒温水浴锅中反应1h，加入2.0mL 10％TCA终止反应。1000g离心10min。取1mL上清液，加入0.5mL Folin-Ciocalteau酚试剂，在660nm下测定吸光度。反应前即加TCA处理用作对照。酶活定义：A660值每增加0.1为1个单位(U)。
二硫键还原酶活性测定方法：1mL由待测样品溶液、0.1mol/L pH 8的磷酸缓冲溶液和蒸馏水按3∶2∶5比例混合组成的酶混合液与1mL 2mmol/L溶解于pH 7的磷酸缓冲溶液中的氧化型谷胱甘肽，5mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)在40℃恒温水浴锅中反应20min1000g离心10min，取1.5μL上清液，加入50μL二硫双硝基苯甲酸(DTNB)，静置2min后于420nm下测定吸光度并计算巯基含量。酶对照为除了加入1mL pH 7的磷酸缓冲溶液取代氧化型谷胱甘肽外，其余按同样的方式进行。1个单位(U)二硫键还原酶活性相当于每毫升酶在40℃下每分钟释放出1μmol巯基。
本发明的蛋白酶复合酶一步法处理毛织物。动物毛发外表层鳞片层由富含二硫键的特殊蛋白质角蛋白构成，正是由于鳞片层的存在造成其水洗后毡缩率高、有刺痒感、难染色等问题。本发明制备的蛋白酶复合酶由于具有的二硫键还原酶活性，因此可打开鳞片层硫键，具有的蛋白酶活性可打开肽键。因此利用此类复合酶可单独处理降解剥除鳞片层，达到毛纺工业中的一步法防毡缩目的。
有益效果
(2)本发明的蛋白酶复合酶，可以直接作用于各类毛纺织物，省去了以往处理过程 中的化学试剂前处理，氧化前处理，避免了环境污染和皮肤损伤；
(3)本发明应用方法简单，适合于与工业化生产；经本发明处理后的毛或毛织物在抗毡缩性和机械强度上均有提高，处理后毛织物毡缩率小于5％，达到机可洗要求，同时纤维强度没有下降；
(4)经过本发明处理后的毛或毛织物，手感得到改善，对人体皮肤的刺激性下降，在很多方面具有羊绒的特点，因此，此方法也可用于仿羊绒制品的加工和生产中。
附图说明
图1处理后羊毛纤维效果的扫描电镜图；
图2未处理羊毛纤维效果的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
以嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ(CGMCC No.2231)(一种产角蛋白酶的菌株及其应用，申请号为2007101719394中已公开)为生产菌种，使用以下培养基进行培养：羊毛粉2g、KCl 0.05g、NaCl 0.05g、磷酸氢二钠0.5g、磷酸二氢钾0.05g、水100ml，pH7.5，置于500mL三角瓶中，在40℃和150rpm转速条件下，恒温培养72小时后得到培养液。超声波(150W，3分钟)破壁处理，过滤菌体，加入硫酸铵10％-40％，搅拌溶化，4℃放置12小时，10000rpm离心10-20分钟得沉淀，加入0.05mol/L pH7.8的Tris-HCl 100mL溶解，透析后冷冻干燥得蛋白酶复合酶酶粉；
离心后测得蛋白酶活为14U/mL，二硫键还原酶活为7U/mL。
利用上述酶冻干粉，使用其对单根羊毛纤维处理：将5g单根羊毛放入100mL 0.05mol/L Tris-HCl(pH7.8)，加酶量为0.002g，于40℃，120rpm摇床上反应60分钟。处理效果见附图1。
实施例2
以橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceus(Waksman)Waksman et Henrici)(CGMCCNo.4.943)(购自中国微生物菌种保藏管理委员会，北京)为生产菌种，使用以下培养基 进行培养：可溶性淀粉2g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl 0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.05g、水100ml，pH6.5，置于500mL三角瓶中，在28℃和150rpm转速条件下，恒温培养72小时后得到培养液。离心分离后获得上清液(胞外液)，蛋白酶活为12U/mL，二硫键还原酶活为5U/mL。利用发酵液得到的胞外酶冻干粉，使用其对羊毛织物处理：冻干酶粉以0.5％溶于0.05mol/L PBS(pH7.8)中，浴比1∶25，50℃作用70分钟。
毡缩率(％)＝(1-处理后毛织物面积/处理前毛织物面积)×100
减量率(％)＝(1-处理后毛织物重量/处理前毛织物重量)×100
纤维强度测定应用纤维强度测定仪(H10K-S，Tiniius olsen Inc.，USA)测定，使待测样品在25℃，60％湿度条件下平衡24小时。将样品剪成50mm×50mm大小，经向夹在仪器上，每边留5mm。处理效果见表2。
表2橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceus(Waksman)Waksman et Henrici)(CGMCC No.4.943)胞外酶处理对羊毛织物影响
实施例3
以肉色曲霉(Aspergillus carneus(Van.Teighem)Blochwitz)(CGMCC No.3.3920)(购自中国微生物菌种保藏管理委员会，北京)为生产菌种，使用以下培养基进行培养：蔗糖2.0g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl 0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.1g水100ml，pH 6.2，置于500mL三角瓶中，在28℃和150rpm转速条件下，恒温培养72小时后得到培养液。离心分离后获得菌体，通过超声波(150W，3分钟)破壁处理，得到胞内酶，蛋白酶活为7U/mL，二硫键还原酶活为8U/mL，加入硫酸铵10％-40％，搅拌溶化，4℃放置24小时，10000rpm离心10分钟，得沉淀，加入0.05mol/L pH7.8的Tris-HCl100mL溶解，透析后冷冻干燥得蛋白酶复合酶酶粉；
