CN101899484A - 一种京尼平的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种京尼平的制备方法，它包括固定化酶的制备工艺、栀子苷的转化工艺和京尼平的分离纯化工艺三个部分，其特征在于将产β-葡萄糖苷酶的菌种发酵，待达到产酶高峰后，将发酵液收集，用包埋-交联结合的方法共固定化酶和细胞、或酶和菌丝，制备固定化酶，采用填充床或搅拌式反应器对栀子苷进行催化水解反应，经纯化后得到京尼平。本发明无须对发酵液进行分离纯化，且制备得到的固定化酶活力高，运行时间达960小时后酶活仍保持50％以上，对环境污染小，京尼平产率高，与其他方法相比具有显著的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种京尼平的制备方法，特别涉及一种共固定化酶和细胞生物催化栀子苷水解制备京尼平的方法。
背景技术
京尼平是由京尼平苷、亦称栀子苷，经β-葡萄糖苷酶水解后得到的环烯醚萜类化合物。京尼平有多种用途，一是可以与氨基酸反应生成蓝色素，这种天然蓝色素可以用作食品添加剂，它无毒、性质稳定，在国外已经得到普遍使用；二是京尼平在医学上可以用作天然生物交联剂，现代生物医学实践中为了减少生物体对植入异种生物组织或人造替代物的排斥反应，增加生物材料的生物相容性和力学性能，通常使用交联的办法来达到目的，传统的交联剂大部分是化学合成交联剂，如戊二醛、碳化二亚胺、三聚磷酸钠、环氧化合物等，这些合成交联剂都具有较大的细胞毒性，植入生物体后会影响正常组织生长，而京尼平无毒性且生物相容性好，能形成稳定的交联产品；三是京尼平可以用于治疗II型糖尿病，研究表明一种叫线粒体解耦联蛋白2(Uncoupled Protein 2，UCP2)的蛋白对胰岛素释放有抑制作用，因此如果解除UCP2对胰岛素释放的抑制，可能会促使更多的胰岛素释放，改善部分II型糖尿病症状，京尼平正是这种可以解除UCP2对胰岛素释放抑制的有效成分，因此有望为临床上治疗II型糖尿病开启新的纪元。另外，京尼平还可以用于治疗肝脏疾病、降血压，以及指纹采集试剂、染色剂等。总之，京尼平应用范围广，开发潜力大，具有广阔的市场前景。
目前京尼平的制备方法一般都采用提纯后的β-葡萄糖苷酶来转化栀子苷如：CN 101104745A；CN 101396455A；CN 101029066A，再经过乙醚萃取，丙酮结晶的方法制备，这种方法得到的京尼平产率低、纯度不高，投入的酶不能回收，因此成本较高，所以目前市场上销售的京尼平价格昂贵。另外，京尼平的制备需要使用大量的有毒有机溶剂，对环境易造成污染；也有利用微生物发酵法转化栀子苷制备京尼平的报道，如霍蕾，苏建，沈竞，等，天然产物研究与开发2008，20：70-73；王永宏，苏建，王建芳，等.时珍国医国药，2007，18(12)：3003-3004；Meng Meng XU，Qun SUN，Jian SU，et al.Enzyme and MicrobialTechnology，2008，42：440-444，但是该方法存在一个比较大的缺陷是，微生物发酵时发酵液中有较多的氨基酸和蛋白类物质，当栀子苷水解生成京尼平后，京尼平会与氨基酸发生反应生成蓝色素，大大降低京尼平的收率；国外有报道利用固定化β-葡萄糖苷酶转化栀子苷制备京尼平的技术，如ShigeakiFUJIKAWA，Tomoko YOKOTA，Kunimasa KOGA，et al.Biotechnology Letters，1987，9(10)：697-702，转化率可达95％以上，并且固定化酶的半衰期长达600小时，但是该方法需要得到大量的纯β-葡萄糖苷酶，因此成本也较高。
发明内容
本发明利用微生物发酵技术，制备含β-葡萄糖苷酶和细胞，或和菌丝的发酵液，再将发酵液直接利用固定化技术，将β葡萄糖苷酶和细胞，或和菌丝共固定化制备固定化酶，然后将栀子苷转化成京尼平，从而完成了本发明。该方法无须对发酵液进行分离纯化，且制备得到的固定化酶活力高，运行时间达960小时后酶活仍保持50％以上，对环境污染小，京尼平产率高，与其他方法相比具有显著的优势。
本发明的目的在于提供一种采用了共固定化技术，制备固定化酶和细胞、或酶和菌丝生物转化栀子苷制备京尼平的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：它包括固定化酶的制备工艺、栀子苷的转化工艺和京尼平的分离纯化工艺三个部分，将产β-葡萄糖苷酶的菌种发酵，待达到产酶高峰后，将发酵液收集，用包埋-交联结合的方法共固定化酶和细胞、或酶和菌丝，制备固定化酶，采用填充床或搅拌式反应器对栀子苷进行催化水解反应，经纯化后得到京尼平。
京尼平是利用β-葡萄糖苷酶对京尼平苷(亦称栀子苷)进行水解后得到的环烯醚萜类化合物，其结构式和水解过程如图1所示。用产β-葡萄糖苷酶的高产菌株如黑曲霉、米根霉、宇佐美曲霉等发酵，制得发酵液和菌丝，采用共固定化法，通过交联-包埋结合制备固定化酶，此方法无须对酶进行分离纯化，降低了生产成本。我们分别使用了搅拌式和填充床式固定化酶对栀子苷进行转化，结果是转化率都在95％以上，但搅拌式固定化酶的使用寿命大大缩短，原因在于搅拌式反应器对固定化酶的活性有较大影响。
各部分工艺为：
(1)固定化酶的制备工艺：将产β-葡萄糖苷酶的高产菌株发酵，发酵好的菌液连同细胞或菌丝一起采用共固定化法固定，即在发酵液中加入终浓度为0.05％-2％的交联材料，然后用终浓度为0.05％-2％的交联剂进行交联，再用海藻酸钠进行包埋，然后逐滴加入到氯化钙溶液中硬化，制成小球状的固定化酶颗粒；
