CN101921245A

CN101921245A - 抑制碳酸酐酶ⅱ的磺胺类化合物及合成方法与用途

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Publication number: CN101921245A
Application number: CN 201010266763
Authority: CN
Inventors: 汪海; 肖忠海; 王林; 崔文玉; 段瑞峰; 张首国; 张东祥; 张延坤; 刘嘉赢; 石永平; 杨永林
Original assignee: THADWEIK ACADEMY OF MEDICINE BEIJING; Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Current assignee: THADWEIK ACADEMY OF MEDICINE BEIJING; Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-08-30
Also published as: CN101921245B

Abstract

本发明涉及抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物及合成方法与用途，该化合物具有下述结构：

Description

抑制碳酸酐酶Ⅱ的磺胺类化合物及合成方法与用途

技术领域

本发明涉及一种抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物及合成方法与用途。

背景技术

高原地区约占我国国土面积的26％，多属战略要地，主要集中在青海、新疆和西藏地区。随着高原经济建设和旅游业的迅速发展以及中印边界紧张局势的加剧，进入高原地区的人群(含部队)越来越多。急性高原反应是由平原进入高原(海拔＞2500m)或由高原进入更高海拔地区时的常见病和多发病，发病率达50％～70％。特点是发病急，发展快，发病机制目前不明，如治疗不及时往往危及生命。高原低氧等因素引起的急性高原反应，已经成为威胁高原经济建设从业人员、高原部队官兵身体健康和劳动能力的关键问题。实践证明，平原人在由平原进入高原的过程中阶梯习服复合适应性体格锻炼是促进高原习服、预防急性高原反应最有效的措施。然而，绝大多数进入高原的人群如旅游者和登山者等均认为适应过程浪费时间，通常依靠服用药物来达到快速登高原的目的。在突发的军事事件或应急情况下，如2010年4月青海玉树抗震救灾时，要求大批救援人员或大部队快速进入高原，锻炼与高原适应不符合战备要求。因此，急性高原反应预防药物的研究最具实际意义。

国内调查表明，海拔2500m以上地区急性高原反应发病率达60％以上。多年来，国内一直致力于研制针对高原缺氧的药物。近半个世纪来，国内研究和使用的预防急性高原反应、提高机体缺氧耐力的药物大多以中草药为主，主要根据中医对高原病的认识，认为其症因气虚、血虚和伤阴所致，故采用补气、活血、养阴的疗法提高机体抗缺氧的耐力。军事医学科学院研制的针对高原头疼的氨扑苯，针对高原呕吐的消呕宁，改善营养状况、提高劳动能力的“高能合剂”和“高原维康片”，西藏军区总医院研制的高原康、兰州军区第十八医院研制的高原西氏胶囊等，对防治急性高原反应仅有部分缓解作用，且起效较慢，疗效局限，上述方剂多为医院或科研单位自制产品，由于尚无新药证书，不能正式装备使用。目前，国内防治急性高原反应药物还属空白，尚无高效、安全，具有自主知识产权的急性高原反应特效防治药物。

美国、印度、墨西哥等高原地区辽阔的国家，在高原、宇航、运动员训练等低氧领域内就低氧所致多种疾病的发病机制及其防治措施开展了大量研究工作，并取得了一些成就。国外报道，海拔4000m以上急性高原反应发病率约为50％～80％。早在半个世纪前，国外就提出用酸性药或饮料如酸性合剂等以对抗初入高原时的碱血症。随后又用兴奋药如苯丙胺、咖啡因、利尿药等不下数十种之多，但迄今为止，所有急性高原反应预防药物效果均有限。高原低氧暴露时，人体出现呼吸代偿，CO₂排出过多，血液CO₂分压降低，出现头痛、呕吐、睡眠障碍等急性高原反应症状。碳酸酐酶抑制剂可有效缓解上述症状。近年来，碳酸酐酶抑制剂醋氮酰胺已成为防治急性高原反应的关键性药物，它是美军陆军环境医学研究所研制的防治急性高原反应和改善高原睡眠障碍的首选药物，1994年获得美国FDA批准正式用于临床，是针对这一适应证的唯一药物。服用醋氮酰胺250mg，每天2次或500mg缓释片，每天 1次，对大多数人来说都可改善气体交换和运动效率，减轻急性高原反应症状。但是醋氮酰胺容易引起高氯性代谢性酸中毒、四肢麻木、胃肠道不适、意识模糊、恶心、厌食、困倦、多尿和耳鸣等不良反应，少数患者可见粒细胞缺乏及血小板缺乏，长期服用可加重低钾血症，低钠血症，电解质紊乱及代谢性酸中毒的症状。一股不良反应发生率为64.1％，严重影响高原从业人员(含部队)的作业能力，限制了其作为预防药物的推广使用。另外，醋氮酰胺在中国人群中防治急性高原反应的效果欠佳。

