CN101899487A - 一种原位酶解纤维素体系及回收方法 - Google Patents

Abstract

一种原位酶解纤维素及回收方法，将纤维素用离子液体于40℃～120℃溶解，加入溶剂形成离子液体/溶剂体系，离子液体的含量占离子液体/溶剂体系总体积的5％～100％，再加入纤维素酶于40℃～60℃下进行纤维素的原位酶解；离子液体为咪唑磷酸酯类离子液体；溶剂为pH＝4.8的柠檬酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；纤维素酶加入量为每毫升离子液体/溶剂体系0.5～50mg；酶解后采用吸附分离法或双水相分离法回收离子液体和糖。本发明工艺简单，与现有的离子液体处理纤维素后再生酶解的“两步法”相比，具有效率高、耗费有机溶剂少、过程经济、三废少等优点。

Description

一种原位酶解纤维素体系及回收方法

技术领域

本发明涉及一种离子液体/溶剂体系中进行纤维素酶解的工艺和酶解体系，以及酶解后离子液体的回收方法。

背景技术

纤维素分子间及分子内具有极强的氢键作用，这使得纤维素不溶于通常的溶剂、难以被直接利用。因此，纤维素的溶解一直是纤维资源综合利用过程重点需要解决的问题。传统上，采用化学改性的方法(如酮氨络合物法、黄原酸盐法等)处理纤维素，该法存在能耗高、污染严重，投资较大等缺点。鉴于此，各国科学家致力于开发新型的纤维素研究溶剂，主要有四氧二氮/二甲基甲酞胺(N₂O₄/DMF)、氯化锂/二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)、二甲基亚砜/四乙基氯化氨体系(DMSO/TEAC)、环胺氧化物。其中，环胺氧化物尤其是N-甲基氧化吗琳(NMMO)被认为是相对比较有前途的有机溶剂。然而，溶剂的挥发性、毒性、溶剂造价高不易回收、应用不稳定等方面的缺点限制了这些溶剂处理纤维素的工业化的发展进程。

近年来，离子液体作为一种“绿色可设计溶剂”，在纤维素预处理领域引起广泛关注，其已经成功地用于纤维素的溶解以及加工过程。常见的研究是采用离子液体(如1-丁基-3-甲基咪唑氯)在一定温度下将纤维素溶解处理，然后用水/有机溶剂进行纤维素再生，最后用纤维素酶对再生纤维素进行酶解，即通常所说的“两步法”，其步骤繁琐，且再生纤维素的有机溶剂用量大。理想的方法是将纤维素、离子液体和酶进行“一锅”处理，实现离子液体对纤维素的溶解和纤维素酶的酶解反应协调进行。目前为止，尚未见有关“一锅”方法的成功报道，主要原因在于：第一，常见的如咪唑氯型等的离子液体虽能溶解纤维素，但离子液体本身与酶分子形成氢键，其生物相容性差，容易造成纤维素酶失活；第二，离子液体黏度高。比一般有机溶剂高1～3个数量级，虽然温度的升高和杂质的存在会显著降低其黏度，但目前离子液体最小的黏度也在5～10cP。黏度大会影响离子液体的传质和传热效果，不利于产物的分离。第三，采用“一锅”法时，由于体系的粘度大，离子液体和单糖回收问题非常复杂。2008年，Kamiya等提出在水-离子液体的体系中进行纤维素的原位酶解，其体系采用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯，分别添加不同量的柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH＝5.0)，在40℃时纤维素酶直接加入到水溶液-离子液体的体系中进行酶解纤维素，当其中离子液体和水的体积比为1∶4时，超过起始量的70％的纤维素能转化成纤维二糖和葡萄糖，这一结果表明原位酶解是可以实现的。然而，在离子液体浓度进一步提高时，酶解效果大大降低，研究者没有考虑到离子液体增加导致的体系粘度和反应的传质传热等问题，同时对于酶解过程的影响因素也未全面考虑。

另一方面，针对离子液体/溶剂混合体系，在其中进行原位酶解后的最大问题是如何从离子液体中回收非挥发、亲水性的离子液体以及酶解后得到的单糖。2003年，Rogers等提出双水相系统(ABS，Aqueous biphasicsystems)可能用于从亲水性离子液体的水溶液中浓缩或者是回收离子液体，然而，目前为止，尚未见到用ABS系统回收离子液体的实例报道，而针对体系中同时含有极性大的单糖和亲水性离子液体这一更为复杂的问题，采用ABS系统来回收其中离子液体以及分离单糖的研究同样也未见报道。此外，2006年，日本学者Yukinobu Fukaya等报道了氧化铝柱可以用来纯化[Amim][Cl]等离子液体，但是针对同时含有高极性的、亲水性的离子液体和极性较大的单糖的复杂体系，也未见有用氧化铝柱等吸附分离离子液体和糖的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种原位酶解纤维素体系及回收方法，以克服离子液体“两步法”处理纤维素技术的不足。

