CN101893607A - 一用uflc测定夏天无总生物碱提取物含量的方法及建立其uflc指纹图谱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及夏天无总生物碱提取物中生物碱含量的测定。本发明的测定方法包括：(1)制备夏天无总生物碱提取物溶液；(2)制备标准品溶液；(3)分别吸取等量的提取物溶液和标准品溶液，进行UFLC测定，得到UFLC色谱图；(4)分析色谱图中原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素和巴马亭的色谱峰，并用外标法计算它们的含量。此外，本发明还提供了一种建立夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱的方法。本发明的测定方法可以快速准确地测定夏天无总生物碱提取物中6种主要生物碱的含量，本发明的夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱可以用于对夏天无总生物碱提取物中的物质群整体进行控制，从而在“宏观分析”的角度对提取物的质量进行控制。

Description

一用UFLC测定夏天无总生物碱提取物含量的方法及建立其UFLC指纹图谱的方法
技术领域
本发明涉及夏天无总生物碱提取物的质量控制方法，以及指纹图谱的建立方法。
背景技术
夏天无系罂粟科(Papaveraceae)紫堇属延胡索亚属的多年生草本植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.(C.amabilis Migo)的干燥块茎或全草，又名一粒金丹、野延胡、洞里神仙、伏地延胡索和落水珠。主产于江西，广泛分布于江苏、安徽、浙江、福建、台湾和湖南等省，是我国常用的中草药。夏天无具活血、通络、行气、止痛等功效。主治高血压、脑血管引起的中风偏瘫，并对风湿性关节炎、坐骨神经痛、小儿麻痹后遗症等具有较好的效果，其主要活性成分为生物碱类。已知的夏天无生物碱提取物中的生物碱主要有：原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素，巴马亭，上述6种生物碱都是夏天无生物碱提取物中的主要活性成分。为了全面准确地反应夏天无总生物碱提取物的质量，有必要对这6种生物碱的含量都进行测定。
UFLC(超快速液相色谱)可以快速准确地测定组分含量，但是其一般只能同时测定两种组分的含量。当UFLC同时测定多种组分含量的时候，由于各组分的色谱分离条件存在很大差异，要想确定一种能同时分离多种组分的色谱条件并非容易。所以，目前还没有将UFLC用于同时测定多个组分(尤其是5个以上的组分)含量的先例。当然，也没有将UFLC用于测定夏天无总生物碱提取物中6种主要生物碱含量的先例。
此外，夏天无生物碱提取物是一种植物提取物，其除了上述6种生物碱之外，还含有多种其它的生物碱。若想进一步准确控制夏天无生物碱提取物的质量，那么仅测定上述6种生物碱的含量还是不够的，而必需要对它的物质群整体予以控制。因此，有必要建立一种对夏天无总生物碱提取物的物质群体的整体予以控制的方法，从而更好的控制夏天无总生物碱提取物的质量。
本发明提到的夏天无总生物碱提取物可以是通过现有技术中的任何一种提取方法提取得到，例如水提醇沉、酸提碱沉、酸提-交换树脂及超临界CO2萃取，尤其是专利申请200610025704.X和200610025941.6中公开的提取方法。
发明内容
本发明的一个目的是，提供一种用UFLC测定夏天无总生物碱提取物中6种主要生物碱(原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素，巴马亭)含量的方法。本发明的另一个目的是，提供一种建立夏天无总生物碱提取物的UFLC标准指纹图谱的方法。
本发明的测定夏天无总生物碱提取物中生物碱含量的方法包含如下步骤：
(1)用流动相溶解夏天无总生物碱提取物，制备得到一定浓度的提取物溶液，所述流动相是体积比为2∶8～9∶1的A溶液和B溶液的混合溶液，A溶液是冰乙酸和三乙胺的水溶液，其pH值为2～5，B溶液是体积比为0.5∶9.5～9.5∶0.5的甲醇与乙腈的混合溶液；
(2)用与步骤(1)相同的流动相分别溶解原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素和盐酸巴马亭标准品，制备得到一定浓度的标准品溶液；
(3)吸取等量的提取物溶液和标准品溶液，分别进行UFLC测定，获得提取物溶液和标准品溶液的UFLC图谱，色谱条件：色谱柱为shim-packXR-ODS(75×3mm，2.2μm)，柱温为40℃，检测波长为282nm，固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为A和B的混合溶液，且A+B＝100％，进行梯度洗脱，
