CN101921835B - 一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活细胞内标记活细胞内核酸的方法和试剂盒，该试剂盒主要包括有：能够插入核酸序列中的、带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物；和含有与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针；所述1，3-二偶极基团与对应的亲偶极基团可进行“点击”反应。标记时，被含1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物修饰的核酸可以同对应的活性探针分子通过“点击”反应进行共价连接。所述标记活细胞内核酸的方法和试剂盒使核酸标记后进一步可应用于检测细胞增值，细胞凋亡；标记质粒载体，病毒，小干扰RNA，microRNA以及研究早期发育。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地是涉及一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒。
技术背景
细胞是生命的基本单位，细胞的特殊性决定了个体的特殊性，因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。细胞的主要生命活动包括增殖、分化、衰老和凋亡等，细胞的这些生命活动对生物体的生存和发展具有重要意义。细胞增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础；细胞分化是个体发育的一个重要阶段，胚层细胞的分化导致组织形成、器官发生和系统建成，细胞的异常分化会导致癌变；细胞的衰老和凋亡与生物体衰老有着极为密切的关系。对细胞的生命活动的研究已经成为现在生物学研究的热点之一，有研究表明，细胞增殖、分化、衰老和凋亡等生命活动通过细胞内核酸调控，细胞内核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，因此，观察检测细胞内核酸变化可以有效的分析细胞增殖、分化、衰老和凋亡状况，进一步可以研究整个生物体的代谢。
现最成熟的检测和分析细胞内核酸变化的方法，是核酸标记技术检测法，这种方法首先将特殊标记(如：放射性标记、化学发光标记等)的核苷或核苷酸探针插入细胞内核酸，然后通过检测细胞内的核酸探针信号达到检测细胞内核酸变化的目的。现普遍应用的核苷和核苷酸探针可分为两类，一类是同位素探针，另一类是免疫识别探针。虽然这两类探针已经应用于细胞周期研究，DNA复制以及细胞增值等研究方面，但这两种方法都存在很大缺陷。同位素探针由于其放射性，操作条件要求很高，不能在普通实验室完成，同位素标记的显微图片的分辨率差，信噪比低，另外，放射自显影法实验持续时间较长(检测通常要几个月)，就不能用于快速高通量检测。免疫识别探针通常采用5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、5-溴尿嘧啶核苷、5-溴尿嘧啶核苷酸等，采用这种免疫识别探针最大缺陷在于，插入核酸的5-溴代核酸一定要暴露在核酸分子表面同识别抗体结合。为检测插入核酸分子链中的探针需要通过各种条件使核酸分子变性，现在经常使用的条件包括醋酸的甲醇溶液，浓盐酸等，这些变性条件使实验结果不稳定，经常出现难以重复的结果。
随着对细胞研究的深入，对于细胞内核酸的检测技术要求越来越高，基于这种要求本发明开发出了一种全新的核酸标记方法。本发明应用分子连接的思想，通过“点击”反应将细胞内核酸同活性分子连接，从而可以使各种检测方法准确、方便的检测核酸分布、含量等指标。
“点击”化学的概念是2001年诺贝尔奖获得者Sharpless提出。“点击”反应是在传统Huisgen三唑反应基础上，发展出一类条件温和，选择性高和产率高的化学反应。传统的Huisgen三唑反应(如图1)是有机叠氮和炔基化合物在加热条件下发生1，3-二偶极[3+2]环加成反应，得到五元杂环[1，2，3]-三氮唑。Huisgen三唑反应为连接两个化合物提供了一种很好的手段，但是该反应条件通常需要通过加热活化等条件才能完成。“点击”反应是亚铜离子催化下的Huisgen三唑反应，由于亚铜离子的催化Huisgen三唑反应活化能降低，使该反应可以在常温下水和多种有机溶剂中高产率完成。另外，“点击”反应仅得到1’4’位三氮唑产物，不同于加热条件下得到1’5’位同1’4’位混和产物。目前“点击”反应已经广泛地被应用于各种生物大分子修饰，并被认为是“搭建起化学和生物学桥梁的杰出反应”。
发明内容
本发明的目的是提供一种标记活细胞内核酸的方法和试剂盒。该方法和试剂盒可用于方便、准确、快速地标记活细胞内核酸。
解决上述目的的技术方案如下：
一种标记活细胞内核酸的试剂盒，主要包括有：
能够在核酸合成的过程中插入细胞内核酸序列中的、带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物；
含有与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针；所述核苷类似物与生物分子探针通过1，3-二偶极基团与对应的亲偶极基团进行“点击”反应。
所述1，3-二偶极基团优选为：氧化腈基、叠氮基、重氮甲基、硝酮基、腈胺基等等；亲偶极基团优选为烯基、炔基。更优选地，所述烯基为乙烯基、丁烯基等；所述炔基为乙炔基、丙炔基，环状炔基等。
优选地，带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物可为：5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)。
生物分子探针可为任何已知的小分子或大分子探针，包括：生物荧光探针、免疫探针、生物素、抗原或半抗原、放射性探针分子、光感探针分子、以及任何的蛋白标签和底物分子；优选为吸收波长350-1000nm的荧光探针和生物素，更优选为吲哚类菁荧光探针，BODIPY类荧光探，Alexa Fluor类荧光探针，以及FAM、FITC、罗丹明荧光探针。
所述标记活细胞内核酸的试剂盒还包括催化剂和溶剂，所述催化剂包为含亚铜离子的化合物，含亚铜离子化合物优选为：硫酸铜和抗坏血酸、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu、Cu丝。所述溶剂可为各种溶剂，优选为水、四氢呋喃、DMSO(二甲基亚砜)、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或几种溶剂的混合物。
所述标记活细胞内核酸的试剂盒还包括有催化剂稳定剂，该催化剂稳定剂优选为TBTA(tris-(benzyltriazolylethy)amine)，TCEP(Tri-(2-carboxyethyl)phosphine)中的一种或多种。
一种标记活细胞内核酸的方法，主要包括以下步骤：
(A)将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物在活细胞核酸合成的过程中插入到核酸序列中，核酸被修饰；
(B)再加入含与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针，含亚铜离子化合物的催化剂和溶剂，在常温下被修饰的核酸与生物分子探针进行“点击”反应，核酸被标记。
所述的标记活细胞内核酸的方法，该核酸为离体的游离活细胞内核酸，(A)步骤为将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物与含有待标记活细胞内核酸的细胞共孵育，核苷类似物插入到待标记活细胞内核酸序列中，核酸被修饰；
所述的标记活细胞内核酸的方法，该核酸为生物体组织的活细胞内中核酸，(A)步骤为将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物以任何一种给药方式注入生物体的组织的活体中，0～960小时后，获取各种器官，用福尔马林固定和石蜡包埋并切片，去除石蜡和复水后，核酸被修饰。
