CN110998330A - 用于分析荧光免疫斑点测定的方法和系统 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于分析荧光免疫斑点测定的方法。该方法包括：用至少一种激发光照射测定板的孔；针对每一种激发光，以原始图像格式捕获孔的至少一个图像；针对每一种激发光生成孔中的分析物释放分布的模型；以及将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定了至少一个多分泌物荧光免疫斑点。针对给定的激发光生成分析物释放分布的模型包括：将孔的捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布；以及基于其中的局部极大值来检测潜在分析物释放位点。

Description

用于分析荧光免疫斑点测定的方法和系统

技术领域

本公开总体上涉及研究技术，诸如测定；并且更具体地，涉及用于分析荧光免疫斑点(FluoroSpot)测定的方法和系统本公开还涉及一种计算机可实现的程序，其可操作以在前述设备上执行前述方法。

背景技术

典型地，诸如测定的研究过程用于医学、分子生物学等等领域。例如，测定广泛地用于免疫学以确定细胞响应于疫苗、传染病、过敏原等的活化率。将抗体作为主要组成部分的测定典型地被称为免疫测定。免疫测定的示例包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点(ELISPOT)测定、荧光免疫斑点测定。

一般地，免疫测定包括对液体样本中的分析物进行检测和量化或者监测观察中的细胞分泌的分析物(例如，细胞因子和免疫球蛋白)。例如，在荧光免疫斑点测定中，可以将特定于细胞因子的捕获抗体添加到其中具有孔的测定板。此后，可以在存在或不存在活化刺激物的情况下将细胞添加到孔，并且可以培养测定板以允许细胞进行细胞因子分泌。分泌的细胞因子可以由在孔的底部处的固定的特定于细胞因子的捕获抗体捕获。此后，可以移除细胞，并且可以清洗孔并添加特定于细胞因子的检测抗体和荧光团偶联物。最终，通过成像来捕获分泌的细胞因子的分泌足迹(或斑点)，并且分析此类图像以用于识别多个分析物、对分泌出分析物的细胞的数量进行计数等等。

然而，存在与此类测定的分析相关联的许多限制。第一，观察中的细胞分泌的分析物量不同，由此生成不同大小和强度的斑点。因此，在一段时间内，这样的分泌可以在分析物的斑点中引起不同的空间强度分布。此外，在很多情况下，所捕获的图像可能被成像设备饱和(或过度曝光)，并且斑点的实际空间强度分布不是清晰可见。通常，细胞靠近彼此定位，由此导致所捕获的图像中的斑点重叠。当前现有的分析技术没有充分发展，不能准确地单独细胞的分泌强度并区分单独的斑点。所捕获的图像的饱和还加剧了与将单独斑点与重叠斑点区分开相关联的问题。第二，当前现有的技术无法准确地确定斑点的中心。具体地，与斑点的其他区域相比，斑点的中心发出更强的荧光信号，由此有助于识别来自单个细胞的多种分泌物。然而，归因于对斑点的中心的准确确定的现有限制，难以识别来自细胞的多种分泌物，并且容易出错。第三，用于当前现有的技术的设备在测定的分析中引入问题，诸如由成像设备捕获的图像的压缩、对图像的不准确捕获(诸如图像之间的移位)、由于设备的振动引起所捕获的图像的模糊、色差等等。第四，用于常规技术的设备无法有效地测量测定的一个或多个孔中的分析物的浓度。此外，它展开重复的测试来测量分析物的浓度，由此增加过程的时间、成本和复杂性。然而，整个过程导致确定潜在分析物释放细胞和孔中的分析物的浓度的效率降低。

因此，鉴于前述讨论，需要克服与测定的分析相关联的前述缺点。

发明内容

本公开力图提供一种用于分析荧光免疫斑点测定的方法。本公开还力图提供一种用于分析荧光免疫斑点测定的系统。本公开力图向不准确地确定单独细胞的分泌物强度、区分单独斑点的误差以及常规测定分析技术中的测量分析物的浓度的现有问题提供解决方案。本公开的目的是提供一种至少部分地克服在现有技术中遇到的问题的解决方案，并且提供一种有效、稳健且易于实施的测定分析技术。

在第一方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析荧光免疫斑点测定的方法，该方法包括：

(i)用至少一种激发光照射具有多个孔的测定板的孔，其中在给定的时间，仅由一种激发光照射测定板的孔；

(ii)针对至少一种激发光中的每一者，以原始图像格式捕获孔的至少一个图像，

(iii)针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型，其中针对给定的激发生成孔中的分析物释放分布的模型

(a)将针对给定的激发光的孔的捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布；以及

(b)基于预扩散分析物分布中的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点；以及

(iv)将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点，

其特征在于，针对至少一种激发光中的每一者生成孔中的分析物释放分布的模型包括：基于检测到的至少一个潜在释放位点来优化预扩散分析物分布；以及修改孔中的分析物释放分布的模型以分析其中的至少一个荧光免疫斑点。

本公开的优点在于，有效地检测和量化液体样本中的细胞分泌出的分析物。

在提供了一种符合先进而高度有效且稳健的分析技术的方法方面，本公开的实施方式是有利的。此外，在用于检测高荧光强度并将荧光强度与孔中的分析物的浓度相关联的自动感测机制方面，本公开的实施方式是有利的。有益地，分析物分布和/或浓度测量需要很少或不需要人工干预，由此降低测定的操作成本。

可选地，用于照射测定板的孔的至少一种激发光取决于孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物。

可选地，孔的至少一个图像指示在空间上定位的分析物来源和在时间上定位的分析物来源。

可选地，将孔的捕获的至少一个图像去卷积包括实施以下项中的至少一项：稀疏促进的正则化、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。

可选地，该方法还包括：生成与测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台；以及基于生成的X-Y平台来获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。

可选地，通过采用校准算法来生成X-Y平台。

可选地，该方法还包括识别孔的中心以用于确定在空间上限定的荧光免疫斑点。

可选地，基于检测到的至少一个潜在分析物释放位点来优化预扩散分析物分布被至少一次迭代地实施，并且包括采用以下各项中的至少一项：交替方向法、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。

可选地，修改孔中的分析物释放分布的模型是基于至少一个用户可选择的参数，其中至少一个参数选自包括以下项的组：荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点大小、估计的分析物释放量、荧光免疫斑点颜色、孔中的感兴趣区域。

可选地，该方法还包括获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。

可选地，将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类采用基于距离的分层聚类算法。

可选地，该方法还包括显示孔中的分析物释放分布的合成模型，其中合成模型包括检测到的至少一个荧光免疫斑点，并且其中不同地呈现单分泌物荧光免疫斑点和多分泌物荧光免疫斑点。

可选地，通过成像来执行捕获孔的至少一个图像。

可选地，通过使用以下各项中的至少一项来执行成像：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。

在第二方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析荧光免疫斑点测定的系统，该系统包括：

(i)光源布置，其被配置为生成至少一种激发光，其中在给定的时间，光源布置仅生成一种激发光；

(ii)准直布置，其定位在生成的激发光的光路上，其中准直布置被配置为使生成的激发光准直；

(iii)多波段分束器，其定位在准直的激发光的光路上，多波段分束器由支撑布置支撑，其中多波段分束器被配置为

(a)将准直的激发光反射到测定板上，以照射具有多个孔的测定板的孔；

(b)从测定板接收激发光的反射和发射光；以及

(c)反射被反射的激发光的一部分，同时将被反射的激发光的剩余部分和发射光传输到滤光布置；

(iv)滤光布置，其包括滤光轮和至少一个发射滤光片，其中滤光轮被配置为在其中容纳至少一个发射滤光片，并且其中至少一个发射滤光片被配置为(d)去除从多波段分束器接收到被反射的激发光的剩余部分；以及(e)对发射光进行滤光，同时将发射光传输到光学布置；

(v)光学布置，其被配置为将经滤光的发射光引导到成像装置上；

(vi)成像装置，其被配置为针对至少一种激发光中的每一者以原始图像格式捕获孔的至少一个图像；以及

(vii)处理模块，其耦合到成像装置，其中处理模块被配置为

(f)针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型；以及

(g)将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点。

可选地，该系统还包括定位在准直的激发光的光路上的至少一个激发滤光片，并且其中至少一个激发滤光片被配置为对准直的激发光进行滤光。

可选地，光源布置包括定位在致动器布置上的至少一个光源，其中通过以下各项中的至少一项来实施至少一个光源：发光二极管、卤素光源、氙光源、激光源。

可选地，通过以下各项中的至少一项来实施多波段分束器：透明镜、半透明镜、棱镜、二向色镜。

可选地，光学布置包括以下各项中的至少一项：远心透镜、微距透镜。

可选地，支撑布置是滤光片立方体。

可选地，成像装置选自以下各项中的至少一项：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。

可选地，该系统还包括调谐器，并且其中调谐器还可操作以沿着测定板的X-Y平面水平地移动到至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中传感器可操作来获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。

可选地，该系统还包括可操作地耦合到调谐器的控制器，并且其中控制器被配置为：

-生成与调谐器水平地沿着测定板的X-Y平面的移动相关联的X-Y平台；以及

-将生成的X-Y平台提供到调谐器，

并且其中调谐器被配置为基于所提供的X-Y平台而沿着测定板的X-Y平面水平地移动。

可选地，制器可操作以通过采用校准算法来生成X-Y平台。

可选地，控制器还可操作以识别孔的中心。

可选地，控制器还可操作以：

-检测生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差；以及

-基于检测到的偏差来提供对调谐器的单独移动的校正。

可选地，该系统还包括耦合到成像装置和处理模块的可视化模块，其中可视化模块包括在与用户相关联的计算装置上渲染的用户界面，并且其中可视化模块被配置为执行以下各项中的至少一项：显示针对至少一种激发光中的每一者的捕获的至少一个图像、显示针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型、接收用户输入以控制处理模块的操作、显示孔中的分析物释放分布的合成模型。