其中，所述梯度洗脱至少包含以下4个梯度：第1梯度：0～5.5min，70～90v％A；第2梯度：5.5～8min，70～90v％A；第3梯度：8～10min，30～80v％A；第4梯度10～13.5min，30～80v％A，流速均为1mL/min；
(4)分析提取物色谱图中原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素和巴马亭的色谱峰，并用外标法计算它们的含量。
优选地，第1梯度的A溶液含量为88v％，第2梯度的A溶液含量为88v％～82v％，第3梯度的A溶液含量为82v％～65v％，第4梯度的A溶液含量为65v％。进一步优选地，第2梯度的A溶液含量为82v％，第3梯度的A溶液含量为65v％。
优选地，所述梯度洗脱还包含第5梯度洗脱：13.5-13.51min，65v％～88v％A溶液，1mL/min，更优选65v％A溶液。
优选地，前述流动相是体积比为8∶2的A溶液和B溶液的混合溶液，A溶液是pH值为3的冰乙酸和三乙胺的水溶液，B溶液是体积比为2∶8的甲醇与乙腈的混合溶液。
优选地，前述步骤(1)所述的提取物是用超临界CO2萃取方法从夏天无药材粉末中提取得到，经过干燥后，用氯仿溶解，挥干氯仿，再用流动相溶解。进一步优选地，前述超临界CO2提取方法的萃取压力为35MPa，萃取温度为70℃；分离I釜压力为7.5MPa，温度为45℃；分离II釜压力为5MPa，温度为35℃。
优选地，前述步骤(2)所述的每个标准品配制成至少2种以上的浓度。进一步优选地，制备以下标准品溶液：夏无宁碱每mL含1400μg，700μg，350μg，175μg，87.5μg，43.75μg的溶液；原阿片碱每mL含852μg，426μg，213μg，106.5μg，53.3μg，26.6μg的溶液；延胡索乙素每mL含839μg，419.5μg，209.7μg，104.9μg，52.4μg，26.2μg的溶液；毕枯枯灵每mL含518μg，259μg，129.5μg，64.75μg，32.38μg，16.19μg的溶液；紫堇尔明每mL含104μg，52μg，26μg，13μg，6.5μg，3.25μg的溶液；盐酸巴马亭每mL含13.3μg，6.65μg，3.33μg，1.66μg，0.813μg，0.416μg的溶液，以上溶液用0.22μm水性微孔滤膜滤过。
优选地，前述步骤(4)的计算方法是标准曲线法。
本发明的建立夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱的方法包含如下步骤：
(1)按照与前述相同的方法测定至少二批以上的夏天无总生物碱提取物，得到相应的UFLC图谱；
(2)确定UFLC图谱中共有的特征峰，制定夏天无总生物碱提取物的UFLC标准指纹图谱。
优选地，至少测定10批以上的夏天无总生物碱提取物。
优选地，前述步骤(2)确定的共有特征峰共计16个，以14号峰延胡索乙素的色谱峰(S峰)的保留时间为1计，16个特征峰的相对保留时间RT和RSD％分别如表1所示。
优选地，以14号峰延胡索乙素的色谱峰(S峰)的峰面积为1计，16个特征峰的相对峰面积、RSD％以及相对于总峰面积的比例分别如表2所示。
一种夏天无总生物碱提取物的标准指纹图谱，其共有16个指纹峰，所述16个指纹峰的相对保留时间RT和RSD％分别如表1所示，相对峰面积、RSD％以及相对于总峰面积的比例分别如表2所示。
一种鉴定夏天无总生物碱提取物的方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品按照前述测定夏天无总生物碱提取物的UFLC方法进行测定，得到其UFLC图谱；
(2)将待测样品的UFLC图谱与前述得到的夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱进行比对，根据峰的相似度判断该待测样品是否为符合要求的夏天无总生物碱，若待测样品是符合要求的夏天无总生物碱提取物，则根据峰面积进一步判断其所含生物碱含量的高低以评价待测样品的质量。
用外标法测定，原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素，巴马亭的回收率为95％～105％，相对标准偏差小于3.2％，稳定性、重现性和精密度的相对标准偏差小于3％。因此，可以认为本发明的UFLC测定方法是符合方法学要求的。
与现有技术相比，本发明的UFLC测定方法具有简便快速、稳定、精密度高、重现性好的优点。此外，通过本发明的UFLC测定方法可以同时测定夏天无总生物碱提取物中6种主要生物碱的含量，从而对夏天无总生物碱提取物的质量进行更为全面准确地控制。
