CN101899086A - 饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺缀合物，在饱和脂肪链酸中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它们的制备方法以及作为免疫抑制剂的应用。这些饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对脾淋巴细胞丝裂原增殖反应的抑制作用，以及对巨噬细胞吞噬活性的抑制作用的实验结果表明，本发明的化合物具有优秀的免疫抑制作用，临床上可作为免疫抑制剂应用。CH3(CH2)n-CO-Glu-Asp-Gly I
Description
技术领域
本发明涉及饱和脂肪链酸三肽酰胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺，还涉及这些饱和脂肪链酸三肽酰胺的制备方法以及它们作为免疫抑制剂的应用，属于生物医药领域。
背景技术
据统计，截至2002年底，全球共进行各种器官移植935792例次，其中肾移植585877例次、肝脏移植112153例次、心脏移植66559例次。此外，胰、肺、小肠等器官移植及心-肺、胰-肾、肝-肾、肝-肠等多脏器联合移植也都获得成功并应用于临床。目前，肾移植1年人/肾存活率达90％～95％，5年存活率超过70％。脏器移植要形成移植耐受，这就要求患者终身服用免疫抑制剂。器官移植的进展在很大程度上取决于免疫抑制剂的进展。近几十年，虽然新免疫抑制药物使得器官移植在临床取突飞猛进发展，但它们的毒副作用，例如肾毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必须面对的严重问题。
环孢菌素A是目前临床常用的免疫抑制剂。由于环孢菌素A的水溶性极差以及肾毒性很强，所以无论是剂型还是疗效都不尽人意。提高环孢菌素A制剂的水溶性，降低环孢菌素A的肾毒性，一直是环孢菌素A研究的热点。尿毒素肽具有免疫抑制活性。发明人认识到，把尿毒素肽与脂肪链酸缀合生成的酰胺具有自组装性能，因而可以用作具有免疫抑制活性的载药材料。例如可以用来包裹环孢菌素A，达到提高环孢菌素A的水溶性和降低环孢菌素A肾毒性的双重目的。
发明内容
本发明的目的之一是，将尿毒素三肽与脂肪链酸缀合，得到具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸三肽酰胺。
本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：
通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺
CH3(CH2)n-CO-Glu-Asp-Gly I
其中，通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
本发明的目的之二是，提供一种制备上述具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法。
本发明的目的之二是通过以下技术方案来实现的：
一种制备通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法，该方法包括：
(1)按照现有液相合成技术，通过逐步接肽合成的Glu-Asp-Gly的保护中间体；
(2)脱去Glu-Asp-Gly的保护中间体的N端保护基；
(3)将C端保护基保护的Glu-Asp-Gly中间体与饱和脂肪酸缩合，所述饱和脂肪酸为CH3(CH2)nCOOH，n＝6、8、10、12、14或16；
(4)脱去C端保护基得到目标化合物。
其中所述N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基(Boc)；所述C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是苄氧基(OBzl)；所述液相合成技术及所述保护、缩合、脱保护的过程是本领域的常规并公知的技术。
该制备方法可以用图1的路线概括，具体的，所述方法包括：
(1)在对甲苯磺酸和苄醇存在下将甘氨酸转化成甘氨酸苄酯；
(2)在DCC、HOBt、无水THF存在下甘氨酸苄酯和N-叔丁氧羰基-天冬氨酸-β-苄酯缩合，生成N-叔丁氧羰基-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯；
(3)在氯化氢-乙酸乙酯中将N-叔丁氧羰基-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯脱除叔丁氧羰保护基，生成β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯；
(4)在无水THF中，在DCC和HOBt存在下将β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯与N-叔丁氧羰基-γ-苄酯-谷氨酸缩合，生成N-叔丁氧羰基-γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯；
(5)在氯化氢-乙酸乙酯存在下将N-叔丁氧羰基-γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯脱除叔丁氧羰基，生成γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯；
(6)在无水THF中，在DCC和HOBt存在下将γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯与饱和脂肪酸缩合，生成饱和脂肪酸酰γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯；
(7)在无水乙醇中，在Pd/C存在下将饱和脂肪酸酰γ-苄酯-谷氨酰-β-苄酯-天冬氨酰甘氨酸苄酯氢解，生成饱和脂肪酸酰谷氨酰天冬氨酰甘氨酸。
实验结果表明本发明的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺具有优秀的免疫抑制作用，临床上可作为免疫抑制剂应用。并且本发明的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自组装成粒经稳定在117-1840nm的纳米球，可作为制备微乳或脂质体药物载体的制剂材料，另外可作为制备微乳、脂质体药物载体的靶向制剂材料。
附图说明
图1为通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺的合成路线。i)无水THF、DCC、HOBt和NMM；ii)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液；iii)无水乙醇、Pd/C和H2；6a n＝6，6b n＝8，6c n＝10，6d n＝12，6e n＝14，6f n＝16。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1Boc-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
将8.08g(25.00mmol)Boc-Asp(OBzl)溶于200ml无水THF，冰浴下向得到的溶液中加入3.38g(25.00mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使其完全溶解。10分钟后加入6.20g(30mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，得到反应液(I)，待用。冰浴下把8.43g(25.00mmol)TosH·Gly-OBzl悬浮于20ml无水THF中，然后加入1ml N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，冰浴条件下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Asp(OBzl)-OH消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压除去THF。残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。有机相用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到11.04g(94％)标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/z)：471[M+H]+。