为实现上述目的，本发明的技术方案是，将纤维素用离子液体溶解，在溶解体系中添加缓冲溶液、有机溶剂及纤维素酶进行原位酶解，酶解后离子液体和单糖进行分离，离子液体可重复利用。有鉴于上述构想，本发明提供的原位酶解纤维素及回收方法，将纤维素用离子液体于40℃～120℃溶解，加入溶剂形成离子液体/溶剂体系，离子液体的含量占离子液体/溶剂体系总体积的5％～100％，再加入纤维素酶于40℃～60℃下进行纤维素的原位酶解；其中：所述离子液体为咪唑磷酸酯类离子液体，如[Mmim][Me₂PO₄]、[Emim][Me₂PO₄]、[Emim][Et₂PO₄]、[Eeim][Et₂PO₄]、[Bmim][Me₂PO₄]、[Beim][Et₂PO₄][Amim][Me₂PO₄]或[Aeim][Et₂PO₄]；

所述溶剂为pH＝4.8的柠檬酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；

纤维素酶加入量为每毫升离子液体/溶剂体系0.5～50mg；

酶解后采用吸附分离法或双水相分离法回收离子液体和糖。

所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，离子液体/溶剂体系中加入0～50％的有机溶剂，该溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，吸附分离法是将中性氧化铝、吸附分离树脂分别装层析柱，将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩后直接上层析柱；先用低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或混合液)作为离子液体的洗脱液，再用水作为糖的洗脱液。或将低级醇和水的混合液作为洗脱液。

所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，双水相分离法是将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩液加入双水相体系中，双水相体为：聚乙二醇/K₃PO₄、聚乙二醇/Na₂SO₄、乙醇/(NH₄)₂SO₄或乙醇/Na₂SO₄。

本发明可以省去“两步法”中纤维素再生的过程，减少大量有机溶剂的消耗量，离子液体回收利用率高，三废排放少。与目前现有的离子液体处理纤维素、然后经再生后酶解的步骤相比，具有明显的先进性和显著的进步，将为纤维素资源的综合利用提供一条新的途径。

附图说明

图1为本发明实施方式的工艺流程示意图；

图2为本发明回收的离子液体[Mmim][Me₂PO₄]的红外光谱分析谱图；

图3为本发明回收离子液体[Mmim][Me₂PO₄]的¹HNMR分析谱图。

具体实施方式

本发明的主要步骤如图1所示：

1)咪唑磷酸酯类离子液体的合成：将等物质的量的N-烷基咪唑和磷酸三烷基酯在圆底烧瓶中混合，在油浴50～150℃搅拌反应1～10小时，冷却至室温后，得浅棕色透明溶液。分别用乙醚(3×80mL)和甲苯(3×50mL)洗，最后加入10～50mL甲苯，80℃减压蒸馏除去甲苯，继续干燥1～5小时，分别得到[Mmim][Me₂PO₄]、[Emim][Me₂PO₄]、[Emim][Et₂PO₄]、[Eeim][Et₂PO₄]、[Bmim][Me₂PO₄]、[Beim][Et₂PO₄][Amim][Me₂PO₄]、[Aeim][Et₂PO₄]。

2)将纤维素小量慢慢加入上述步骤1合成的任一离子液体中进行纤维素的搅拌溶解，待完全溶解后再继续加入，至不能溶解为止。溶解温度可选40～120℃。

3)经步骤2将纤维素溶解在离子液体中后，体系中直接添加醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)，使离子液体在整个体系中占的体积比为5％～100％，此体系直接添加纤维素酶进行原位酶解纤维素，或者体系中在加酶之前加入0～50％体积比的有机溶剂，然后再进行原位酶解。酶解温度控制在40℃～80℃。

4)酶解完成后，体系中大部分水和有机溶剂可经减压蒸馏除去，浓缩后的体系中糖和离子液体采用双水相或者吸附分离法进行离子液体的回收及单糖的分离。采用中性氧化铝、大孔吸附分离树脂等分别装层析柱，将浓缩后的含单糖和离子液体的混合液直接投入层析柱，先用甲醇、乙醇、异丙醇等有机醇做洗脱剂，其中最佳为甲醇，洗脱流速控制为1～50mL/min。至离子液体完全洗脱出来后，采用去离子水作洗脱剂，洗脱流速为5～50mL/min，即可将单糖洗脱出来。或者采用双水相分离方法回收离子液体，其中双水相体系可为聚乙二醇/K₃PO₄、聚乙二醇/Na₂SO₄、乙醇/(NH₄)₂SO₄、乙醇/Na₂SO₄体系等。将酶解后的浓缩液直接加入上述双水相体系中，其中离子液体主要分布于有机相中，糖主要分布于盐相中，经过多次双水相分离可达到离子液体回收的目的。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明：