醋氮酰胺防治急性高原反应的机制主要是通过抑制肾脏的碳酸酐酶，导致碳酸氢盐从尿中排泄，从而引起轻微的代谢性酸中毒(通气刺激因素)，进而允许更完全的通气反应。另一方面，红细胞中碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA，主要是CA I和CA II)和血管内皮细胞血管腔侧的碳酸酐酶(主要是CA IV，细胞膜外连接的碳酸酐酶)也被抑制，引起正常的从组织到血液的CO₂转运轻微障碍，导致组织中CO₂分压升高。在中枢和外周化学感受器附近轻微的CO₂潴留将足以刺激通气。这些作用能够升高肺动脉氧分压和血氧饱和度。醋氮酰胺防治急性高原反应的机制研究表明，其药物靶标主要是CA I、CA II和CA IV。一股需要每天服用500mg以上的醋氮酰胺来预防急性高原反应，这可能与它对CA I、CA II和CA IV的抑制作用不够强有关，因此需要筛选对CA I、CA II和CA IV的抑制作用比醋氮酰胺更强的化合物；由于碳酸酐酶有多种同工酶，它们的组织/器官分布、亚细胞定位、生理功能都有较大差异，而醋氮酰胺对多种碳酸酐酶同工酶都有较强的抑制作用，因此筛选的化合物要具有对药物靶标CA I、CA II和CA IV高选择性的抑制作用，降低对其他同功酶如CA VII、CA XII、CA VI、CA XIII、CA IX、CA XIV等的抑制作用，就可能减少其不良反应。

综上所述，研制安全的、有效的新型急性高原反应防治药物尤为迫切，对于保障和提高高原从业人员(含部队)的身体健康和作业能力，保障高原地区经济建设的顺利进行，具有重要的社会效益和军事意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物。

本发明的第二个目的是提供抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物的合成方法。

本发明的第三个目的是提供抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

1.抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物，化学名为：[5-(N，N-R₁，R₂-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺，具有下述结构：

其中：R₁为对甲苯磺酰基或苯磺酰基；R₂为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基、正十二烷基、苯甲基、苯乙基、4-氯苯甲基、4-溴苯甲基、4-氟苯甲基、4- 甲基苯甲基、4-甲氧基苯甲基、2，4-二氯苯甲基、3，4，5-三甲氧基苯甲基、2-甲氧基苯丙基或4-溴苯乙基。

2.抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物的合成方法，其特征是包括如下步骤：

(1)由原料A与浓盐酸在无水乙醇中加热到80～90℃，水解反应4～6小时，经水重结晶后得到B；

(2)将B溶解在2.5摩尔/升的氢氧化钠水溶液中，同时加入C和5摩尔/升氢氧化钠水溶液进行酰化反应20～40分钟，乙醚萃取，水相用浓盐酸酸化到pH＝2～4，析出沉淀，经水重结晶得到白色絮状晶体D；

(3)将D与1～2倍摩尔量的E、等摩尔量的氢氧化钾在二甲基甲酰胺中进行烷基化反应1～6小时，减压条件下蒸干二甲基甲酰胺后经硅胶柱层析分离，以石油醚与乙酸乙酯混合液为洗脱剂，洗脱得到化学名为：[5-(N，N-R₁，R₂-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺的抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物I；

反应式为：

其中C为：

R₁-Cl；

E为：

R₂-X；

R₁为对甲苯磺酰基或苯磺酰基；

R₂为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基、正十二烷基、苯甲基、苯乙基、4-氯苯甲基、4-溴苯甲基、4-氟苯甲基、4-甲基苯甲基、4-甲氧基苯甲基、2，4-二氯苯甲基、3，4，5-三甲氧基苯甲基、2-甲氧基苯丙基、4-溴苯乙基；

X为Cl、Br或I。

3.权利要求1的抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物在制备抗缺氧药物中的应用。

本发明的合成路线，经济、合理且资源利用度高。合成方法简便、易行，更适合大规模的工业化生产。

本发明以原核细胞表达的人碳酸酐酶II(Human Carbonic Anhydrase II，hCA II)为酶源，建立了体外碳酸酐酶抑制剂筛选模型。本发明的抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物对人碳酸酐酶II的活性具有抑制作用。

附图说明

图1为从SACC-83 cell中扩增的hCAII基因。M：分子量标准；1.hCAII基因。分子量标准从上至下分别为4500、3000、2000、1200、800、500、200bp。

图2为在大肠杆菌中表达hCA II蛋白。M：分子量标准；分子量标准从上至下分别为94.0、66.2、45.0、35.0、26.0、20.0、14.4KDa。1.转化有pET-28b-hCA II质粒的大肠杆菌的不溶性蛋白电泳图谱。2.转化有pET-28b质粒的大肠杆菌的不溶性蛋白电泳图谱。3.转化有pET-28b-hCA II质粒的大肠杆菌诱导后可溶性蛋白电泳图谱。4.转化有pET-28b质粒的大肠杆菌诱导后可溶性蛋白电泳图谱。hCA II蛋白(箭头指示)的分子量约为30KDa。

具体实施方式

仪器与试剂

熔点用RY-1型显微熔点仪测定；¹H NMR谱用JNM-ECA-400型超导核磁共振谱仪测定，TMS为内标；MS谱用LCQ Advantage MAX 10型质谱仪测定；元素分析用Italy Carlo Erbal 106CHN全自动元素分析仪测定；UV-240紫外分光光度计(日本岛津公司)。薄层层析采用GF254硅胶板，柱层析采用200～300目硅胶(青岛海洋化工厂)；其余试剂均为化学纯或分析纯，购于北京化学试剂公司。