实施例2HCl·Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
将11.04g(23.50mmol)Boc-Asp(OBzl)-Gly-OBzl溶解在250ml 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿∶甲醇，5∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成9.17g(96％)标题化合物，为无色固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：371[M+H]+。
实施例3Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由7.61g(22.56mmol)Boc-Glu(OBzl)和9.17g(22.56mmol)HCl·Asp(OBzl)-Gly-OBzl得米黄色油状物。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色油状物目标10.73g，纯化条件：氯仿∶甲醇＝100∶1，收率为69％。ESI-MS(m/z)：690[M+H]+，[α]20 D＝-24.4(c＝1.0，CH3OH)。
实施例4HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例2的方法由10.73g(15.57mmol)Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得9.06g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：590[M+H]+。
实施例5CH3(CH2)6CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.35g(2.41mmol)CH3(CH2)6CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.08g，纯化条件：氯仿洗脱，收率为61％。ESI-MS(m/z)：716[M+H]+，[α]20 D＝-32.5(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：54.2-56.1℃。
实施例6CH3(CH2)8CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.42g(2.41mmol)CH3(CH2)8CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.17g，纯化条件：氯仿洗脱，收率为64％。ESI-MS(m/z)：744[M+H]+，[α]20 D＝-32.9(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：73.2-74.8℃。
实施例7CH3(CH2)10CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.48g(2.41mmol)CH3(CH2)10CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为淡黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.27g，纯化条件：氯仿洗脱，收率为67％。ESI-MS(m/z)：772[M+H]+，[α]20 D＝--31.0(c＝1.0，DMF)，M.p.：60.1-61.5℃。
实施例8CH3(CH2)12CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.55g(2.41mmol)CH3(CH2)12CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.52g，纯化条件：氯仿∶甲醇＝50∶1，收率为77％。ESI-MS(m/z)：800[M+H]+，[α]20 D＝-34.5(c＝1.0，DMF)，M.p.：68.6-69.7℃。
实施例9CH3(CH2)14CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.62g(2.41mmol)CH3(CH2)14CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.16mg，纯化条件：氯仿洗脱，收率为57％。ESI-MS(m/z)：828[M+H]+，[α]20 D＝-30.8(c＝1.0，DMF)，M.p.：72.1-73.9℃。
实施例10CH3(CH2)16CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl的制备
按照实施例1的方法由0.68g(2.41mmol)CH3(CH2)16CO2H和1.51g(2.41mmol)HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl制得标题化合物，为黄色固体。所得化合物经硅胶柱层析纯化得无色固体粉末1.49g，纯化条件：氯仿洗脱，收率为71％。ESI-MS(m/z)：856[M+H]+，[α]20 D＝-27.9(c＝1.0，DMF)，M.p.：70.9-72.4℃。
实施例11CH3(CH2)6CO-Glu-Asp-Gly(6a)的制备
将900mg(1.26mmol)CH3(CH2)6CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加45mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得482mg(86％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：444[M-H]-，[α]20 D＝-28.3(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：134.0-135.0℃。
实施例12CH3(CH2)8CO-Glu-Asp-Gly(6b)的制备
将1.00g(1.35mmol)CH3(CH2)8CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加50mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得516mg(81％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：472[M-H]-，[α]20 D＝-10.9(c1，CH3OH)，M.p.：140.5-12.0℃。
实施例13CH3(CH2)10CO-Glu-Asp-Gly(6c)的制备
将1.10mg(1.43mmol)CH3(CH2)10CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加60mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得537mg(75％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：500[M-H]-，[α]20 D＝-22.1(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：108.5-110.2℃。