实施例1

将纤维素在离子液体[Mmim][Me₂PO₄]中溶解，溶解温度为60℃，然后加入醋酸缓冲液(pH＝4.8)，使离子液体占体系的体积比为20％，加入纤维素酶1.5mg/mL，在60℃下酶解24小时，用HPLC法分析其中还原糖的含量，得到纤维素转化成还原糖的转化率为75.6％。

实施例2

将纤维素在离子液体[Mmim][Me₂PO₄]中溶解，溶解温度为60℃，然后加入醋酸缓冲液(pH＝4.8)，使离子液体占体系的体积比为20％，另外加入有机溶剂DMSO质量比为1％，加入纤维素酶1.5mg/mL，在60℃下酶解24小时，用HPLC法分析其中还原糖的含量，得到纤维素转化成还原糖的转化率为82.2％。

实施例3

将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩，其中含离子液体[Mmim][Me₂PO₄]和质量比为12.5％的单糖，用中性氧化铝(200～300目)装层析柱，柱高径比为15，首先用甲醇洗脱，洗脱流速为1.0mL/min，用紫外分光光度计在220nm波长下检测洗脱组分是否含离子液体，用DNS法分析洗脱液中的葡萄糖，至离子液体完全洗脱出来后，改用去离子水作为洗脱剂，洗脱流速为10mL/min。回收的离子液体用红外光谱和核磁共振谱进行结构确证(见图2和图3)，其中离子液体的回收率为96.5％。

实施例4

将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩，其中含离子液体[Mmim][Me₂PO₄]和质量比为15％的单糖，用大孔吸附树脂JT-008装层析柱，柱高径比为20，首先用甲醇洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，用紫外分光光度计在220nm波长下检测洗脱组分是否含离子液体，用DNS法分析洗脱液中的葡萄糖，至离子液体完全洗脱出来后，改用去离子水作为洗脱剂，洗脱流速为8mL/min。回收的离子液体用红外光谱进行结构确证，其中离子液体的回收率为90％。

实施例5

将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩，其中含离子液体[Emim][Me₂PO₄]和质量比为10.5％的单糖，用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取分离离子液体和单糖，双水相的配置方法为控制硫酸铵为质量比的20％，用紫外分光光度计检测上下相中含离子液体的量，用生物传感分析仪分盐水下相中含葡萄糖的量，其中离子液体主要分布于乙醇相中，经四次重复萃取分离，离子液体[Emim][Me₂PO₄]的回收率为89.2％。

Claims (8)

1.一种原位酶解纤维素及回收方法，将纤维素用离子液体于40℃～120℃溶解，加入溶剂形成离子液体/溶剂体系，离子液体的含量占离子液体/溶剂体系总体积的5％～100％，再加入纤维素酶于40℃～60℃下进行纤维素的原位酶解；其中：

所述离子液体为咪唑磷酸酯类离子液体；

所述溶剂为pH＝4.8的柠檬酸缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；

纤维素酶加入量为每毫升离子液体/溶剂体系0.5～50mg；

酶解后采用吸附分离法或双水相分离法回收离子液体和糖。

2.根据权利要求1所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，离子液体/溶剂体系中加入0～50％的有机溶剂，该溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

3.根据权利要求1所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，咪唑磷酸酯类离子液体为：

[Mmim][Me₂PO₄]、[Emim][Me₂PO₄]、[Emim][Et₂PO₄]、[Eeim][Et₂PO₄]、[Bmim][Me₂PO₄]、[Beim][Et₂PO₄][Amim][Me₂PO₄]或[Aeim][Et₂PO₄]。

4.根据权利要求1所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，吸附分离法是将中性氧化铝、吸附分离树脂分别装层析柱，将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩后直接上层析柱；先用低级醇作为离子液体的洗脱液，再用水作为糖的洗脱液。

5.根据权利要求4所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，将低级醇和水的混合液作为洗脱液。

6.根据权利要求4所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或混合液。

7.根据权利要求1所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，双水相分离法是将原位酶解后的离子液体/溶剂体系浓缩液加入双水相体系中。

8.根据权利要求6所述的原位酶解纤维素及回收方法，其中，双水相体为：聚乙二醇/K₃PO₄、聚乙二醇/Na₂SO₄、乙醇/(NH₄)₂SO₄或乙醇/Na₂SO₄。

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