(2)栀子苷的转化工艺：利用固定化酶颗粒，采用搅拌式或填充床式进行栀子苷的转化，在填充床中栀子苷溶液以每小时0.1-3个柱体积的流速通过固定化酶床，转化温度为45-55℃，即得到京尼平溶液，栀子苷的转化率在95％以上；如果采用搅拌式转化，则将栀子苷溶液与固定化酶混合，在45-55℃温度下以一定的搅拌转速进行转化，搅拌转速以50-200r/min为最佳，转化时间以2-6小时为最佳，转化率达95％以上。
我们对共固定化与单纯固定化酶进行了比较，即采用两种不同方法固定化后的酶分别用填充床式反应器对栀子苷进行转化，栀子苷浓度为1％，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH值为4.5，以1BV/hr(BV指柱体积)流速通过固定化酶床，一定时间后各取出1g固定化酶进行酶活力测定，酶活力测定方法采用pNPG法(梁华正，刘富梁，彭玲西，等.食品科学，2006，4：182-185)，结果表明，共固定化酶和细胞、或酶和菌丝酶活半衰期明显长于普通固定化酶，具体结果见下表1：
表1共固定化与单纯固定化酶在转化一定时间后取出测定的酶活结果
由表1可知，共固定化酶半衰期达到960hr左右，高于普通固定化方法的酶活半衰期。并且共固定化酶在前120hr酶活变化都较小，原因在于共固定化法制得的固定化酶中包含有产酶活细胞或菌丝，这些细胞被包埋后还处于活性状态，仍然具有产酶能力。
(3)京尼平的分离纯化工艺：将京尼平转化液经大孔树脂吸附，洗脱，再浓缩、干燥、结晶，即可得京尼平产品，其高效液相色谱图如图2所示。以京尼平对照品(购于日本Wako公司)的高效液相色谱峰面积制作标准曲线，计算结果表明，用本方法制备的京尼平含量达到98.65％。
(4)京尼平的收率：取含量为95％的栀子苷100克，用pH为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解成浓度为1.5％的溶液，另采用本发明方法共固定化制备固定化酶和细胞、或酶和菌丝500克，将酶装柱后置于50℃预热，然后用缓冲液冲洗至检测不出氨基酸(用京尼平显色法检测，参考梁华正，廖夫生，乐长高，等.天然产物研究与开发，2006(3)：467-470)后，再将栀子苷溶液以1BV/hr的流速通过固定化酶床，将转化液用HPD100大孔吸附树脂吸附，经洗脱、浓缩、结晶、干燥后得到粉末状京尼平46.82克，用HPLC法检测京尼平含量为96.26％，京尼平收率计算公式为：收率＝[(京尼平质量×京尼平含量)/(栀子苷质量×栀子苷含量)]/(226.23/388.36)，计算得收率为81.45％。
本发明实施时包括如下步骤：
(1)将产β-葡萄糖苷酶的高产菌株发酵48-150小时，将发酵液连同菌丝一起取出，直接加入终浓度为0.1％-2％交联材料，和终浓度为0.1％-2％的交联剂中进行交联，交联时间为0.5-4小时，交联温度为4-20℃，或对发酵液连同菌丝进行浓缩后再交联；
所述的产β-葡萄糖苷酶的高产菌株为黑曲霉、米根霉、或宇佐美曲霉；
所述交联材料为壳聚糖或明胶；
所述交联剂为戊二醛、碳化二亚胺、三聚磷酸钠、或环氧化合物；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为1％-6％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度0.5％-8％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.1％-1％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为1-3小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)将固定化酶湿法装柱，再用去离子水配制0.1％-5％的栀子苷溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，以每小时0.1-3个柱体积的流速将栀子苷溶液通过固定化酶柱床，酶解温度为50℃；
(7)将转化液用大孔吸附树脂吸附，经洗脱、浓缩、低温干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右，再经重结晶后京尼平纯度可达98％以上；
所述的百分比为重量百分比。
采用分子量为6000至30000的中空纤维超滤器对发酵液连同菌丝进行浓缩，浓缩至原体积的六分之一至二分之一。
本发明采用共固定化酶和细胞、或酶和菌丝的方法，只需要将发酵好的发酵液连同细胞或菌丝一起交联-包埋，不仅延长了固定化酶的使用时间，还大大降低了成本，克服了以往使用纯酶转化栀子苷成本高、效率低、分离困难的缺点。其实用性和优越性具体表现在以下三个方面：一是发酵液无须分离，制备固定化酶成本低；二是共固定化酶和细胞、或酶和菌丝得到的酶活性高，半衰期长；三是固定化酶经装柱后用缓冲液冲洗可以有效地弃除氨基酸、蛋白质等，转化液不会发生绿变，提高了京尼平的得率。
附图说明
图1、本发明栀子苷经β-葡萄糖苷水解成京尼平的反应式。
图2、本发明纯化后京尼平的高效液相色谱图。
图2中的色谱条件为：Hypersil ODS C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇∶水(22∶78)，流速为1.0ml/min，检测波长238nm。
具体实施方式
本发明可以通过发明内容中说明的技术具体实施，通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例，所述的百分比为重量百分比：
