CN101918532A - 用于体外测试免疫原性和免疫功能的培养系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供培养装置，其包括多个培养单元，其中每一单元包括：培养室、用于为培养物供应液体的入口和用于从所述单元排出液体的出口，其中所述入口与所述培养室流体连通，而所述培养室与所述出口流体连通，以允许液体流动通过培养室。该培养装置特别适合用于体外测试免疫细胞和免疫功能。本发明的各方面包括用于培养免疫细胞的培养装置和相关方法以及分析测试化合物对免疫细胞的影响的体外方法。

Description

用于体外测试免疫原性和免疫功能的培养系统和方法
技术领域
本发明涉及培养真核细胞、特别是免疫细胞的培养装置和方法。本发明还涉及体外分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法。
背景技术
在临床前药物研发的早期，需要在体外对物质对细胞的影响进行比较分析。为此，需要在严格控制的条件下制备细胞培养物并以感兴趣的治疗剂进行处理。仅当以可重复和高度类似的方式对各个细胞培养物(即相同的或不同的细胞培养物)进行测试时，才能获得可靠的结果。
不过，通常会遇到严重的问题。例如，在细胞培养物制备和测试过程中细胞培养物受到损害或遭受应激，且因此导致分析结果至少部分是由于此类损害造成的。不仅如此，将这些基于从受损细胞上获得的结果而得出的结论应用于体内情况可能引起致命的错误。此外，损害或应激条件在各个细胞培养物之间不具有可重复性并可影响各种因素，有可能产生高比例的假阳性或假阴性。
正因如此，在体外测试之后在动物模型系统上进行体内测试非常重要。这导致出现这样一种悖论，即由于不能控制测试条件而无法预期在人类细胞培养物自身上进行的实验的有效性。实验中的人为因素妨害了预期的有效性。
另一方面，实验中的人为因素较少影响从动物实验中获得的体内结果。不过，对于人类应用而言，动物实验本身的有效性十分有限(更不用说还有为进行比较分析而设立遗传学相同的动物分组的育种问题)。
正因如此，一直在进行各种努力，例如通过启动费用高昂的基因组学和蛋白质组学课题，以确保结果可从动物转用于人类。不过，对于这一问题还远远没有找到令人满意的解决方案。
因此，目前新药研发的风险仍然主要涉及临床研究领域，该领域是花费最为昂贵且涉及伦理学问题最多的领域。类似的问题也存在于在细胞培养物上进行的诊断测试研发中。
本发明因此旨在建立用于体外测试的培养装置和方法，其可将活细胞材料上的应激条件降至最低。这会使得通过比较分析而获得的结果的有效性增加，且优选地，可将这些结果直接外推至与所培养的细胞相对应的整个生物体，由此可以避免进一步的动物测试或减少其数量。
化妆品、药物和化学消费品的所有成分均需测试广泛的不良反应谱。风险评估策略的最终目标是确定产品的用途和适应症，以便将对健康和环境的威胁降至最低。除了例如毒性、腐蚀性、致癌性和胚胎毒性之外，还需要将免疫原性纳入产品安全的考虑范围。产品相关的免疫原性可导致，例如皮肤过敏、变态反应和过敏反应。
免疫原性仅对于免疫接种而言是需要的。药物、化妆品和包括食品成分在内的其他消费者相关化学品以及它们的组合在应用于人体的过程中可能引起不期望的免疫原性。因此，免疫原性和改变的免疫功能是与使用化学品和生物制药制品相关的重要问题。
产品相关参数例如药物设计、制造方法、制剂或施用途径可影响免疫原性(Schellekens，H.，Bioequivalence and the Immunogenicity ofBiopharmaceuticals.Nature Reviews Immunology.Vol.1，457；2002)。
新的化合物以及生物制药药物例如重组蛋白质、来自动物和植物的成分，可引起患者产生中和抗体、变态反应和过敏反应。新的化合物以及生物学物质例如抗体或细胞因子，以高度特异性的方式与特定靶反应并对齐造成干扰，或在其作用方式中具有特定的物种特异性。
因此，为了测试免疫原性和免疫功能，需要建立与人体情况密切类似的模型系统。因此，需要基于人类的具有免疫能力的淋巴类器官的等同测试系统和强有力的过程来研究它们的影响。
有很多体外测试使用人类细胞，但它们并没有效仿器官或组织的功能，因此价值有限。因此，为了研究药物功效和不良反应，使用动物品种的体内测试一直是必需的。
已经建立了大量经确认的动物测试系统并强制用于产品批准过程，对于制药、化学和化妆品工业尤其如此。
对于早期临床前期研究和后期药物筛选过程，已经建立了大量转基因模型，并已经用于测试对免疫应答的诱导。公认的动物模型被强制用于后期临床前期毒性测试(例如，小鼠、大鼠、狗和非人类灵长类动物)。在临床试验的范围内，人类中的免疫原性测试集中于分析接受治疗的志愿者的血液和尿液样品中的药物中和抗体。
人源化动物模型已经被公开，例如参见WO 2006/056769A1，其提供了具有人类II类MHC转基因的小鼠。WO 02/102830A1公开了动物模型，其中补充了典型的人血清白蛋白序列或以之替换天然的白蛋白序列。US 6,248,721提供了人源化动物模型，其用于评价被设计用来产生针对人类病原体的免疫力的疫苗，包括针对人免疫缺陷病毒的疫苗。
其他方法致力于鉴定T细胞表位。US 2004/0180386A1公开了使用重叠序列的肽文库来定位(筛选)表位的方法，以便设计出免疫原性降低的新蛋白质。
不仅如此，还产生了大量基于计算模型的数据文库，以便估计抗原与已知的相关人类表位相匹配的可能性。例如，US 6,939,546B2公开了基于计算机的模型，用于进行肽与II类MHC受体的结合研究。可以产生有关肽的免疫原性潜能的预测信息。这些数据有助于减少后续需要进行的体外测试的数量。
已经公开了多种借助于分离的动物和人类细胞来测试免疫功能的方法。最常被分离的是不同物种的外周血单个核细胞(PBMC)，它们被悬浮培养并暴露于不同浓度的药物。在短时期内，例如1至48小时内，监测所诱导的细胞增殖和细胞因子释放。
更加详细的研究使用PBMC的确定亚群分析细胞类型特异性应答。例如，使用T细胞进行肽和表位定位，并使用树突细胞分析抗原呈递。US2003/0152550A1公开了使用树突细胞来筛选和测试影响树突细胞成熟的药物。
常见读出参数是被引发的淋巴细胞的抗原依赖性增殖和抗原依赖性细胞因子分泌。
现有体外测试的主要缺点在于它们是在试管中的细胞悬浮液中进行，而绝大多数体内生理学反应则是组织相关的和器官相关的。绝大多数免疫反应的结构和环境基础是次级淋巴器官和所有实体组织例如皮肤，而不是外周血。因此，需要效仿组织或器官功能的人造组织模型。
已经以液体处理为目的研发了生物学人造器官(US 20050142530)。其他系统的目的在于提供组织工程化的系统(包括肝组织、肾组织、心脏组织、软骨组织或骨髓组织)，用于测试药物代谢和毒性(WO 2004065616A2，WO2003104439A2)。US20060110822公开了基于多孔的灌注流体生物反应器，用于在动态细胞培养物的细胞上进行药物测试。
对于合适的组织培养技术，已经显而易见的是，除了有效的氧气和营养物供应之外，建立(i)代谢物、(ii)细胞因子、和(iii)趋化因子和其他(尚未发现的)参数的局部梯度以及趋化作用的结构化表面和局部安排(包括通过致密连接发生的细胞间交互作用(intercellular cross-talk))等是适当效仿体内环境的至关重要的先决条件(Griffith，L.G.and Swartz，M.A.2006.Capturingcomplex 3D tissue physiology in vitro.Nat Reviews Molecular Cell Biology，7：211-224)。这促成了由建立均质性培养系统向建立异质性培养系统的转变，并集中于受控的连续可调式长期培养方法。
研发这些细胞培养装置和方法的基本目的是创建模拟特定组织自组织(self-organisation)的具体人体相关微环境的结构和内稳态(见US2005/0142530A1)。
效仿免疫器官功能的基于人体组织的模型据设想可成为早期前导优化与临床前期研发阶段之间的桥梁。人类或动物淋巴类器官模型可为药物作用模式提供认识，此外还可用于细化产品相关性风险谱。
使用组织样(类器官)构造内的人细胞和强有力测试过程的体外效仿人类免疫功能的技术平台使得有可能对免疫原性和人类免疫功能进行预测性体外测试，其使用有助于优化产品研发以及患者和消费者的健康和安全。此外，这一技术和方法使得有可能减少并替代动物测试。
已经在尝试体外模仿免疫接种过程，以便研究候选疫苗的作用方式及其效能。为此已经研发了模块式小型化免疫生物反应器系统(WO2005/104755A2)，其包括淋巴样组织等同物。所述淋巴样组织等同物是通过将T和B细胞接种于微载体上，并在多孔容器内共培养接种了T和B细胞的微载体。