本发明的起始原料N-[5-(氨磺酰基)-1，3，4-噻二唑-2-基]乙酰胺(醋氮酰胺)，对甲基苯磺酰氯，苯磺酰氯，卤代烃等可通过相关的教科书教导的方法制备或从市场购得。

抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物的合成路线如下所示：

其中C为：

R₁-Cl；

E为：

R₂-X；

R₁为对甲苯磺酰基或苯磺酰基；

X为Cl、Br或I。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基)磺酰胺(化合物B)的制备

在250ml圆底烧瓶中加入12.15g(55mmol)化合物A和180ml无水乙醇，加热到80-90℃回流，搅拌下加入12ml浓HCl，回流5小时变成透明溶液；蒸掉大部分乙醇得到白色浆状物，冷却后过滤得到白色粉末状固体，水重结晶析出无色粒状晶体B；干燥后称重得7.23g，收率73.4％，mp 216-219℃。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆，TMS)，δ(ppm)：7.81(s)，2H；8.05(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)180.90(180.98)，Target[M-H]^-(calcd.)178.88(198.98)；

步骤同上，在回流的时间采用4～6小时中的任意时间时，经检测也可以制备出化合物B。

实施例2

[5-(N-对甲苯磺酰胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(化合物D₁)的制备

在50ml圆底烧瓶中加入3.60g(20mmol)化合物B和8ml 2.5mol/L NaOH水溶液，磁力搅拌；将3.80g(20mmol)对甲基苯磺酰氯(化合物C₁)溶解在6ml丙酮中制成丙酮溶液，再将丙酮溶液和4ml 5mol/L NaOH水溶液同时加到上述圆底烧瓶中，冰浴冷却到0～5℃，溶液慢慢变成粉红色，酰化反应30分钟；加入25ml乙醚，振摇后分出乙醚层，水相用浓HCl酸化到pH＝3，有白色沉淀析出，冰浴冷却下搅拌30min，过滤得到白色固体，干燥后称重得2.78g，水重结晶得到白色絮状晶体(D₁)0.70g，收率10.6％，mp 254-255℃。元素分析C₉H₁₀N₄O₄S₃，计算值(％)C 32.33，H 3.01，N 16.75；实测值(％)C 32.52，H 2.86，N 17.04。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆，TMS)，δ(ppm)：2.38(s)，3H；7.38-7.40(d)，2H；7.71-7.73(d)，2H；8.50(s)，2H；13.40(s)，1H；ESI-MS，m/z：Target[M-H]^-(calcd.)332.81(332.99)。

步骤同上，其中酰化反应为20～40分钟之间的任意时间，水相用浓HCl酸化到pH＝2～4之间的任意一值，经检测也可以制备出化合物D₁。

实施例3

[5-(N-苯磺酰胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(化合物D₂)的制备

在50ml圆底烧瓶中加入3.60g(20mmol)化合物B和8ml 2.5mol/L NaOH水溶液，磁力搅拌；将3.50g(20mmol)苯磺酰氯(化合物C₂)和4ml 5mol/LNaOH水溶液同时加到烧瓶中，室温下反应30min；加入25ml乙醚，振摇后分出乙醚层，水相经浓HCl酸化到pH＝3，有白色沉淀析出，冰浴冷却下搅拌30min，过滤得到白色固体，水重结晶得到白色絮状晶体(D₂)0.27g，收率15.5％，mp 230-232℃。元素分析C₈H₈N₄O₄S₃，计算值(％)C 29.99，H 2.52，N 17.49；实测值(％)C 30.10，H 2.36，N 18.02。ESI-MS，m/z：Target[M-H]^-(calcd.)318.80(318.97)。

步骤同上，其中酰化反应为20～40分钟之间的任意时间，水相用浓HCl酸化到pH＝2～4之间的任意一值，经检测也可以制备出化合物D₂。

实施例4

[5-(N，N-正丁基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-1)的制备方法

在25ml圆底烧瓶中加入0.16g(0.5mmol)化合物D₁和1ml二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌下使固体全部溶解；在一容器中加入0.034g(0.5mmol)KOH粉末和1ml DMF，成混浊液，将其加到上述圆底烧瓶中，继续搅拌，KOH固体慢慢溶解；称取0.082g(0.6mmol)溴代正丁烷(化合物E)溶于1ml DMF中，加到上述圆底烧瓶中；60～90℃油浴中反应2h，TLC检测反应进度。结束后用旋转蒸发仪减压条件下蒸干溶剂DMF，得到淡黄色固体；乙酸乙酯溶解后经硅胶柱层析分离(洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.10g白色固体(I-1)。收率为51.3％，mp 136-138℃。Yield，51.3％；mp 136～138℃；¹H NMR(CDCl₃，TMS)：0.85-0.89(t)，3H；1.23-1.29(m)，2H；1.70-1.75(m)，2H；2.42(s)，3H；4.13-4.17(t)，2H；5.69(s)，2H；7.29-7.31(d)，2H；7.76-7.78(d)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)391.04(391.06)，Target[M-H]^-(calcd.)388.97(389.04).