可选地，该系统还包括用于从至少一种激发光去除噪声的掩模。

可选地，如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模可操作以从系统布置移除。

在第三方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的方法，该方法包括确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中对分析物的浓度的确定包括：

(a)识别至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；

(b)感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与至少一个荧光免疫斑点测定相关联的荧光强度；以及

(c)将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

可选地，该方法还包括：

-生成与测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台；以及

-基于生成的X-Y平台来获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。

更可选地，通过采用校准算法来生成X-Y平台。

可选地，该方法还包括识别孔的中心以用于确定在空间上限定的荧光免疫斑点。

可选地，孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度是基于荧光强度。

可选地，该方法还包括获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。

可选地，该方法还包括从至少一种激发光去除噪声。

可选地，分析物包括以下各项中的至少一项：血清样本、血浆样本、尿样、溶液样本、病毒颗粒、蛋白质、细胞培养液、所述孔中的至少一种潜在的分析物。

在第四方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的系统，该系统包括传感器布置，该传感器布置用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中传感器布置包括：

(a)传感器，其可操作以读出至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；以及

(b)调谐器，其被配置为获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度，

该系统的特征在于，调谐器还被配置为将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

可选地，调谐器还可操作以沿着测定板的X-Y平面水平地移动到至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中传感器可操作来获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。

可选地，该系统还包括可操作地耦合到调谐器的控制器，并且其中控制器被配置为：

-生成与调谐器水平地沿着测定板的X-Y平面的移动相关联的X-Y平台；以及

-将生成的X-Y平台提供到调谐器，

并且其中调谐器被配置为基于所提供的X-Y平台而沿着测定板的X-Y平面水平地移动。

可选地，制器可操作以通过采用校准算法来生成X-Y平台。

可选地，控制器还可操作以识别孔的中心。

可选地，控制器还可操作以：

-检测生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差；以及

-基于检测到的偏差来提供对调谐器的单独移动的校正。

可选地，调谐器被配置为调节传感器布置中、优选地传感器中的电流。

可选地，该系统还包括用于从至少一种激发光去除噪声的掩模。

可选地，如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模可操作以从系统布置移除。

在第二方面，本公开的实施方式提供了一种计算机程序产品，其包括上面存储有计算机可读指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机可读指令能够由包括处理硬件的计算机化装置执行以执行前述一种或多种方法。

本公开的实施方式基本上消除或至少部分地解决了现有技术中的前述问题，并且实现准确且可靠的测定分析。

从附图以及结合所附所附权利要求书解释的说明性实施方式的详细描述中，本公开的额外方面、优点、特征和目的将变得显而易见。

应当理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本公开的范围的情况下，本公开的特征易于以各种组合进行组合。

可以通过以下示例获得对本发明的更好理解，阐述以下示例是为了进行说明，而不应被解释为限制本发明。

附图说明

当结合附图阅读时更好地理解以上概述以及以下对说明性实施方式的详细描述。为了说明本公开，在附图中示出了本公开的示例性构造。然而，本公开不限于本文所公开的特定方法和工具。此外，本领域的技术人员将理解附图不是按比例绘制的。在任何可能之处，相同的元件已经由相同的标号指示。

现在将参考以下各图仅以举例方式描述本公开的实施方式，在附图中：

图1是根据本公开的实施方式的用于分析荧光免疫斑点测定的系统的示意图；

图2A、图2B和图2C分别是根据本公开的实施方式的孔中的第一分析物释放分布的生成的模型、第二分析物释放分布的生成的模型和分析物释放分布的合成模型的图像的示意图；

图3示出了根据本公开的实施方式的用于分析荧光免疫斑点测定的方法的步骤；

图4是根据本公开的实施方式的用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度的系统的示意图；以及

图5示出了根据本公开的实施方式的用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度的方法的步骤。

在附图中，带下划线数字用于表示带下划线数字位于上方的项目或带下划线数字邻近的项目。不带下划线的数字是指由将不带下划线的数字与项目相关联的线标识的项目。当数字不带下划线并且附有相关联箭头时，不带下划线的数字用于标识箭头所指向的一般项目。

具体实施方式

应了解，为清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。

以下详细描述说明了本公开的实施方式及其实施方式。虽然已经公开了实行本公开的一些模式，但是本领域的技术人员将认识到，用于实行或实践本公开的其他实施方式也是可能的。

在一方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析荧光免疫斑点测定的方法，该方法包括：

(i)用至少一种激发光照射具有多个孔的测定板的孔，其中在给定的时间，仅由一种激发光照射测定板的孔；

(ii)针对至少一种激发光中的每一者，以原始图像格式捕获孔的至少一个图像，

(iii)针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型，其中针对给定的激发生成孔中的分析物释放分布的模型

(a)将针对给定的激发光的孔的捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布；以及

(b)基于预扩散分析物分布中的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点；以及

(iv)将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点，

其特征在于，针对至少一种激发光中的每一者生成孔中的分析物释放分布的模型包括：基于检测到的至少一个潜在释放位点来优化预扩散分析物分布；以及修改孔中的分析物释放分布的模型以分析其中的至少一个荧光免疫斑点。

在另一个方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析荧光免疫斑点测定的系统，该系统包括：

(i)光源布置，其被配置为生成至少一种激发光，其中在给定的时间，光源布置仅生成一种激发光；

(ii)准直布置，其定位在生成的激发光的光路上，其中准直布置被配置为使生成的激发光准直；

(iii)多波段分束器，其定位在准直的激发光的光路上，多波段分束器由支撑布置支撑，其中多波段分束器被配置为

(a)将准直的激发光反射到测定板上，以照射具有多个孔的测定板的孔；

(b)从测定板接收激发光的反射和发射光；以及(c)反射被反射的激发光的一部分，同时将被反射的激发光的剩余部分和发射光传输到滤光布置；

(iv)滤光布置，其包括滤光轮和至少一个发射滤光片，其中滤光轮被配置为在其中容纳至少一个发射滤光片，并且其中至少一个发射滤光片被配置为(d)去除从多波段分束器接收到被反射的激发光的剩余部分；以及(e)对发射光进行滤光，同时将发射光传输到光学布置；

(v)光学布置，其被配置为将经滤光的发射光引导到成像装置上；

(vi)成像装置，其被配置为针对至少一种激发光中的每一者以原始图像格式捕获孔的至少一个图像；以及

(vii)处理模块，其耦合到成像装置，其中处理模块被配置为

(f)针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型；以及

(g)将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点。

本公开提供了一种用于分析荧光测定的方法和系统。与用于测定的分析的常规技术和设备相比，所描述的方法和系统是简单、稳健且容易实施的。有益地，所描述的方法通过分析分泌出的分析物的斑点之中的不同空间强度分布来准确地确定细胞的分泌物浓度，并且区分单独的斑点。此外，所描述的方法准确地确定斑点的中心，由此有助于准确地识别来自单个细胞的多种分泌物。此外，该方法通过对具有高荧光强度的强斑点采用较低曝光来最小化传感器饱和的风险。另外地，该系统使用全自动化的传感器和校准仪器来有效地测量分析物的浓度。另外，本文中描述的系统便宜、容易使用、可靠、时间有效并且减少由于人工检查、通过成像设备对所捕获的图像的压缩、所捕获的图像的模糊(归因于移动或振动的部件和/或不精确的焦点)、错误校准、暂时或固有的噪声等等引起的误差。

在实施方式中，本文中使用的术语“测定”涉及基于荧光的测定。具体地，此类基于荧光的测定(例如，荧光免疫斑点测定)利用荧光的原理，以便研究诸如人类细胞、动物细胞等等细胞。更具体地，基于荧光的测定使得能够通过采用荧光标记的检测试剂不同地识别不同的分析物来同时分析由研究中的细胞分泌出的不同分析物。因此，不同分析物的分泌足迹(或荧光免疫斑点)是彼此不同的。此外，基于荧光的测定使得能够基于样本(具体地，液体溶液)中的分析物的荧光强度来测量由细胞分泌出的分析物的浓度。根据本公开的实施方式，本文中使用的术语“分析物”涉及通过实施诸如荧光免疫斑点测定的测定来分析的物质。

在本公开的实施方式中，本文中使用的术语“荧光免疫斑点测定”涉及枚举细胞分泌出的分析物的免疫测定。具体地，荧光免疫斑点测定涉及对由诸如人类细胞、动物细胞等等细胞分泌出的分析物的检测方法。此外，在实施方式中，本文中使用的术语“荧光免疫斑点”涉及分析物的分泌足迹。具体地，分析物的分泌足迹对激发光的波长敏感。更具体地，分析物的分泌足迹由成像装置捕获以检测分析物。

用于分析荧光免疫斑点测定的方法包括用至少一种激发光照射具有多个孔的测定板的孔，其中在给定的时间，仅由一种激发光照射测定板的孔。具体地，测定板(通常被称为微量滴定板、微型板、微孔板等)的多个孔包括至少一种荧光团检测到的分析物(在下文被称为“至少一种分析物”)。此外，在被至少一种激发光照射后，至少一种分析物可以发射荧光(被称为“至少一种发射光”)。此外，由细胞分泌出的至少一种分析物可以粘附到标签标记且生物素化的分析物特定检测抗体的混合物。此外，该混合物可以进一步粘附到偶联到不同荧光团的检测试剂。在实施方式中，至少一种发射光的波长可以大于至少一种激发光的波长。应当理解，尽管本文中描述的方法涉及对测定板的一个孔的分析，但可以实施该方法来分析测定板的一个以上孔。

