CN101892270A - 木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中的应用 - Google Patents

木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中的应用 Download PDF

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何延红
官智
胡文
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Abstract

本发明公开了木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，具有通用性好、催化效率高、反应条件温和、生产成本低、使用安全、对环境友好等优点，且在羰基化合物与1，3-二羰基化合物的Knoevenagel反应中可以获得较好的产率，具有较好的应用前景。

Description

木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中的应用
技术领域
本发明涉及木瓜蛋白酶，尤其涉及木瓜蛋白酶作为Knoevenagel(克脑文盖尔)反应催化剂的应用。
背景技术
木瓜蛋白酶(Papain)广泛存在于番木瓜茎叶和果实中，以未成熟果实乳汁的含量为最高，可以通过化学方法(沉淀法)和生物技术方法制备而得。木瓜蛋白酶属植物蛋白酶，简称木瓜酶，因其含量高、稳定性好，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的酶解能力，已被广泛应用于食品、医药、化妆品、鞣革领域。
近年来，虽然有关木瓜蛋白酶的研究工作已有很多报道，但将其应用于有机化学中的经典反应——Knoevenagel反应还从未涉及。Knoevenagel反应是羰基化合物与活泼亚甲基化合物之间的缩合反应，是有机合成中形成碳碳双键的重要反应，长期以来受到人们的高度重视并在工业上已经得到了广泛的运用。
Knoevenagel反应通常采用的催化剂有碱、Lewis酸、沸石和非均相催化剂等，但这些催化剂缺乏通用性，当羰基化合物为芳香醛时可以取得较好的催化效果，当羰基化合物为杂环芳香醛、脂肪醛或α，β-不饱和醛时催化效果则较差；而且，当涉及到反应活性较低的活泼亚甲基化合物的Knoevenagel反应时，通常只能得到很低的产率。
发明内容
本发明的目的在于提供木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中的新应用。
实际上，本发明涉及木瓜蛋白酶作为催化剂在Knoevenagel反应中的应用。
本发明具体是这样实现的：向含有羰基化合物与活泼亚甲基化合物的反应体系中加入木瓜蛋白酶作为催化剂，反应介质为二甲亚砜(DMSO)和去离子水(反应介质中去离子水的体积百分比为20～32％)，在50～61℃下搅拌反应80～120h，过滤除去木瓜蛋白酶，稀释反应液，用水洗涤反应液2次，萃取水洗液2次，合并有机层，用水洗涤，减压蒸馏除去溶剂，得产物粗品，通过硅胶柱层析分离纯化(固定相为200～300目硅胶流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，即得最终产物。
上述羰基化合物为芳香醛、杂环芳香醛、脂肪醛或α，β-不饱和醛；上述活泼亚甲基化合物为1，3-二羰基化合物；
上述反应中，羰基化合物与活泼亚甲基化合物摩尔用量比为：1∶1～1∶1.2，优选1∶1.2；羰基化合物与木瓜蛋白酶的用量比为：lmmol∶50mg～lmmol∶150mg，优选lmmol∶75mg；羰基化合物与反应介质的用量比为：lmmol∶3ml～lmmol∶2ml，优选2mmol∶5ml；反应介质中去离子水的体积百分比优选25％；反应温度(即在反应中使用木瓜蛋白酶的温度)优选60℃；反应时间优选120h。
上述芳香醛优选芳香环上含吸电子取代基的芳香醛，上述杂环芳香醛优选亲电性好的杂环芳香醛，上述α，β-不饱和醛优选含有给电子取代基的α，β-不饱和醛。
上述1，3-二羰基化合物为乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯。
本发明的有益效果在于：
本发明对已知物质木瓜蛋白酶发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域；
本发明采用的催化剂木瓜蛋白酶，其资源丰富、价格经济、使用安全、对环境友好；
本发明采用的催化剂木瓜蛋白酶对反应物的通用性好，当羰基化合物是芳香醛、杂环芳香醛、脂肪醛或α，β-不饱和醛时，均可以取得良好的催化效果；
本发明采用木瓜蛋白酶作为Knoevenagel反应的催化剂，反应条件温和，对此反应的催化具有专一性，副反应少，从而较好地催化了反应活性较低的活泼亚甲基化合物的Knoevenagel反应，克服了目前涉及到反应活性较低的活泼亚甲基化合物的Knoevenagel反应通常只能得到很低产率的困难。
总之，木瓜蛋白酶作为Knoevenagel反应催化剂的应用具有较好的应用前景。
为了进一步证明木瓜蛋白酶的催化效应。发明人进行了控制实验。具体采用的催化剂、反应条件和产物收率详见表1。
编号1～6的Knoevenagel反应：
Figure BSA00000157204600021
表1控制实验a
Figure BSA00000157204600022
a所有反应在60℃下进行，苯甲醛(2mmol)，乙酰丙酮(2.4mmol)，催化剂(150mg)，去离子水(1.25ml)，DMSO(3.75ml)。
b最终产物通过硅胶柱层析分离。
通过对实验结果的分析发现，在100℃失活的木瓜蛋白酶催化苯甲醛与乙酰丙酮的Knoevenagel反应，最终只得到了5％的产率。用尿素或者EDTA失活了的木瓜蛋白酶做催化剂的时候，通过薄层色谱分析发现，只有痕量的产物。然后，发明人用PMSF对木瓜蛋白酶失活，再让其催化Knoevenagel反应，最终只得到了8％的产率。为了排除蛋白质催化的可能性，反应用牛血清蛋白代替木瓜蛋白酶后只得到了10％的产率。上述结果表明，该反应发生在木瓜蛋白酶的活性位点上，说明木瓜蛋白酶对Knoevenagel反应的催化效应是利用了其酶的活性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将描述本发明的优选实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
在实施例中，原料和试剂均为市售品且未经进一步纯化，其中木瓜蛋白酶是从广西南宁庞博生物工程有限公司购得；核磁共振氢谱(1HNMR)用Bruker AV-300核磁共振波谱仪进行测定，频率为300MHz，溶剂为氘代氯仿，内标为四甲基硅(TMS)。
所有实施例中，木瓜蛋白酶催化的Knoevenagel反应：
Figure BSA00000157204600031
EWG1和EWG2为吸电子官能团
实施例1～14：向含有羰基化合物(2mmol)、活泼亚甲基化合物(2.4mmol)、DMSO(3.75ml)与去离子水(1.25ml)的反应体系中加入木瓜蛋白酶(150mg)，在60℃下搅拌反应120h，过滤除去木瓜蛋白酶，加入乙酸乙酯(10ml)稀释反应液，用水洗涤2次(每次5ml)，水洗液用乙酸乙酯萃取2次(每次10ml)，合并有机层，用水(30ml)洗涤，减压蒸馏除去溶剂，得缩合产物粗品，通过硅胶柱层析分离纯化(固定相为200～300目硅胶流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液)，即得缩合的最终产物。具体原料、反应条件和产物收率详见表2。
表2木瓜蛋白酶催化的Knoevenagel反应
注：a为通过硅胶柱层析分离后的最终产物；b为产物中Z/E-异构体的摩尔比，Z/E-异构体的结构用1HNMR表征。
由表2可知：
(1)活泼亚甲基化合物用乙酰丙酮比乙酰乙酸乙酯产率要高一些，是因为在采用优选实验条件之下，乙酰丙酮比乙酰乙酸乙酯反应活性更强。这与已经报道过的用氨基酸催化的结果相反，这说明了酶特殊的催化效应。
(2)在芳香环上取代基的电子效应对整个反应有明显的影响。含有吸电子取代基的芳香醛，反应产率较高；含有给电子取代基的芳香醛，反应产率较低。这是因为，吸电子基团活化了醛上的羰基，更有利于这个反应。
但对于α，β-不饱和醛却得到了完全相反的结果。含有给电子取代基的α，β-不饱和醛比含有吸电子取代基的α，β-不饱和醛产率更高。比如：4-甲氧基肉桂醛与乙酰丙酮反应产率为81％，然而4-氟肉桂醛与乙酰丙酮反应的产率为66％。
此外，2-呋喃甲醛与乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯反应分别得到了77％和70％的产率。相比之下，2-噻吩甲醛与乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯却分别得到了51％和43％的产率。这源于2-呋喃甲醛比2-噻吩甲醛更高的亲电性。
(3)在木瓜蛋白酶催化下，芳香醛(实施例1～4、14)、杂环芳香醛(实施例10～13)或α，β-不饱和醛(实施例5～9)与反应活性较低的活泼亚甲基化合物1，3-二羰基化合物(乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯)的反应都取得了较好的结果，当然，当使用反应活性较高的活泼亚甲基化合物时可以取得更好的结果。