实施例5

参照实施例4的方法，用溴苄替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-苯甲基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-2)，mp 179-181℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.38(s)，3H；5.34(s)，2H；7.19-7.22(m)，2H；7.29-7.32(m)，3H；7.36-7.38(d)，2H；7.68-7.70(d)，2H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)424.94(425.04)，Target[M-H]^-(calcd.)422.93(423.03).

实施例6

参照实施例4用溴代正丙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正丙基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-3)，mp 161～163℃；¹HNMR(CDCl₃，TMS)：0.86-0.90(t)，3H；1.77-1.80(m)，2H；2.42(s)，3H；4.10-4.14(t)，2H；5.69(s)，2H；7.29-7.3 1(d)，2H；7.76-7.78(d)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)377.01(377.04)，Target[M-H]^-(calcd.)374.94(375.03).

实施例7

参照实施例4用碘甲烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-甲基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-4)，mp 205～208℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.38(s)，3H；3.71(s)，3H；7.39-7.41(d)，2H；7.74-7.76(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)348.97(349.01)，Target[M-H]^-(calcd.)346.91(346.99)。

实施例8

参照实施例4用碘乙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-乙基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-5)，mp 200～203℃；¹HNMR(DMSO-d₆，TMS)：1.24-1.28(t)，3H；2.38(s)，3H；4.10-4.16(q)，2H；7.39-7.41(d)，2H；7.74-7.76(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)363.02(363.03)，Target[M-H]^-(calcd.)360.92(361.01).

实施例9

参照实施例4用溴代正十二烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正十二烷基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-6)，mp 96～99℃；¹H NMR(CDCl₃，TMS)：0.86-0.90(t)，3H；1.20-1.30(m)，18H；1.72-1.75(m)，2H；2.42(s)，3H；4.12-4.16(t)，2H；5.81(s)，2H；7.28-7.30(d)，2H；7.75-7.77(d)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)503.15(503.18)，Target[M-H]^-(calcd.)501.05(501.17).

实施例10

参照实施例4用溴代异丙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-异丙基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-7)，mp 186～188℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：1.32-1.33(d)，6H；2.38(s)，3H；4.77-4.81(m)，1H；7.39-7.41(d)，2H；7.74-7.76(d)，2H；8.57(s)，2H；ESI-MS，m/z： Target[M+H]⁺(calcd.)376.98(377.04)，Target[M-H]^-(calcd.)374.93(375.03).

实施例11

参照实施例4用溴代异丁烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-异丁基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-8)，mp 182～184℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.79-0.81(d)，6H；2.03-2.10(m)，1H；2.38(s)，3H；3.95-3.97(d)，2H；7.38-7.40(d)，2H；7.72-7.74(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)391.02(391.06)，Target[M-H]^-(calcd.)388.94(389.04).

实施例12

参照实施例4用溴代正戊烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正戊基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-9)，mp 149-152℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.73-0.77(t)，3H；1.08-1.22(m)，4H；1.64-1.70(m)，2H；2.38(s)，3H；4.09-4.13(t)，2H；7.38-7.40(d)，2H；7.72-7.74(d)，2H；8.58(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)405.04(405.07)，Target[M-H]^-(calcd.)402.96(403.06).

实施例13

参照实施例4用4-氯苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-氯苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-10)，mp 220～224℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.39(s)，3H；5.34(s)，2H；7.22-7.24(d)，2H；7.34-7.36(d)，2H；7.35-7.37(d)，2H；7.65-7.67(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)458.93(459.00)，Target[M-H]^-(calcd.)456.91(456.99).

实施例14

参照实施例4用2，4-二氯苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(2，4-二氯苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-11)，mp 125～126℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.39(s)，3H；5.39(s)，2H；7.30-7.32(d)，2H；7.36-7.66(m)，4H；7.95(s)，1H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)492.86(492.96)，Target[M-H]^-(calcd.)490.87(490.95).

实施例15

参照实施例4用苯乙基溴替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-苯乙基，对甲苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-12)，mp 148～150℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.40(s)，3H；3.00-3.03(t)，2H；4.36-4.39(t)，2H；7.04-7.16(m)，5H；7.38-7.40(d)，2H；7.62-7.64(d)，2H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)439.02(439.06)，Target[M-H]^-(calcd.)436.94(437.04).

实施例16

参照实施例4用4-溴苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-溴苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-13)，mp 235～238℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.39(s)，3H；5.32(s)，2H；7.15-7.37(m)，4H；7.48-7.66(m)，4H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)502.85(502.95)，Target[M-H]^-(calcd.)500.85(500.94).

实施例17

参照实施例4用4-甲氧基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-甲氧基苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-14)，mp 225～227℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.39(s)，3H；3.72(s)，3H；5.26(s)，2H；6.83-6.85(d)，2H；7.15-7.17(d)，2H；7.37-7.39(d)，2H；7.70-7.71(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)454.95(455.05)，Target[M-H]^-(calcd.)452.95(453.04).