在现有技术中，绝大多数组织工程化方法均基于贴壁细胞(adherentcell)。非贴壁细胞的细胞培养方法通常使用悬浮培养物。悬浮培养物的缺点在于悬浮培养物中的细胞均是单个细胞，它们并不效仿组织或器官的功能。悬浮培养物的另一个问题是难以撤出样品，除非从培养物中取出悬浮的细胞、采用例如离心等繁琐的步骤并中断培养。因此，十分需要具有贴壁细胞细胞培养系统的优点的非贴壁细胞细胞培养系统。
总之，中断细胞的培养会给细胞造成应激，其风险在于会测量到由此类造成的人为干扰。因此，对于比较分析，需要能够分析测试化合物对细胞的影响而不中断细胞培养过程的培养方法。
发明内容
本发明通过提供用于体外测试免疫原性和免疫功能的细胞培养装置和方法而解决了上述问题。本发明的培养装置和方法可提供微环境。所述微环境使得细胞应答与体内的细胞应答相类似。
在一个方面，本发明提供培养装置，其具有顶面、底面和至少一个侧面，所述培养装置包括多个培养单元，其中每一单元包括：
(i)培养室，
(ii)用于将所述单元与外部液体供应源可逆连接的入口，和
(iii)用于从所述单元排出液体的出口，
其中所述入口与所述培养室流体连通，而所述培养室与所述出口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室，
其中所述入口可与来自所述培养装置的顶面或侧面的外部液体供应源连接，且所述出口可与来自所述装置的顶面或侧面的排出导管连接。
在另一个方面，本发明提供培养装置，其包括多个培养单元，其中每一单元包括：
(i)培养室，
(ii)用于将所述单元与外部液体供应源可逆连接的入口，和
(iii)用于从所述单元排出液体的出口，
其中所述入口与所述培养室流体连通，而所述培养室与所述出口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室，其中所述液体流动的主流在所述培养装置的平面内穿过培养室。
根据本发明，所述流体连通可以是由所述培养室与入口之间的通道和所述培养室与出口之间的通道建立的。
所述培养装置可包括多个培养单元，使得能够进行多重平行细胞培养和测试。培养装置的培养单元可具有小型化格式，这允许将大量培养单元整合在单个培养装置内。由此，可在单个装置中处理多个单元，且多个单元可在例如完全相同的条件下暴露于确定的环境，例如温度、气体和湿度。
此外，使用本发明的培养装置可实现中-高通量的应用。本发明的培养装置可包括2至200培养单元。
在一个实施方式中，所述培养装置的培养室的培养容积为25至1000μl。在另一个实施方式中，所述培养装置的培养室的培养容积为50至250μl，优选地50至150μl。
可将测试物质和/或刺激剂分别添加至每一个单元内的活细胞材料中。
所述培养装置可被构造为允许通过显微镜观察培养室中的细胞。
本发明还提供培养免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(a)将形成基质(matrix)的水性组合物中的免疫细胞悬浮液引入培养室，
(b)固化所述悬浮液，由此形成其中包埋有所述免疫细胞的基质，和
(c)将所述免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
此外，本发明提供培养免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(a)将形成基质的水性组合物中的免疫细胞悬浮液引入本发明的培养装置的至少一个培养单元的培养室，
(b)固化所述悬浮液，由此形成其中包埋有所述免疫细胞的基质，和
(c)将所述免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
在另一个方面，本发明提供培养免疫细胞的方法，包括将包埋于基质中的免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
此外，本发明提供培养免疫细胞的方法，包括将包埋于基质中的免疫细胞在本发明的培养装置的至少一个培养单元的培养室中在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
根据本发明，各个培养单元可提供类似的条件。因此，所述条件可相似或基本上相同。
在另一个方面，本发明提供分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法，其包括以下步骤：
(a)将包埋于基质中的免疫细胞在本发明的培养装置的至少一个培养单元的培养室中在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中给所述基质连续注入液体培养基和补充物，
(b)通过所述入口将所述测试化合物加入至少一个培养单元，
(c)在存在所述至少一种测试化合物的情况下按照步骤a)所述培养免疫细胞，
(d)从其中加入了所述测试化合物的所述至少一个培养单元的出口排出的培养基中取出至少一个样品，和
(e)分析所述样品中所述测试化合物对所述免疫细胞的影响。
在另一个方面，分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法可进一步包括在所述培养过程之后通过选自如下一组的方法分析免疫细胞：免疫荧光、光学显微镜、流式细胞术、荧光激活的细胞分选、组织学和酶联免疫斑点测定(ELISPOT)方法等等。
附图说明
图1-4显示了本发明装置(分别为装置1-4)的优选实施方式的工程图(顶视图)。图1B、2B和3B所示为沿着如图所示的相应轴线所作的所述装置不同实施方式的培养隔室的横切面。图4B所示为装置4的培养隔室的3D投影图。该盒包括培养隔室以及第一和第二中空纤维膜，该盒可以插入所述培养装置的基板内。
图5所示为根据实施例1所述的时间依赖性细胞因子谱。采用图1所示的装置1进行该实验，但该装置具有160μL的较大培养隔室。
图6所示为根据实施例2所述的时间依赖性细胞因子谱。采用图1所示的装置1进行该实验，但该装置具有160μL的较大培养隔室。
图7示例性显示了一个具有外周流控系统(peripheral fluidic system)的培养单元(由培养基通道和培养隔室组成)。
图8显示了在实施例4的装置4中的PBMC培养物的葡萄糖和乳酸盐谱。数据点以时间依赖方式指明流通(flow through)中这些代谢参数的浓度。
图9显示了实施例4中以抗Ki67抗体特异性染色并以苏木精(heamatoxiline)复染的琼脂糖基质中PBMC培养物的免疫组织学切片：对照(左侧)和以OKT-3和IL-2刺激的PBMC培养物(右侧)。
图10显示了实施例4中以抗CD3抗体特异性染色并以苏木精复染的琼脂糖基质中PBMC培养物的免疫组织学切片：对照(左侧)和以OKT-3和白细胞介素-2刺激的PBMC培养物(右侧)。
发明详述
定义
自分泌因子是所有由细胞分泌的这样的物质，这些物质能够支持和介导分泌该因子的同一细胞的维持、生长或分化。
旁分泌因子是所有由细胞分泌的这样的物质，这些物质能够支持和介导其他邻近细胞的维持、生长或分化。
自调理(Self-conditioning)描述的是引起细胞行为改善的所有因子。
分化指的是培养的细胞发展出组织特异性功能。
维持描述的是在特定细胞培养过程中保持特定组织的所有功能恒定的能力。
活细胞材料描述的是活的原代细胞以及源自人活动物的细胞系、类器官体或细胞聚集体。
培养基指的是含有营养物和培养细胞所需物质的液体。
补充物描述的是添加至培养基中以诱导或改变细胞功能的物质(例如，细胞因子、生长因子、血清)。
基质描述的是用于表面涂覆或大体积应用以增强细胞的增殖、分化和功能以及细胞的组织形成的物质或它们的混合物。基质可包括人工物质或生物源物质，例如水凝胶、泡沫材料、海绵状物、织物或无纺纤维(non-woven fibres)。基质由结构、化学组成和/或官能化来限定，例如具有细胞外基质蛋白。
微环境指的是在微米尺度上位于细胞周围并影响细胞的物质的局部浓度。
灌注指的是将培养基和/或气体定向运输通过培养室。
免疫原性是特定物质(抗原)引起免疫应答的能力。免疫应答可以是体液介导的和/或细胞介导的。
免疫功能包括生物体识别病原体或外来物质的存在并相应地发生反应(例如，产生细胞因子)的能力，其可能引发免疫应答。
细胞因子是8-30kDa的蛋白质和糖蛋白，它们由多种细胞类型产生，用作细胞间通讯的信号。它们在免疫系统中发挥中心角色并参与各种各样的免疫学疾病、炎性疾病和感染性疾病。
趋化因子是一类小的细胞因子，它们能够在附近的反应性细胞中诱导定向趋化作用。这些蛋白质通过与称为趋化因子受体的G蛋白偶联的跨膜受体相互作用而发挥其生物学作用，这些受体选择性存在于趋化因子的靶细胞表面。