本发明提供了一种简单有效的生物分子探针标记活细胞内核酸的方法和试剂盒。本发明方法合成一类核苷类似物，该类似物能够在细胞核酸合成的过程中插入细胞内核酸，核苷类似物上携带可“点击”反应的活性基团(如炔基、叠氮基等)。化学合成或酶合成或细胞中的核酸经“点击”反应核苷修饰后可以同任何已有生物分子探针连接，该生物探针分子携带另外一部分互补的“点击”反应基团即可，这样在适当条件下核酸就可以同活性探针分子通过“点击”反应进行共价连接。所述“点击”反应的条件温和，反应时间快，产率高，故适用于已知的全部生物分子探针同核酸连接，使被标记的核酸可方便于多种方式在分子、细胞、组织水平上被准确分离鉴定、检测、分析，从而可有利于进一步的检测细胞增值，细胞凋亡；标记质粒载体，病毒，小干扰RNA，microRNA以及研究早期发育。
附图说明
图1是Huisgen三唑反应；
图2是含亲偶极基团嘧啶核苷类似物；
图3是含亲偶极基团嘌呤核苷类似物；
图4是1，3-二偶极基团修饰嘧啶核苷；
图5是1，3-二偶极基团修饰嘌呤核苷；
图6为YTU和YU标记Hela细胞的结果示意图，其中A～C图为对照组；D～F图为YTD标记组；G～I图为YD标记组；其中图A，D和G为Hoechst染色；图B，E和H为Cy3染色；图C，F和I为叠加图；
图7为YTU和YU标记NIH3T3细胞结果示意图，其中A～C图为对照组；D～F图为YTD标记组；G～I图为YD标记组；其中图A，D和G为Hoechst染色；图B，E和H为Cy3染色；图C，F和I为叠加图；
图8其中A为无铜离子条件下的“点击”反应；B为CuSO4终浓度为100nM条件下的“点击”反应；C为CuSO4终浓度为1000nM条件下的“点击”反应；
图9是激发光谱390～492nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物标记DNA；A为DNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图；
图10是激发光谱492～597nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物标记DNA；A为DNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图；
图11是激发光谱597～770nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物标记DNA；A为DNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图
图12是激发光谱390～492nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物标记RNA；A为RNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图；
图13是激发光谱492～597nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物标记RNA；A为RNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图；
图14是激发光谱597～770nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物标记RNA；A为RNA“点击”反应标记；图B为Hoechst染色；图C为叠加图；
图15为检测凋亡因子对A549细胞增殖的影响结果示意图，其中A图为对照组；B图为凋亡诱导因子A刺激组；C图为凋亡诱导因子B刺激组；图D为含有EdU细胞数目的比率分布图；
图16为检测凋亡因子对A549细胞生长的影响结果示意图，其中A～C图为对照组；D～F图为凋亡刺激组；其中图A，D为Hoechst染色；图B，E为Cy3染色；图C，F为叠加图；图G为DNA/RNA比率频率分布图；
图17为YTU标记小鼠小肠组织结果示意图，其中A～D图为对照组；E～H图为YTD标记组A，E为透射图；图B，F为Hoechst染色；图C，G为Cy3染色；图D，H为叠加图。
具体实施方式
本发明所述标记活细胞内核酸的试剂盒的应用范围：其可以标记任何形式活细胞内的核酸(通过DNA聚合酶或RNA聚合酶合成等等)；所述活细胞，是能够合成核酸的细胞。根据现有技术，本发明所指的生物分子探针包括任何已知的小分子或大分子探针，包括：生物荧光探针、免疫探针、生物素、抗原或半抗原、放射性探针分子、光感探针分子、以及任何的蛋白标签和底物分子等，其可通过直接检测到的，也可以是通过间接检测到的；可使用任何一种检测仪器(包括光学仪器，生物仪器，化学仪器，如高内涵筛选仪，流式细胞仪)检测分子水平、细胞水平和组织水平上核酸的分布和含量变化，有效地分析细胞增殖和细胞凋亡以及相关信号转导的调控。
核苷类似物(nucleosideanalogues)对本领域技术人员而言，是一类具有类似脱氧核糖核苷和核糖核苷结构的化合物，本发明所述的核苷类似物能在细胞内的核酸合成时插入核酸中，且其带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团，可用于点击反应。
1.标记不同离体的游离细胞中的核酸时，所述细胞包括正常细胞和衍生细胞，包括哺乳动物细胞(人或动物，如：老鼠、猴等)，包括从体液、器官、组织中提取的细胞(如：血液、脑，肝，肺，心脏，骨骼等)，包括各种类型的细胞(如：基底细胞，上皮细胞，血小板，淋巴细胞，T细胞，B细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞，肿瘤细胞等)。以女性子宫颈癌细胞(Hela)和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)为例，本发明所提供的试剂盒可用于标记其核酸，方便于下一步检测细胞中核酸变化。本发明将合成的不同“点击”化学的核苷底物插入细胞内的核酸。以5-乙炔基尿嘧啶核苷为例，5-乙炔基尿嘧啶核苷进入细胞后磷酸化成5-乙炔基三磷酸尿苷，5-乙炔基三磷酸尿苷在细胞内RNA合酶的作用下插入细胞的RNA序列中。
2本发明可应用于任何有生长能力的生物组织的细胞中的核酸标记，生物组织来源包括单细胞生物、多细胞生物；包括人类，动物，植物，细菌，原生动物和真菌等；包括小鼠，大鼠，兔，狗，猫，牛，猪，羊，马或灵长类动物等)。
本发明将合成的不同“点击”化学的核苷类似物插入活体组织细胞内的核酸。可以为各种给药方式包括：口腔，直肠，跨膜，经皮或者肠道给药；包括非肠道分布：肌注，皮下，脊髓内给药(注射)以及鞘内的，直接心室和静脉注射、腹腔的，鼻内的(经鼻的)或者眼内注射，另外，核苷类似物可用于局部给药、非全身给药、在长效或缓释配方中，通过直接注射特定组织。以腹腔注射为例，本发明以腹腔注射给药的方法对实验小鼠注射炔基脱氧尿嘧啶核苷。
本发明将活体组织细胞中携带含“点击”化学活性基团的核酸，同对应的“点击”化学活性基团的生物分子探针，用“点击”化学反应连接，使核酸被标记，然后被标记的核酸可通过分子探针检测方法检测活体组织细胞中核酸。活体组织细胞可以通过不同方式获取，包括采集血样、活检法获取组织(如：针吸活检、雷射捕捉微选取技术、切开式活组织检验)、器官或部分器官中获取等等。获取的细胞按照如前介绍检测细胞中核酸方法检测。
本发明将携带“点击”化学活性基团核酸的组织同对应的“点击”化学活性基团的生物分子探针通过“点击”化学反应连接，可通过标准的方法着色(如：固定、切片，在“点击”化学试剂的作用下培养)。
实施例1：构建核酸标记试剂盒
1.核苷类似物合成
1.1含亲偶极基团核苷类似物合成
本发明合成了如图(2)(3)中结构的亲偶极基团核苷类似物，5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。合成方法是通过引入碘原子后引入各种炔基，合成路线类似，仅以2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)和5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)合成为例。