实施例18

参照实施例4用4-溴苯乙基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-溴苯乙基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-15)，mp 195～198℃；¹HNMR(DMSO-d₆，TMS)：2.41(s)，3H；2.99-3.03(t)，2H；4.38-4.41(t)，2H；6.99-7.01(d)，2H；7.27-7.29(d)，2H；7.39-7.41(d)，2H；7.61-7.63(d)，2H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)5 16.90(5 16.97)，Target[M-H]^-(calcd.)5 14.88(5 14.95).

实施例19

参照实施例4用3，4，5-三甲氧基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(3，4，5-三甲氧基苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-16)，mp 82～85℃；¹HNMR(DMSO-d₆，TMS)：2.38(s)，3H；3.57(s)，9H；5.26(s)，2H；6.51(s)，2H；7.36-7.38(d)，2H；7.72-7.74(d)，2H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+Na]⁺(calcd.)536.96(537.05)，Target[M-H]^-(calcd.)512.97(513.06).

实施例20

参照实施例4用4-甲基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-甲基苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-17)，mp 192～195℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.26(s)，3H；2.39(s)，3H；5.29(s)，2H；7.09(s)，4H；7.36-7.38(d)，2H；7.68-7.70(d)，2H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)438.92(439.06)，Target[M-H]^-(calcd.)436.95(437.04).

实施例21

参照实施例4用4-氟苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-氟苯甲基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-18)，mp 199～201℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.38(s)，3H；5.33(s)，2H；7.11-7.16(t)，2H；7.26-7.29(q)，2H；7.36-7.38(d)，2H；7.68-7.70(d)，2H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)442.97(443.03)，Target[M-H]^-(calcd.)440.94(441.02).

实施例22

参照实施例4用2-甲氧基苯丙基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(2-甲氧基苯丙基)，对甲苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-19)，mp 111～113℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：1.91-1.95(m)，2H；2.36(s)，3H；3.71(s)，3H；4.09-4.13(t)，2H；6.78-7.17(m)，4H；7.37-7.39(d)，2H；7.72-7.74(d)，2H；8.58(s)，2H；¹H NMR(CDCl₃，TMS)：2.04-2.11(m)，2H；2.40(s)，3H；2.57-2.61(t)，2H；4.15-4.18(t)，2H；5.61(s)，2H；6.80-7.20(m)，4H；7.26-7.28(d)，2H；7.75-7.77(d)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)483.07(483.08)，Target[M-H]^-(calcd.)481.02(481.07).

实施例23

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用碘乙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-乙基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-20)，mp 152-155℃；¹HNMR(DMSO-d₆，TMS)：1.25～1.28(t)，3H；4.12-4.18(q)，2H；7.58-7.88(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)349.01(349.01)，Target[M-H]^-(calcd.)346.93(346.99).

实施例24

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代正丁烷制备[5-(N，N-正丁基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-21)，mp 178-181℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.76-0.80(t)，3H；1.16-1.17(m)，2H；1.63-1.67(m)，2H；4.11-4.15(t)，2H；7.58-7.87(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS， m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)377.03(377.04)，Target[M-H]^-(calcd.)374.95(375.03).

实施例25

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代正丙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正丙基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-22)，mp 150-152℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.78-0.80(t)，3H；1.67-1.73(m)，2H；4.08-4.12(t)，2H；7.39-7.87(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)363.00(363.03)，Target[M-H]^-(calcd.)360.92(361.01).

实施例26

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用苯乙基溴替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-苯乙基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-23)，mp 152～154℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：3.00-3.04(t)，2H；4.37-4.41(t)，2H；7.02-7.15(m)，5H；7.57-7.76(m)，5H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)425.01(425.04)，Target[M-H]^-(calcd.)422.94(423.03).

实施例27

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-氯苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-氯苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-24)，mp 198～199℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：5.36(s)，2H；7.23-7.25(m)，2H；7.34-7.36(m)，2H；7.55-7.80(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)444.88(444.99)，Target[M-H]^-(calcd.)442.87(442.97).

实施例28

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用2，4-二氯苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(2，4-二氯苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-25)，mp 125～128℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：5.40(s)，2H；7.32-7.56(m)，3H；7.58-7.79(m)，5H；8.59(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)478.84(478.95)，Target[M-H]^-(calcd.)476.86(476.93).

实施例29

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用碘甲烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-甲基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-26)，mp 194～196℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：3.72(s)，3H；7.58-7.89(m)，5H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)334.95(334.99)，Target[M-H]^-(calcd.)332.90(332.98).

实施例30

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代正戊烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正戊基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-27)，mp 137～139℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.72-0.76(t)，3H；1.09-1.23(m)，4H；1.63-1.70(m)，2H；4.11-4.14(t)，2H；7.58-7.87(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)391.01(391.06)，Target[M-H]^-(calcd.)388.94(389.04).

实施例31

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代异丁烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-异丁基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-28)，mp 125～130℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：0.78-0.80(d)，6H；2.02-2.09(m)，1H；3.96-3.98(d)，2H；7.58-7.87(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)376.99(377.04)，Target[M-H]^-(calcd.)374.92(375.03).

