CN101911938B - 银杏酚酸类化合物在杀灭福寿螺上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药技术领域。公开了一类银杏酚酸类化合物具有杀灭农业有害软体动物的作用。为银杏酸、银杏酚在制备生物农药中的新用途。发明显示银杏酸和银杏酚类化合物可有效地抑制福寿螺软体中糖原和蛋白的合成；可同时抑制福寿螺头足部和肝脏中ChE、SDH和MDH活性，干扰NADH呼吸链，引起能量代谢障碍，进而引起细胞供能不足无法完成正常合成分泌功能，促使福寿螺体内重要蛋白质和酶类含量的缺乏导致福寿螺死亡。银杏酸、银杏酚在自然环境中易于降解，对环境影响小；经急性毒性实验证实属微毒农药，可开发成新型生物农药，用于水稻、蔬菜、瓜果的福寿螺防治。

Description

银杏酚酸类化合物在杀灭福寿螺上的用途

技术领域

本发明涉及生物农药，特指银杏酸(ginkgolic acids)和银杏酚(ginkgols，亦称白果酚)在制备生物农药中的新用途，具体涉及银杏酸和银杏酚用于杀灭农业害虫福寿螺。

背景技术

福寿螺[Pomacea canaliculata(Lamarck)]在我国又称大瓶螺、苹果螺、雪螺，是一种水生螺类。原产于南美洲的亚马逊河流域，20世纪70年代末引入我国台湾作为经济动物养殖，1981年引入广东养殖，随后被引入广西、福建、海南、浙江、上海、江苏等地养殖，但因人们不喜欢食用，养殖经济效益差，不久被遗弃于农田环境，并逐步发展成为农作物的有害生物，是国家环保总局2003年公布的首批入侵中国的16种外来物种之一。

福寿螺属杂食性动物，危害许多水生或湿生作物，包括水稻、瓜果、蔬菜等。福寿螺危害水稻的方式主要以成、幼螺在水稻秧苗期和移栽后咬剪主茎和有效分蘖，造成缺株少苗，甚至局部秧苗被食光。在福寿螺为害的田块，水稻一般受害株率为5％～13％，严重的达56％，有效穗减少11.5％，减产8.4％，严重的减产50％以上。福寿螺现在已经成为我国水稻生产中危害较为严重的有害生物之一。

福寿螺在中国的适生性研究结果表明，福寿螺适于在我国广大地区生栖为害，危险区面积达60％左右，对我国的水稻生产和生态安全构成严重威胁。其中在我国福建、广东、广西、海南、台湾和江西、云南的部分地区，福寿螺一年可发生两代或两代以上，田间种群密度增长很快，对农作物危险性极大，为特别危险区；在全国大部分地区，福寿螺一年发生一代，对农作物也有较大的危险性。

目前，虽然福寿螺防治有多种方式，如：冬季稻田修整、科学管水、人工摘除卵块、放鸭食螺等，但因受效果的稳定性、实施时机的选择和材料的获取以及成本等因素制约，大都不宜大范围使用。因此药物防制仍然是福寿螺防治的最主要措施之一，但喷洒在蔬菜表面的化学药物会因影响食用者的健康，其残留物容易危害生态环境，而且一些地区福寿螺对化学农药产生了抗性，使防治难度和成本加大。植物来源的天然药物，特别是采用在当地具有丰富资源的植物或农产品加工废弃物作为天然药物，具有化学药物无法比拟的优势：来源丰富、成本低廉、在自然环境中易降解、对环境的污染小。

银杏(Ginkgo biloba L.)是我国传统的中药材，我国的药用已有数千年的历史。银杏叶提取物(extract from Ginkgo leaves，EGb)被广泛地用于心脑血管疾病的防治，是世界上销售最好的植物药之一，2001年全球银杏干叶的消费约在450万磅到510万磅。白果为银杏的果实，银杏外种皮即为白果的外层胞衣，在白果生产过程中被剥除，为白果生产的废弃物。