在实施方式中，用于照射测定板的孔的至少一种激发光取决于孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物。由于可以使用不同的荧光团检测来检测分析物，因此可以采用不同的激发光来照射和分析不同的分析物。例如，可以用两种激光法“L1”和“L2”来照射包括两种荧光团检测到的细胞因子“A”和“B”的测定板的孔。在这样的示例中，激发光L1的波长可以匹配用来标记细胞因子质A的荧光团的波长，并且激发光L2的波长可以匹配用来标记细胞因子B的荧光团的波长。

此外，该方法包括针对至少一种激发光中的每一者，以原始图像格式捕获孔的至少一个图像。具体地，可以使用在用至少一种激发光照射孔时从至少一种分析物发射的至少一种发射光来构成所捕获的至少一个图像。更具体地，针对给定的激发光，与此相对应的所捕获的至少一个图像在视觉上表示对给定的激发光的波长敏感的分析物的分泌足迹(或荧光免疫斑点)。应当理解，针对不同的激发光的所捕获的至少一个图像的数量(或技术)可以相同或可以不同。参考前述示例，可以针对激发光L1捕获孔的20个图像，并且可以针对激发光L2捕获孔的30个图像。因此，所捕获的20个图像在视觉上表示细胞因子A的荧光免疫斑点，并且所捕获的30个图像在视觉上表示细胞因子B的荧光免疫斑点。

根据本公开的实施方式，孔的至少一个图像指示在空间上定位的分析物来源和时间分布。具体地，术语“在空间上定位的分析物来源”涉及孔的图像中的至少一种分析物的荧光免疫斑点的空间分布。此外，“时间分布”涉及孔的所捕获的至少一个图像的某个时间处的至少一种分析物的荧光免疫斑点。具体地，所捕获的至少一个图像表示至少一种分析物的荧光免疫斑点的时间分布。在示例中，孔的所捕获的至少一个图像基于分析物的空间分布和孔中的分析物的扩散来提供对分析物的空间分布的指示。在另一个示例中，孔的所捕获的至少一个图像可以不包括孔中的分析物，并且被捕获以用于确定所有孔的坐标、孔的深度、孔的中心以及孔边界的确切位置。

将了解，针对至少一种激发光中的每一者的孔的所捕获的至少一个图像是原始图像格式。有益地，以原始图像格式捕获的图像是未处理形式并且因此免于依赖颜色空间的编码。可选地，针对至少一种激发光中的每一者的孔的所捕获的至少一个图像具有图像文件格式，包括但不限于，联合图像专家组格式、标记图像文件格式、便携式网络图像格式和图形交换格式。

此外，通过成像来执行捕获孔的至少一个图像。具体地，术语“成像”涉及通过借助于发射或反射记录源于对象的光(或其他电磁辐射)来表示或创建对象(或场景)。更具体地，在定时曝光期间，在成像装置内部的图像感测表面上生成实际图像。通常，图像感测表面包括布置在滤色器装置(或单元)中的像素阵列，以用于生成红色、蓝色、绿色和白色图像信号。

将了解，通过使用以下各项中的至少一项来执行成像：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。本公开的实施方式采用高动态范围(下文由“HDR”指示)成像装置。具体地，HDR成像采用将两个或更多个图像相结合，以便与标准数字成像技术相比，在最终图像中生成更大的亮度范围。更具体地，HDR成像采用以不同曝光拍摄若干图像并且然后将图像合并成单个HDR图像。在示例中，不同的曝光可以是-1EV、0EV和+1EV。有益地，HDR成像采用实现高灵敏度、优异的测量范围、更高的亮度、最小化的传感器饱和风险、色调映射、大得多的颜色和亮度范围、图像对准、滤波随机噪声等等的合适的HDR软件。

此外，该方法包括针对至少一种激发光中的每一者生成孔中的分析物释放分布的模型，其中针对给定的激发光生成孔中的分析物释放分布的模型包括：将针对给定的激发光的孔的所捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布，其中在至少一种分析物的局部扩散之前执行此去卷积；以及基于预扩散分析物分布的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点。在实施方式中，针对至少一种激发光中的每一者的所生成的模型是数学函数。此外，数学函数可以是三维函数，其中数学函数可以表示在二维平面(例如，x-y平面)上提供分析物的空间分布，并且其三维可以指示分析物的时间分布。随后，数学函数的第三维可以投影到二维平面上以提供二维数学函数。此外，二维数学函数可以类似于二维图像。因此，针对至少一种激发光中的每一者的所生成的模型是表示针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物分布(具体地，至少一种分析物的分泌估计或荧光免疫斑点)的数学函数。此外，应当理解，表示不同分析物的荧光免疫斑点的波长是不同的。具体地，分析物释放分布的每个生成的模型表示孔中的不同分析物的分布，并且通过用具体激发光照射孔并且针对具体激发光以原始图像格式捕获孔的至少一个图像来检测此分布，以生成不同分析物的分析物释放分布的模型。例如，可以生成针对两种激发光(L3和L4)的孔中的分析物释放分布的两个模型(G1和G2)。在此示例中，模型G1可以表示孔中的分析物A1的分布，并且模型G2可以表示孔中的分析物A2的分布。因此，模型G1中的分析物A1的荧光免疫斑点的波长不同于模型G2中的分析物A2的荧光免疫斑点的波长。

可选地，该方法还包括：生成与测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台；以及基于生成的X-Y平台来获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。术语“X-Y平台”涉及具有线性运动(水平或竖直)的机动化限定滑动装置。具体地，X-Y平台为自动化机械提供水平运动，即，沿着XY平面的X和Y轴线。测定板的XY平面包括分隔开预先限定的距离的多个孔。在实施方式中，本公开的方法使得能够检测与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置相对应的数据。可选地，此类数据还可以包括荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、至少两个相邻孔的中心的距离。在另一个实施方式中，与测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台使得能够测量至少两个相邻孔的中心的距离。更可选地，通过采用标定算法来生成X-Y平台。具体地，形成校准算法以校准X-Y平台。更具体地，形成校准算法以校准X-Y平台并且在多轮之后进行重新校准。在实施方式中，校准算法被编程为访问测定板的XY平面上的每个荧光免疫斑点。在又一个实施方式中，与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的数据是预先限定/预先设定的以使过程完全自动化。替代地，另外地，校准算法可以通过从系统的用户接收手动输入而由用户修改。有益地，全(或半)自动化系统提供了时间效率和减少错误校准的益处。在实施方式中，对孔的所捕获的至少一个图像进行的去卷积是被实施以便通过移除由扩散和成像设备引起的模糊来锐化针对至少一种激发光中的每一者的所捕获的至少一个图像的图像处理技术。具体地，可以实施去卷积以便确定针对给定的激发光的所捕获的至少一个图像之中的图像，其中所确定的图像表示针对给定的激发光的预扩散分析物分布。这样确定的图像被认为是最接近地表示针对给定的激发光的所捕获的至少一个图像之中的预扩散分析物分布。更具体地，在针对至少一种激发光中的每一者的所捕获的至少一个图像上执行此去卷积，由此考虑到由至少一个图像表示的在空间上定位的分析物来源和时间分布。此外，在实施方式中，此去卷积的输入是针对至少一种激发光的所捕获的至少一个图像，并且此去卷积步骤的输出是表示针对给定的激发光中的每一者的预扩散分析物分布的图像。在另一个实施方式中，此去卷积的输入是分析物释放分布的数学模型，并且此去卷积步骤的输出是表示由多维去卷积提供的预扩散分析物分布的图像。

根据实施方式，将孔的捕获的至少一个图像去卷积包括实施以下项中的至少一项：稀疏促进的正则化、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。具体地，可以采用前述算法中的至少一个，以便估计针对至少一种激发光中的每一者的预扩散分析物分布。例如，稀疏促进的正则化可以基于针对给定的激发光的所捕获的至少一个图像的/2-正则化的(非平方)形式而以/1-正则化或组稀疏正则化的形式实施，以用于在此去卷积期间在至少一个图像之中实施正则化。在另一个示例中，乘法更新规则和/或正向-反向近端梯度算法可以有助于在此去卷积期间优化变量。正向-反向近端梯度算法的示例包括但不限于迭代收缩-阈值化算法(ISTA)和加速的近端梯度算法(FISTA)。

可选地，该方法还包括识别孔的中心以用于确定在空间上限定的荧光免疫斑点。具体地，每个孔的中心处的局部极大值被称为校准点或硬斑点或者在空间上限定的荧光免疫斑点。在实施方式中，基于预扩散分析物分布来检测至少一个潜在分析物释放位点可以使用常规数学公式和图像处理功能来实施，以分别用于确定局部极大值和评估表示预扩散分析物分布的图像。