2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)合成
5-碘-2′-脱氧尿嘧啶核苷(1.50g，4.26mmol)PdCl2(PPh3)2(0.299g，0.426mmol)碘化亚铜(0.161g，0.852mmol)溶于3mlDMF，加入(3.9ml，21.3mmol)N，N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔(0.908g，5.54mmol)溶于1mlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇：乙酸乙酯0-10％)，得到产物0.89g(63％)。谱图数据：1HNMR(d6-DMSO，400MHz)61.57(m，4H)，2.11(m，2H)，2.19(m，2H)，2.38(m，2H)，2.75(m，1H)，3.55-3.65(m，2H)，3.78(dd，1H)，4.23(m，1H)，5.06(t，1H)，5.22(b，1H)，6.10(t，1H)，8.10(s，1H)，11.3(bs，1H)。
2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)合成
5-碘-2′-脱氧尿嘧啶核苷(0.6g，1.7mmol)Pd(PPh3)4(196mg，0.17mmol)碘化亚铜65.5mg，0.34mmol)溶于3mlDMF，加入1ml N，N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔(1.8g，17mmol)溶于1mlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇：乙酸乙酯0-10％)，得到产物0.42g(75％)。谱图数据：谱图数据：1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：1.54-1.62(m，4H，2CH2)，2.0-2.15(m，3H，HR-C(2′)，CH2)，2.22-2.44(m，3H，H_-C(2′)，CH2)，2.76(s，1H，C≡CH)，3.54-3.62(m，2H-C(5′))，3.79(m，H-C(4′))，4.20(m，H-C(3′))，5.04(t，OH-C(5′))，5.20(d，OH-C(3′))，6.12(t，H-C(1′))，6.71(s，NH)，7.67(s，NH)，8.07(s，H-C(6))。
5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(KU)
将2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷(14g，37.81mmol，1eq)溶于230mlCH3CN中，向反应液中加入12(4.8g，18.91mmol，0.5eq)及Ce(NH4)2(NO3)6(10.36g，18.9mmol，0.5eq)，加热到80℃恒温搅拌1h。旋蒸除去溶剂，残余物用300ml CH2Cl2溶解，有机层分别用200mlH2O，200ml 5％NaHSO3水溶液，200ml饱和食盐水洗涤。水相用200ml CH2Cl2返萃，合并有机层。旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE∶EA 1∶1，得白色固体产物5-碘-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷16.9g，产率90％。
将5-碘-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷(5g，10mmol，1eq)溶于100ml CH2Cl2∶(C2H5)3N 1∶1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdCl2(0.53g，0.757mmol，0.075eq)，CuI(0.29g，1.5mmol，0.15eq)，1-三甲硅基-1，6二辛炔(3.12g，6.7ml，21.17mmol，2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用100mlCH2Cl2溶解，有机层用2×200ml 10％EDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200ml CH2Cl2返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE∶EA 3∶1～1∶1，得淡黄色泡沫5-(三甲基硅1，7辛二炔基)-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷4g，产率78.2％。
将5-(三甲基硅1，7辛二炔基)-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷(12g，21.22mmol，1eq)溶于200mlCH3OH中，向其中加入28％NH3·H2O(35ml，10eq)，常温搅拌2h，向反应液中加入K2CO3(2.22g，16mmol，1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH3OH∶H2O 1∶1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2Cl2∶CH3OH 7∶1～1∶1，得白色粉末状固体产物4.5g，产率62％。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ1.57(m，4H)，2.11(m，2H)，2.19(m，2H)，2.38(m，2H)，2.75(m，1H)，3.55-3.65(m，2H)，3.78(dd，1H)，4.23(m，1H)，5.06(t，1H)，5.22(b，1H)，5.26(b，1H)，6.10(t，1H)，8.10(s，1H)，11.3(bs，1H)。
5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)
5-碘-胞嘧啶核苷(3.1g，8.5mmol)，Pd(PPh3)4(980mg，0.85mmol)，碘化亚铜(327.5mg，0.34mmol)溶于30mlDMF，加入8ml N，N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔(9g，85mmol)溶于1mlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用100ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于2ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇∶乙酸乙酯0-10％)，得到产物4.1g(70％)。谱图数据：谱图数据：1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：1.54-1.62(m，4H，2CH2)，2.0-2.15(m，3H，HR-C(2′)，CH2)，2.22-2.44(m，2H，CH2)，2.76(s，1H，C≡CH)，3.54-3.62(m，2H-C(5′))，3.79(m，H-C(4′))，4.20(m，H-C(3′))，5.04(t，OH-C(5′))，5.20(d，OH-C(3′))，5.26(d，OH-C(2′))，6.12(t，H-C(1′))，6.71(s，NH)，7.67(s，NH)，8.07(s，H-C(6)).