刺激物是通过诱导免疫系统的任何组成部分活化或增加其活性，例如增加细胞增殖，而刺激免疫系统的药物。著名的实例包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，商品名为“Leukine”。免疫刺激物主要有两种：特异性免疫刺激物，它们提供免疫应答的抗原特异性，例如为疫苗或任何抗原；非特异性免疫刺激物，它们以与抗原特异性无关的方式增强其他抗原的免疫应答或刺激无抗原特异性的免疫系统组成部分，例如为佐剂和非特异性免疫刺激物。
生长和分化因子是细胞所释放的一些物质，它们诱导其他细胞(旁分泌因子)或同一细胞(自分泌因子)增殖(生长因子)或分化(分化因子)。可将已知的这些因子补充进细胞培养基。
增殖指的是通过重复进行细胞分裂以增加细胞量。
药物是化学或生物学物质，可以是合成的或非合成的，当施用后它们可以某种方式改变生物体的功能。与内源性生物化学物质不同的是，药物通常需要从生物体以外被引入。
多重平行指的是具有相同的培养物和培养条件的分开的培养隔室。多重平行培养隔室均被分别供应细胞培养基，每一培养隔室的样品可被连续吸取。优选地可使用显微镜对所有培养隔室进行分别观察。术语多重平行包括2至200个单独、但相同的培养物设置。
培养装置
培养装置可以是板状。在顶视图中，其可以是矩形或圆形。其优选地是矩形。培养装置可以由任何适合细胞培养的材料产生，特别是经过无毒细胞培养测试的材料。材料的实例是塑料材料，例如热塑性塑料材料或硬质塑料材料。合适的材料的实例是聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、polyetherethylketone(PEEK)或聚四氟乙烯(PTFE)。培养装置可以是透明的。培养装置可以是无菌的。所述装置可以通过注塑产生，当其由热塑性塑料材料制得时尤为如此。或者，其可通过压模产生，当其由硬质塑料材料制得时尤为如此。在另一方案中，其可从各层组装而成。
培养装置包括多个培养单元。培养装置可具有2至200个培养单元，优选地具有6、8、12、16个单元或其倍数。对培养单元的排列没有特殊限制，图1-4给出的实例是一些可能的排列。每一培养单元包括培养室、入口和出口。
在一个实施方式中，每一培养单元的入口和出口与装置上其他的培养单元的入口和出口是分开的。
在另一实施方式中，两个或更多个培养室可共用同一入口，但具有分开的出口。要实现共用入口，可使用多个液体导管，每一导管将入口与一个培养室相连接。这一实施方式可用于在相同条件下培养一个以上的培养室，以测试实验的可重复性。培养单元的出、入口的位置可接近单元的培养室。
培养室可具有小型化的格式。在顶视图中，培养室可以是矩形或圆形。所述室可通过钻孔形成。室可以是矩形(5x5mm至25x25mm或10x10mm，高度为0.5mm至5mm或1至3mm)或圆形(直径6mm至20mm或8至14mm，高度为0.5mm至5mm或1至3mm)。培养室的培养容积可以为25至1000μl，50至250μl，或50至150μl。培养室的顶面可通过盖子而可逆性关闭。盖子可以是覆盖多个培养室的盖子。或者，各培养室可以单独地关闭，例如通过盖玻片或聚合物膜。
培养室可以是透明的，以允许通过显微镜观察培养室中的细胞。培养室可以具有槽装或平坦的底面。后者特别适合允许通过显微镜观察培养室中的细胞。
培养室与入口流体连通，以便将培养单元与外部液体供应源相连接。培养单元可通过入口连接于泵。泵可以是蠕动泵、膜泵或注射泵。为了实现最小的连续流速，优选的泵形式可以是注射泵(例如，KD Scientific)。
外部液体供应源可以是用于培养真核细胞的培养基。可通过导管例如管路建立外部液体供应源与入口之间的流体连通。导管可通过本领域常规使用的标准接头可逆性连接于入口。例如，可将路厄连接器或M6连接器用作接头。入口适合于接受导管的相应接头。例如，对于导管的阴螺纹管接头，入口具有对应的相应阳螺纹管接头。
出口可适合于连接于导管，这与入口的情况相似。可连接于出口的导管可导向废液容器、培养收集器或分析装置，例如pH和pO2探测器、微芯片、生物传感器等等。一次性pH和pO2探测器和生物传感器也可整合于培养室或可与出口连接的导管内。
培养室与入口和出口流体连通。可通过连接培养室与入口的通道建立培养室和入口之间的流体连通。可通过连接培养室与出口的通道建立培养室和出口之间的流体连通。
可通过铣削形成通道。通道可与被小型化，并可适合于从培养基至培养室所需的流速。通道可具有圆形横切面，横切面的直径可与在0.1mm至3mm之间，或0.3至1mm之间。
培养单元的入口和出口和培养室被设置为允许液体流动通过培养室，其中所述液体流动的主流在培养装置的平面内穿过培养室，即与培养装置的底平面平行的平面。流动的方向可以是从入口至出口。根据装置的位置，流动可以是水平方向的或垂直方向的。
本发明的培养装置优选地具有板样的总体形状(例如，如同多孔组织培养板那样)并具有多个相同的单元。一个具有至少3个培养室的装置内的不同培养室内的相应点限定出了被称为培养装置的底平面的平面的方向。所述液体流动的主流代表培养室的输入流和输出流开口之间液体流动的总体方向。平行指的是平行或与平行偏差至多50％、30％或20％。理想地，培养室的输入流和输出流开口在空间上是分离的，使得流体在排出培养室之前可穿过培养室的整个容积。如图所示，开口可彼此相对。由此可在培养室内实现培养基成分近乎均匀的分布。
可选择液体流动的流速以适合所需的用途和培养室的内部容积。流速的范围可以是10至1000μl/天。通常，可以选择流速使得每天通过培养室的液体体积在培养室容积的四分之一和四倍之间。优选地，每天通过培养室的液体体积在培养室容积的1-2倍之间。培养室可以连续灌注，这意味着以连续液体流动进行恒定灌注或以预定的间隔进行灌注，例如，每15分钟1μl或每30分钟1μl。可通过使用例如，蠕动泵或注射泵，实现以预定的间隔进行灌注。在培养过程中，流速可以是恒定，也可以是变化的。
在一个实施方式中，所述培养室的至少一个面用透气性薄膜密封。在这一实施方式中，可通过使培养室内的培养基与预设的环境氧气和二氧化碳含量(例如，20％氧气，5％二氧化碳)相平衡而给培养的细胞提供气体。环境可以是细胞培养箱内的空气。透气性薄膜可由本领域人员已知的塑料薄膜制得，其允许氧气和二氧化碳从周围环境扩散进来。例如，可以使用Greiner bio-one销售的Biofoil25TM。
在另一实施方式中，除了参与所述培养室与所述出、入口之间流体连通的开口以外，所述培养室是气密性封闭的。培养室内细胞的气体供应可以通过在将培养基输送至培养室内之前对培养基进行预平衡而实现。为此，培养装置可进一步包括所述入口与外部液体供应源之间的导管，所述导管包括允许将液体培养基平衡至环境(例如细胞培养箱内的空气)中的预定的氧气和二氧化碳含量(例如20％的氧气，5％二氧化碳)的透气性导管。所述透气性导管可由硅氧烷制造。
或者，可使用渗滤器将细胞培养基预平衡至预设的氧气和二氧化碳含量。为此，液体供液源的液体存储池可配备连接于外部气体供应源(例如，20％氧气，5％二氧化碳)的渗滤器。使用这一实施方式，可以在37℃的加热箱内操作培养装置。
在一个实施方式中，可以从部件组装培养装置。一种部件可包括第一板状塑料，其具有通道和培养孔，它们的排列类似于本发明的培养单元上通道和培养室的排列。可通过铣削或钻孔在第一板状塑料内形成通道和培养孔。在第一板状塑料的顶部可安装盖子，例如通过安装第二板状塑料，后者可粘附于所述第一板(例如，使用二氯乙烷)。可安装出、入口(例如，使用医用硅氧烷粘合剂)使得它们与培养室流体连通。
在一个实施方式中，可以培养室灌注液体培养基和补充物。培养基指的是含有营养物和培养细胞所需物质的液体。培养真核细胞所用的液体培养基是本领域人员熟知的(例如，DMEM，RPMI 1640等等)。可根据待培养的细胞类型选择合适的培养基。例如，淋巴细胞可培养于RPMI 164010％FCS。也可以使用X-Vivo 15培养淋巴细胞。可以选择任何合适的培养基，但要确保所测量的淋巴细胞应答不会因培养基中加入对于人体条件而言是外来的那些因子(例如，来源于植物因子)而发生改变。补充物描述的是待加入至培养基内以诱导或改变细胞功能(例如，细胞因子、生长和分化因子、丝裂原、血清)的物质。补充物是本领域人员已知的。常用于真核细胞的血清的实例是胎牛血清。培养基可进一步补充抗生素，例如青霉素、链霉素等等。
在一个实施方式中，可将测试物质和/或刺激剂分别添加至每一个单元内的活细胞材料中。测试物质可以是药物或药物组分。刺激物可包括支持细胞的维持、生长或分化的任何物质。在具体的实施方式中，刺激物是作用于免疫细胞的物质，例如通过活化免疫细胞。用于活化免疫细胞的刺激物是本领域已知的。此类药剂可以是多肽、肽或抗体以及其他刺激物。例如，OKT-3、干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、寡CPG、丝裂原(例如，PWM、PHA、LPS)等等。可使用与培养隔室相距确定距离的口将测试物质和刺激物注入细胞培养基流，或可将测试物质和刺激物补充至细胞培养基存储池，然后通过泵在整个培养期间或培养期间的预定时段(例如，第一个24小时)进行连续提供。