银杏酸和银杏酚存在于银杏的叶、果和外种皮中，以外种皮中的含量最高，可达5％，其次为银杏叶，含量约为1.5％左右。银杏酸和银杏酚被认为是银杏叶提取物中的致敏成分，在标准银杏叶提取物EGb761中要求控制在10ppm以下，因此在银杏叶提取物生产过程中必须除去。我国是银杏大国，占世界银杏资源的70％以上，每年随着白果生产而产生的大量银杏外种皮，以及EGb生产过程中剔除的银杏酚酸为我们银杏酸、银杏酚生物农药的生产提供了充足的原料。

发明内容

本发明的目的是提供银杏酸、银杏酚在制备生物农药中的新用途，具体涉及银杏酸、银杏酚在杀灭福寿螺生物农药、保护水稻和蔬菜生产中的新用途。

本发明经杀灭试验表明，银杏酸和银杏酚可以有效杀灭危害水稻和蔬菜的害虫福寿螺，起到防治其危害的作用。银杏酸、银杏酚在自然条件下能够降解，不会对环境造成影响。且银杏酸、银杏酚对蜂、鸟、鱼、蚕毒性很低，属微毒农药，小鼠急性经口LD₅₀＞5000mg/kg。

本发明所涉及的银杏酸为烷基或烯基水杨酸，银杏酚为烷基或烯基苯酚，具有通式I和II所示结构，其中R为直链烷基或烯基，R基上碳原子数可为11-17个，双键数0-3个。这类烷基酚酸类化合物主要存在于银杏的叶和外种皮中；此外还存在于贾如树(Anacardiumoccidentale L.)的叶、果及壳液中。

本发明所述的银杏酸、银杏酚可以从上述银杏叶、银杏外种皮、以及贾如树果壳液中提取、分离得到；由于其结构简单也可通过人工合成的方式得到。

通式I或II中取代基R为直链烷烃或烯烃，碳链长度为11-17碳，双键数0-3个，上述通式I或II中可应用于杀灭福寿螺。

下式为通式I或II中的几个结构示例，其单一化合物或者混合物可应用于杀灭福寿螺：

包含本发明化合物的药物可以作为单独的杀福寿螺药物使用，也可以与其它药物联合使用。

包含本发明化合物的药物可以制成各种农药剂型使用。

本发明实验结果表明银杏酸和银杏酚可抑制福寿螺糖原和蛋白的合成，并通过抑制福寿螺头足部和肝脏胆碱酯酶(choline esterase，ChE)、琥珀酸脱氢酶(succinodehydrogenase，SDH)和苹果酸脱氢酶(malic dehydrogenase，MDH)的活性，干扰福寿螺NADH呼吸链，引起能量代谢障碍，引起细胞供能不足无法完成正常合成分泌功能，使其体内重要蛋白质和酶类含量的缺乏导致福寿螺死亡。

具体实施方式

实施例1：银杏酸同系物杀灭福寿螺的作用

银杏酸同系物的制备 称取干银杏外种皮100g粉碎，5倍量石油醚超声萃取三次，每次2h，合并提取液，减压过滤，挥去溶剂成石油醚浸膏。将浸膏以少量石油醚溶解后上样于硅胶柱(Φ3.2×40cm)，以石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(v/v/v)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集银杏酸组分；多次重复过柱。最后银杏酸组分水洗至中性，挥去洗脱液，得银杏酸同系混合物。

银杏酸同系物的HPLC分析 Varian高效液相色谱仪，SinoChrom ODS-AP C18(250mm×4.6mm，5μm)分析柱，流动相为甲醇∶3％乙酸＝92∶8(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长为310nm。由HPLC分析可知，银杏酸同系物的含量＞98％，由银杏酸C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2五个同系物组成，五个同系物比例依次为：20.7％，3.3％，51.6％，21.1％和3.3％。