与现有技术相比，本发明的夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱可以对夏天无总生物碱提取物中的物质群整体予以控制，从而在“宏观分析”的角度对提取物的质量进行全面控制。
表1.16个特征峰的平均相对保留时间RT和RSD％
  峰号   平均相对保留时间RT   RSD％
  1   0.090   0.433
  2   0.127   0.340
  3   0.156   0.270
  4   0.168   0.281
  5   0.249   0.379
  6   0.291   0.368
  7   0.324   0.163
  8   0.365   0.164
  9   0.425   0.102
  10   0.496   0.140
  11   0.573   0.121
  12   0.791   0.119
  13   0.844   0.212
  14   1.000   0.000
  15   1.529   0.191
  16   1.648   0.304
表2.16个特征峰的平均相对峰面积、RSD％以及相对于总峰面积的比例
  峰号   平均相对峰面积   RSD％   百分比％
  1   0.009   28.389   0.055
  2   0.024   7.128   0.621
  3   0.005   25.181   0.131
  4   0.008   23.162   0.221
  5   0.016   15.901   0.500
  6   0.025   11.331   0.713
  7   0.121   2.399   3.131
  8   0.012   10.938   0.242
  9   1.346   4.524   35.121
  10   0.179   2.440   4.717
  11   1.073   5.623   26.171
  12   0.034   26.990   0.673
  13   0.015   10.979   0.396
  14   1.000   0.000   26.231
  15   0.014   36.159   0.234
  16   0.006   25.822   0.171
附图说明
图1：本发明实施例1的夏天无总生物碱提取物的UFLC图谱；
图2：本发明实施例2的夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱。
图注：图1中7号峰为毕枯枯灵，9号峰为夏无宁碱，10号峰为紫堇尔明，11号峰为原阿片碱，14号峰为延胡索乙素，15号峰为巴马亭；图2中的S1～S10分别代表第1批至第10批夏天无总生物碱的UFLC图谱，R代表夏天无总生物碱提取物的UFLC标准指纹图谱。
实施例1：UFLC测定夏天无总生物碱提取物中生物碱的含量
1仪器与试药
1.1仪器
Shimadzu Prominenece UFLC色谱仪(SPD-M20A PDA检测器，DGU-20A5在线自动脱气器，LC-20AD泵，SIL-20AC自动进样器，CBM-20A二极管阵列检测器，CTO-20AC柱温箱)。
1.2试药
原阿片碱，盐酸巴马亭和延胡索乙素标准品，购自中国药品生物制品检定所。毕枯枯灵，夏无宁碱和紫堇尔明标准品，自制，纯度大于97％。甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，蒸馏水，三乙胺为分析纯，夏天无药材购自江西余江县。
紫堇尔明的制备：取夏天无总生物碱提取物30g，用300-400目硅胶干法拌样，以300-400目硅胶为层析填料进行柱层析，柱子规格：6×38cm。先用4000mL体积比为8∶2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，再用8000mL体积比为7∶3的石油醚和乙酸乙酯混合溶液进行洗脱。以500mL为一份收集洗脱液，经HPLC检测后发现，第11和12瓶洗脱液中含有紫堇尔明与四氢巴马亭。将第11和12瓶的洗脱液浓缩至50ml，静置过夜，浓缩液中有大量晶体析出，经检测是紫堇尔明与四氢巴马的混晶。用大量热乙醇洗混晶，再过滤得到紫堇尔明不溶物。精密称重共115mg，用HPLC峰面积归一化法检测其纯度为97.2389％。