在实施方式中，针对给定的激发光生成孔中的分析物释放分布的模型包括基于检测到的至少一个潜在释放位点来优化预扩散分析物分布以生成针对给定的激发光的孔中的分析物释放分布的模型。可选地，优化预扩散分析物分布涉及基于检测到的至少一个潜在分析物释放位点来改装表示预扩散分析物分布的图像。具体地，在此优化中，向表示预扩散分析物分布的图像添加约束，其中约束是只可以从检测到的至少一个潜在分析物释放位点释放分析物。根据实施方式，基于检测到的至少一个潜在分析物释放位点来优化预扩散分析物分布被至少一次迭代地实施，并且包括采用以下各项中的至少一项：交替方向法、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。交替方向法的示例包括，但不限于，Douglas-Rachford交替方向法、迭代收缩-阈值化算法(ISTA)和分裂不精确Uzawa法。乘法更新规则的示例包括，但不限于，指数化梯度更新规则和用于正性约束二次程式的乘法更新。

在示例中，在两个阶段中执行针对激发光L5优化预扩散分析物分布，其中在第一阶段，将表示针对激发光L5的预扩散分析物分布的图像的所有像素视为潜在分析物释放位点，并且在第二阶段，通过采用前述算法/规则中的至少一个，减少被视为潜在分析物释放位点的像素数量。

因此，应当理解，以数学函数的形式生成针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型。

在实施方式中，针对至少一种激发光中的每一者生成孔中的分析物释放分布的模型包括修改针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型，以分析其中的至少一个荧光免疫斑点。具体地，此类修改可以涉及选通或修剪针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型中的至少一个荧光免疫斑点。此外，可以执行此类修改来设定“界限”以便用来排除和/或包括在针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型中检测到的至少一个荧光免疫斑点。更具体地，此类修改可以有助于用户选择至少一个荧光免疫斑点来分析属性，诸如细胞的分泌物强度(或分析物分泌物的量)。例如，通过修改针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型，用户可以单独地研究和计算由研究中的细胞分泌出的至少一种分析物的量。

根据实施方式，修改孔中的分析物释放分布的模型是基于至少一个用户可选择的参数，其中至少一个参数选自包括以下项的组：荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点大小、估计的分析物释放量、荧光免疫斑点颜色、孔中的感兴趣区域。具体地，在选择至少一个参数后，用户可以指定所选择的至少一个参数的值作为荧光免疫斑点检测/分析的灵敏度的度量。在示例中，对于给定的激发光L6，用户可以选择参数，诸如孔中的感兴趣区域，并且指定只可以分析孔的左半部中的荧光免疫斑点。可选地，在此示例中，用户可以指定可以丢弃沿着孔的周边的荧光免疫斑点以防止分析不需要的人工制品。在另一个示例中，对于给定的激发光L6，用户可以选择参数，诸如荧光免疫斑点大小，并且指定只可以分析半径大于30微米的荧光免疫斑点。

因此，应当理解，以数学函数的形式提供针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的修改的模型。

可选地，该方法还包括获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。更可选地，基于生成的X-Y平台来获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。具体地，从发射或辐射高强度荧光的所生成的X-Y平台识别在空间上限定的荧光免疫斑点。

该方法还包括将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点。具体地，处理分析物释放分布的所有生成的模型，以识别定位在相同位置(例如，在相同像素坐标)和/或彼此接近的不同分析物的多个荧光免疫斑点。此外，在此类情况下，如果多个荧光免疫斑点的相应位置位于彼此的预定距离内，则它们可以被视为彼此接近。具体地，此预定距离可以是能够聚类在一起的荧光免疫斑点之间的最大距离。可选地，此预定距离可以由用户指定。在实施方式中，将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类采用基于距离的分层聚类算法。具体地，基于距离的分层聚类算法是受接近约束的，由此防止分析物释放分布的相同生成的模型的接近荧光免疫斑点被聚类在一起。

应当理解，本文中使用的术语“多分泌物荧光免疫斑点”涉及从单个细胞分泌出的多种分析物的分泌足迹。因此，分析物释放分布的所有生成的模型的多个共同位置的荧光免疫斑点表示从单个细胞分泌出的多种分析物。此外，通过前述聚类确定的至少一个多分泌物荧光免疫斑点涉及分泌出多种分析物的至少一个细胞。

根据实施方式，该方法还可以包括显示孔中的分析物释放分布的合成模型，其中合成模型包括检测到的至少一个荧光免疫斑点，并且其中不同地呈现单分泌物荧光免疫斑点和多分泌物荧光免疫斑点。具体地，孔中的分析物释放分布的合成模型涉及作为针对至少一种激发光中的每一者的分析物释放分布的生成的模型的图像的叠加的合成图像。更具体地，由于不同分析物的荧光免疫斑点的波长是不同的，因此在孔中的分析物释放分布的合成模型中，多分泌物荧光免疫斑点的波长可以是其组成分析物的荧光免疫斑点的波长的组合。例如，可以存在孔中的分析物释放分布的两个修改的模型，以分析两种分析物(诸如分析物A3和A4)。在此示例中，分析物A3的荧光免疫斑点的波长可以对应于绿色，并且分析物A4的荧光免疫斑点的波长可以对应于红色。此后，在孔中的分析物释放分布的合成模型中，存在(分析物A3和A4中的每一者的)单分泌物荧光免疫斑点和(分析物A3和A4两者的)多分泌物荧光免疫斑点。

如先前所述，本公开描述了一种用于分析荧光免疫斑点测定的系统。具体地，采用所描述的系统来实施用于分析荧光免疫斑点测定的前述方法。

该系统包括被配置为生成至少一种激发光的光源布置，其中在给定的时间，光源布置仅生成一种激发光。在实施方式中，光源布置包括定位在致动器布置上的至少一个光源，其中通过以下各项中的至少一项来实施至少一个光源：发光二极管、卤素光源、氙光源、激光源。例如，光源布置可以包括定位在机动化致动器布置上的5个光源，其中机动化致动器布置可以是可旋转、可倾斜或可移位的(水平地和/或竖直地)。

此外，该系统包括定位在生成的激发光的光路上的准直布置，其中准直布置被配置为使生成的激发光准直。具体地，准直布置使至少一种激发光的光束彼此平行。在示例中，准直布置可以是至少一个准直透镜。

此外，该系统包括定位在准直的激发光的光路上的多波段分束器，多波段分束器由支撑布置支撑。多波段分束器被配置为：将准直的激发光反射到测定板上，以照射具有多个孔的测定板的孔；从测定板接收激发光的反射和发射光；以及反射被反射的激发光的一部分，同时将被反射的激发光的剩余部分和发射光传输到滤光布置。具体地，多波段分束器从测定板接收与发射光混合的激发光的反射，但无法完全地阻止激发光的反射穿过其中。因此，被反射的激发光的从多波段分束器反射的那部分涉及被反射的激发光的被阻止穿过多波段分束器的一部分。此外，被反射的激发光的传输通过多波段分束器反射的剩余部分涉及被反射的激发光的没有被阻止传输的残余。如先前所述，发射光涉及在被准直的激发光照射之后从分析物发射的荧光。因此，从不同的分析物发射的不同发射光穿过多波段分束器。

在实施方式中，测定板相对于多波段分束器以直角定位。因此，多波段分束器可以使准直的激发光以大约90度的角度反射到测定板上，以用于照射测定板的孔。

根据实施方式，通过以下各项中的至少一项来实施多波段分束器：透明镜、半透明镜、棱镜、二向色镜。根据另一个实施方式，支撑布置是滤光片立方体。具体地，滤光片立方体可以是被配置为容纳和支撑多波段分束器的半透明或透明的立方体结构。例如，在该系统中，二向色镜可以对角线地安装在滤光片立方体内。

该系统还包括滤光布置，该滤光布置包括滤光轮和至少一个发射滤光片，其中滤光轮被配置为在其中容纳至少一个发射滤光片。至少一个发射滤光片被配置为：去除从多波段分束器接收到被反射的激发光的剩余部分；以及对发射光进行滤光，同时将发射光传输到光学布置。具体地，滤光轮是包括至少一个壳体的可旋转装置，该至少一个壳体用于在其中容纳至少一个发射滤光片。更具体地，至少一个发射滤光片可以被配置为阻止除了发射光之外的任何波长的光。

此外，该系统包括被配置为将经滤光的发射光引导到成像装置上的光学布置。具体地，光学布置可以包括至少一个光学元件以改变经滤光的发射光的光路，以便使经滤光的发射光聚焦在成像装置上。在实施方式中，光学布置包括以下各项中的至少一项：远心透镜、微距透镜。可选地，光学布置还可以包括诸如镜、棱镜、透镜等的光学元件。

该系统包括被配置为针对至少一种激发光中的每一者以原始图像格式捕获孔的至少一个图像的成像装置。具体地，成像装置选自以下各项中的至少一项：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。如先前所述，本公开采用被配置为针对至少一种激发光中的每一者以原始图像格式捕获孔的至少一个图像的HDR成像装置。更具体地，成像装置接收从光学装置到成像装置的图像传感器上的经滤光的发射光，以捕获至少一个图像。在实施方式中，成像装置可以按灰度捕获至少一个图像。具体地，通过采用原始图像格式来捕获更高分辨率的灰度图像。有益地，与诸如联合图像专家组(JPEG)格式的其他格式的图像相比，以原始图像格式捕获的图像是未处理形式，并且因此免于依赖颜色空间的编码。在另一个实施方式中，成像装置可以捕获至少一个图像作为彩色图像。

此外，该系统包括耦合到成像装置的处理模块，其中处理模块被配置为：针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型；以及将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点。

可选地，就这点而言，处理模块还被配置为：将针对给定的激发光的孔的所捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布；以及基于预扩散分析物分布的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点。