银杏酸同系物杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酸同系物以二甲基甲酰溶解后，配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照，氯硝柳胺为阳性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡24h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。阳性对照组氯硝柳胺剂量为5.0mg/L时，福寿螺全部死亡。银杏酸同系物杀灭福寿螺的效果见下表1。计算得到银杏酸同系物的杀灭福寿螺的LD₅₀＝6.81mg/L。

表1 银杏酸同系物杀灭福寿螺的效果(24h)

实施例2：银杏酸C13:0单体杀灭福寿螺的作用

银杏酸C13:0的制备 将银杏酸同系物以四氢呋喃∶甲醇＝1∶1溶解，以HPLC半制备柱HiQ C18(250×21.2mm，15μm)分离银杏酸单体，流动相为甲醇∶3％乙酸＝90∶10，UV检测器于280nm处检测吸收峰，收集第一个峰，重复一次，得到银杏酸C13:0单体。结构式如下：

银杏酸C13:0的HPLC分析 Varian高效液相色谱仪，SinoChrom ODS-AP C18(250×4.6mm，5μm)分析柱，流动相为甲醇∶3％乙酸＝92∶8(v/v)，流速1.0mL/min，紫外检测波长为310nm，对分离得到的银杏酸C13:0进行分析，并与标准品对照，经检测所的银杏酸C13:0的纯度达86％。

银杏酸C13:0的杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酸C13:0以二甲基甲酰溶解后，配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡24h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明0.5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。

银杏酸C13:0杀灭福寿螺的实验结果见表2。计算得到银杏酸C13:0的杀灭福寿螺的LD₅₀＝10.47mg/L。

表2 银杏酸C13:0的杀灭福寿螺效果(24h)

实施例3：银杏酸C15:1单体杀灭福寿螺的作用

银杏酸C15:1的制备 将银杏酸同系物以四氢呋喃∶甲醇＝1∶1溶解，以HPLC半制备柱HiQC18(21.2×250mm，15μm)分离银杏酸单体，流动相为甲醇∶3％乙酸＝90∶10，流速3.0mL/min，UV检测器于280nm处检测吸收峰，收集第二个峰，重复一次，得到银杏酸C15:1单体。结构式如下：

银杏酸C15:1的HPLC分析 Varian高效液相色谱仪，SinoChrom ODS-AP C18(250mm×4.6mm，5μm)分析柱，流动相为甲醇∶3％乙酸＝92∶8(v/v)，流速1.0mL/min，紫外检测波长为310nm，对分离得到的银杏酸C15:1进行分析，经检测所的银杏酸C15:1的纯度达80％。

银杏酸C15:1的杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酸C153:1以二甲基甲酰溶解后，配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡24h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。

银杏酸C15:1杀灭福寿螺的实验结果见表3。计算得到银杏酸C15:1的LD₅₀＝9.63mg/L。

表3 银杏酸C15:1的杀灭福寿螺效果(24h)

实施例4：银杏酚同系物杀灭福寿螺的作用

银杏酸同系物脱羧制备银杏酚同系物 取1.0g银杏酸同系物和0.02g NaOH混合于烧瓶中，在135～140℃下搅拌至无气泡产生，混合物冷却至室温，用石油醚萃取。过滤，浓缩得到一黑褐色油状物。

该黑褐色油状物以乙酸乙酯溶解后，上样于硅胶柱(硅胶120g，硅胶柱为32×400mm的玻璃柱，湿法装柱)，分别采用氯仿、氯仿∶甲醇混合溶液(比例从9∶1逐渐变为5∶5，V/V)洗脱，以薄层层析在254nm处出现荧光为检测，收集白果酚组分，浓缩至干；重复过柱一次，得到的银杏酚同系混合物。LC-ESI-MS分析：安捷伦TC18柱(150×4.6mm，5μm)，流动相甲醇∶1％HAc溶液(90∶10，v/v)，测得银杏酚5个同系物的质量分别为276，304，302，330，328，分别对应于银杏酚C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2。