毕枯枯灵和夏无宁碱的制备：取30.52g夏天无总生物碱提取物，用2％盐酸溶解，过滤，取滤液加饱和NaOH水溶液，调pH＝10，过滤，用去离子水反复清洗沉淀至pH＝7，烘干，得样品13.826g。上52cm×4cm的硅胶柱，先用2000ml体积比为80∶20的石油醚和乙酸乙酯混合溶液冲柱，再用2000ml体积比为70∶30的石油醚和乙酸乙酯混合物溶液冲柱，然后再用5000ml体积比为60∶40的石油醚和乙酸乙酯混合溶液冲柱。以500mL为一份，收集洗脱液，经过HPLC检测后发现，第11-13瓶洗脱液含有夏无宁和毕枯枯灵。将第11-13瓶洗脱液浓缩至50ml，静置过夜，有大量晶体析出。用大量热乙醇洗晶体，在氯仿-乙醇溶液中重结晶不溶物，即得321mg毕枯枯灵(纯度97％以上)，冷却热乙醇溶液即得1.32g夏无宁碱结晶(纯度97％)。
2.色谱条件
色谱柱为shim-pack XR-ODS(75×3mm，2.2μm)，柱温为40℃，检测波长为282nm，固定相为十八烷基键合硅胶。流动相由体积比为8∶2的A溶液和B溶液混合所得，A溶液：77ml冰乙酸和8ml三乙胺加水稀释至1000ml，pH＝3；B溶液：由体积比为2∶8的甲醇与乙腈混合所得。
3.标准品溶液的制备
取标准品适量，精密称定，加流动相制成：夏无宁碱每mL含1400μg，700μg，350μg，175μg，87.5μg，43.75μg的溶液；原阿片碱碱每mL含852μg，426μg，213μg，106.5μg，53.3μg，26.6μg的溶液；延胡索乙素每mL含839μg，419.5μg，209.7μg，104.9μg，52.4μg，26.2μg的溶液；毕枯枯灵每mL含518μg，259μg，129.5μg，64.75μg，32.38μg，16.19μg的溶液；紫堇尔明每mL含104μg，52μg，26μg，13μg，6.5μg，3.25μg的溶液；盐酸巴马亭每mL含13.3μg，6.65μg，3.33μg，1.66μg，0.813μg，0.416μg的溶液。以上溶液用水性微孔滤膜0.22μm滤过。
4.夏天无总生物碱提取物的制备
取夏天无的干燥块茎，打粉，得到粒度为10目～60目的药材粉末；取药材粉末200g，加入120ml 10％的氨水作为碱化剂，拌至弱碱性；将药材投入萃取釜中，对储罐分别进行加热；当萃取温度达到70℃，解析釜I温度达到45℃、解析釜II温度达到35℃时，开启CO2瓶，通过高压泵对系统进行加压；当萃取釜压力达到35Mpa、解析釜I压力达到7.5Mpa、解析釜II压力达到5Mpa时，保持恒温恒压，保持恒定CO2流量为45L/h；萃取过程中连续加入无水乙醇作为夹带剂，流速为260ml/h；当萃取35分钟后，停止萃取，从解析釜I得到总生物碱提取物，干燥，即得夏天无总生物碱提取物。
5.提取物溶液的制备
取夏天无总碱提取物约10mg，用10mL流动相溶解。
6.UFLC测定
分别精密吸取标准品溶液和提取物溶液各10μl注入UFLC色谱仪，按照UFLC测定方法进行测定，记录14分钟的色谱图，梯度洗脱条件如下：
Figure B200910051819XD0000081
7.结果计算
根据外标法计算夏天无总生物碱提取物中6种主要生物碱的含量，分别为：毕枯枯灵8.41wt％，夏无宁碱24.26wt％％，紫堇尔明2.67wt％％，原阿片碱21.34wt％％，延胡索乙素17.75wt％％，巴马亭0.99wt％％。
实施例2：建立夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱
取10批夏天无总生物碱提取物，按照与实施例1相同的测定方法，对10批提取物进行UFLC测定，获得10张UFLC色图谱；比较10张UFLC色谱图，确定UFLC图谱中共有的特征峰，共计16个，以延胡索乙素的色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积，即得夏天无总生物碱提取物的UFLC标准指纹图谱。共有峰的相对保留时间及相对峰面积统计结果分别见表3和表4。
表3.相对保留时间统计(保留时间的单位为min)
  峰号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   平均   RSD％
  1   0.090   0.090   0.090   0.091   0.090   0.090   0.089   0.090   0.091   0.090   0.090   0.433
  2   0.127   0.127   0.128   0.128   0.128   0.127   0.127   0.127   0.128   0.127   0.127   0.340
  3   0.156   0.155   0.156   0.157   0.156   0.156   0.156   0.156   0.157   0.156   0.156   0.270