可选地，该系统还包括调谐器，其中调谐器可操作以沿着测定板的X-Y平面水平地移动到至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中传感器可操作来获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。具体地，调谐器访问测定板的XY平面上的每一个在空间上限定的荧光免疫斑点。更具体地，耦合到调谐器的传感器记录与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。此外，对具有高荧光强度的在空间上限定的荧光免疫斑点进行计数，并且将如通过所生成的XY平台获得的其位置提供到系统的一个或多个部件，以供进一步使用，诸如数据处理。

可选地，该系统还包括可操作地耦合到调谐器的控制器。更可选地，控制器可操作以预先设定：与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的数据是预先限定/预先设定的以使过程完全自动化。

此外，控制器被配置为生成与调谐器水平地沿着测定板的X-Y平面的移动相关联的X-Y平台。可选地，控制器可操作以基于与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的预先设定的数据来生成X-Y平台。控制器还可操作以将所生成的X-Y平台提供到调谐器，并且其中调谐器被配置为基于所提供的X-Y平台而沿着测定板的X-Y平面水平地移动。具体地，所生成的X-Y平台引导调谐器在测定板的XY平面上以预先限定的限定运动、优选地水平运动访问多个荧光免疫斑点。更具体地，调谐器基于所提供的X-Y平台沿着测定板的X-Y平面的水平移动使得能够评估测定板的所有孔并且确定具有高荧光强度的在空间上限定的荧光免疫斑点。

可选地，制器可操作以通过采用校准算法来生成X-Y平台。如先前所述，校准算法包括预先设定/预先限定的以使过程完全自动化的与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的数据。具体地，校准算法管理调谐器在测定板的XY平面上经过每一个荧光免疫斑点的移动。

可选地，控制器还可操作以识别孔的中心。具体地，形成校准算法以识别测定板中的感兴趣区域以便检测荧光免疫斑点。更具体地，在感兴趣区域内对荧光免疫斑点进行计数，并且在确定孔的在空间上限定的区域中的至少一个荧光团检测到的分析物的浓度时，不对落在感兴趣区域之外的荧光免疫斑点进行计数。此外，校准算法具有自动定中心功能，其确定孔的中心以便测量荧光强度。在这种情况下，校准算法计算两个孔的中心之间的距离，以识别校准点。校准算法将调谐器移动到校准点，其中调谐器的传感器测量荧光强度。在实施方式中，校准算法校准X-Y平台并且在使用一段时间之后进行重新校准以避免传感器饱和。

可选地，控制器还可操作以检测所生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差。具体地，校准算法检测预先限定的距离与至少两个相邻孔的中心和调谐器的位置的差异。更具体地，所生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差是对错误校准的指示。例如。如果测定板(W)上的两个相邻孔(W0和W1)的中心之间的距离是1.25cm，并且X-Y平台中设定同样的距离；然而，调谐器移动到远离孔W0的中心1cm的孔W1，那么在这种情况下，控制器可操作以检测所生成的X-Y平台和调谐器的移动的0.25cm的偏差。

此外，控制器还可操作以基于检测到的偏差来提供对调谐器的单独移动的校正。具体地，控制器校正所生成的X-Y平台和调谐器的移动的任何偏差。更具体地，控制器采用自动定中心模块以用于校正调谐器的移动。更具体地，自动定中心模块校正调谐器的移动并且将调谐器放置在空间上限定的荧光免疫斑点的正上方。例如，在上述示例中，对于所生成的X-Y平台和调谐器的移动的0.25cm的偏差，通过自动定中心模块使调谐器在空间上限定的荧光免疫斑点的正上方移位进行校正。

在实施方式中，校准算法包括约束其中在所捕获的每个图像中对在空间上限定的荧光免疫斑点进行检测和计数的区域的圆形感兴趣区域(AOI)。不对在AOI之外检测到的荧光免疫斑点进行计数。具体地，校准算法中的特征识别孔边界并且自动地将AOI放在孔的中心位置。更具体地，由于孔中心在孔之间和板之间是偏离的，因此孔定中心算法是完全必要的，以便生成一致的数据。

此外，可选地，处理模块被配置为：基于检测到的至少一个潜在分析物释放位点来优化预扩散分析物分布；以及修改针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型，以分析其中的至少一个荧光免疫斑点。

在实施方式中，该系统还包括定位在准直的激发光的光路上的至少一个激发滤光片，其中至少一个激发滤光片被配置为对准直的激发光进行滤光。具体地，至少一个激发滤光片可以被配置为至少一种激发光的波长，使得在给定的时间，激光滤光片可以只让期望波长的激发光通过而阻止其他波长的光穿过其中。因此，至少一个激发滤光片通过阻止不期望的光组成来净化准直的激发光。在这种情况下，可以将不同的激发滤光器用于不同的激发光。可选地，激发滤光片可以包括滤光轮。

在实施方式中，该系统还可以包括耦合到成像装置和处理模块的可视化模块，其中可视化模块包括在与用户相关联的计算装置上渲染的用户界面，并且其中可视化模块被配置为执行以下各项中的至少一项：显示针对至少一种激发光中的每一者的捕获的至少一个图像、显示针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的生成的模型、接收用户输入以控制处理模块的操作、显示孔中的分析物释放分布的合成模型。具体地，可视化模块可由系统的用户操作以用于观察测定的分析。在示例中，用户可以通过与用户界面交互(例如，经由触摸输入小键盘输入、鼠标输入等)以选择诸如孔中的感兴趣区域的参数并且指定参数的值(诸如，孔的左半部)来修改针对至少一种激发光中的每一者的孔中的分析物释放分布的所生成的模型。与用户相关联的计算装置的示例包括，但不限于，智能电话、平板计算机、台式计算机、笔记本计算机和个人数字助理。

在实施方式中，该系统还可以包括用于从至少一种激发光去除噪声的掩模。术语“噪声”涉及影响整体荧光免疫斑点计数的随机干扰。噪声可以得自进入测定板的孔中的人工制品，诸如头发、灰尘、纤维等。此噪声可能会被成像装置的算法或软件计数，并且导致整体荧光免疫斑点计数的假阳性和/或假阴性。因此，有必要一个接一个地去除假阳性和假阴性，从而确保无噪声的荧光免疫斑点计数。噪声去除是通过将涂料层(诸如掩模)添加到受噪声影响的孔来执行，并且被配置为将掩模后面的噪声排除在整体荧光免疫斑点计数之外。具体地，术语“掩模”涉及用于从图像去除噪声的实际方法。有益地，掩模将此类人工制品排除在斑点计数之外，其中掩模后面的所有斑点都从整体斑点计数排除。随后，从荧光强度提取噪声以获得净荧光强度。以图像文件格式中的任一种保存测定板的每个孔的所获得的净荧光强度，包括但不限于，联合图像专家组格式、标记图像文件格式、便携式网络图像格式和图形交换格式。

例如，当例如以诸如联合图像专家组(JPEG)格式的格式保存板的图像时，创建专门的联合图像专家组(JPEG)图像，即，描绘其中添加掩模的孔板上的位置的掩模(或掩模.jpeg)。有益地，创建记录在图像上执行的每个动作的“历史文件”。另外地，使用历史文件来访问对所保存的图像文件进行的可能的改变。

此外，如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模可操作以从系统布置移除。具体地，添加的涂料层可操作以根据用户的期望通过简单地访问板的保存的图像并且移除掩模以获得原始数据而移除，原始数据包括荧光免疫斑点以及与荧光免疫斑点相关联的潜在噪声。将了解，在掩模实施方式或移除过程中，从不擦除动作或数据并且将每个动作记录在历史文件中。历史文件记录在分析荧光免疫斑点测定的过程中做出的每个改变。

在又一个方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的方法，该方法包括确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中对分析物的浓度的确定包括：

(a)识别至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；

(b)感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度；以及

(c)将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

在又一个方面，本公开的实施方式提供了一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的系统，该系统包括传感器布置，该传感器布置用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中传感器布置包括：

(a)传感器，其可操作以读出至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；以及

(b)调谐器，其被配置为获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度，该系统的特征在于，调谐器还被配置为将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

具体地，可以分析荧光免疫斑点测定以用于检测由细胞分泌处的分析物以及用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度。可选地，分析物包括以下各项中的至少一项：血清样本、血浆样本、尿样、溶液样本、病毒颗粒、蛋白质、细胞培养液、所述孔中的至少一种潜在的分析物。具体地，分析物包括，但不限于，细胞因子和免疫球蛋白。更具体地，可以在测定板内培养各种样本，诸如血清样本、血浆样本、尿样、溶液样本、病毒颗粒、蛋白质、细胞培养液、孔中的至少一种潜在的分析物，以增加由细胞的样本分泌出的分析物的浓度。

术语“浓度”涉及可测量的性质。具体地，可以将浓度测量为质量浓度、体积浓度、摩尔浓度、计数浓度等等。此外，溶液中的溶质或溶剂的浓度可以在稀释到浓缩的范围内，具体取决于溶液中的溶质或溶剂的量。具体地，从针对给定的激发光生成的孔中的分析物释放分布的模型确定分析物的浓度。

用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度的方法包括识别至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点。在实施方式中，孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度是基于至少一个用户可选择的参数，其中至少一个参数选自包括以下项的组：荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点大小、估计的分析物释放量、荧光免疫斑点颜色、孔中的感兴趣区域。具体地，在选择至少一个参数后，用户可以指定所选择的至少一个参数的值作为荧光免疫斑点检测/分析的灵敏度的度量。更具体地地，孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度是基于荧光免疫斑点/荧光强度。在示例中，针对激发光L7，用户可以选择一个或多个参数，诸如荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点颜色和感兴趣区域，并且指定仅选择孔的左半部内的具有高强度的绿色的荧光免疫斑点。