银杏酸同系物的HPLC分析 Agilent 1200高效率液相色谱仪，ZORBAX Eclipse XDB-C18(150×4.6mm，5μm)分析色谱柱；流动相为甲醇∶水＝92∶8(v/v)；流速1mL/min；紫外检测波长275nm。银杏酚同系物含量＞90％，由银杏酚C13:0，C15:0，C15:1，C17:1和C17:2五个同系物组成，五个同系物比例与银杏酸基本一致。

银杏酚同系物杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酚同系物先二甲基甲酰溶解，再配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照，氯硝柳胺为阳性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡24h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明0.5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。阳性对照组氯硝柳胺剂量为5.0mg/L时，福寿螺全部死亡。

银杏酚同系物杀灭福寿螺的效果见下表4。计算得到银杏酚同系物的LD₅₀＝69.52mg/L。

表4 银杏酚同系物杀灭福寿螺的效果(24h)

实施例5：银杏酚C13:0杀灭福寿螺的作用

银杏酚C13:0的制备 将银杏酚同系物以四氢呋喃∶甲醇＝1∶1溶解配成溶液，以HPLC半制备柱ZORBAX SB-C18(250×9.4mm，15μm)分离银杏酚单体，流动相为甲醇∶水＝90∶10，流速3.0mL/min；UV检测器于275nm处检测吸收峰，收集第一个峰得银杏酚C13:0，重复一次，得银杏酚C13:0单体。结构式如下：

银杏酚C13:0的HPLC分析 Agilent 1200高效率液相色谱仪，ZORBAX Eclipse XDB-C18(150×4.6mm，5μm)分析色谱柱；流动相为甲醇∶水＝92∶8(V/V)；流速1.0mL/min；紫外检测波长275nm。对分离得到的银杏酚C13:0进行分析，采用面积归一法测得经检测所的银杏酚C13:0的纯度达90％。

银杏酚C13:0的杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酚C13:0先二甲基甲酰溶解，再配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡48h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。

银杏酚C13:0杀灭福寿螺的实验结果见表5。计算得到银杏酚C13:0的LD₅₀＝82.41mg/L。

表5 银杏酚C13:0杀灭福寿螺的效果(24h)

实施例6：银杏酚C15:1杀灭福寿螺的作用

银杏酚C15:1的制备 将银杏酚同系物以四氢呋喃∶甲醇＝1∶1溶解配成溶液，以HPLC半制备柱ZORBAX SB-C18(250×9.4mm，15μm)分离银杏酚单体，流动相为甲醇∶水＝90∶10，流速3.0mL/min；UV检测器于275nm处检测吸收峰，收集第二个峰得银杏酚C15:1，重复一次，得银杏酚C15:1单体。结构式如下：

银杏酚C15:1的HPLC分析 Agilent 1200高效率液相色谱仪，ZORBAX Eclipse XDB-C18(150×4.6mm，5μm)分析色谱柱；流动相为甲醇∶水＝92∶8(V/V)；流速1.0mL/min；紫外检测波长275nm。对分离得到的银杏酚C15:1进行分析，采用面积归一法测得经检测所的银杏酚C15:1的纯度为75％。

银杏酚C15:1的杀灭福寿螺实验 采用浸杀法，银杏酚C15:1先二甲基甲酰溶解，再配成一系列浓度的溶液，每个浓度浸没15只鲜活福寿螺，以含0.5％(v/v)二甲基甲酰胺的去氯水为溶剂对照组；以去氯水作为阴性对照。分别于24h取出福寿螺，用去氯水清洗三次，25℃饲养24h后观察福寿螺的存活率，以未见活动，并用针刺无反应者判为死螺。