8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)
8-碘-鸟嘌呤核苷4.08g，(10mmol)，Pd(PPh3)4(1.1g，1mmol)，碘化亚铜(0.28g，1.5mmol)溶于100mlDMF，加入10ml N，N-二异丙基乙胺室温搅拌10分钟。1-三甲硅基-1，6二辛炔17.8g，100mmol)溶于15mlDMF，缓慢滴入反应体系，滴加完后常温搅拌过夜。蒸干反应溶剂后，混合物用500ml乙酸乙酯溶解，分别用200ml水、饱和NaCl溶液洗，硫酸镁干燥有机层后旋干，直接用于下一步反应。将得到的固体溶于20ml水，加入2当量的碳酸钾，搅拌1小时。旋干反应液，直接柱层析分离，梯度洗脱(甲醇∶乙酸乙酯0-10％)，得到产物2.1g(56％)。谱图数据：1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：1.54-1.62(m，4H)，2.0-2.15(m，4H)，2.79(s，1H)，3.2-3.8(m，2H)，4-4.5(m，2H)，4.8(d，1H)，5.1(t，1H)，6.5(d，1H)，8.5-9(b，1H).
将5-碘-3’5’-氧-二乙酰基-2’-脱氧尿苷(16g，36.52mmol，1eq)溶于200ml CH2Cl2∶(C2H5)3N1∶1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdCl2(1.59g，2.27mmol，0.075eq)，CuI(0.86g，4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml，63.53mmol，2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用300mlCH2Cl2溶解，有机层用2×200ml 10％EDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200ml CH2Cl2返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE∶EA 3∶1～1∶1，得淡黄色泡沫11.65g，5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3’5’-氧-二乙酰基-2’-脱氧尿苷，产率78％。
将5-[(三甲基硅基)乙炔基]-3’5’-氧-二乙酰基-2’-脱氧尿苷(11g，26.93mmol，1eq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28％NH3·H2O(15ml，10eq)，常温搅拌2h，向反应液中加入K2CO3(4.44g，32.13mmol，1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH3OH∶H2O 1∶1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2Cl2∶CH3OH 7∶1～1∶1，得白色粉末状固体产物4.1g，产率64％。核磁数据：1H NMR δ2.10-2.14(m，2H，H-2’2”)，3.54-3.64(m，2H，H-5’，5”)，3.78-3.80(m，1H，H-4’)，4.23-4.25(m，1H，H-3’)，5.14，5.24(t and d；1H and 1H；OH’s)，6.09(t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，8.39(s，1H，H-61，11.65(s，1H，NH)；
5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)
将5-碘-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷(15g，30.23mmol，1eq)溶于200ml CH2Cl2∶(C2H5)3N 1∶1混合溶液中，N2保护下向其中加入(PPh3)2PdCl2(1.59g，2.27mmol，0.075eq)，CuI(0.86g，4.52mmol，0.15eq)，三甲基硅基乙炔(6.24g，8.8ml，63.53mmol，2.1eq)，N2保护下常温搅拌20h，旋蒸除去溶剂，残余物用300mlCH2Cl2溶解，有机层用2×200ml 10％EDTA二钠水溶液，200ml饱和食盐水溶液洗涤，水层用200ml CH2Cl2返萃，合并有机层，旋干溶剂，过柱分离，洗脱剂比例PE∶EA 3∶1～1∶1，得淡黄色泡沫5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷11.4g，产率81％。
将5-[(三甲基硅基)乙炔基]-2’3’5’-氧-三乙酰基尿苷(10g，21.44mmol，1eq)溶于100mlCH3OH中，向其中加入28％NH3·H2O(15ml，10eq)，常温搅拌2h，向反应液中加入K2CO3(4.44g，32.13mmol，1.5eq)，常温搅拌过夜。旋蒸除去溶剂，残余物用少CH3OH∶H2O 1∶1混合液溶解后过柱分离，洗脱剂比例CH2Cl2∶CH3OH 7∶1～1∶1，得白色粉末状固体产物3.65g，产率67.53％。谱图数据：1H NMR δ3.54-3.70(m，2H，H-5’，5”)，3.85-3.87(m，1H，H-4’)，3.96-3.99(m，1H，H-3’，4.01-4.05(m，1H，H-2’)，5.07，5.26，5.42(d，t，and d，1H，1H，and 1H，OH’s)，5.72(d，J＝4.6Hz，1H，H-1’)，8.48(s，1H，H-6)，11.65(br s，1H，NH)；
1.2.1，3-二偶极基团核苷类似物
本发明合成了图(4)(5)中含1，3-二偶极基团核苷类似物，包括5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)。其中1，3-二偶极基团修饰嘌呤核苷按照已有文献合成。1，3-二偶极基团修饰嘧啶核苷合成是首先合成氨基核苷通过重氮化反应活化氨基，用叠氮基取代氨基，得到对应的1，3-二偶极基团修饰嘧啶核苷，以5-叠氮基-尿嘧啶核苷合成为例。
5-叠氮基-尿嘧啶核苷合成
将2.59g(10mmol)5-氨基-尿嘧啶核苷在冰浴中溶于30ml的1N HCl，加入10mmolNaNO2，搅拌2分钟后加入20gNaN3，室温搅拌3小时后用氨水中和至中性，蒸干溶剂后，直接上柱，二氯甲烷∶甲醇10∶1得到产物1.31g产率46％谱图数据：1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：3.5-4(m，4H)，4.1-4.53(m，3H)，4.8-5.1(m，3H)，6.12(d，1H)，6.71(s，1H)，7.97(s，1H)
2.生物探针分子合成
本发明合成了叠氮基和炔基吲哚类菁荧光探针，合成了6-叠氮己胺，购买了丙炔胺和BODIPY类荧光探针琥珀酰亚胺酯，Alexa Fluor类荧光探针琥珀酰亚胺酯，以及FAM、FITC、罗丹明琥珀酰亚胺酯。用6-叠氮己胺和丙炔胺同购买的荧光探针琥珀酰亚胺酯反应得到对应的含1，3-二偶极基团和亲偶极基团的荧光探针，并合成了生物素探针。吲哚菁类荧光探针如下，6-叠氮己胺合成和氨基同琥珀酰亚胺酯反应按照文献报道不加赘述。
吲哚菁类荧光探针合成
1，1，1’，1’-四甲基-3-乙基-3’-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁(Cy3)合成
4.55g(10mmol)1，1-甲基3-乙基-2-(β-苯胺)乙烯基-吲哚啉和4.20g(10mmol)1，1，2-三甲基-3-叠氮基丙基-吲哚啉于50mL吡啶和2mL乙酸酐中，加热回流过夜。将溶剂蒸发后反应混合物溶于100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷层三次，100ml饱和NaCl溶液洗二氯甲烷层，硫酸钠干燥后旋干，柱层析。洗脱剂甲醇∶二氯甲烷(0-10％)的产物2.12g(36.8％)谱图数据：1HNMR(CDCl3，400MHz)δ0.98-1.02(t，3H)，1.52-1.61(m，2H)，1.89-1.96(m，2H)，2.06(s，12H)，2.81(s，3H)，4.17-4.25(t，2H)，7.25-7.53(m，4H)，7.55-7.60(d，2H)，7.62-7.68(d，2H)，7.90-8.00(d，4H)，8.08-8.15(d，2H)，8.58-8.62(t，1H)。