实施例1
(1)将产酶黑曲霉菌株发酵96小时，将发酵液连同菌丝一起取出，采用分子量为6000的中空纤维超滤器对其进行浓缩，浓缩至原体积的三分之一左右，加入终浓度为1％的明胶和终浓度为0.25％的戊二醛进行交联，交联时间为1小时，交联温度为10℃；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为3％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度3％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.5％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为2小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)将固定化酶湿法装柱，再配制1％的栀子苷溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，以每小时0.5个柱体积的流速将栀子苷溶液通过固定化酶柱床，酶解温度为50℃；
(7)将转化液用型号HPD-100等大孔吸附树脂进行吸附；用去离子水冲洗树脂至无色液体流出，再用浓度为35％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，得到膏状的京尼平，再冷冻干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右。经重结晶后京尼平纯度可达98％以上。
实施例2
(1)将产酶宇佐美曲霉菌株发酵120小时，将发酵液连同菌丝一起取出，采用分子量为30000的中空纤维超滤器对其进行浓缩，浓缩至原体积的五分之一左右，加入终浓度为0.5％壳聚糖和终浓度为0.5％的戊二醛进行交联，交联时间为2小时，交联温度为20℃；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为3％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度3％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.5％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为3小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)将固定化酶湿法装柱，再配制2％的栀子苷溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，以每小时0.3个柱体积的流速将栀子苷溶液通过固定化酶柱床，酶解温度为50℃；
(7)将转化液用型号HPD-200树脂进行吸附；用去离子水冲洗树脂至无色液体流出，再用浓度为35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，得到膏状的京尼平，再冷冻干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右。经重结晶后京尼平纯度可达98％以上。
实施例3
(1)将产酶米根霉菌株发酵96小时，将发酵液连同菌丝一起取出，加入终浓度为2％明胶和终浓度为1％的戊二醛进行交联，交联时间为1小时，交联温度为10℃；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为3％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度4％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.5％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为2小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)将固定化酶湿法装柱，再配制2％的栀子苷溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，以每小时1.5个柱体积的流速将栀子苷溶液通过固定化酶柱床，酶解温度为50℃；
(7)将转化液用型号HPD-100树脂进行吸附；用去离子水冲洗树脂至无色液体流出，再用浓度为35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，得到膏状的京尼平，再冷冻干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右。经重结晶后京尼平纯度可达98％以上。
实施例4
(1)将产酶黑曲霉菌株发酵96小时，将发酵液连同菌丝一起取出，加入终浓度为1％壳聚糖和终浓度为0.25％的戊二醛进行交联，交联时间为1小时，交联温度为10℃；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为4％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度5％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在1％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为3小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)配制0.5％的栀子苷溶液5升，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，加入固定化酶1kg，置于50℃恒温水浴锅内进行水解转化5小时；