25℃恒温下，进行多批不同浓度和不同时间的浸泡杀螺试验，结果显示：溶剂对照组和阴性对照组，浸泡48h，福寿螺全部存活，死亡率为0％。说明5％的DMF对福寿螺的存活率没有影响。

由银杏酚C15:1杀灭福寿螺的实验结果，计算得到银杏酚C15:1的LD₅₀＝84.79mg/L。

药效学实验一：银杏酸和银杏酚同系物对福寿螺蛋白质和糖原的影响

将福寿螺随机分成3组，每组20只，分别浸没于含有2.72mg/L(40％ LD₅₀)银杏酸同系物的去氯水中，和含有27.81mg/L(40％ LD₅₀)银杏酚同系物的去氯水中，以去氯水为阴性对照组。浸泡24h后以去氯水洗涤福寿螺三次，置于烧杯中，待其爬至烧杯上端，取出去壳取软体，置于40℃干燥后碾成粉状。称取10mg粉末，加入2mL 30％KOH溶液于100℃水浴恒温20min，冷却至室温，加入10mL乙醇充分混匀，于2000rmp离心10min，取上清液，以蒽酮比色法测定糖原含量。另取100mg粉末，以凯氏定氮法测定蛋白含量。总蛋白含量以

下列公式计算：总蛋白％＝6.25×N％。平行重复三次。结果见表6。

表6 银杏酸和银杏酚对福寿螺糖原和蛋白质含量的影响(n＝3)

由表6可知，经银杏酸和银杏酚处理后，福寿螺软体中糖原和蛋白的含量都有显著的降低，降低程度随着用药剂量的增加而加大。因此提示银杏酸和银杏酚的杀灭福寿螺的作用与它们影响福寿螺正常能量代谢有关。

药效学实验二：银杏酸和银杏酚同系物对福寿螺酶学指标的影响

将福寿螺随机分成3组，每组20只，分别浸没于含有2.72mg/L(40％ LD₅₀)银杏酸同系物的去氯水中，和含有27.81mg/L(40％ LD₅₀)银杏酚同系物的去氯水中，以去氯水为阴性对照组。浸泡24h后以去氯水洗涤福寿螺三次，置于烧杯中，待其爬至烧杯上端，取出福寿螺，去壳后，将其头足部与肝脏分离后，分别在冰面上匀浆，匀浆液于4℃条件下，4000rmp离心20min，取上清液进行酶学指标分析，平行重复三次。

乙酰胆碱酯酶(ChE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和蛋白试剂盒购于南京建成生物工程公司，测定按说明书进行。

实验结果显示，经40％ LD₅₀的银杏酸处理后，福寿螺头足部的ChE、SDH和MDH活性分别为对照组的90.4％、68.7％和83.3％；经40％ LD₅₀的银杏酚处理后，福寿螺头足部的ChE、SDH和MDH活性分别为对照组的89.3％、76.8％和83.0％。

由实验结果可见，亚致死剂量的银杏酸和银杏酚能够抑制福寿螺头足部和肝脏乙酰胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性。实验中还发现随着药物浓度的增加，银杏酚酸对三种酶活性的抑制率增强。

ChE活性的抑制可导致神经递质乙酰胆碱堆积，使足跖肌运动功能丧失，当达到一定程度时，可导致支持运动、呼吸、心跳等生命活动的肌肉功能丧失，加速福寿螺死亡。SDH和MDH分别是FADH2和NADH呼吸链中代表酶，在体内能量转移中发挥着十分重要的作用；干扰FADH2和NADH呼吸链可使氧化磷酸化产生的能量难以转移，引起细胞供能不足，合成和分泌功能受抑制，并最终导致福寿螺死亡。

Claims (1)

1.银杏酚酸类化合物在杀灭福寿螺上的用途，其特征在于下式的化合物可应用于制备杀灭福寿螺的药物； 

                                               

          或

     ；

或者下式的化合物的混合物可应用于制备杀灭福寿螺的药物；

       和

   和

   和

和

。