实施例32

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代正十二烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-正十二烷基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-29)，mp 92～94℃；¹HNMR(DMSO-d₆，TMS)：0.84-0.87(t)，3H；1.13-1.27(m)，18H；1.64-1.67(m)，2H；4.10-4.14(t)，2H；7.57-7.86(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)489.12(489.17)，Target[M-H]^-(calcd.)487.00(487.15).

实施例33

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用氯苄替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-苯甲基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-30)，mp 147～150℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：5.36(s)，2H；7.19-7.32(m)，5H；7.56-7.82(m)，5H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)411.01(411.03)，Target[M-H]^-(calcd.)408.92(409.01).

实施例34

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-甲氧基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-甲氧基苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-31)，mp 188～191℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：3.72(s)，3H；5.27(s)，2H；6.82-6.84(d)，2H；7.15-7.18(d)，2H；7.57-7.83(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)440.73(441.04)，Target[M-H]^-(calcd.)438.93(439.02).

实施例35

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用溴代异丙烷替代溴代正丁烷制备[5-(N，N-异丙基，苯磺酰基-胺基)-1，3，4-噻二唑-2-基]磺酰胺(I-32)，mp 163～166℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：1.32-1.34(d)，6H；4.77-4.84(m)，1H；7.59-7.88(m)，5H；8.60(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)362.98(363.03)，Target[M-H]^-(calcd.)360.94(361.01).

实施例36

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-溴苯乙基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-溴苯乙基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-33)，mp 193～195℃；¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：2.99-3.03(t)，2H；4.38-4.42(t)，2H；6.99-7.01(d)，2H；7.29-7.31(m)，2H；7.58-7.76(m)，5H；8.63(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)502.90(502.95)，Target[M-H]^-(calcd.)500.85(500.94).

实施例37

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用3，4，5-三甲氧基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(3，4，5-三甲氧基苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-34)，mp 84-88℃； ¹H NMR(DMSO-d₆，TMS)：3.58(s)，9H；5.27(s)，2H；6.53(s)，2H；7.55-7.86(m)，5H；8.61(s)，2H；ESI-MS，m/z：Target[M+Na]⁺(calcd.)522.97(523.04)，Target[M-H]^-(calcd.)498.94(499.04).

实施例38

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-溴苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-溴苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-35)，ESI-MS，m/z：Target[M+H]⁺(calcd.)488.90(488.93)，Target[M+Na]⁺(calcd.)510.85(510.92)，Target[M-H]^-(calcd.)486.86(486.93)；经检测合成成功。

实施例39

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-氟苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-氟苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-36)，经检测合成成功。

实施例40

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用4-甲基苯甲基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(4-甲基苯甲基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-37)，经检测合成成功。

实施例41

参照实施例4用化合物D₂替代D₁，用2-甲氧基苯丙基溴替代溴代正丁烷制备{5-[N，N-(2-甲氧基苯丙基)，苯磺酰基-胺基]-1，3，4-噻二唑-2-基}磺酰胺(I-38)，经检测合成成功。

实施例42

本发明通过小鼠常压密闭缺氧模型对磺胺类系列化合物(其中10个化合物)进行评价。发现7个化合物(I-2、I-8、I-17、I-18、I-21、I-22和I-27)能显著延长小鼠的存活时间，与空白对照组存在显著性差异。

磺胺类系列化合物抗缺氧活性的药理实验测定：

一、实验材料和仪器

250ml缺氧装置瓶，秒表，灌胃器和分析天平；

土温80，钠石灰，醋氮酰胺和10个磺胺类系列化合物(I)由本实验室合成；

昆明小鼠：雌雄各半，体重(20±2)g。

二、实验方法

分组及计量设置：以醋氮酰胺产生耐缺氧作用的剂量(80mg·kg^-1·d^-1)为给药剂量，观察相同给药剂量下磺胺类系列化合物对小鼠存活时间的影响。实验分组如下所示：

(1)空白对照组：灌服生理盐水，0.2ml/只。

(2)阳性对照组：灌服醋氮酰胺溶液，0.2ml/只，给药量为80mg·kg^-1·d^-1。

(3)目标化合物组：灌服样品(磺胺类系列化合物)溶液，0.2ml/只，给药量为80mg·kg^-1·d^-1。

以醋氮酰胺为阳性对照药，采用经典的小鼠常压密闭缺氧实验方法。实验分为空白对照组、阳性药物对照组和目标化合物组。10个化合物用生理盐水稀释成混悬液(C＝8.0mg/ml，土温80助溶)，每天早上空腹灌服0.2ml，连续5天，空白对照组灌服等量生理盐水，阳性对照组灌服等量醋氮酰胺混悬液。实验前禁食12h，实验当日早上灌药1h后进行实验。

常压缺氧耐受实验在室温25℃(空调)条件下严格按实验常规要求，迅速把小鼠放入底部盛有10g钠石灰、容量约250ml的缺氧装置瓶中(钠石灰用以吸收二氧化碳和水，钠石灰上垫有滤纸，用以吸收尿液，广口瓶用前均盛水校正容量，每瓶放小鼠一只，瓶口涂以凡士林以防漏气)，旋紧瓶塞开始计时，以小鼠停止呼吸为死亡指标，观察并记录各组小鼠在缺氧瓶中的存活时间(s)。