在另一个实施方式中，培养室可以含有包埋于基质中的活真核细胞材料。或者，培养室内的真核细胞材料可以被接种于已经置于培养室内的基质上。
基质描述的是用于表面涂覆或大体积应用以优化细胞附着或允许3D包埋式培养的物质或混合物。最佳的基质应能够效仿细胞在体内的相应情况(例如，促进细胞的增殖、分化、功能和组织形成、表达细胞特异性表型和细胞的活性)。基质可包括人工物质或生物源物质，例如水凝胶、海绵状物、泡沫材料、织物或无纺纤维。基质可选自水凝胶、海绵状物、泡沫材料、织物或无纺纤维。基质由结构、化学组成和/或官能化来限定，例如具有细胞外基质蛋白。基质的结构可允许营养物、补充物、测试物质和气体被最优地转移至细胞内。
可以使用本领域人员已知的任何合适的单体形成聚合物。聚合物具有生物相容性，是可生物降解的或不可生物降解的。合适的聚合物包括琼脂糖、胶原、纤维蛋白、藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、壳多糖、聚碳酸丙二醇酯、聚羟基丁酸酯、基于氨基酸的聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚延胡索酸酯、聚HEMA、聚苯乙烯、PTFE、聚乙二醇、或基于聚乙二醇的聚合物以及它们的衍生物。可生物降解的聚合物包括聚乳酸化合物类、乙交酯类、己内酯类、原酸酯类以及它们的共聚物。
例如，优选的水凝胶可以使用MatrigelTM。海绵状物可以不含胶原(OptiMaixTM，来自Matricel)。
泡沫材料例如可以由聚醚砜(GKSS)或聚苯乙烯(Wilden AG)制得。无纺纤维可由聚酰胺制得，如同用于制备输血用红细胞浓缩物那样(Asahi)，或可使用电纺技术(electro-spinning technology)制造(J.H.Wenndorff)。
培养装置可含有预先形成的固体基质，特别是泡沫材料(例如，由聚苯乙烯或聚醚砜制得)或无纺纤维(例如，聚酰胺绒(polyamide wool)或电纺产品)或海绵状物(例如，胶原或聚苯乙烯)。
可以液体培养基灌注基质，使得液体大部分通过基质的内部。基质可几乎完全充满培养室的内部容积。
可通过在形成基质的水性组合物中制备细胞悬浮液并固化所述悬浮液而将活真核细胞材料包埋于基质中。可通过降低温度(琼脂糖)或将基质细胞悬浮液的温度升高至37℃(例如，MatrigelTM，胶原凝胶，纤维蛋白凝胶)而使得水凝胶细胞悬浮液固化。
在优选的实施方式中，活真核细胞材料可包括免疫细胞。实例是白细胞或白细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物。白细胞可选自全外周血单个核细胞、外周血单个核细胞的确定亚群、体外分化的外周血单个核细胞亚群以及它们的任何共培养物。所述感兴趣的其他细胞可选自内皮细胞、干细胞、滤泡状树突细胞、基质细胞(stromal cell)和其他细胞。
此外，可在这一培养系统内培养并检测具有特异性免疫学特性的细胞系。这些细胞可以是T细胞系(例如，Jurkat)、B细胞系(例如，Ramos，Raji)或树突细胞系(例如，Nemod)或它们的混合物。
在一个实施方式中，培养单元可包括额外的入口，用于将包含真核细胞的悬浮物和/或形成基质的水性组合物引入培养室。用于引入形成基质的组合物的入口可通过导管，例如基质通道，连接于培养室。图3显示了这一实施方式的一个实例。可在培养装置的板中铣削出基质通道，例如，在板样培养装置的与培养室底面相同的一面上。培养室可以注入预定体积的悬浮液。例如，悬浮液可通过位于培养室底面或培养室侧面底部的开口注入培养室。由此可将向所述室内的基质悬浮液中带入气泡的风险降至最低。
可采用基质特异性方案在培养室内部固定化。或者，可将细胞接种于在培养室内预先形成的固体基质上。固体基质可包括泡沫材料(例如，由聚苯乙烯或聚醚砜制得)、无纺纤维(例如，聚酰胺绒或电纺产品)或海绵状物(例如，胶原或聚苯乙烯)。可通过入口或分开的口将细胞接种于固体基质上。
在另一实施方式中，培养单元可还包括穿过培养腔隙的中空纤维膜。中空纤维膜与所述培养室和出、入口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室。图4示例了这一实施方式。液体培养基和补充物可通过第一中空纤维输送至培养室，并通过第二中空纤维从培养室输出。因此，用于制造合适的中空纤维膜的材料可以是任何如下材料，其应该适合于细胞培养并允许水性液体、营养物和补充物以及将要与细胞相接触的其他药剂渗透过来。可商品化获得合适的中空纤维膜，例如MicroPES，来自Membrana。在一个具体的实施方式中，在图4B所示的分隔盒内制成两侧具有第一和第二中空纤维膜的培养室以及基质通道。该盒可通过铣削和钻孔或通过压塑而制备。随后插入膜片并通过加压、加热或使用粘合剂使之与盒紧密相连。然后将所述盒插入包含培养基通道的基板，通气通道(venting channel)和部分基质通道通向基质口。通过加压或使用粘合剂将这种精确制造的盒插入基板。
在另一个实施方式中，中空纤维膜可连接于排气口。由此可将空气从中空纤维膜和/或培养单元去除。
通过打开所述入口和出口以及排气口(如果有的话)而给中空纤维注入培养基。现在泵入细胞培养基使之通过中空纤维直至后者充满培养基，然后关闭排气口。然后可将预充盈的供应导管(例如，以培养基预充盈的管路)和输出导管分别连接于入口和出口。
在另一个方面，培养室可以含有被半透膜分开的两个培养隔室，其中一个培养隔室是用于液体培养基中的活细胞材料的培养隔室，而另一个培养隔室是通过液体流动而灌注的液体培养基培养隔室。由此水性液体、营养物和补充物以及将要与细胞相接触的其他药剂可渗透进活细胞材料培养隔室，而细胞产物，例如，废液、代谢物(例如，葡萄糖，乳酸盐)和细胞分泌的因子，可输送至活细胞材料培养隔室外面，而活细胞材料则保留。
在一个实施方式中，培养室的液体培养基培养隔室可以通过侧向流动进行灌注，由此沿着半透膜与液体培养基培养隔室内的液体培养基的界面建立液体流动。
方法
在另一个方面，本发明提供培养免疫细胞的方法。
根据本发明的方法，各个培养单元可提供类似的条件。例如，可以相同的方式处理多个培养单元，例如就以下因素而言：环境因素，例如温度、气体、湿度和培养条件，例如细胞类型、细胞密度、培养基组成、补充物、基质、灌注流的流速。
本发明的培养免疫细胞的方法所使用的基质可以是水凝胶、泡沫材料或无纺纤维，它们可如上所述来制备。在优选的实施方式中，所述基质是水凝胶。通过将细胞悬浮液在形成基质的水性组合物固化而将细胞包埋于基质例如水凝胶中。可根据如上所述的基质特异性方案固化基质。基质可以是3-D基质。
可采用已知的基质特异性方案在培养室内固化基质。可通过在形成基质的水性组合物中制备细胞悬浮液并固化所述悬浮液而将活真核细胞材料包埋于基质中。可通过降低温度(琼脂糖)或将基质细胞悬浮液的温度升高至37℃(例如，MatrigelTM，胶原)而使得水凝胶细胞悬浮液固化。
如上所述，可采用标准的方法，例如通过注射，将包含免疫细胞的悬浮液通过与培养室相连的入口引入本发明的培养系统内。
免疫细胞可以是白细胞或白细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物。白细胞可选自全外周血单个核细胞、外周血单个核细胞的确定亚群、体外分化的外周血单个核细胞亚群以及它们的任何共培养物。白细胞包括白细胞的确定亚群，例如淋巴细胞(T细胞，B细胞)、单核细胞和体外分化的白细胞以及它们的任何共培养物(例如，T细胞与树突细胞的共培养物或B/T细胞与树突细胞的共培养物)。此外，白细胞或白细胞的确定亚群可与感兴趣的其他细胞共培养，所述感兴趣的其他细胞选自内皮细胞、干细胞、滤泡状树突细胞、基质细胞和其他细胞，此外，可以使用具有特异性免疫功能的细胞系。这些细胞系衍生自免疫细胞，并可模拟免疫应答。这些细胞可选自B细胞系(例如，Ramos，Raji)、T细胞系(例如，Jurkat，Karpas-299)或树突细胞系(例如，Nemod)、或本领域人员已知的其他细胞。这些细胞系的混合物也可在本发明的装置中培养。
体外产生的树突细胞(DC)与PBMC的共培养物的合适比例可以是1∶10。PBMC可以与滤泡状树突细胞按照1∶10至1∶50的比例共培养，基质细胞可以与PBMC按照1∶10至1∶100的比例培养。使用B细胞和T细胞培养物，这两种亚群可以等比例培养。
在一个实施方式中，可使用这种培养免疫细胞的方法进行长期培养，例如，免疫细胞可在预定的培养条件下培养数天、至少一周、至少4周和多达8周的一段时间。培养条件和培养时间取决于多种因素，例如所培养的细胞类型和待检测的免疫应答的类型。