实施例14CH3(CH2)12CO-Glu-Asp-Gly(6d)的制备
将1.30g(1.63mmol)CH3(CH2)12CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加70mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得681mg(79％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：528[M-H]-，[α]20 D＝-16.2(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：124.8-126.1℃。
实施例15CH3(CH2)14CO-Glu-Asp-Gly(6e)的制备
将1.00mg(1.21mmol)CH3(CH2)14CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加50mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得539mg(80％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：556[M-H]-，[α]20 D＝-10.9(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：137.2-138.8℃。
实施例16CH3(CH2)16CO-Glu-Asp-Gly(6f)的制备
将1.20g(1.41mmol)CH3(CH2)16CO-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解，加65mgPd/C(约5％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，制得689mg(84％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：584[M-H]-，[α]20 D＝-9.4(c＝1.0，CH3OH)，M.p.：144.5-146.1℃。
试验例1饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑制作用
脱颈处死小鼠，无菌取脾，用200目钢网和注射器芯研磨，用HANK’S液洗两次，1500转/分条件下离心10分钟，计数后用完全RPMI-1640培养液配成5×106/ml个脾淋巴细胞，加100μl细胞悬液于96孔培养板中(每孔含5×106个细胞)。每孔加20μl ConA(ConA终浓度为5μg/ml)，该96孔培养板置于体积分数为0.05的CO2饱和湿度的培养箱内37℃培养4h。4h后分别加入不同浓度饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1×10-4M、8×10-5M、5×10-5M、3×10-5M、1×10-5M、8×10-6M、5×10-6M和1×10-6M)，每个浓度3个复孔。同时设不含化合物对照孔和只含同量培养液无ConA的细胞空白孔。各个孔均重复3次(n＝3)。培养48h后用MTT法检测化合物对脾淋巴细胞的抑制作用。
按照公式“抑制率＝(D对照-D含药)/D对照×100％”计算不同浓度饱和脂肪链酸酰Glu-Asp-Gly三肽对脾淋巴细胞增殖的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的浓度绘制细胞生长曲线，利用该生长曲线求得半数抑制率(DxIC50)。结果列入表1。结果表明本发明的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞增殖有明确的抑制作用。
表1饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑制作用
试验例2饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对巨噬细胞吞噬的抑制作用
将生长状态良好、处于对数生长期的Ana-1小鼠巨噬细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl，37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1×10-4M、8×10-5M、5×10-5M、3×10-5M、1×10-5M、8×10-6M、5×10-6M和1×10-6M)，每个浓度3个复孔，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养24小时后，吸弃上清液，每孔加入100μl0.1％的中性红溶液，置于37℃孵育30分钟。吸弃中性红溶液，并用PBS缓冲溶液洗涤2-3次(除去未被巨噬细胞吞噬的中性红)，加入细胞溶解液(乙醇∶乙酸＝1∶1)100μl，4℃过夜，酶标仪检测吸光度值，波长540nm。各个孔均重复3次(n＝3)。
按照公式“抑制率＝(D对照-D含药)/D对照×100％”计算不同浓度的化合物对巨噬细胞的吞噬能力的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的浓度绘制细胞生长曲线，利用该生长曲线求得半数抑制率(DxIC50)。结果列入表2。结果表明本发明的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对Ana-1小鼠巨噬细胞吞噬有明确的抑制作用。
表2饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺对Ana-1小鼠巨噬细胞吞噬的抑制作用
试验例3饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺在纳米水平的自组装
将饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺配置成1μmol/ml的水溶液，在激光纳米粒度仪上25℃测定粒径。连续测定8天，记录其粒径。结果列入表3。数据表明，本发明的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自组装成粒经稳定在117-1840nm的纳米球。
表3饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺在水中自组装的纳米球粒径
Claims (5)
1.通式I的6种具有免疫抑制活性的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺：
CH3(CH2)n-CO-Glu-Asp-Gly I
通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
2.一种制备权利要求1的饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法，包括：
(1)按照现有液相合成技术，通过逐步接肽合成的Glu-Asp-Gly的保护中间体；
(2)脱去Glu-Asp-Gly的保护中间体的N端保护基；
(3)将C端保护基保护的Glu-Asp-Gly中间体与饱和脂肪酸缩合，所述饱和脂肪酸为CH3(CH2)nCOOH，n＝6、8、10、12、14或16；
(4)脱去C端保护基得到目标化合物。
3.权利要求1的6种饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺在制备免疫抑制剂类药物中的应用。
4.权利要求1的6种饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺作为制备微乳或脂质体药物载体的制剂材料的用途。
5.权利要求1的6种饱和脂肪链酸Glu-Asp-Gly三肽酰胺作为制备微乳、脂质体药物载体的靶向制剂材料中的用途。
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