CN101396455B - 栀子苷元的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种将栀子苷制备成栀子苷元的方法，包括酶解、萃取、结晶等步骤，其优点是提供了更佳的栀子苷酶解条件，提高了栀子苷元的得率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用栀子苷制备栀子苷元的方法，属中药技术领域。
中药栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，含栀子苷(geniposide)、栀子苷酸(geniposidic acid)、羟异栀子苷(gardenoside)、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷(genipin-1-β-D-gentiobioside)等环烯醚萜苷类成分。以往研究认为中药栀子的保肝功效是栀子苷发挥作用的。但是随着研究深入，逐渐发现栀子苷在大鼠肝组织匀浆中不能代谢，栀子中的环烯醚萜苷类成分如果离开肠道菌群，其治疗作用将难以发挥，以及直接静脉给予栀子苷并不产生利胆作用。深入研究表明，栀子苷是在肠道细菌(真杆菌sp.A-44等)所含活性酶的作用下转化为栀子苷元，从而发挥出治疗效果。还有研究表明中药栀子的抗肝纤维化、抑制星状细胞活性的起效成分也是栀子苷元，而不是栀子苷。栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷有可能是在体内转化成栀子苷元而起效的。
栀子苷、栀子苷元、京尼平-1-β-D-龙胆双糖甙的结构式为：
但是栀子苷元的获得却是本行业人员感到困难的地方。由于栀子苷元性质活泼，本身容易和蛋白质(酶)发生聚合反应，采用常规的酶解提取方法来提取栀子苷元时(即条件是37℃、pH 5.0的环境中用葡萄糖苷酶反应2小时)，得率非常低，无法满足工业化生产的需求。因此，如果用栀子苷元直接作为药用活性成分进行保肝和抗肝纤维化的预防和治疗，必需首先发明一种高得率的栀子苷元制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用栀子苷制备高得率栀子苷元的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的用栀子苷制备栀子苷元的方法包括如下步骤：
(1)酶解：将栀子苷和β-葡萄糖苷酶，混合加入pH3.75-4.95醋酸缓冲溶液中，在37.5-55.0℃水浴中反应0.5-1.9小时；
(2)萃取：用无水乙醚萃取，合并乙醚提取液，加入无水硫酸钠，干燥30分钟，滤过，再用微孔滤膜精滤；
(3)结晶：低温减压回收溶剂，然后置于2-6℃的环境中，析晶，收集结晶，30-70℃干燥，得到酶解产物栀子苷元。
本发明的优选的技术方案包括如下步骤：
(1)酶解：将栀子苷和β-葡萄糖苷酶，混合加入pH3.80-4.80醋酸缓冲溶液中，在40-53℃水浴中反应0.8-1.8小时；
(2)萃取：用无水乙醚萃取3次，合并乙醚提取液，加入无水硫酸钠，干燥30分钟，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤；
(3)结晶：低温减压回收溶剂，然后置于3-4℃的环境中，析晶，收集结晶，40-50℃干燥，得到酶解产物栀子苷元。
进一步，本发明在步骤(1)的酶解步骤的最优选的条件为：
将栀子苷和β-葡萄糖苷酶，混合加入pH4.5醋酸缓冲溶液中，在50℃水浴中反应1.0小时。
本发明人经过严格的实验筛选，得到本发明上述优选和最优选技术方案的：
1.1温度对酶水解的影响
分别精密称取栀子苷0.5g，β-葡萄糖苷酶1g，于圆底烧瓶中，加入50ml pH值为4.50的缓冲溶液，分别于25℃；30℃；37℃；45℃；50℃；55℃；65℃的不同温度下，加热磁力搅拌2h，放冷后用无水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚层溶液，加入适量无水硫酸钠，减压回收乙醚，收集结晶。见表1。
表1反应温度对酶水解的影响
| 温度(℃) | 25℃ | 30℃ | 37℃ | 40℃ | 45℃ | 50℃ | 55℃ | 65℃ |
| 结晶质量(mg) | - | - | 46.8 | 105.8 | 119.2 | 126.4 | 96.1 | - |
*“-”表示没有结晶或者乳化严重，不能正常萃取
结果表明：适宜的酶解温度为40℃-55℃，其中50℃时酶解效果最好。
1.2反应时间对酶水解的影响
分别精密称取栀子苷0.5g，β-葡萄糖苷酶1g，于圆底烧瓶中，加入50ml pH值为4.50缓冲溶液，反应时间分别为1小时；2小时；2.5小时；3小时；4小时，加热磁力搅拌，反应温度为50℃，放冷后用无水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚层溶液，加入适量无水硫酸钠，减压回收乙醚，收集结晶。结果见表2。
表2反应时间对酶水解的影响
| 时间 | 0.5小时 | 1小时 | 1.5小时 | 2.0小时 | 2.5小时 |
| 结晶质量(mg) | 51.6 | 129.3 | 121.5 | 90.6 | 62.1 |
结果表明：适宜的酶解时间为0.8-1.8小时，其中酶解1小时效果最好。反应超过2小时，得率反而下降，这是由于栀子苷元在水溶液中不稳定，易与氨基结合所致。
1.3 pH值对酶水解的影响
分别精密称取栀子苷0.5g，β-葡萄糖苷酶1g，于圆底烧瓶中，加入50ml缓冲溶液，缓冲溶液的pH值分别为8.0；5.7；5.3；5.1；4.7；4.5；4.3；3.8的，加热磁力搅拌反应1小时，反应温度为50℃，，放冷后用无水乙醚萃取三次(50ml*3)，合并乙醚层溶液，加入适量无水硫酸钠，减压回收乙醚，收集结晶。结果见表3。
表3 pH值对酶水解的影响
| pH值 | 3.70 | 3.80 | 4.10 | 4.50 | 4.80 | 5.00 | 5.70 | 7.50 |
| 结晶质量(mg) | 108 | 112 | 113.4 | 125.1 | 112 | 100 | 85.2 | - |
*“-”表示没有结晶或者乳化严重，不能正常萃取
结果表明：适宜的酶解pH为3.80-4.80，其中pH4.50时酶解效果最好。
采用常规提取栀子苷元时，酶解条件为37℃、pH 5.0、反应2小时，由于温度低，反应时间长，栀子苷元性质活泼，与酶发生聚合反应。实验结果表明：栀子苷元提取率非常低，小于10％，通常只有6％-9％。