此外，该方法包括感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。在空间上限定的荧光免疫斑点提供由传感器检测到的可测量荧光信号。可选地，分布在孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度是基于荧光强度。将了解，荧光团检测到的分析物的浓度与荧光强度、并且优选地荧光团的颜色的暗度成比例。

可选地，该方法还包括获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。此外，获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度包括设定“界限”。具体地，可以采用该界限以排除和/或包括在针对至少一种激发光中的每一者的分析物释放分布的生成的模型中检测到的至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点。更可选地，此类修改可以有助于感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点来分析属性，诸如分泌物强度和/或由细胞分泌出的分析物的浓度。此外，此类修改可以基于至少一个用户可选择的参数，其中至少一个参数选自包括以下项的组：荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点大小、估计的分析物释放量、荧光免疫斑点颜色、孔中的感兴趣区域。可选地，通过将荧光强度和捕获孔的图像相结合，有可能提供高灵敏度和用于荧光团检测到的分析物的浓度的优异测量范围。感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度包括感测孔中的感兴趣区域处、优选地在中心处的荧光强度。此外，该方法还包括识别孔的中心以用于确定在空间上限定的荧光免疫斑点。“孔的中心”是基于通过分析孔的所捕获的图像而获得的孔的坐标来确定的。具体地，自动地执行感测至少一个荧光免疫斑点以获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度，而不需要直接和频繁的人工干预。更具体地，感测至少一个荧光免疫斑点以获得与至少一个荧光免疫斑点相关联的荧光强度排除作为简单壁反射的结果的与至少一个荧光免疫斑点相关联的荧光强度。可选地，在感兴趣区域、优选地圆形感兴趣区域周围执行感测至少一个荧光免疫斑点以获得与至少一个荧光免疫斑点相关联的荧光强度。在示例中，针对分析物A5在预先限定的圆形感兴趣区域中感测出呈现高强度的绿色的荧光免疫斑点。应当理解，在感测至少一个荧光免疫斑点以获得荧光强度时不包括在感兴趣区域之外的荧光免疫斑点。

可选地，该方法还包括生成与测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台。在实施方式中，本公开的实施方式使得能够检测与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心的距离等相对应的数据。具体地，该方法采用被配置为确定至少两个相邻孔的中心的距离的自动化机械，诸如精密电机。

可选地，该方法还包括获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。更可选地，基于生成的X-Y平台来获得至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的荧光强度。具体地，从发射或辐射高强度荧光的所生成的X-Y平台识别在空间上限定的荧光免疫斑点。更具体地，由荧光测量仪器在至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处测量荧光强度。

此外，通过采用校准算法来生成X-Y平台。具体地，形成校准算法以校准X-Y平台。更具体地，形成校准算法以校准X-Y平台并且在多轮之后进行重新校准。在实施方式中，校准算法被编程为将耦合到调谐器的传感器移动到每一个荧光免疫斑点。在另一个实施方式中，校准算法被编程为保护传感器免受过电流。可选地，与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的数据是在传感器中预先限定/预先设定的以使过程完全自动化。替代地，另外地，传感器被配置为从荧光测量仪器的用户接收手动输入。

该方法还包括将与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所述获得的荧光强度和分布在所述孔的所述在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的所述浓度相关联。具体地，孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度与由传感器检测到的荧光信号成比例。所获得的荧光强度可以与孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。在实施方式中，孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度是数学函数。此外，数学函数可以表示孔中的分析物浓度。在示例中，具有与绿色对应的波长的荧光免疫斑点的净荧光强度可以与孔中的分析物A6及其浓度相关联。在另一个示例中，孔中的A6的浓度被确定为以下各项中的一个或多个：质量浓度、体积浓度、摩尔浓度、计数浓度等等。在又一个示例中，孔中的A6的浓度是每升溶剂3微克分析物A6。应当理解，尽管本文中描述的方法涉及对测定板的一个孔的分析，但可以实施该方法来分析测定板的一个以上孔。在这种情况下，可以生成针对两种激发光(L8和L9)的孔中的分析物释放分布的两个模型(G3和G4)。在此示例中，模型G3可以表示孔中的分析物A7的分布，并且模型G4可以表示孔中的分析物A8的分布。因此，模型G3中的分析物A7的荧光免疫斑点的波长不同于模型G4中的分析物A8的荧光免疫斑点的波长。此外，模型G3中的分析物A7的浓度C1不同于模型G4中的分析物A8的浓度C2。

可选地，该方法还包括从至少一种激发光去除噪声。如先前所述，通过采用掩模来执行噪声去除。有益地，掩模将此类人工制品排除在斑点计数之外，其中掩模后面的所有斑点都从整体斑点计数排除。随后，从荧光强度提取噪声以获得净荧光强度。以图像文件格式中的任一种保存测定板的每个孔的所获得的净荧光强度，包括但不限于，联合图像专家组格式、标记图像文件格式、便携式网络图像格式和图形交换格式。

如先前所述，本公开描述了用于分析荧光免疫斑点测定的系统，该系统用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度。具体地，对至少一种荧光团检测到的分析物的确定需要采用感测布置来测量每个孔的荧光强度，并且将每个孔的测量到的荧光强度与孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。具体地，采用所描述的系统来实施用于分析荧光免疫斑点测定的前述方法。

用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度的系统包括可操作以读取至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点的传感器。术语“传感器”涉及被配置为检测不同波长的荧光强度的高精度测量仪器。可选地，传感器可操作以移动到至少一个荧光免疫斑点，并且确定孔的中心以检测每个孔处的荧光强度。在实施方式中，传感器将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度转换成用于量化荧光强度的电信号。

传感器布置还包括被配置为获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度的调谐器。具体地，调谐器可操作地耦合到传感器并且包括高精度电机和校准算法。更具体地，调谐器被配置为访问与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置相对应的数据。在访问适当的荧光免疫斑点之后，调谐器将传感器放置于在空间上限定的荧光免疫斑点处，其中传感器检测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。

可选地，调谐器被配置为调节传感器布置中、优选地传感器中的电流。具体地，调谐器防止传感器受到由荧光强度引起的过电流，同时将荧光强度转换成电信号。

调谐器还被配置为将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。通过从与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度去除噪声来获得净荧光强度。可选地，调谐器可操作以从至少一种激发光去除噪声。如先前所述，通过采用掩模来执行噪声去除。有益地，掩模将此类人工制品排除在斑点计数之外，其中掩模后面的所有斑点都从整体斑点计数排除。随后，从与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度中提取噪声，以获得净荧光强度。以图像文件格式中的任一种保存测定板的每个孔的净荧光强度，包括但不限于，联合图像专家组格式、标记图像文件格式、便携式网络图像格式和图形交换格式。此外，在保存净荧光强度的图像时，创建专门的联合图像专家组(JPEG)图像，即，描绘其中添加掩模的孔板上的位置的掩模(或掩模.jpeg)。另外地，创建记录在图像上执行的每个动作的“历史文件”。使用历史文件来访问对所保存的图像文件进行的可能的改变。

此外，如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模可操作以从系统布置移除。具体地，添加的涂料层可操作以根据用户的期望通过简单地访问板的保存的图像并且移除掩模以获得原始数据而移除，原始数据包括荧光免疫斑点以及与荧光免疫斑点相关联的潜在噪声。将了解，在掩模实施方式或移除过程中，从不擦除动作或数据并且将每个动作记录在历史文件中。历史文件记录在分析荧光免疫斑点测定的过程中做出的每个改变。

可选地，该系统还包括可操作地耦合到调谐器的控制器。控制器布置可操作地耦合到调谐器以帮助确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度。此外，控制器被配置为生成与调谐器水平地沿着测定板的X-Y平面的移动相关联的X-Y平台。如先前所述，X-Y平台使得调谐器能够在线性(优选地水平)方向上移动，并且评估测定板的所有孔并确定具有高荧光强度的荧光免疫斑点。可选地，制器可操作以通过采用校准算法来生成X-Y平台。校准算法使得控制器能够预先设定与孔坐标、孔的深度、孔的中心和孔边界的确切位置、荧光免疫斑点大小、相邻孔之间的外围距离、两个相邻孔的中心之间的距离等相对应的数据来生成X-Y平台。

控制器还可操作以将生成的X-Y平台提供到调谐器。调谐器可操作以沿着测定板的X-Y平面水平地移动到至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中传感器可操作来获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。如先前所述，通过采用校准算法来生成X-Y平台。调谐器被配置为根据校准算法基于所提供的X-Y平台而沿着测定板的X-Y平面水平地移动。调谐器基于所提供的X-Y平台沿着测定板的X-Y平面的水平移动使得能够评估测定板的所有孔并且确定具有高荧光强度的在空间上限定的荧光免疫斑点。

可选地，控制器还可操作以识别孔的中心。具体地，形成校准算法以识别测定板中的感兴趣区域以便检测荧光免疫斑点。更具体地，在感兴趣区域内对荧光免疫斑点进行计数，并且在确定孔的在空间上限定的区域中的至少一个荧光团检测到的分析物的浓度时，不对落在感兴趣区域之外的荧光免疫斑点进行计数。此外，校准算法具有自动定中心功能，其确定孔的中心以便测量荧光强度。在这种情况下，校准算法计算两个孔的中心之间的距离，以识别校准点。校准算法将调谐器移动到校准点，其中调谐器的传感器测量荧光强度。在实施方式中，校准算法校准X-Y平台并且在使用一段时间之后进行重新校准以避免传感器饱和。