上述酶冻干粉对兔毛布(针织)处理：1kg兔毛针织物放于一大水浴锅内，毛织物与处理溶液(0.05mol/L Tris-HCl，pH7.8)比为1∶20，加入1g酶，于40℃，150rpm/min反应240分钟，处理效果见表3。测定方法同实施例2。
表3源自肉色曲霉(Aspergillus carneus(Van.Teighem)Blochwitz)(CGMCC No.3.3920)胞内酶处理对兔毛织物影响
实施例4
以假单胞菌(Pseudomonas)3096-4(CGMCC No.3888)为生产菌种，100mL过夜培养种子液接种于3L灭菌发酵培养基(每100mL含葡萄糖1g、羊毛粉2.0g、KCl 0.0373g、NaCl 0.0294g、磷酸氢二钠0.4g、磷酸二氢钾0.03g，pH 7.4-7.8)中，利用上海宝兴生物工程公司发酵罐发酵，30℃通气量3L/min，120-500rpm发酵培养48h。终止发酵，过滤菌体，得发酵酶液，测得蛋白酶活为40U/mL，二硫键还原酶活为17U/mL，稀释4倍，置毛织物，浴比为1∶20，pH7.8，30℃作用90分钟，处理后水洗烘干。测定方法同实施例2，测定结果见表4。
表4源自假单胞菌(Pseudomonas)3096-4混合酶处理对羊毛织物影响
Claims (8)
1.一种蛋白酶复合酶，其制备方法包括：
将微生物接种于培养基中，放置在温度为25-40℃，转速为120-200转/分钟的摇床上培养24-96小时，酶或超声破壁或不破壁处理，过滤菌体，加入硫酸铵10％-40％，搅拌溶化，0℃-4℃放置12-24小时得培养液，10000rpm离心10-20分钟，得沉淀，加入0.05mol/LpH7.8的Tris-HCl溶解，透析后冷冻干燥得蛋白酶复合酶酶粉；
或将微生物接种于发酵培养基，30℃发酵23-72小时，通气量3-5L/min，搅拌速度为120-600rpm，培养24-72小时；终止发酵，过滤或离心菌体，得到蛋白酶粗酶液；
所述的微生物为假单胞菌(Pseudomonas)3096-4 CGMCC No.3888、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)DHHJ CGMCC No.2231、橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivaceus(Waksman)Waksman et Henrici)CGMCC No.4.943或肉色曲霉(Aspergilluscarneus(Van.Teighem)Blochwitz)CGMCC No.3.3920。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶复合酶，其特征在于：所述的培养基，每100ml含蛋白粉1-4g，KCl 0.01～0.1g、NaCl 0.01～0.1g、吐温800.2～1.0g、磷酸氢二钠Na2HPO4 0.1～1.0g、磷酸二氢钾KH2PO4 0.01～0.1g，pH为6.2-7.8。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶复合酶，其特征在于：所述的培养基，每100ml含羊毛粉2g、KCl 0.05g、NaCl 0.05g、磷酸氢二钠Na2HPO4 0.5g、磷酸二氢钾KH2PO4 0.05g、水100ml，pH7.5；
或所述的培养基，每100ml含可溶性淀粉2g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.05g、水100ml，pH6.5；
或所述的培养基，每100ml含蔗糖2.0g、羊毛粉1g、MgSO4·7H2O 0.05g、KCl 0.05g、FeSO4·7H2O 0.001g、K2HPO4 0.1g、水100ml，pH 6.2；
或所述的发酵培养基，每100mL含葡萄糖1g、羊毛粉2.0g、干酪素0.2g、KCl 0.0373g、NaCl 0.0294g、吐温80 0.4g、磷酸氢二钠Na2HPO4 0.4g、磷酸二氢钾KH2PO4 0.03g，pH7.4-7.8。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白酶复合酶，其特征在于：所述Tris-HCl与培养液体积比为1-4∶1。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白酶复合酶，其特征在于：所述蛋白酶复合酶为胞外酶；该酶具有蛋白酶活性，同时具有二硫键还原酶活性。
6.如权利要求1所述的一种蛋白酶复合酶用于羊毛织物抗毡缩处理。
7.根据权利要求6所述的一种蛋白酶复合酶用于羊毛织物抗毡缩处理，处理方法包括：
将羊毛织物加入到0.05mol/L pH7.8Tris-HCl中，再加入权利要求1所述的蛋白酶复合酶酶粉，调pH值为5.0-8.0，在温度28-50℃，震荡0.5-10小时；所述羊毛织物与Tris-HCl的比例为1∶10-40，每公斤羊毛织物中酶粉用量为0.002-20g；
或将权利要求1所述蛋白酶粗酶液或稀释2-10倍后的蛋白酶粗酶液，放入羊毛织物，浴比为1∶10-40，pH为7.0-8.0，温度为20-35℃，作用时间为30分钟至4小时。
8.根据权利要求7所述的一种蛋白酶复合酶用于羊毛织物抗毡缩处理，其特征在于：所述反应的pH为7.6，温度为30℃。
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