1-乙基-1’-叠氮正己基-3，3，3’，3’-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁(Cy5)合成
3.96g(10mmol)1-乙基-2-正苯胺基丁二烯基-3，3-二甲基-6-磺酸基吲哚，3.98g(10mmol)1-叠氮正己基-2，3，3-三甲基吲哚碘盐溶于25mL吡啶和25mL乙酸酐中，加热回流过夜。将溶剂蒸发后反应混合物溶于100ml二氯甲烷，100ml水洗二氯甲烷层三次，100ml饱和NaCl溶液洗二氯甲烷层，硫酸钠干燥后旋干，柱层析。洗脱剂甲醇∶二氯甲烷(0-10％)的产物2.85g(35.9％)谱图数据：1HNMR(CDCl3，400MHz)δ1.24-1.39(m，5H)，1.53(s，12H)，1.68(m，6H)，3.25(t，2H)，3.36(t，2H)，4.05(t，2H)，6.09(d，1H)，6.29(d，1H)，6.74(t，1H)，6.94-7.35(m，7H)，7.94(q，2H)。
本发明购买了
630/650-X，SE、
FL，SE、530/550，SE、
493/503，SE、
558/568，SE、
564/570，SE、576/589，SE、
581/591，SE、FL-X，SE、
TR-X，SE、
TMR-X，SE、
R6G，SE、
FLC5，SE、以及Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、555、546、568、594、610、633、647、660、680、700、750和FAM、FITC、罗丹明琥珀酰亚胺酯，用这些活化好的荧光探针和丙炔胺反应，得到含亲偶极基团的荧光探针，用这些活化好的荧光探针和6-叠氮己胺反应得到含1，3-二偶极基团的荧光探针。
叠氮基三甘醇生物素合成
1g(4.09mmol)生物素溶于10ml DMF，加入0.942g(8.19mmol)N-羟基琥珀酰亚胺，1.57g(8.19mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜。蒸干溶剂将反应物溶于二氯甲烷，水洗，产物析出。干燥后得产物1.02g(73％)。
将1g(2.93mmol)产物直接溶于5ml DMF，加入1.531g(8.79mmol)叠氮三甘醇胺，搅拌过夜。蒸干反应液，将反应物混合物溶于10ml二氯甲烷，10ml水洗三次，饱和NaCl洗三次，干燥旋干后柱层析纯化。得到产物0.93g(79％)。谱图数据：1HNMR(CD3Cl，400MHz)δ1.34-1.47(m，2H)，1.54-1.78(m，4H)，2.15-2.13(t，2H)，2.68-2.76(d，1H)，2.84-2.92(m，1H)，3.06-3.16(m，1H)，3.34-3.44(m，4H)，3.52-3.7(m，10H)，4.28-4.31(m，1H)，4.44-4.5(m，1H)。
3.催化剂、催化剂稳定剂和反应体系的建立：
以上反应条件下反应过夜，旋干反应液直接柱层析纯化。本实验表明，在不同铜催化剂下，不同催化剂稳定剂下，不同溶剂体系中，都可以进行“点击”反应。
谱图数据：1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.75-2.5(m，44H)，3.0-3.2(s，1H)，3.4-3.8(m，14H)，3.9-4.2(b，4H)，4.3-4.8(b，3H)，5.2-5.4(s，1H)，6.20-6.5(s，1H)，8.1-9.5(b，3H)。
实施例2：细胞水平利用“点击”反应试剂盒标记细胞内DNA、RNA
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
亲偶极基团核苷类似物：5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、或7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。其中可分为2’脱氧核糖核苷和核糖核苷两类，前者可修饰DNA后者修饰RNA。在实际操作中，可选择其中的一种或多种与分子探针、催化剂等组成试剂盒使用，其效果一致。
激发光谱492～597nm含1，3-二偶极基团的荧光分子探针：含1，3-二偶极基团的吲哚三甲川菁、
FL、
530/550、
493/503、
558/568、
564/570、
576/589、581/591、
FL-X、
TMR-X、
R6G、
FLC5、以及Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、555、546、568和FITC、罗丹明，在实际操作中，可选择其中的一种或多种与对应的核苷类似物、催化剂等组成试剂盒使用，其效果一致。
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液
(2)核酸标记：“点击”反应液配置：1μM-1M1Tris(pH 8.5)，1μM-1M CuSO4，0.5μM-5M分子探针(花菁叠氮基染料)和1μM-1M抗坏血酸钠以及DMSO配置而成。
炔基核苷标记细胞：Hela细胞和NIH3T3细胞接种于96孔板，分别用含10％胎牛血清的DMEM培养液和含10％小牛血清的DMEM培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM含亲偶极基团的2’脱氧核糖核苷类似物(如5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(YTU))或1nM-1000nM含亲偶极基团核糖核苷类似物(如5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU))，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记。其标记的原理是：2’脱氧核糖核苷类似物和核糖核苷类似物加入培养基后，进入细胞。在Hela细胞和NIH3T3细胞生长过程，取代正常的核苷参与细胞的DNA和RNA合成，新生成的DNA和RNA含有相应YTU和YU基团，经过“点击”反应，被荧光分子探针标记。
染完色的细胞可以进行Hoechst染色或免疫荧光染色等常规染色。制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像或置4℃暂时保存。其实验结果如图6和图7。从图6和图7可知，Hela和NIH3T3细胞的DNA和RNA已被标记。细胞内的DNA主要分布在细胞核；RNA则分布在整个细胞，但含量存在区域差异，其中核仁区域的RNA含量最强。
实施例3：细胞水平利用不同浓度铜离子催化“点击”反应
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
核苷类似物：YTU
生物分子探针：花菁叠氮基染料(1，1，1’，1’-四甲基-3-乙基-3’-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’-叠氮正己基-3，3，3’，3’-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁)；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：Hela细胞接种于96孔板，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后分别加入不同终浓度CuSO4的“点击”反应液孵育10-30min。CuSO4终浓度分别为0nM、100nM和1000nM。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像和数据分析。其实验结果如图6所示。从图8可知，在无铜离子催化条件下，“点击反应”无法发生。比较CuSO4终浓度为100nM和1000nM时的点击反应强度，CuSO4终浓度为1000nM的“点击”反应比较强。
实施例4：细胞水平利用激发光谱300～492nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
含亲偶极基团核苷类似物：5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)中的任一种，其效果一致。
激发光谱300～492nm含1，3-二偶极基团的荧光分子探针：包括含1，3-二偶极基团的
FL、Alexa Fluor 350、405、430、488、500中的任一种，其效果一致。