(7)将转化液用型号HPD-200树脂进行吸附；用去离子水冲洗树脂至无色液体流出，再用浓度为35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，得到膏状的京尼平，再低温干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右。经重结晶后京尼平纯度可达98％以上。
实施例5
(1)将产酶黑曲霉菌株发酵120小时，将发酵液连同菌丝一起取出，加入终浓度为1％明胶和终浓度为0.25％的戊二醛进行交联，交联时间为1.5小时，交联温度为15℃；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为3％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度4％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.5％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为2小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)配制0.5％的栀子苷溶液10升，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，加入固定化酶2kg，置于50℃恒温水浴锅内进行水解转化6小时；
(7)将转化液用型号HPD-100树脂进行吸附；用去离子水冲洗树脂至无色液体流出，再用浓度为35％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液浓缩，得到膏状的京尼平，再冷冻干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右。经重结晶后京尼平纯度可达98％以上。
Claims (4)
1.一种京尼平的制备方法，它包括固定化酶的制备工艺、栀子苷的转化工艺和京尼平的分离纯化工艺三个部分，其特征在于将产β-葡萄糖苷酶的菌种发酵，待达到产酶高峰后，将发酵液收集，用包埋-交联结合的方法共固定化酶和细胞、或酶和菌丝，制备固定化酶，采用填充床或搅拌式反应器对栀子苷进行催化水解反应，经纯化后得到京尼平。
2.根据权利要求1所述的一种京尼平的制备方法，其特征在于各部分工艺为：
(1)固定化酶的制备工艺：将产β-葡萄糖苷酶的高产菌株发酵，发酵好的菌液连同细胞或菌丝一起采用共固定化法固定，即在发酵液中加入终浓度为0.05％-2％的交联材料，然后用终浓度为0.05％-2％的交联剂进行交联，再用海藻酸钠进行包埋，然后逐滴加入到氯化钙溶液中硬化，制成小球状的固定化酶颗粒；
(2)栀子苷的转化工艺：利用固定化酶颗粒，采用搅拌式或填充床式进行栀子苷的转化，在填充床中栀子苷溶液以每小时0.1-3个柱体积的流速通过固定化酶床，转化温度为45-55℃，即得到京尼平溶液，栀子苷的转化率在95％以上；如果采用搅拌式转化，则将栀子苷溶液与固定化酶混合，在45-55℃温度下以一定的搅拌转速进行转化，搅拌转速以50-200r/min为最佳，转化时间以2-6小时为最佳，转化率达95％以上。
(3)京尼平的分离纯化工艺：将京尼平转化液经大孔树脂吸附，洗脱，再浓缩、干燥、结晶，即可得京尼平产品；
所述的百分比为重量百分比。
3.根据权利要求1或2所述的一种京尼平的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)将产β-葡萄糖苷酶的高产菌株发酵48-150小时，将发酵液连同菌丝一起取出，直接加入终浓度为0.1％-2％交联材料，和终浓度为0.1％-2％的交联剂中进行交联，交联时间为0.5-4小时，交联温度为4-20℃，或对发酵液连同菌丝进行浓缩后再交联；
所述的产β-葡萄糖苷酶的高产菌株为黑曲霉、米根霉、或宇佐美曲霉；
所述交联材料为壳聚糖或明胶；
所述交联剂为戊二醛、碳化二亚胺、三聚磷酸钠、或环氧化合物；
(2)将交联后的酶和菌丝液用海藻酸钠进行包埋，海藻酸钠浓度为1％-6％；
(3)将包埋好的混合液逐滴加入氯化钙溶液中进行固定，氯化钙浓度0.5％-8％，制备固定化酶小球；
(4)将制备的固定化酶小球置于室温在0.1％-1％的氯化钙溶液中进行硬化，硬化时间为1-3小时；
(5)过滤硬化好的固定化酶，置于4℃下保存备用；
(6)将固定化酶湿法装柱，再用去离子水配制0.1％-5％的栀子苷溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲液调节溶液pH为4.5，以每小时0.1-3个柱体积的流速将栀子苷溶液通过固定化酶柱床，酶解温度为50℃；
(7)将转化液用大孔吸附树脂吸附，经洗脱、浓缩、低温干燥得到粉末状京尼平，纯度可达95％左右，再经重结晶后京尼平纯度可达98％以上；
所述的百分比为重量百分比。
4.根据权利要求2所述的一种京尼平的制备方法，其特征在于采用分子量为6000至30000的中空纤维超滤器对发酵液连同菌丝进行浓缩，浓缩至原体积的六分之一至二分之一。
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