免疫细胞可以高密度接种，例如每毫升1x106至1x1010个活细胞。优选地，细胞的接种密度为每毫升1x107至5x108个活细胞。
所述培养条件由培养基、补充物、基质、技术支持微环境和气体供应确定。各个培养单元可提供类似的条件。可根据细胞类型选择培养条件。例如，细胞可培养在37℃，5％CO2和20％氧气。可通过密封所述培养室的至少一个面的透气性膜给培养的细胞提供气体。
可用新鲜液体培养基连续灌注基质，其中已经通过培养室或由出口排出的培养基不再循环使用。
在另一实施方式中，所述基质、培养基组成、细胞密度和细胞混合物允许形成微类器官结构。由此，所培养的免疫细胞以及所述细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物可效仿组织或器官的功能。根据本发明的方法，免疫细胞可在模拟特定组织自组织的相关微环境的微梯度/内稳态和结构中建立细胞-细胞接触并生长。
本发明的培养系统和相应的培养免疫细胞(例如，白细胞和白细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物)的方法，能够在体外效仿免疫原性和免疫功能。
本发明的培养系统允许模拟免疫学功能并体外测试免疫原性，其目的在于测试诸如药物和免疫学刺激物等物质对免疫细胞和免疫细胞与专业人员所知的有关细胞的共培养物的影响。
本发明的另一目的是提供分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法。
免疫细胞可以是上述类型。免疫细胞包埋于适合细胞培养的基质内，所述基质可允许进行自调理、建立微环境和细胞迁移。基质可以是3D支持结构，所述3D支持结构允许以高密度培养免疫细胞(即，每毫升1x106至1x1010个活细胞)。可通过将形成基质的水性组合物中细胞悬浮液固化而使细胞包埋于基质例如水凝胶中。或者，可将细胞接种于培养室内预先形成的海绵状物、泡沫材料或无纺纤维基质中，这是通过以细胞悬浮液灌注基质，以使得细胞被基质的多孔结构捕获。
当细胞和基质注入系统后，可在无刺激物的情况下预培养该细胞培养物12小时、24小时、或48小时或更长，或12-48小时或12-24小时。
可按照如上所述的培养免疫细胞的方法来培养包埋于基质中的免疫细胞。可根据细胞类型和后续测试的读出参数选择培养条件和培养时间。例如，对于PBMC，可在1-2周内产生细胞因子谱，而抗体应答的产生可需要2-21天(IgM)，或4-21天(IgG)，并可持续直至40天。T细胞应答可在3-7天出现。对于特异性增殖，细胞可培养2-21天之间。
培养系统的灌注可用于细胞的长期培养，例如，至少1周，长达4周，甚至长达8周。
在采用本发明的方法的免疫细胞培养过程中，培养室可以连续灌注。连续灌注可使用注射泵、蠕动泵或膜泵，其中液体培养基被恒定泵入培养室或以预定的间隔泵入培养室。在使用蠕动泵的情况下，培养基被输入培养室的速度为，例如，每30分钟1μl，每45分钟1μl，每60分钟1μl等等。流速取决于多种因素，例如培养室的内部容积、细胞的密度等等。可如上所述选择合适的流速范围。
测试化合物可以是感兴趣的药物或药物成分或影响(例如，活化)细胞的刺激剂(例如，刺激物)或它们的组合。可将测试化合物添加至输送到培养室的培养基中，例如通过注射到隔膜内添加。
细胞可与治疗有效剂量的测试剂温育一段治疗有效时间，这取决于所述测试化合物的性质。
本发明的用于分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法所使用的基质可以是水凝胶、泡沫材料或无纺纤维，其可按照如上所述进行制备。在优选的实施方式中，所述基质是水凝胶。
在优选的实施方式中，以新鲜液体培养基连续灌注基质，其中从出口排出的培养基不再循环使用。这种设置对于以时间依赖方式获得所产生的应答谱十分理想，例如，用于测量培养期间细胞因子分泌的增加。这一方案也给细胞提供了最佳的氧气和营养物支持以使细胞保持高活力，由此允许对细胞进行长期培养。
可通过以预定间隔取出等体积的培养基而取得从出口排出的培养基样品。间隔的长度取决于读出参数。可每1小时至每3天，优选地每6小时至1天取样。
在另一个方面，在分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法的步骤e)中，分析样品中的选自细胞因子、趋化因子和抗体的可溶性因子的存在和浓度。可溶性因子可以是细胞所分泌的蛋白质物质(例如，IL-2/4/5/10、TNF-α和IFN-γ、MIP1α或抗体)。
在优选的实施方式中，取出所述样品但维持对所述细胞的培养。
这可提高测量的可重复性。在另一个方面，这一实施方式允许以时间依赖性方式产生数据。例如，随着细胞的分泌细胞因子，获得输入液体中细胞因子含量的升高谱。
在另一实施方式中，其中各个培养单元之间的所述测试化合物、测试化合物的浓度、所述细胞暴露于所述测试化合物的时间是不同的。由此可以进行具有高统计学相关性和高重复性的测试。
在另一实施方式中，分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法还包括在线监测和/或离线监测所述出口排出的培养基中的细胞培养条件。
可采用本领域人员已知的生物传感器和生物传感器方法进行在线监测。在线监测的读出参数包括pH、氧气含量、营养物和代谢物，例如，葡萄糖、乳酸盐。通过从出口排出的培养基中取出样品并通过离线测量所述样品而进一步分析细胞所分泌的因子，例如细胞因子、趋化因子、抗体和细胞代谢物。离线分析的方法可以是，例如，ELISA、Biacore SPR技术或多重珠阵列技术。
例如，可采用多重珠阵列技术(LuminexTM/Luminex Corporation，FlowCytomixTM/Bender Medsystems或CBA/BD)产生细胞因子谱，在这些技术中，细胞因子结合特异性荧光珠并随后通过FACS分析进行定量。将哪些细胞因子纳入测试取决于所选择的商品化多重试剂盒。
培养结束时，可打开培养隔室，采用各种方法观察基质包埋的细胞。可将来自培养隔室的细胞基质结构直接包埋于石蜡内并切片用于组织性分析，或者对基质进行酶消化(例如，胶原酶，纤溶酶)以得到单个细胞用于进一步分析。
在另一个方面，分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法可进一步包括通过选自以下一组的方法分析免疫细胞：光学显微镜、组织学、免疫荧光技术、流式细胞术、荧光激活的细胞分选(FACS)、酶联免疫斑点技术(ELISPOT)、分子生物学技术(例如，DNA、RNA芯片)和本领域人员已知的其他方法。
附图详述
图1：装置1的顶视图(图1A)和一个培养单元的横切面(图1B)。多重平行培养单元由在塑料基板(例如，聚碳酸酯；6)中铣削出的培养基通道(4)和培养隔室(2)组成。这一实施方式的培养隔室的直径为10mm，高度1mm(79μL)。以透气性薄膜(biofoil25；5)密封基板，以便培养物获得最佳气体供应(氧气，二氧化碳)。透气性薄膜粘合于基板(例如，使用医用压力敏感性硅氧烷粘合剂)。在基板的顶部，第二板(7)覆盖培养隔室和通道。盖片粘合于基板(例如，使用二氯乙烷)。给基板安装路厄口(1和3)(例如，使用医用硅氧烷粘合剂)并允许外周流控系统与入口和出口通道连接。通过入口(1)以基质-细胞悬浮液接种系统。基质凝胶化后，将外周流控系统连接于各口，并给培养隔室连续灌注细胞培养基和补充物。从出口培养基口(3)收集样品用于进一步分析。
图2：装置2的顶视图(图2A)和一个培养单元的横切面(图2B)。与装置1类似，在基板(6)上实现多重平行培养单元，基板(6)覆盖盖片(7)，并在底部以透气性薄膜(5)密封。在该板上实现了直径10mm、高度4mm的更大的培养隔室。
图3：装置3的顶视图(图3A)和一个培养单元的横切面(图3B)。与装置1和2类似，在基板(6)上实现多重平行培养单元，基板(6)覆盖盖片(7)，并在底部以透气性薄膜(5)密封。在本发明的这一实施方式中，通过分开的口(8)和基质-通道(9)给培养隔室注入基质-细胞悬浮液。该实施方式的培养隔室(2)的直径为10mm，高度4mm。接种时，使用注射器通过基质口(8)给培养隔室注入基质-细胞悬浮液。注入完毕，以盲端路厄接头封闭基质口。基质凝胶化后，将外周流控系统连接于培养基供应源(1)和探测器取样口(3)，并给培养隔室连续灌注细胞培养基和补充物，所述细胞培养基和补充物通过培养基通道(4)进入培养室。