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记活细胞内核酸：A549细胞接种于96孔板，用含10％胎牛血清的F12培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM含亲偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像。以标记DNA的含亲偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图9所示。从图9可知，利用激发光谱390～492nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的DNA。
实施例6：细胞水平利用激发光谱492～597nm系列生物分子探针探针和含亲偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
亲偶极基团核苷类似物：5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。其中可分为2’脱氧核糖核苷和核糖核苷两类，前者可修饰DNA后者修饰RNA；选择其中的任一种，其效果一致。
激发光谱492～597nm含1，3-二偶极基团的荧光分子探针：含1，3-二偶极基团的吲哚三甲川菁、
FL、
530/550、493/503、
558/568、
564/570、
576/589、
581/591、
FL-X、TMR-X、
R6G、
FLC5、以及Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、555、546、568和FITC、罗丹明；选择其中的任一种，其效果一致。
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：A549细胞接种于96孔板，用10％胎牛血清的F12培养液培养培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM含亲偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像。以标记DNA的含亲偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图10所示。从图10可知，利用激发光谱492～597nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的DNA。
实施例7：细胞水平利用激发光谱597～770nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
亲偶极基团核苷类似物：5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XTU)、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷(XU)、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(YTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(YC)、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XTC)、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷(XC)、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YTA)、8-乙炔基-腺嘌呤核苷(YA)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XTA)、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷(XA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QYTA)、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QYA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷(QXTA)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷(QXA)、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YTG、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷(YG)、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XTG)、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷(XG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QYTG)、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QYG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷(QXTG)、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷(QXG)。其中可分为2’脱氧核糖核苷和核糖核苷两类，前者可修饰DNA后者修饰RNA。选择其中的任一种，与相应的分子探针配用，其效果一致。
激发光谱597～770nm含1，3-二偶极基团的荧光分子探针：含1，3-二偶极基团的吲哚五甲川菁、
630/650-X、
TR-X、
FLC5、以及Alexa Fluor 594、610、633、647、660、680、700、750。
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：A549细胞接种于96孔板，用含10％胎牛血清的F12培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM含亲偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像。以标记DNA的含亲偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图11所示。从图11可知，利用激发光谱597～770nm系列生物分子探针和含亲偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的DNA。
实施例8：细胞水平利用激发光谱300～492nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
1，3-二偶极基团核苷类似物：5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)中的任一种。
激发光谱300～492nm含亲偶极基团的荧光分子探针：包括含亲偶极基团的
FL、Alexa Fluor 350、405、430、488、500中的任一种；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记活细胞内核酸：NIH3T3细胞接种于96孔板，用含10％小牛血清的DMEM培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM的1，3-二偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像。以标记RNA的1，3-二偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图12所示。从图12可知，利用激发光谱390～492nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的RNA。
实施例9：细胞水平利用激发光谱492～597nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
1，3-二偶极基团核苷类似物：5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)中的任一种。
激发光谱492～597nm含1亲偶极基团的荧光分子探针：含亲偶极基团的吲哚三甲川菁、FL、530/550、
493/503、
558/568、
564/570、
576/589、
581/591、
FL-X、
TMR-X、R6G、