可选地，控制器还可操作以检测所生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差。具体地，校准算法检测预先限定的距离与至少两个相邻孔的中心和调谐器的位置的差异。更具体地，所生成的X-Y平台和调谐器的移动的偏差是对错误校准的指示。

然而，控制器还可操作以基于检测到的偏差来提供对调谐器的单独移动的校正。具体地，控制器拥有自动定中心模块以用于校正调谐器的移动。更具体地，自动定中心模块校正调谐器的移动并且将调谐器放置在空间上限定的荧光免疫斑点的正上方。在实施方式中，校准算法包括约束其中在所捕获的每个图像中对在空间上限定的荧光免疫斑点进行检测和计数的区域的圆形感兴趣区域(AOI)。不对在AOI之外检测到的荧光免疫斑点进行计数。具体地，校准算法中的特征识别孔边界并且自动地将AOI放在孔的中心位置。更具体地，由于孔中心在孔之间和板之间是偏离的，因此孔定中心算法是完全必要的，以便生成一致的数据。在实施方式中，调谐器可以包括内置式传感器，其被配置为检测荧光免疫斑点/荧光强度并且将其转换成与荧光免疫斑点/荧光强度相对应的电信号。

在又一个方面，本公开的实施方式提供了一种记录在机器可读非暂时性(非瞬态)数据存储介质上的软件产品，其中软件产品可在计算硬件上执行以用于实施前述方法；换句话说，本公开提供了一种计算机程序产品，该计算机程序产品包括上面存储有计算机可读指令的非暂时性计算机可读存储介质，这些计算机可读指令可由包括处理硬件的计算机化装置执行以执行用于分析荧光免疫斑点测定的方法。

附图详细描述

参考图1，示出了根据本公开的实施方式的用于分析测定的系统100的示意图。系统100包括被配置为生成至少一种激发光的光源布置102，其中在给定的时间，光源布置102仅生成一种激发光。如图所示，光源布置102包括至少一个光源，被描绘为位于致动器布置110上的光源104、106和108。例如，通过发光二极管来实现光源104至108。应当理解，从光源106生成的激发光被描绘为虚线，并且通过沿着该虚线使用箭头来描绘激发光的光路。系统100包括位于生成的激发光的光路上的用于使生成的激发光准直的准直布置112，并且可以含有至少一个激发滤光片(被描绘为激发滤光片114)以对准直的激发光进行滤光。

如图所示，系统100包括位于经滤光的激发光的光路上的多波段分束器116，多波段分束器116由支撑布置118支撑。例如，通过二向色镜来实现多波段分束器116，并且支撑布置118是滤光片立方体。如图所示，多波段分束器116将经滤光的激发光反射到测定板120上，以照射具有多个孔的测定板120的孔。多波段分束器116还被配置为从测定板接收激发光的反射和发射光并且反射被反射的激发光的一部分，同时将被反射的激发光的剩余部分和发射光传输到滤光布置122。应当理解，激发光和发射光的反射的组合被描绘为具有箭头的点划线(通常被称为中心线)。

滤光布置122包括滤光轮124和至少一个发射滤光片(被描绘为发射滤光片126和128)，其中滤光轮124被配置为在其中容纳至少一个发射滤光片126至128。如图所示，发射滤光片126被配置为去除从多波段分束器116接收到的反射激发光的剩余部分并且对发射光进行滤光，同时将发射光传输到光学布置130。应当理解，经滤光的发射光被描绘为虚线，并且通过沿着该虚线使用箭头来描绘经滤光的发射光的光路。光学布置130被配置为将经滤光的发射光引导到成像装置132上。系统100还包括耦合到成像装置132的处理模块(未示出)。

参考图2A、图2B和图2C，分别示出了根据本公开的实施方式的孔200中的第一分析物释放分布的生成的模型、第二分析物释放分布的生成的模型和分析物释放分布的合成模型的图像的示意图。

参考图2A，示出了根据本公开的实施方式的孔200中的第一分析物释放分布的生成的模型的图像。如图所示，第一分析物的多个荧光免疫斑点202A、202B、202C和202D被描绘为十字。

参考图2B，示出了根据本公开的实施方式的孔200中的第二分析物释放分布的生成的模型的图像。如图所示，第二分析物的多个荧光免疫斑点204A、204B、204C、204D和204E被描绘为点。

参考图2C，示出了根据本公开的实施方式的孔200中的分析物释放分布的合成模型的图像。如图所示，图2C是图2A和图2B的图像的叠加，其中明显地描绘第一分析物的多个荧光免疫斑点202A至202D和第二分析物的多个荧光免疫斑点204A至204E。如图所示，荧光免疫斑点202A和204A是在共同位置并且因此被确定为第一多分泌物荧光免疫斑点。类似地，荧光免疫斑点202C和204D是在共同位置并且因此被确定为第二多分泌物荧光免疫斑点。

图2A、图2B和图2C仅仅是示例，其不应过度限制本文的权利要求书的范围。本领域的技术人员将认识到本公开的实施方式的许多变化、替代和修改。

参考图3，示出了根据本公开的实施方式的用于分析测定的方法300的步骤。在步骤302处，用至少一种激发光照射具有多个孔的测定板的孔，其中在给定的时间，仅由一种激发光照射测定板的孔。在步骤304处，针对至少一种激发光中的每一者，以原始图像格式捕获孔的至少一个图像。在步骤306处，针对至少一种激发光中的每一者，生成孔中的分析物释放分布的模型。针对给定的激发光生成孔中的分析物释放分布的模型包括：将针对给定的激发光的孔的所捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布，其中在至少一种分析物的局部扩散之前执行此去卷积；以及基于预扩散分析物分布的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点。在步骤308处，将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行聚类，并且其中聚类确定了至少一个多分泌物荧光免疫斑点。

步骤302至308仅是说明性的，并且还可以提供其他替代方案，其中在不脱离本文权利要求书的范围的情况下，添加一个或多个步骤、去除一个或多个步骤，或者以不同的序列提供一个或多个步骤。

参考图4，示出了根据本公开的实施方式的用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的系统400的示意图。系统400包括传感器布置402以确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度。此外，传感器布置402包括可操作来读取至少一个荧光免疫斑点的传感器404。传感器布置402还包括被配置为获得与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度的调谐器布置406。调谐器布置406还被配置为将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

参考图5，示出了根据本公开的实施方式的用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的方法500的步骤。方法500包括确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度。在步骤502处，识别至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点。在步骤504处，感测至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与该至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。在步骤506处，将与至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所获得的荧光强度和孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度相关联。

步骤502至508仅是说明性的，并且还可以提供其他替代方案，其中在不脱离本文权利要求书的范围的情况下，添加一个或多个步骤、去除一个或多个步骤，或者以不同的序列提供一个或多个步骤。

在不脱离由所附权利要求书限定的本公开的范围的情况下有可能对前文中所描述的本公开的实施方式做出修改。诸如“包括”、“包含”、“并入”、“具有”、“是”等用于描述和要求保护本公开的表达旨在以非排他性方式解释，即允许没有明确描述的项目、部件或元件也存在。对单数的引用也应被解释为与多数相关。

Claims (47)

1.一种用于分析荧光免疫斑点测定的方法(300)，所述方法包括：

(i)用至少一种激发光照射具有多个孔的测定板的孔，其中在给定的时间，仅由一种激发光照射所述测定板的所述孔；

(ii)针对所述至少一种激发光中的每一者，以原始图像格式捕获所述孔的至少一个图像，

(iii)针对所述至少一种激发光中的每一者，生成所述孔中的分析物释放分布的模型，其中针对给定的激发生成所述孔中的所述分析物释放分布的模型

(a)将针对所述给定的激发光的所述孔的捕获的至少一个图像去卷积以估计预扩散分析物分布；以及

(b)基于所述预扩散分析物分布中的局部极大值来检测至少一个潜在分析物释放位点；以及

(iv)将多个共同位置的荧光免疫斑点聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行所述聚类，并且其中所述聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点，

其特征在于，针对所述至少一种激发光中的每一者生成所述孔中的所述分析物释放分布的模型包括：基于检测到的至少一个潜在释放位点来优化所述预扩散分析物分布；以及修改所述孔中的所述分析物释放分布的模型以分析其中的至少一个荧光免疫斑点。

2.根据权利要求1所述的方法(300)，其中用于照射所述测定板的所述孔的所述至少一种激发光取决于所述孔的在空间上限定的区域中的所述至少一种荧光团检测到的分析物。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述孔的所述至少一个图像指示在空间上定位的分析物来源和在时间上定位的分析物来源。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中将所述孔的所述捕获的至少一个图像去卷积包括实施以下项中的至少一项：稀疏促进的正则化、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。

5.根据权利要求1所述的方法(300)，其中所述方法还包括：

-生成与所述测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台；以及

-基于所述生成的X-Y平台来获得所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的所述荧光强度。

6.根据权利要求5所述的方法(300)，其中通过采用校准算法来生成所述X-Y平台。

7.根据权利要求1所述的方法(300)，其中所述方法还包括识别所述孔的中心以用于确定所述在空间上限定的荧光免疫斑点。

8.根据权利要求1所述的方法(300)，其中基于所述检测到的至少一个潜在分析物释放位点来优化所述预扩散分析物分布被迭代地实施至少一次，并且包括采用以下各项中的至少一项：交替方向法、乘法更新规则、正向-反向近端梯度算法。