Claims (10)

1.木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用。
2.如权利要求1所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：使用木瓜蛋白酶时的温度为50～61℃。
3.如权利要求2所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：使用木瓜蛋白酶时以二甲亚砜和去离子水为反应介质。
4.如权利要求3所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述反应介质中去离子水的体积百分比为20～32％。
5.如权利要求4所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述应用是向羰基化合物与活泼亚甲基化合物的反应体系中加入木瓜蛋白酶作为催化剂，反应时间80～120h。
6.如权利要求5所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述羰基化合物为芳香醛、杂环芳香醛、脂肪醛或α，β-不饱和醛；所述活泼亚甲基化合物为1，3-二羰基化合物。
7.如权利要求6所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述反应中，羰基化合物与活泼亚甲基化合物摩尔用量比为：1∶1～1∶1.2，羰基化合物与木瓜蛋白酶的用量比为：1mmol∶50mg～1mmol∶150mg，羰基化合物与反应介质的用量比为：1mmol∶3ml～1mmol∶2ml。
8.如权利要求7所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述芳香醛为芳香环上含吸电子取代基的芳香醛，所述杂环芳香醛为亲电性好的杂环芳香醛，所述α，β-不饱和醛为含有给电子取代基的α，β-不饱和醛。
9.如权利要求8所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述1，3-二羰基化合物为乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯。
10.如权利要求2-9任一所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反应中作为催化剂的应用，其特征在于：所述木瓜蛋白酶的使用温度为60℃，所述反应介质中去离子水的体积百分比为25％，所述反应时间为120h，所述羰基化合物与活泼亚甲基化合物摩尔用量比为1∶1.2，所述羰基化合物与木瓜蛋白酶的用量比为1mmol∶75mg，所述羰基化合物与反应介质的用量比为：2mmol∶5ml。
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