FLC5、以及Alexa Fluor 350、405、430、488、500、514、532、555、546、568和FITC、罗丹明中的任一种；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：NIH3T3细胞接种于96孔板，用含10％小牛血清的DMEM培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM的1，3-二偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育1-300min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像和数据分析。以标记RNA的1，3-二偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图13所示。从图13可知，利用激发光谱492～597nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的RNA。
实施例10：细胞水平利用激发光谱597～770nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物通过“点击”反应检测核酸
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
1，3-二偶极基团核苷类似物：5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(DTU)、5-乙炔基尿嘧啶核苷(DU)、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷(DTC)、5-乙炔基胞嘧啶核苷(DC)、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DTA)、8-叠氮基-腺嘌呤核苷(DA)、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DTG)、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷(DG)中的任一种。
激发光谱597～770nm含亲偶极基团的荧光分子探针：含亲偶极基团的吲哚五甲川菁、
630/650-X、
TR-X、
FLC5、以及Alexa Fluor 594、610、633、647、660、680、700、750中的任一种。
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：NIH3T3细胞接种于96孔板，用含10％小牛血清的DMEM培养液培养。培养24h后，在培养液加入终浓度1nM-1000nM的1，3-二偶极基团核苷类似物，再培养24h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入“点击”反应液孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记，其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像和数据分析。以标记RNA的1，3-二偶极基团核苷类似物为例，其实验结果如图14所示。从图14可知，利用激发光谱597～770nm系列生物分子探针和1，3-二偶极基团核苷类似物，通过“点击”反应可以清楚地标记细胞内的RNA。
实施例11：细胞水平利用“点击”反应试剂盒检测凋亡因子对细胞增殖的影响
(1)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
核苷类似物：YTU
生物分子探针：花菁叠氮基染料(1，1，1’，1’-四甲基-3-乙基-3’-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’-叠氮正己基-3，3，3’，3’-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁)；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：A549细胞接种于96孔板，含10％胎牛血清的F12培养液培养。培养24h后，在对照组加入终浓度1nM-1000nM 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)；在凋亡诱导因子A刺激组加入终浓度1nM-1000nM 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)和1μl凋亡诱导因子A；在凋亡诱导因子B刺激组加入终浓度1nM-1000nM 5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(YTU)和1μl凋亡诱导因子B。培养12h后，移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入click反应液(同实施例2)孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记。其标记原理与实施例2相同。
制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像和数据分析。其实验结果如图15所示。从图15的图象和数据分析可知，正常生理条件下，细胞增殖正常。而在凋亡诱导因子A和凋亡诱导因子B刺激条件下，细胞增殖受阻，与对照组相比，其增殖细胞数目明显下降。
实施例12：细胞水平利用“点击”反应试剂盒检测凋亡因子对细胞生长的影响
(1.)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
核苷类似物：YU
生物分子探针：花菁叠氮基染料(1，1，1’，1’-四甲基-3-乙基-3’-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’-叠氮正己基-3，3，3’，3’-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁)；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸钠；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)标记核酸：A549细胞接种于96孔板，含10％胎牛血清的F12培养液培养。培养24h后，在对照组加入终浓度0.01-100μM 5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)，在凋亡刺激组加入终浓度0.01-100μM 5-乙炔基尿嘧啶核苷(YU)和1μl凋亡诱导因子A，再培养12h。移走培养液，每孔加入100μl 4％多聚甲醛固定30min，2mg/ml甘氨酸冲洗5min，0.2％Tritonx-100透化10min，然后加入click反应液(同实施例2)孵育10-30min。反应完后，用0.5％Tritonx-100冲洗若干次。核酸被标记。
染完色的细胞可以进行Hoechst常规染色。制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像和数据分析。其实验结果如图16所示。从图16可知，正常生理条件下，细胞生长状态良好，DNA和RNA的合成正常。而在凋亡诱导因子A刺激条件下，细胞核固缩，DNA和RNA的合成出现异常，其DNA/RNA比值与正常条件下的DNA/RNA比值相比偏大。
实施例13：在动物水平利用“点击”反应试剂盒标记小鼠体内核酸
(1.)本实施例核酸标记试剂盒包括有：
核苷类似物：YTU
生物分子探针：花菁叠氮基染料(1，1，1’，1’-四甲基-3-乙基-3’-叠氮基丙基-吲哚三甲川花菁或1-乙基-1’-叠氮正己基-3，3，3’，3’-四甲基-6-磺酸基-吲哚五甲川花菁)；
催化剂：CuSO4、抗坏血酸；
溶剂：水和DMSO混合溶液。
(2)核酸标记：小鼠腹腔注射1μg-0.5mg的YTU/YU。注射1-240h的过程中获取小鼠小肠等器官，用福尔马林固定和石蜡包埋并切片。去除石蜡和复水后，加入同实施例3所述的点击反应液孵育1min-48h。反应完后，0.5％Tritonx-100冲洗若干次，核酸被标记。其标记的原理是：YTU/YU以腹腔注射方式注入小鼠体内后，进入小肠细胞。在小肠细胞增殖时，YTU/YU以脱氧尿嘧啶类似物参与细胞的DNA/RNA合成，新生成的DNA和RNA含有相应YTU或YU基团，经过“点击”反应，被花菁叠氮基染料标记。