图4：装置4的顶视图(图4A)和一个培养单元一部分的3D投影图(图4B)。与装置1至3类似，在基板(6)上实现多重平行培养单元，基板(6)覆盖盖片(7)，并在底部以透气性薄膜(5)密封。在本发明的这一实施方式中，通过中空纤维膜(例如，MicroPES，Membrana，外径2mm；(10))将细胞培养基和补充物输送至培养室。在本发明的这一实施方式中，所述中空纤维膜被安装于包含所述培养室的分隔盒内。将该盒插入基板内，使得培养基通道、基质通道和通气通道各自适当连接。接种时，通过基质口(8)和基质通道(9)给培养隔室注入细胞/基质-细胞悬浮液。基质口关闭后，可通过改变温度诱导基质的受控凝胶化。将外周流控导管连接于入口和出口。通过将培养基泵入系统内同时打开用于排气口(11)的口，给所述第一和第二中空纤维膜各自注入培养基。采用这一方案，避免了流控系统内出现干扰性气泡。给系统注入细胞培养基完毕后关闭排气口，而进来的细胞培养基现在可均匀灌注培养隔室。培养隔室灌注完毕后，培养基通过第二中空纤维膜(其保留了基质和细胞)，经探测器取样口排出并被收集到各个探测器取样容器内。
图1至4的图例
1-培养基供液源口(入口)
2-培养隔室
3-探测器取样口(出口)
4-培养基通道
5-给培养物供应气体的透气性薄膜
6-具有通道和培养隔室的基板
7-盖片
8-用于给培养隔室注入基质-细胞悬浮液的口
9-用于给培养隔室注入基质-细胞悬浮液的通道
10-用于供应培养基和探测器取样的中空纤维
11-排气口和给系统注入培养基的口
图5：根据实施例1的装置1内的多重平行PBMC培养物的细胞因子谱。数据是采用多重珠阵列技术(Luminex，Austin，TX.)产生的。TNF-α、IL-5、IL-4、IL-2和IFN-γ被纳入本测试。接种后24小时，将100μL的100ng/mL OKT-3溶液注入培养系统，引发特异性免疫反应。
图6：根据实施例2的装置1内的多重平行PBMC培养物的细胞因子谱。数据是采用多重珠阵列技术(Luminex，Austin，TX.)产生的。TNF-α、IL-5、IL-4、IL-2和IFN-γ被纳入本测试。接种后24小时，将100μL的100ng/mL OKT-3溶液注入培养系统，引发特异性免疫反应。
图7：一个示例性培养单元和相应的外周流控系统的实验性结构。冷却的培养基存储池(A)含有细胞培养基和补充物。存储池连接于培养基泵(B)，例如，蠕动泵或注射泵。管路进入培养箱并连接于培养基供液源口(C)。该口前方直接为注射位置(G)，例如是隔膜，其允许施用药物、刺激物或具有免疫学意义的其他化合物。培养细胞并灌注到培养隔室(D)内。通过探测器取样口(E)排出废弃培养基，并收集到样品容器(F)内。该系统允许以各个外周流控系统同时处理多重平行培养单元。每一经细胞培养基灌注的单元产生独立的样品用于进一步分析。
图7的图例
A-细胞培养基存储池(优选地4℃)
B-培养基泵
C-培养基供液源口(入口)
D-装置的细胞培养隔室
E-探测器取样口(出口)
F-独立探测器取样容器
G-施用药物、刺激物或其他免疫学活性物质的注射位置
图8：根据实施例4的装置4内的PBMC培养物的葡萄糖和乳酸盐谱。数据点以时间依赖方式指明流通中这些代谢参数的浓度。使用Ektachem系统(Johnson&Johnson)分析流通。与未经OKT-3和IL-2刺激的对照培养物相比，流通中的葡萄糖浓度降低而乳酸盐浓度升高，可以看出经OKT-3和白细胞介素-2刺激的培养物的代谢活性增加。
图9：以抗Ki67抗体特异性染色并以苏木精复染的琼脂糖基质中PBMC培养物的免疫组织学切片：对照(左侧)和以OKT-3和IL-2刺激的PBMC培养物(右侧)。根据实施例4(装置4)培养7天后分析细胞基质培养物。与经过刺激的培养物内显示T细胞活化和诱导增殖的对照培养物相比，对照切片显示Ki67阳性细胞(黑色)较少。
图10：以抗CD3抗体特异性染色并以苏木精复染的琼脂糖基质中PBMC培养物的免疫组织学切片：对照(左侧)和以OKT-3和白细胞介素-2刺激的PBMC培养物(右侧)。根据实施例4使用装置4的实施方式(见图4/4B)培养7天后分析细胞基质培养物。与显示诱导T细胞增殖的经过刺激的培养物相比，对照切片显示CD3阳性细胞(黑色)较少。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步阐述本发明。
缩写：
PBMC-外周血单个核细胞
FCS-胎牛血清
℃-摄氏度
g，mg，μg-克、毫克、微克
L，mL，μL，nL-升、毫升、微升、毫微升
mm-毫米
PC-聚碳酸酯
h，min-小时，分钟
IL-白细胞介素
TNF-α-肿瘤坏死因子α
IFN-γ-干扰素-γ
实施例1
采用标准方案复苏冻存的人类PBMC(通过Ficoll密度梯度离心法分离自全血)。在X-Vivo 15细胞培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中将细胞浓度调整至每毫升3E8个活细胞，该培养基补充了5mg/mL VII型琼脂糖(由50mg/mL 37℃液体溶液制备，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2.5μg/mL纤连蛋白(人类，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和1x青霉素/链霉素溶液(100x，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
装置由1mm PC板制得，装有培养隔室、进料和排出管(见图1和1A)。该板在顶部覆盖了1mm PC板，该处附着了路厄连接器，而透气性膜(Biofoil25，Greiner bio-one，Kremsmünster，Germany)位于板的底部，用于培养物的最佳气体供应。装置1的这一具体实施方式的培养隔室的体积为160μL。将该装置置于湿化培养箱内培养(37℃/5％二氧化碳)。
图1A进一步演示了该装置的3个培养隔室，给培养隔室注入位于液体琼脂糖培养基内的细胞悬浮液，避免产生气泡(4.8E7个或PBMC/培养隔室)。将整个培养装置在4℃冷却5min，以便使基质凝胶化。随后给周围流控系统预注入X-Vivo 15细胞培养基，并与培养装置的路厄连接器相接触。使用蠕动培养基泵将流速设定为13.1μL/h。
每日获取样品并立即冷冻于-20℃，用于随后采用多重珠阵列技术(Luminex，Austin，TX)分析细胞因子。
接种24小时后获取第二份样品，然后通过流控系统中的注射位置施用100μL OKT-3抗体(X-Vivo 15内的100ng/L溶液，Ortho Biotech，Bridgewater，NJ)。接种后5天获取最后一份样品并使用吖啶橙(1μg/mL，Sigma，St.Louis，MI)和溴乙啶(4μg/mL，Sigma，St.Louis，MI)检查培养物的活力。
图5给出了细胞因子分析的结果。t＝0h的点代表仅X-Vivo 15细胞培养基内的细胞因子浓度。接种培养系统后24小时，仅观察到低水平的细胞因子，证明基质和系统没有刺激作用。施用OKT-3后24小时可观察到IL-2突然大量增加。OKT-2抗体特异性结合T细胞CD3受体的η-链。这些被活化的T细胞开始释放细胞因子，特别是IL-2。促炎性细胞因子例如IFN-γ和TNF-α也被释放。这一体外系统在此效仿了将OKT-3施用于人类后产生的药物作用和常见的不良反应。在最初的IL-2突然大量产生之后，其水平在72小时下降。经吖啶橙和溴乙啶染色分析，5天后，系统内的基质辅助的培养物显示高活力。因此，本发明的培养系统和方法允许以时间依赖性方式检查人类PBMC的免疫功能刺激和免疫学效应，同时细胞的氧气和营养物的最佳支持能够维持其高活力。
实施例2
如实施例1所述进行本实验。PBMC来自一不同的供者，随后将细胞培养于RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)，培养基中补充了10％FCS(Biochrom，Berlin，Germany)和1x青霉素/链霉素溶液(100x，Invitrogen，Carlsbad，CA)。如前所述，给培养装置1的培养隔室(见图1和1A)注入液体琼脂糖培养基(RPMI 164010％FCS细胞培养基，补充了5mg/mL VII型琼脂糖(来自50mg/mL 37℃的液体溶液，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2.5μg/mL纤连蛋白(人类，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和1x青霉素/链霉素溶液(100x，Invitrogen，Carlsbad，CA))和细胞(4.8E7PBMC/培养隔室)。以13.1μL培养基的恒定灌注速度预培养24小时之后，施用100μL 100ng/mL的OKT-3溶液。每24小时获取样品，冷冻于-20℃，直至用于确定细胞因子水平。