9.根据权利要求8中任一项所述的方法(300)，其中修改所述孔中的所述分析物释放分布的模型是基于至少一个用户可选择的参数，其中所述至少一个参数选自包括以下项的组：荧光免疫斑点/荧光强度、荧光免疫斑点大小、估计的分析物释放量、荧光免疫斑点颜色、所述孔中的感兴趣区域。

10.根据权利要求9所述的方法(500)，其中所述方法还包括获得所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的所述荧光强度。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中将所述多个共同位置的荧光免疫斑点聚类采用基于距离的分层聚类算法。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其还包括显示所述孔中的分析物释放分布的合成模型，其中所述合成模型包括所述检测到的至少一个荧光免疫斑点，并且其中不同地呈现单分泌物荧光免疫斑点和多分泌物荧光免疫斑点。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中通过成像来执行捕获所述孔的至少一个图像。

14.根据权利要求13所述的方法(300)，其中通过使用以下各项中的至少一项来执行成像：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。

15.一种用于分析荧光免疫斑点测定的系统(100)，所述系统(100)包括：

(i)光源布置(102)，其被配置为生成至少一种激发光，其中在给定的时间，所述光源布置(102)仅生成一种激发光；

(ii)准直(112)布置，其定位在生成的激发光的光路上，其中所述准直布置(112)被配置为使所述生成的激发光准直；

(iii)多波段分束器(116)，其定位在准直的激发光的光路上，所述多波段分束器(116)由支撑布置(118)支撑，其中所述多波段分束器被配置为

(a)将所述准直的激发光反射到测定板(120)上，以照射具有多个孔的测定板(120)的孔(200)；

(b)从所述测定板(120)接收所述激发光的反射和发射光；以及

(c)反射被反射的激发光的一部分，同时将所述被反射的激发光的剩余部分和所述发射光传输到滤光布置(122)；

(iv)所述滤光布置(122)，其包括滤光轮(124)和至少一个发射滤光片(126，128)，其中所述滤光轮(124)被配置为在其中容纳所述至少一个发射滤光片(126，128)，并且其中所述至少一个发射滤光片(126，128)被配置为

(d)去除从所述多波段分束器(116)接收到的所述被反射的激发光的所述剩余部分；以及

(e)对所述发射光进行滤光，同时将所述发射光传输到光学布置(130)；

(v)所述光学布置(130)，其被配置为将经滤光的发射光引导到成像装置(132)上；

(vi)所述成像装置(132)，其被配置为针对所述至少一种激发光中的每一者以原始图像格式捕获所述孔(200)的至少一个图像；以及

(vii)处理模块，其耦合到所述成像装置(132)，其中所述处理模块被配置为

(f)针对所述至少一种激发光中的每一者，生成所述孔(200)中的分析物释放分布的模型；以及

(g)将多个共同位置的荧光免疫斑点(202A至202D)聚类为多分泌物荧光免疫斑点，其中针对分析物释放分布的所有生成的模型执行所述聚类，并且其中所述聚类确定至少一个多分泌物荧光免疫斑点。

16.根据权利要求15所述的系统(100)，其中所述系统(100)还包括定位在所述准直的激发光的光路上的至少一个激发滤光片(114)，并且其中所述至少一个激发滤光片(114)被配置为对所述准直的激发光进行滤光。

17.根据权利要求15或16中任一项所述的系统(100)，其中所述光源布置(102)包括定位在致动器布置(110)上的至少一个光源，其中通过以下各项中的至少一项来实施所述至少一个光源：发光二极管、卤素光源、氙光源、激光源。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的系统(100)，其中通过以下各项中的至少一项来实施所述多波段分束器(116)：透明镜、半透明镜、棱镜、二向色镜。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的系统(100)，其中所述光学布置(130)包括以下各项中的至少一项：远心透镜、微距透镜。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的系统(100)，其中所述支撑布置(118)是滤光片立方体。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的系统(100)，其中所述成像装置选自以下各项中的至少一项：高动态范围成像装置、低动态范围成像装置、数字相机。

22.根据权利要求15所述的系统(100)，其中所述系统还包括调谐器，并且其中所述调谐器还可操作以沿着所述测定板的X-Y平面水平地移动到所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中所述传感器可操作来获得与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度。

23.根据权利要求15所述的系统(100)，其中所述系统还包括可操作地耦合到所述调谐器的控制器，并且其中所述控制器被配置为：

-生成与所述调谐器水平地沿着所述测定板的所述X-Y平面的移动相关联的X-Y平台；以及

-将所述生成的X-Y平台提供到所述调谐器，

并且其中所述调谐器被配置为基于所述提供的X-Y平台而沿着所述测定板的所述X-Y平面水平地移动。

24.根据权利要求23所述的系统(100)，其中所述控制器可操作以通过采用校准算法来生成所述X-Y平台。

25.根据权利要求23所述的系统(400)，其中所述控制器还可操作以识别所述孔的中心。

26.根据权利要求23至25所述的系统(100)，其中所述控制器还可操作以：

-检测所述生成的X-Y平台和所述调谐器的所述移动的偏差；以及

-基于所述检测到的偏差来提供对所述调谐器的单独移动的校正。

27.根据权利要求15至26中任一项所述的系统(100)，其还包括耦合到所述成像装置(132)和所述处理模块的可视化模块，其中所述可视化模块包括在与用户相关联的计算装置上渲染的用户界面，并且其中所述可视化模块被配置为执行以下各项中的至少一项：显示针对所述至少一种激发光中的每一者的所述捕获的至少一个图像、显示针对所述至少一种激发光中的每一者的所述孔(200)中的分析物释放分布的所述生成的模型、接收用户输入以控制所述处理模块的操作、显示所述孔中的分析物释放分布的合成模型。

28.根据权利要求15所述的系统(100)，其中所述系统还包括用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模。

29.根据权利要求15或28中任一项所述的系统(100)，其中如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的所述掩模可操作以从所述系统布置移除。

30.一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的方法(500)，所述方法包括确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中对所述分析物的所述浓度的确定包括：

(a)识别至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；

(b)感测所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点以获得与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度；以及

(c)将与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所述获得的荧光强度和分布在所述孔的所述在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的所述浓度相关联。

31.根据权利要求30所述的方法(500)，其中所述方法还包括：

-生成与所述测定板的X-Y平面相关联的X-Y平台；以及

-基于所述生成的X-Y平台来获得所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的所述荧光强度。

32.根据权利要求31所述的方法(500)，其中通过采用校准算法来生成所述X-Y平台。

33.根据权利要求30所述的方法(500)，其中所述方法还包括识别所述孔的中心以用于确定所述在空间上限定的荧光免疫斑点。

34.根据权利要求30所述的方法(500)，其中分布在所述孔的所述在空间上限定的区域中的所述至少一种荧光团检测到的分析物的所述浓度是基于荧光强度。

35.根据权利要求30所述的方法(500)，其中所述方法还包括获得所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点处的所述荧光强度。

36.根据权利要求30或34中任一项所述的方法(500)，其中所述方法还包括从所述至少一种激发光去除噪声。

37.根据权利要求37至36中任一项所述的方法(500)，所述分析物包括以下各项中的至少一项：血清样本、血浆样本、尿样、溶液样本、病毒颗粒、蛋白质、细胞培养液、所述孔中的至少一种潜在的分析物。

38.一种用于分析在空间上限定的荧光免疫斑点测定的系统(400)，所述系统包括传感器布置，所述传感器布置用于确定孔的在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的浓度；其中所述传感器布置包括：

(a)传感器，其可操作以读出至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点；以及

(b)调谐器，其被配置为获得与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的荧光强度，

所述系统的特征在于，所述调谐器还被配置为将与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所述获得的荧光强度和分布在所述孔的所述在空间上限定的区域中的至少一种荧光团检测到的分析物的所述浓度相关联。

39.根据权利要求38所述的系统(400)，其中所述调谐器还可操作以沿着测定板的X-Y平面水平地移动到所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点，并且其中所述传感器可操作来获得与所述至少一个在空间上限定的荧光免疫斑点相关联的所述荧光强度。

40.根据权利要求39所述的系统(400)，其中所述系统还包括可操作地耦合到所述调谐器的控制器，并且其中所述控制器被配置为：

-生成与所述调谐器水平地沿着所述测定板的所述X-Y平面的移动相关联的X-Y平台；以及

-将所述生成的X-Y平台提供到所述调谐器，

并且其中所述调谐器被配置为基于所述提供的X-Y平台而沿着所述测定板的所述X-Y平面水平地移动。

41.根据权利要求40所述的系统(400)，其中所述控制器可操作以通过采用校准算法来生成所述X-Y平台。

42.根据权利要求40所述的系统(400)，其中所述控制器还可操作以识别所述孔的中心。

43.根据权利要求40或41所述的系统(400)，其中所述控制器还可操作以：

-检测所述生成的X-Y平台和所述调谐器的所述移动的偏差；以及

-基于所述检测到的偏差来提供对所述调节器的单独移动的校正。

44.根据权利要求38中任一项所述的系统(400)，其中所述调谐器被配置为调节所述传感器布置中、优选地所述传感器中的电流。

45.根据权利要求38所述的系统(400)，其中所述系统还包括用于从所述至少一种激发光去除噪声的掩模。

46.根据权利要求38或45中任一项所述的系统(400)，其中如果需要，用于从所述至少一种激发光去除噪声的所述掩模可操作以从所述系统布置移除。

47.一种计算机程序产品，其包括上面存储有计算机可读指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机可读指令能够由包括处理硬件的计算机化装置执行以执行权利要求15至29和/或权利要求38至46中任一项的方法。

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