采用本发明的制备方法，克服了现有技术中栀子苷元得率不高的技术缺陷，在本发明提供的最佳工艺条件下，采用本发明方法使栀子苷元的得率较常规工艺条件提高了近3倍。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
称取500g栀子苷和500g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.50的醋酸缓冲溶液中，在50℃水浴中反应1小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于4℃的环境中，析晶，收集结晶，50℃干燥，称重，得栀子苷元125g，得率为25.0％。
注：栀子苷分子量388，栀子苷元分子量226，栀子苷完全转化为栀子苷元 的理论得率58.2％。
实施例2
称取500g栀子苷和200g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.50的醋酸缓冲溶液中，在40℃水浴中反应1.5小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于4℃的环境中，析晶，收集结晶，45℃干燥，称重，得栀子苷元106g，得率为21.2％。
实施例3
称取500g栀子苷和100g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.10的醋酸缓冲溶液中，在45℃水浴中反应1.5小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于2℃的环境中，析晶，收集结晶，30℃减压干燥，称重，得栀子苷元105g，得率为21.0％。
实施例4
称取500g栀子苷和80g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为3.75的醋酸缓冲溶液中，在55℃水浴中反应0.5小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于2℃的环境中，析晶，收集结晶，70℃干燥，称重，得栀子苷元108g，得率为21.6％。
实施例5
称取500g栀子苷和50g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.95的醋酸缓冲溶液中，在52℃水浴中反应1.9小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于6℃的环境中，析晶，收集结晶，30℃减压干燥，称重，得栀子苷元98g，得率为19.6％。
实施例6
称取500g栀子苷和300g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.50的醋酸缓冲溶液中，在37.5℃水浴中反应1.0小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于6℃的环境中，析晶，收集结晶，70℃干燥，称重，得栀子苷元112g，得率为22.4％。
实施例7
称取300g栀子苷和300g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.50的醋酸缓冲溶液中，在40℃水浴中反应1.5小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为30L、30L、30L)，合并乙醚提取液，加入0.6kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于3℃的环境中，析晶，收集结晶，40℃干燥，称重，得栀子苷元69g，得率为23.0％。
实施例8
称取500g栀子苷和150g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.51的醋酸缓冲溶液中，在45℃水浴中反应1.5小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于3℃的环境中，析晶，收集结晶，50℃干燥，称重，得栀子苷元105，得率为21.0％g。
实施例9
称取200g栀子苷和200g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.50的醋酸缓冲溶液中，在50℃水浴中反应1.0小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为20L、20L、20L)，合并乙醚提取液，加入0.2kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于4℃的环境中，析晶，收集结晶，40℃干燥，称重，得栀子苷元50g，得率为25.0％。
实施例10
称取500g栀子苷和350g的β-葡萄糖苷酶，混合加入50L、pH为4.51的醋酸缓冲溶液中，在53℃水浴中反应1.0小时，用无水乙醚萃取3次(用量分别为50L、50L、50L)，合并乙醚提取液，加入1kg无水硫酸钠，干燥30min，滤过，再用0.22μm微孔滤膜精滤。低温减压回收溶剂，然后置于4℃的环境中，析晶，收集结晶，50℃干燥，称重，得栀子苷元111g，得率为22.2％。
Claims (5)
1. 一种栀子苷元的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1)酶解：将栀子苷和β-葡萄糖苷酶混合加入pH3.75-4.95醋酸缓冲溶液中，在37.5-55.0℃水浴中反应0.5-1.9小时；
(2)萃取：用无水乙醚萃取，合并乙醚提取液，加入无水硫酸钠，干燥30分钟，滤过，再用微孔滤膜精滤；
(3)结晶：低温减压回收溶剂，然后置于2-6℃的环境中，析晶，收集结晶，30-70℃干燥，得到酶解产物栀子苷元。
2. 根据权利要求1所述的栀子苷元的制备方法，其特征是，步骤(1)中醋酸缓冲溶液的PH值为3.80-4.80，水浴温度为45-53℃，酶解时间为0.8-1.8小时；步骤(2)中萃取次数为3次，微孔滤膜的孔径为0.22μm；步骤(3)中析晶环境温度为4℃，干燥温度为40-50℃。
3. 根据权利要求1或2所述的栀子苷元的制备方法，其特征是，步骤(1)中水浴温度为50℃。
4. 根据权利要求1或2所述的栀子苷元的制备方法，其特征是，步骤(1)中醋酸缓冲溶液的pH值是4.5。
5. 根据权利要求1或2所述的栀子苷元的制备方法，其特征是，步骤(1)中酶解时间是1小时。
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