这些实验样品的细胞因子谱(图6)与实验1中所获得的结果相当。同样，施用OKT-3导致IL-2大量释放，而且IL-5最初也升高，类似于实施例1的情况。促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α仅轻度升高，说明存在供者特异性差异。同样，细胞因子水平的高度可归因于细胞材料的差异以及X-Vivo 15与RPMI 1640 10％FCS的培养基配制之间的差异。与实施例1相似，OKT-3刺激产生的免疫功能效应表现出时间依赖性方式。
实施例3
图4和4B所示的培养装置的这一具体实施方式具有3mmx7mmx7mm的培养隔室，因此其培养容积为147μL。如图4B所示，将第一和第二中空纤维膜(内经1.5mm/外径2.0mm/Micro PES毛细管膜/Membrana，Wuppertal，Germany)插入分隔盒内的3mm聚碳酸酯基板内。第一中空纤维膜连接于通向入口和通气口的通道。第二中空纤维膜连接于通向出口和通气口的通道。出口通过导管连接于样品收集瓶。培养隔室连接于基质口，以允许液体的形成凝胶的基质注入进来。培养隔室和用于通气、培养基供应和探测器取样的通道覆盖了1mm的聚碳酸酯板，其中所有用于连接管路的路厄口位于顶部，而透气性薄膜(Biofoil25，Greiner bio-one，Frickenhausen，Germany)位于底部。使用压力敏感性硅氧烷粘合剂(M7-4502，Dow Corning，Midland，USA)将所述3mm的基板和1mm的盖片以及所述3mm的基板和透气性薄膜结合在一起。类似于本发明的其他实施方式，在一个外形尺寸相当于多孔板的基板上实现了6个多重平行培养隔室。
将培养于RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，USA)+10％FCS(Biochrom，Berlin，Germany)中的Ramos细胞(5E5个活细胞/人Burkitt淋巴瘤/CD20阳性，CD3阴性)和Jurkat细胞(1E6个活细胞/人白血病T细胞淋巴母细胞/CD3阳性，CD20阴性)混合，以产生这些细胞的共培养物，并在200xg离心5min。细胞沉淀重悬于100μL RPMI 1640+10％FCS，并与以下物质混合：856μL纤维蛋白原(3.5mg/mL/Sigma-Aldrich，St.Louise，USA)、7μL抑肽酶(5mg/mL，Sigma-Aldrich)和25μL凝血酶溶液(50U/mL，Sigma-Aldrich)。打开入口和出口，使用1mL注射器将细胞基质溶液快速注入两个培养隔室，令纤维蛋白凝胶37℃聚合10min。凝胶化后关闭基质口。每一培养隔室的入口通过管路连接于供应培养基的5mL注射器(RPMI1640+10％FCS+35μg/L抑肽酶)，而每一出口通过管路连接于样品收集瓶。在每一培养隔室中，通过打开的通气口和为了收集多余培养基而连接注射器，使用细胞培养基冲刷第一中空纤维。使用连接于出口通气口的注射器冲刷每一第二中空纤维，并将多余培养基收集到相应的样品瓶内。取下连接于通气口的注射器，将所述口关闭。更换样品瓶。将连接于入口的培养基供应注射器插入注射泵(KDS 220，KDScientific，Holliston，USA)。将反应器转移至培养箱内(37℃，5％CO2)，启动灌注泵，连续流速为25μL/hr。
培养一天后，使用解剖刀切开装置底部的透气性薄膜而打开一个培养隔室，并将细胞基质块移至反应管内。将凝胶切成片，并与250μg纤溶酶(Sigma-Aldrich)在37℃温育1hr。凝胶被酶消化后，离心细胞，以20μLAPC-缀合的抗CD3抗体(BD，San Jose，USA)和20μL FITC-缀合的抗CD20抗体(BD)染色沉淀物，并使用Partec CyFlow space(Münster，Germany)通过流式细胞术进行分析。培养5天后以类似方式重复这一过程。在第1天，36％的CD3-CD20阳性细胞呈CD20阳性(Ramos)，64％为CD3阳性(Jurkat)，在培养第5天，91％为CD20阳性，9％为CD3阳性。因此，所述培养装置允许对培养的细胞进行终点流式细胞术分析。
实施例4
在以下实施例中，使用了与实施例3中所述装置类似的装置。同样，在板上实现了尺寸为3x7x7mm的培养隔室。
复苏冻存的人PBMC(通过密度梯度离心分离自白血球分离术材料)，并使用标准的T形瓶在RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，USA)10％FCS(Biochrom，Berlin，Germany)中预培养过夜。在接种当日，收集PBMC，取1E8个细胞培养，并在10mL RPMI 1640+10％FCS+100U/mL ProleukinS
Figure GPA00001032481100271
(Aldesleukin，Novartis，Basel，Schweiz)+50ngmL OKT-3
Figure GPA00001032481100272
(Muromonab-CD3，Ortho Biotech，Neuss，Germany)中于37℃刺激2小时。对照仅在10mL RPMI 1640+10％FCS中于37℃培养2小时。以细胞培养基洗涤PBMC两次，重悬于750μL RPMI 1640+10％FCS+100U/mL ProleukinS
Figure GPA00001032481100273
和750μL RPMI 1640+10％FCS(对照)，上述培养基与250μL预加温的溶于磷酸缓冲盐水的20mg/mL低熔点VII型琼脂糖(Sigma-Aldrich)混合。如实施例3所述注入细胞基质悬浮液，在4-8℃凝胶化10min。如实施例3所述连接管路并冲刷中空纤维膜。以RPMI 1640+10％FCS+100U/mL Proleukin S
Figure GPA00001032481100274
和RPMI 1640+10％FCS+(对照)开始进行培养基灌注，25μL/hr。
在第1，2，5，6和7天收集灌注的培养基，随后分析代谢参数葡萄糖和乳酸盐(Ektachem，Johnson&Johnson，Langhorne，USA)。在第7天，通过在磷酸缓冲盐水中的4％多聚甲醛溶液(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)中固定2小时来制备用于组织学分析的细胞基质培养物。随后，将标本在如下一组浓度逐渐增加的醇中进行脱水，在每一浓度脱水20分钟：80％的乙醇，96％的乙醇，和100％异丙醇。脱水后将基质转移至组织盒内，在二甲苯中浸泡2x10min，然后石蜡(Carl Roth GmbH&Co，Karlsruhe，Germany；65℃)包埋2小时。将标本储存于-20℃直至制备7μm切片并在SuperfrostPlus载片(Menzel GmbH，Braunschweig，Germany)上干燥过夜。脱蜡时将载片在二甲苯中温育2x5min，随后在如下次序的液体中再水化：异丙醇，100％的乙醇，96％的乙醇，70％的乙醇(各3min)，和纯净水(10min)。
进行免疫组织化学染色时，使用纯净水中的1x靶修复溶液(targetretrieval solution)(DAKO，Hamburg，Germany)在95-99℃将切片解蔽20-30min，然后缓慢冷却20-30min。载片以PBS洗涤10min后，用PBS 2％FCS封闭15min。载片与一抗即小鼠抗人CD3抗体(BD，San Jose，USA)和抗Ki67抗体(Biotrend，Cologne，Germany)温育过夜，随后与二抗即生物素缀合的抗小鼠抗体(Dianova，Hamburg，Germany)和碱性磷酸酶缀合的Extravidin(Sigma-Aldrich)各温育45min，每一次温育后有一次洗涤(PBS)。显像时与Sigma Fast Red(Sigma-Aldrich)温育5-15min，随后以纯净水洗涤。将载片以苏木精复染1-5min，以纯净水快速洗涤，并以自来水冲洗(10min)，然后以Kaiser甘油白明胶封片，显微镜下观察(亮视野)。
OKT-3是鼠IgG2a单克隆抗体，其识别人T细胞受体的CD3的η链。当低剂量浓度的该抗体与白细胞介素-2一起使用时可诱导T细胞增殖。分析每天的灌注培养基样品的代谢参数即葡萄糖和乳酸盐。比较对照与经OKT-3/IL-2刺激的培养物的结果，检测到代谢活性升高(见图8)。切片的，免疫组织学染色显示，经OKT-3/IL-2刺激的培养物中Ki67的表达更高，证实了代谢方面的数据(见图9)。此外，培养后7天，对比抗CD3染色的经OKT-3/IL-2刺激的培养物与对照培养物的切片发现，CD3阳性细胞(T细胞)被诱导增殖，并检测到了T细胞克隆(见图10)。这一实施例说明，灌注培养基的分析以及对细胞基质培养物的免疫组织学终点分析允许在体外对细胞应答进行全面的作用模式分析。这些细胞应答是由培养物中的特定微环境诱导的。出乎预料的是，这种微环境使得细胞应答与体内的应答相类似。这种特定的微环境例如可以通过本发明的培养装置而实现。