三、实验结果

小鼠的密闭缺氧存活时间参见表1。

结果表明(表1)，与空白对照组比较，其中8个化合物(醋氮酰胺、I-2、I-8、I-17、I-18、I-21、I-22和I-27)均能显著延长小鼠的密闭缺氧存活时间；与阳性对照药醋氮酰胺组比较，3个化合物(I-8、I-18和I-22)能显著延长小鼠的密闭缺氧存活时间。这7个化合物(I-2、I-8、I-17、I-18、I-21、I-22和I-27)在制备抗缺氧药物中的应用。

表1 目标化合物对小鼠常压缺氧耐受力的影响

^*P＜0.05；^**P＜0.01vs空白对照组；^##P＜0.01vs醋氮酰胺组

实施例43

本发明的抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物抑酶活性的药理实验测定：

一、实验材料和仪器

对硝基酚乙酸酯(PNPA)购自Sigma公司；大肠杆菌BL21(DE3)和IPTG购自北京普博欣公司；质粒pET-28b(+)购自Novagen公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购于北京天根公司；限制性内切酶EcoR I和Sal I、DNA连接酶购自NEB公司；Bradford蛋白定量试剂盒购自北京博奥森公司；醋氮酰胺和34个本发明的抑制碳酸酐酶II的磺胺类化合物。

UV-240紫外分光光度计(日本岛津公司)；DY-3A型稳压稳流电泳仪(江苏兴华分析仪器厂)；PTC-200常规PCR仪(美国MJ Research公司)；JC-3型超声处理机(通化市超声设备厂)；SPECTRARainbow酶标仪(奥地利TECAN公司)；96孔酶标板(德国Greiner公司)。

二、实验方法

(1)酶反应液制备

RT-PCR和质粒构建：根据hCA II的全长cDNA序列设计了-对扩增引物：5’-CGGAATTCGATGTCCCATCACTGGG-3’和5’-GCGTCGACTTTGAAGGAAG CTTTG-3’，通过RT-PCR方法从SACC-83细胞中获得hCA II基因的开放阅读框，限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切后纯化回收并定向亚克隆进pET-28b(+)质粒中得到hCA II的表达质粒pET-28b-hCA II。将构建的pET-28b-hCA II质粒进行插入片段的全长测序。

基因表达及酶溶液制备：将pET-28b(+)和pET-28b-hCA II分别转化进BL21(DE3)大肠杆菌中，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％稀释扩大培养至OD600nm为0.4～0.6，加入0.4mmol·L^-1的IPTG和1mmol·L^-1 ZnSO₄诱导培养4h。超声破碎细菌，10000r·min^-1离心10min后吸取上清液混匀，分装，-20℃冻存备用。经BCA法测定后将含pET-28b(+)质粒的对照菌和含pET-28b-hCA II质粒的工程菌上清液的浓度用15mmol·L^-1的Tris-SO₄缓冲液调整为0.926g·L^-1。

SDS-PAGE检测细菌中hCA II蛋白表达：对照菌和工程菌在诱导培养4h后，4000×g离心20min收集菌体，按照离心前菌液的1/10体积加入15mmol·L^-1的Tris-SO₄缓冲液，超声破碎细菌后离心收集上清液，将沉淀按照离心前菌液的1/10体积加入15mmol·L^-1的Tris-SO₄缓冲液，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴10min，浓缩胶5％，分离胶12％进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色。

底物液和缓冲液配制：0.003mol·L^-1对硝基酚乙酸酯(13.60mg对硝基酚乙酸酯)溶于1ml丙酮中，用水稀释至25ml，必须新鲜配制避光保存。缓冲液为15mmol·L^-1 pH 7.6的Tris-SO₄缓冲液。

(2)hCA II活性检测和抑制剂抑制率计算

利用CA II具有酯酶活性，能够催化对硝基酚乙酸酯分解引起348nm处光吸收增加的性质，采用紫外分光光度法检测hCA II的活性。单位定义：在25℃、pH7.6，每分钟催化分解1μg底物的酶量为1单位。实验操作：将Tris-SO₄缓冲液和底物液置于25℃恒温水浴箱中，酶溶液置于冰浴中保存，抑制剂溶液室温放置，向反应体系依次加入Tris-SO₄缓冲液，抑制剂溶液，底物液和酶溶液，至反应体系总体积为3.0ml。在348nm下测定体系吸光度值(A)的变化，用双蒸水校正光吸收到0点，每隔30s读取吸光度值，共读3.0min。以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算出每分钟A的增加值(ΔA/min)为：ΔA_348nm/min＝ΔA_样品/min-ΔA _对照菌/min。

计算公式：

比活(U/mg)＝(ΔA_348nm/min)/(5.0×mg酶/ml反应液)………………公式1

(注：上述条件下对硝基酚的克分子消光系数为5.0×10⁶)

抑制率(％)＝[1-比活_{(样品+抑制剂)}/比活_(样品)]×100………………………公式2

(3)酶稳定性研究

将冻存的对照菌和工程菌于冰上融化后保存于冰水浴中，分别在0、1、2、3、4、5、6、12、18、24h取100μl酶液加入已混合的25℃放置的2.3ml缓冲液和0.6ml的底物液中，使用紫外分光光度计，选择波长为348nm，用1cm光径的比色杯测定光吸收值，按照(2)方法计算酶比活。