染完色的细胞可以进行Hoechst染色或免疫荧光染色。制备好的样品直接用高内涵仪器采集图像或置4℃暂时保存。实验结果如图17，从图17可知，小鼠小肠细胞的DNA已被标记。小肠细胞内的DNA主要分布在细胞核。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (13)
1.一种标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，主要包括有：
(A)能够在活细胞内核酸合成的过程中插入核酸序列中的、带有1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物；所述核苷类似物为2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2’-脱氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核苷、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷、8-乙炔基-腺嘌呤核苷、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基尿嘧啶核苷、5-叠氮基-2’-脱氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核苷、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷、8-叠氮基-腺嘌呤核苷、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷；
(B)含有与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针；核苷类似物与生物分子探针通过所述1，3-二偶极基团能与对应的亲偶极基团进行“点击”反应；
还包括有催化剂，所述催化剂为含亚铜离子化合物。
2.根据权利要求1所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为生物荧光探针、免疫探针、生物素、抗原或半抗原、放射性探针分子、光感探针分子、或蛋白标签分子。
3.根据权利要求2所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为激发波长300nm-1000nm的荧光探针。
4.根据权利要求3所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，所述生物分子探针为吲哚菁类、BODIPY类、Alexa Fluor类、FAM、FITC、或罗丹明生物荧光探针。
5.根据权利要求1所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括有溶剂，所述溶剂为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或上述化合物的混合物。
6.根据权利要求1所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，含亚铜离子化合物为：硫酸铜和抗坏血酸、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu。
7.根据权利要求5或6所述的标记活细胞内核酸的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括催化剂稳定剂，该催化剂稳定剂为TBTA，TCEP中的一种或多种。
8.一种标记活细胞内核酸的方法，其特征是，主要包括以下步骤：
(1)将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物在核酸合成的过程中插入
到核酸序列中，核酸被修饰；所述核苷类似物为2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷、5-(1，7辛二炔)-尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核苷、2’-脱氧-5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、5-(1，7辛二炔)-胞嘧啶核苷、2’-脱氧-8-乙炔基-腺嘌呤核苷、8-乙炔基-腺嘌呤核苷、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷、8-(1，7辛二炔)-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-腺嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-腺嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-腺嘌呤核苷、2’-脱氧-8-乙炔基-鸟嘌呤核苷、8-乙炔基-鸟嘌呤核苷、2’-脱氧-8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷、8-(1，7辛二炔)-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-乙炔基-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-2’脱氧-鸟嘌呤核苷、7-(1，7辛二炔)-7-氮杂-鸟嘌呤核苷、5-叠氮基-2’-脱氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基尿嘧啶核苷、5-叠氮基-2'-脱氧胞嘧啶核苷、5-乙炔基胞嘧啶核苷、2’脱氧-8-叠氮基-腺嘌呤核苷、8-叠氮基-腺嘌呤核苷、2’脱氧-8-叠氮基-鸟嘌呤核苷、8-叠氮基-鸟嘌呤核苷；
(2)再加入含与上述1，3-二偶极基团或亲偶极基团的对应的亲偶极基团或1，3-二偶极基团的生物分子探针，含亚铜离子化合物的催化剂和溶剂，在常温下被修饰的核酸与生物分子探针进行“点击”反应，核酸被标记。
9.根据权利要求8所述的标记活细胞内核酸的方法，其特征是，所述核酸为体外游离细胞内的核酸，(1)步骤为将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物与含有待标记核酸的细胞共孵育，核苷类似物插入到待标记核酸序列中，核酸被修饰。
10.根据权利要求9所述的标记活细胞内核酸的方法，其特征是，该核酸为生物体的组织细胞中核酸，(1)步骤为将1，3-二偶极基团或亲偶极基团的核苷类似物以任何一种给药方式注入生物体的组织的活体中，4～96小时后，获取需标记核酸的器官，用福尔马林固定和石蜡包埋并切片，去除石蜡和复水后，核酸被修饰。
11.根据权利要求8所述的标记活细胞内核酸的方法，其特征是，所述生物分子探针为激发波长300nm-1000nm的荧光探针。
12.根据权利要求8所述的标记活细胞内核酸的方法，其特征是，所述溶剂为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或其中多种溶剂混合物；所述催化剂为：硫酸铜和抗坏血酸、溴化亚铜、Cu(CH3)4PF6、C54H45BrP5Cu。
13.根据权利要求8所述的标记活细胞内核酸的方法，其特征是，步骤(2)中点击反应时还加入催化剂稳定剂，该催化剂稳定剂为TBTA，TCEP中的一种或多种。
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| CN101550175A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-10-07 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种修饰体外合成rna的试剂盒和方法 |
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| Title |
|---|
| Salic A.A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.《Proc Natl Acad Sci U S A》.2008,第105卷(第7期),results and disscussion部分. * |
| 田少敏.核酸荧光探针新进展.《生命的化学》.1998,第18卷(第1期),36-38. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101921835A (zh) | 2010-12-22 |
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