显然，在上述教导下，可以对本发明做出大量的改动和变化。因此要理解的是，在所附权利要求书的范围内，可以采取不同于在此具体描述的方式来实施本发明。

Claims (47)

1.一种培养装置，其具有顶面、底面和至少一个侧面，所述培养装置包括多个培养单元，其中每一单元包括：
(i)培养室，
(ii)用于将所述单元与外部液体供应源可逆连接的入口，和
(iii)用于从所述单元排出液体的出口，
其中所述入口与所述培养室流体连通，而所述培养室与所述出口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室，
其中所述入口可与来自所述培养装置的顶面或侧面的外部液体供应源连接，且所述出口可与来自所述装置的顶面或侧面的排出导管连接。
2.一种培养装置，其包括多个培养单元，其中每一单元包括：
(i)培养室，
(ii)用于将所述单元与外部液体供应源可逆连接的入口，和
(iii)用于从所述单元排出液体的出口，
其中所述入口与所述培养室流体连通，而所述培养室与所述出口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室，由此所述液体流动的主流在所述培养装置的平面内穿过培养室。
3.权利要求1或2的培养装置，其中所述流体连通是由所述培养室与入口之间的通道和所述培养室与出口之间的通道建立的。
4.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室的至少一个面用透气性薄膜密封。
5.权利要求1至3中任一项的培养装置，其中除了参与所述培养室与所述出、入口之间流体连通的开口以外，所述培养室是气密性封闭的。
6.权利要求5的培养装置，还包括位于所述入口与外部液体供应源之间的导管，所述导管包括允许将液体培养基平衡至预定的氧气和二氧化碳含量的透气性导管。
7.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室的培养容积为25至1000μl。
8.权利要求7的培养装置，其中所述培养室的培养容积为50至250μl，优选地为50至100μl。
9.前述权利要求中任一项的培养装置，所述装置包括2至200个培养单元。
10.前述权利要求中任一项的培养装置，其中可将测试物质和/或刺激剂分别添加至每一个单元内的活细胞材料中。
11.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室是透明的，以允许对所述培养室内存在的细胞进行显微镜观察。
12.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室含有预先形成的基质。
13.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室含有包埋于基质中的活真核细胞材料。
14.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养室含有接种于基质中的活真核细胞材料。
15.权利要求12至14中任一项的培养装置，其中所述基质选自水凝胶、泡沫材料或无纺纤维。
16.权利要求12至15中任一项的培养装置，其中所述基质是水凝胶。
17.权利要求13至16中任一项的培养装置，其中所述活真核细胞材料包括白细胞或白细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物。
18.权利要求17的培养装置，其中所述白细胞是全外周血单个核细胞、外周血单个核细胞的确定亚群、体外分化的外周血单个核细胞亚群以及它们的任何共培养物。
19.权利要求17的培养装置，其中所述感兴趣的其他细胞选自内皮细胞、干细胞、滤泡状树突细胞、基质细胞和其他细胞。
20.前述权利要求中任一项的培养装置，其中所述培养单元包括额外的入口，用于将包含真核细胞的悬浮液和/或形成基质的水性组合物引入培养室。
21.前述权利要求中任一项的培养装置，其中培养单元还包括穿过培养腔隙的中空纤维膜，由此所述中空纤维膜与所述培养室和出、入口流体连通，以允许液体流动通过所述培养室。
22.权利要求21的培养装置，其中所述中空纤维膜被安装于包含所述培养室的分隔盒内。
23.前述权利要求中任一项的培养装置，其提供微环境。
24.培养免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(a)将在形成基质的水性组合物中的免疫细胞悬浮液引入培养室，
(b)固化所述悬浮液，由此形成其中包埋有所述免疫细胞的基质，和
(c)将所述免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
25.培养免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(a)将在形成基质的水性组合物中的免疫细胞悬浮液引入权利要求1至23中任一项的培养装置的至少一个培养单元的培养室，
(b)固化所述悬浮液，由此形成其中包埋有所述免疫细胞的基质，和
(c)将所述免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
26.培养免疫细胞的方法，包括将包埋于基质中的免疫细胞在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
27.培养免疫细胞的方法，包括将包埋于基质中的免疫细胞在权利要求1至23中任一项的培养装置的至少一个培养单元的培养室内在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中向所述基质连续注入液体培养基和补充物。
28.权利要求25或27的方法，其中所述各个培养单元提供类似的条件。
29.权利要求24至28中任一项的方法，其中所述基质选自水凝胶、泡沫材料、海绵状物或无纺纤维。
30.权利要求29的方法，其中所述基质是水凝胶。
31.权利要求24至30中任一项的方法，其中所述免疫细胞是白细胞或白细胞与感兴趣的其他细胞的共培养物。
32.权利要求31的方法，其中所述白细胞可以是全外周血单个核细胞、外周血单个核细胞的确定亚群、体外分化的外周血单个核细胞亚群以及它们的任何共培养物。
33.权利要求31的方法，其中所述感兴趣的其他细胞选自内皮细胞、干细胞、滤泡状树突细胞、基质细胞和其他细胞。
34.权利要求24至33中任一项的方法，其中所述免疫细胞在预定的培养条件下培养达8周的时间。
35.权利要求24至34中任一项的方法，其中所述培养条件由培养基、补充物、基质、技术支持微环境和气体供应确定。
36.权利要求24至35中任一项的方法，其中通过密封所述培养室的至少一个面的透气性膜给培养的细胞提供气体。
37.权利要求24至36中任一项的方法，其中所述基质、培养基组成、细胞密度和细胞混合物允许形成微类器官结构。
38.权利要求24至37中任一项的方法，其中所述基质、培养基组成、细胞密度和细胞混合物允许形成微环境。
39.分析测试化合物对免疫细胞的影响的方法，其包括以下步骤：
(a)将包埋于基质中的免疫细胞在权利要求1至23中任一项的培养装置的至少一个培养单元的培养室中在预定的培养条件下培养预定的培养时间，其中给所述基质连续注入液体培养基和补充物，
(b)通过所述入口将所述测试化合物加入至少一个培养单元，
(c)在存在所述至少一种测试化合物的情况下按照步骤a)所述培养免疫细胞，
(d)从其中加入了所述测试化合物的所述至少一个培养单元的出口排出的培养基中取出至少一个样品，和
(e)分析所述样品中所述测试化合物对所述免疫细胞的影响。
40.权利要求39的方法，其中所述基质选自水凝胶、泡沫材料、海绵状物或无纺纤维。
41.权利要求40的方法，其中所述基质是水凝胶。
42.权利要求39的方法，其中在步骤e)中分析所述样品中选自细胞因子、趋化因子和抗体的可溶性因子的存在和浓度。
43.权利要求39至42中任一项的方法，其中取出所述样品但维持对所述细胞的培养。
44.权利要求39的方法，其中各个培养单元之间的所述测试化合物、测试化合物的浓度、所述细胞暴露于所述测试化合物的时间是不同的。
45.权利要求25、27和39至44中任一项的方法，还包括在线监测和/或离线监测所述出口排出的培养基中的细胞培养条件。
46.权利要求45的方法，其中所述细胞培养条件包括氧含量、pH和代谢物。
47.权利要求39至46中任一项的方法，还包括在所述培养过程之后通过选自以下一组的方法分析所述免疫细胞：免疫荧光、光学显微镜、流式细胞术、荧光激活的细胞分选、组织学、分子生物学技术和酶联免疫斑点测定方法。
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