(4)醋氮酰胺标准曲线绘制

在反应体系中分别加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.11、0.12ml的10μmol·L^-1的醋氮酰胺，按照(2)方法进行醋氮酰胺标准曲线绘制。

(5)磺胺类系列化合物I和II抑酶活性评价

以醋氮酰胺对hCA II的抑制率达到50％时的剂量为标准，检测相同剂量的36个目标化合物对hCA II抑制率的大小。实验分组如下：a.对照菌组：Tris-SO₄缓冲液+底物液+对照菌上清液；b.样品组：Tris-SO₄缓冲液+底物液+hCA II菌上清液；c.样品+醋氮酰胺组：Tris-SO₄缓冲液+底物液+醋氮酰胺溶液+hCA II菌上清液(以醋氮酰胺表示)；d.样品+抑制剂组：Tris-SO₄缓冲液+底物液+抑制剂溶液+hCA II菌上清液(以抑制剂编号表示)。按照(2)方法计算目标化合物对hCA II的抑制率。

(6)统计学分析

实验数据以

表示，多组间比较用方差分析，两组均数比较用t检验。采用OriginLab OriginPro v8.0-ROR软件进行数据分析。

三、实验结果

(1)hCA II基因的扩增及测序

hCA II的RT-PCR扩增及其序列分析：从SACC-83细胞中获得hCA II基因的开放阅读框长度797bp的目的片段见图1，测序结果表明得到了能正确编码hCA II蛋白的核苷酸序列。

(2)SDS-PAGE检测细菌中hCA II蛋白表达

将扩增的hCA II基因亚克隆进原核表达质粒pET-28b中得到表达质粒pET-28b-hCA II，转化入BL21(DE3)细菌并进行诱导表达；以诱导表达转化有质粒pET-28b的BL21(DE3)细菌作为对照。hCA II蛋白表达见图2，表明含有表达质粒pET-28b-hCA II工程菌在细菌裂解后的上清液和沉淀物中均有hCA II蛋白被诱导表达，hCA II蛋白分子量约为30KDa，见图2。

(3)hCA II酶稳定性：实验表明，-20℃保存的酶液，解冻后48h内酶催化活性基本没有变化。

(4)hCA II活性检测结果：hCA II活性检测实验中，对照菌和hCA II工程菌酶液终浓度为0.0359g·L^-1。对照菌上清液比活(U/mg)＝0.0159±0.0062；hCA II菌裂解上清液比活(U/mg)＝1.1043±0.0633。对照菌上清液比活占hCA II菌裂解上清液比活百分数为1.44％。hCA II活性分析表明：在工程菌裂解液上清中hCA II的活性很高(＞98％)，表明hCA II工程菌裂解液上清液可以用于CA II抑制剂的抑酶活性评价。这与SDS-PAGE的蛋白检测结果相吻合(图2，3、4泳道所示)。

(5)醋氮酰胺标准曲线测定结果

计算醋氮酰胺对hCA II的抑制率(％)，用Excel作图法，以醋氮酰胺加入体积(μl)对抑制率(％)作图，取反应线性部分(即10μmol·L^-1的醋氮酰胺加入体积为40、60、80、100、110、120μl)，得到醋氮酰胺标准曲线。醋氮酰胺标准曲线方程为y＝0.7645x-24.6010(r＝0.9948)。当醋氮酰胺(inhibition％)＝50.00时，x＝97.58μl。即醋氮酰胺对hCA II的抑制率为50％时醋氮酰胺加入体积约为0.10ml。

(6)目标化合物抑酶活性评价结果

计算34个新化合物对hCA II的抑制率(％)，采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析(参见表2)。

表2 新化合物对hCAII的抑制作用(

n＝7)

^#P＞0.05，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001vs醋氮酰胺

结果表明：I-5、I-7、I-12、I-17、I-18、I-20、I-21、I-22、I-28和I-30共10个化合物对hCAII的抑制率大于对照化合物醋氮酰胺，且存在显著性差异；化合物I-3、I-4、I-8、I-23、I-26、I-27、I-29、I-31和I-32共9个化合物对hCAII的抑制率与醋氮酰胺相当，与空白对照组存在显著性差异。具有抑酶活性的有19个化合物(I-3、I-4、I-5、I-7、I-8、I-12、I-17、I-18、I-20、I-21、I-22、I-23、I-26、I-27、I-28、I-29、I-30和I-31)在制备抑制碳酸酐酶II的药物中的应用。

Claims

其中：R₁为对甲苯磺酰基或苯磺酰基；R₂为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基、正十二烷基、苯甲基、苯乙基、4-氯苯甲基、4-溴苯甲基、4-氟苯甲基、4-甲基苯甲基、4-甲氧基苯甲基、2，4-二氯苯甲基、3，4，5-三甲氧基苯甲基、2-甲氧基苯丙基或4-溴苯乙基。

反应式为：

其中C为：

R₁-Cl.

E为：

R₂-X.

R₁为对甲苯磺酰基或苯磺酰基；

X为Cl、Br或I。