  4   0.168   0.167   0.169   0.169   0.168   0.168   0.168   0.168   0.169   0.168   0.168   0.281
  5   0.249   0.247   0.249   0.251   0.247   0.248   0.249   0.249   0.248   0.248   0.249   0.379
  6   0.290   0.288   0.291   0.292   0.291   0.290   0.290   0.291   0.291   0.291   0.291   0.368
  7   0.323   0.323   0.324   0.325   0.324   0.323   0.323   0.324   0.324   0.323   0.324   0.163
  8   0.365   0.364   0.365   0.365   0.365   0.364   0.364   0.364   0.365   0.365   0.365   0.164
  9   0.425   0.425   0.425   0.426   0.425   0.424   0.425   0.424   0.426   0.425   0.425   0.102
  10   0.498   0.495   0.496   0.497   0.497   0.496   0.496   0.495   0.497   0.496   0.496   0.140
  11   0.575   0.574   0.573   0.574   0.573   0.573   0.573   0.573   0.574   0.573   0.573   0.121
  12   0.792   0.792   0.792   0.792   0.792   0.791   0.791   0.790   0.791   0.790   0.791   0.119
  13   0.847   0.842   0.847   0.844   0.845   0.844   0.845   0.844   0.843   0.841   0.844   0.212
  14(S峰)   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   1.000   0.000
  15   1.531   1.522   1.528   1.533   1.532   1.529   1.526   1.531   1.529   1.529   1.529   0.191
  16   1.651   1.634   1.648   1.653   1.652   1.649   1.646   1.651   1.648   1.649   1.648   0.304
表4.相对峰面积统计
Figure B200910051819XD0000091
实施例3：方法学考察
1.标准品溶液标准曲线的线性分析
绘制实施例1中的6个生物碱标准品溶液的标准曲线，结果如下表5所示：
  标准品   标准曲线   R2
  夏无宁碱   y＝5.077133e-4X+3.634177   1.0
  延胡索乙素   y＝4.123552e-4X+0.460858   0.9999
  原阿片碱   y＝3.913227e-4X+2.171534   0.9999
  紫堇尔明   y＝3.535232e-4X-0.1505344   1.0
  盐酸巴马亭   y＝2.629337e-4X   0.9999
  毕枯枯灵   y＝1.919997e-3X-0.7133639   1.0
其中，e-4和e-3分别代表“×10-4”和“×10-3，R代表线性，R2越接近1，说明标准曲线的线性越好。从上表可以看出，6个生物碱标准品溶液标准曲线的R2或者是1或者是无限接近1，说明它们的线性关系都非常良好。因此，本发明所用的含量测定方法是符合方法学要求的。
2.重现性实验
取夏天无总生物碱提取物样品，然后根据2005年版《中华人民共和国药典》的中药质量标准分析方法验证指导原则中有关质量标准重现性的规定进行重现性实验，以峰面积进行统计，RSD不超过3％，具体结果请参见表6。
表6.重现性实验结果(示峰面积)
  峰号   样品1   样品2   样品3   样品4   样品5   样品6   平均   RSD％   百分比
  7   2.696   23142   22141   22123   21872   21745   22204.6±492.19   2.217   2.871
  9   3.55   282149   276828   277252   278212   261624   276842.8±7396.16   2.672   35.797
  10   4.17   36595   35166   33974   35980   35602   35463.4±880.15   2.482   4.586
  11   4.797   223692   211807   208465   217311   215600   215370±4716.12   2.190   27.848
  14   8.453   201476   192367   190575   198226   188120   194152.8±4951.86   2.550   25.105
  15   12.386   1059   1056   1037   1097   1074   1064.6±20.02   1.881   0.138
3.稳定性与精密度实验
取夏天无总生物碱提取物的样品，然后根据2005年版《中华人民共和国药典》的中药质量标准分析方法验证指导原则中有关质量标准稳定性与精密度的规定进行稳定性和精密度试验，其峰面积的RSD％不超过2.6％，且24小时稳定，具体结果请参见下表7。
表7.稳定性实验结果(示峰面积)
4.加样回收率
取夏天无总生物碱提取物样品，然后根据2005年版中华人民共和国药典里的中药质量标准分析方法验证指导原则中有关加样回收率的规定进行测定，计算回收率，RSD不超过3.2％，具体结果请参见下表8。
以上实验显示，本发明的UFLC测定方法稳定可靠，进而也可以说明本发明的建立夏天无总生物碱提取物UFLC标准指纹图谱的方法也是稳定可靠的。
Figure B200910051819XD0000121

Claims (12)

1.一种测定夏天无总生物碱提取物中生物碱含量的方法，其包含如下步骤：
(1)用流动相溶解夏天无总生物碱提取物，制备得到一定浓度的提取物溶液，所述流动相是体积比为2∶8～9∶1的A溶液和B溶液的混合溶液，A溶液是冰乙酸和三乙胺的水溶液，其pH值为2～5，B溶液是体积比为0.5∶9.5～9.5∶0.5的甲醇与乙腈的混合溶液；
(2)用与步骤(1)相同的流动相分别溶解原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素和盐酸巴马亭标准品，制备得到一定浓度的标准品溶液；
(3)吸取等量的提取物溶液和标准品溶液，分别进行UFLC测定，获得提取物溶液和标准品溶液的UFLC图谱，色谱条件：色谱柱为shim-packXR-ODS(75×3mm，2.2μm)，柱温为40℃，检测波长为282nm，固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为A和B的混合溶液，且A+B＝100％，进行梯度洗脱，
其中，所述的梯度洗脱至少包含以下4个梯度：第1梯度：0～5.5min，70～90v％A；第2梯度：5.5～8min，70～90v％A；第3梯度：8～10min，30～80v％A；第4梯度10～13.5min，30～80v％A，流速均为1mL/min；
(4)分析提取物色谱图中原阿片碱，毕枯枯灵，夏无宁碱，紫堇尔明，延胡索乙素和巴马亭的色谱峰，并用外标法计算它们的含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，第1梯度的A溶液含量为88v％，第2梯度的A溶液含量为88v％～82v％，第3梯度的A溶液含量为82v％～65v％，第4梯度的A溶液含量为65v％。
3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，第2梯度的A溶液含量为82v％，第3梯度的A溶液含量为65v％。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相是体积比为8∶2的A溶液和B溶液的混合溶液，A溶液是pH值为3的冰乙酸和三乙胺的水溶液，B溶液是体积比为2∶8的甲醇与乙腈的混合溶液。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取物是用超临界CO2萃取方法从夏天无药材粉末中提取得到，经过干燥后，用氯仿溶解，挥干氯仿，再用流动相溶解；步骤(2)所述的每个标准品配制成至少2种以上的浓度；步骤(4)所述的计算方法是标准曲线法。
6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，标准品溶液的浓度如下：夏无宁碱每mL含1400μg，700μg，350μg，175μg，87.5μg，43.75μg的溶液；原阿片碱每mL含852μg，426μg，213μg，106.5μg，53.3μg，26.6μg的溶液；延胡索乙素每mL含839μg，419.5μg，209.7μg，104.9μg，52.4μg，26.2μg的溶液；毕枯枯灵每mL含518μg，259μg，129.5μg，64.75μg，32.38μg，16.19μg的溶液；紫堇尔明每mL含104μg，52μg，26μg，13μg，6.5μg，3.25μg的溶液；盐酸巴马亭每mL含13.3μg，6.65μg，3.33μg，1.66μg，0.813μg，0.416μg的溶液，以上溶液用0.22μm水性微孔滤膜滤过。
7.一种建立夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱的方法，其包括如下步骤：
(1)按照与权利要求1-6中任一项相同的方法测定至少二批以上的夏天无总生物碱提取物，得到相应的UFLC图谱；
(2)确定UFLC图谱中共有的特征峰，制定夏天无总生物碱提取物的UFLC标准指纹图谱。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测定至少10批以上的夏天无总生物碱提取物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，确定的共有特征峰共计16个，以14号峰延胡索乙素的色谱峰(S峰)的保留时间为1计，16个特征峰的相对保留时间RT和RSD％分别如下：
  峰号   RT   RSD％   1号峰   0.090   0.433   2号峰   0.127   0.340   3号峰   0.156   0.270   4号峰   0.168   0.281   5号峰   0.249   0.379   6号峰   0.291   0.368   7号峰   0.324   0.163   8号峰   0.365   0.164   9号峰   0.425   0.102   10号峰   0.496   0.140   11号峰   0.573   0.121   12号峰   0.791   0.119   13号峰   0.844   0.212   14号峰   1.000   0.000   15号峰   1.529   0.191   16号峰   1.648   0.304
10.如权利要求9所述的方法，以14号峰延胡索乙素的色谱峰(S峰)的峰面积为1计，16个特征峰的相对峰面积、RSD％以及相对于总峰面积的比例分别如下：
  峰号   相对峰面积   RSD％   峰面积百分比％
  1   0.009   28.389   0.055   2   0.024   7.128   0.621   3   0.005   25.181   0.131   4   0.008   23.162   0.221   5   0.016   15.901   0.500   6   0.025   11.331   0.713   7   0.121   2.399   3.131   8   0.012   10.938   0.242   9   1.346   4.524   35.121   10   0.179   2.440   4.717   11   1.073   5.623   26.171   12   0.034   26.990   0.673   13   0.015   10.979   0.396   14   1.000   0.000   26.231   15   0.014   36.159   0.234   16   0.006   25.822   0.171
11.一种夏天无总生物碱提取物的标准指纹图谱，其有16个特征峰，所述特征峰的相对保留时间RT和RSD％如权利要求7所述，所述特征峰相对峰面积、RSD％以及相对于总峰面积的比例如权利要求8所述。
12.一种鉴定夏天无总生物碱提取物的方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品按照权利要求1～6中任一项所述的方法进行测定，得到其UFLC图谱；
(2)将待测样品的UFLC图谱与权利要求7或8或9或10或11中建立的夏天无总生物碱提取物的UFLC指纹图谱进行比对，根据峰的相似度判断该待测样品是否为符合要求的夏天无总生物碱，若待测样品是符合要求的夏天无总生物碱提取物，则根据峰面积进一步判断其所含生物碱含量的高低以评价待测样品的质量。
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