CN101890155A

CN101890155A - 一种药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN101890155A
Application number: CN 201010182183
Authority: CN
Inventors: 甄永苏; 李兴起; 尚伯扬; 王冬春; 张胜华; 吴淑英
Original assignee: Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd
Current assignee: Shandong Simcere Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2030-05-25
Also published as: CN101890155B

Abstract

本发明属于生物制品技术领域，公开了一种药物组合物及其应用。该组合物以重组人血管内皮抑制素和地塞米松为有效成分，其中重组人血管内皮抑制素和地塞米松的摩尔比为10～100∶1。该组合物中的重组人血管内皮抑制素可与地塞米松协同抑制内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成。体内试验结果也表明，重组人血管内皮抑制素联合地塞米松对小鼠H22肝癌移植瘤和人Bel7402肝癌移植瘤生长具有协同抑制作用，故本发明组合物可在制备治疗肝癌的药物中广泛应用。

Description

一种药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，涉及一种药物组合物及其应用。

背景技术

人血管内皮抑制素(endostatin)是胶原x VlII羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物，具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移，和抑制体内血管生成的活性，是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子。

重组人血管内皮抑制素是利用DNA重组工程技术，以原核或真核表达栽体，将人血管内皮抑制素基因经克隆、表达和纯化得到的有血管生成抑制活性形式的蛋白质。

中国发明专利“生产内皮抑制素的方法”(专利公开号为CN132481 8A，公开日为2001年12月5日)提供了一种改良的，以更高的产率和更简单的纯化工艺生产重组人血管内皮抑制素的方法。该发明利用DNA重组工程技术，以大肠杆菌表达系统，以简单的方法和较低的成本大批量生产H末端带有(Met)GlyGlyxaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人血管内皮抑制素(其中xaa代表中性氨基酸或不存在)，不仅保留了人血管内皮抑制素的完全的生物学活性，而且没有产生因加入附加N端序列所致的体内免疫性。上述附加氨基酸序列不仅提高了内皮抑制素结构基因的转录和翻译起始效率，有利于重组蛋白的纯化，而且附加氨基酸序列的结构也增加了重组蛋白的稳定性。

有文献报道，人血管内皮抑制素能有效抑制裸鼠人肝癌细胞种植瘤生长，且靶向明确，对正常细胞无损害，有较好的安全性，和一定的有效性，参见吕小平等，内皮抑制素对小鼠肝癌细胞种植瘤的抑制作用，广西医学，2008年6月第30卷第6期。

炎症反应或肿瘤引起的炎症反应是肿瘤发生过程中的一个明显现象，科研人员认为抗炎处理能够预防肿瘤进展过程，因此炎症反应已经成为肿瘤治疗中一个潜在的靶点。动物模型与人体实验研究证明阿斯匹林及非甾体类抗炎药物能够通过抑制血管生成抑制肿瘤生长，进而减少直结肠癌及其他胃肠道癌的风险。地塞米松是常用的甾体类抗炎药物，在肿瘤治疗中被用来预防放化疗副反应，并且已经证明地塞米松能够通过抑制血管生成从而发挥抗肿瘤作用，同时地塞米松与顺铂、卡铂、吉西他滨、阿霉素和多西他赛联合能够协同抑制多种肿瘤的生长。

目前，尚没有文献公开过人血管内皮抑制素与地塞米松联合使用对肝癌有作用，也没有文献给予这样联合使用的技术启示，更没有文献报道过人血管内皮抑制素与地塞米松联合使用具有协同作用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种药物组合物。

本发明的另一目的是提供该药物组合物的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的重组人血管内皮抑制素和地塞米松。

所述的重组人血管内皮抑制素保留了人血管内皮抑制素的完全的生物活性，可运用基因工程手段获得，通过将人的内皮抑制素基因或将改构的人血管内皮抑制素基因构建到大肠杆菌或毕赤酵母表达体系中，经过发酵、分离、纯化等手段得到。

本发明中优选的重组人血管内皮抑制素是在人血管内皮抑制素编码氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0～4个任意氨基酸和2～8个组氨酸序列，其制备方法同中国发明专利“生产内皮抑制素的方法”(专利号为ZL00107569.1)。

所述的重组人血管内皮抑制素的起始氨基酸Met可以被切除，原因是在表达宿主中蛋白翻译后加工过程中可能被删除。

本发明进一步优选的重组人血管内皮抑制素的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，该序列和中国发明专利“生产内皮抑制素的方法”(专利号为ZL00107569.1)公开的SEQ ID NO.2相同，该序列构成的蛋白质的制备方法和上述公开专利的制备实施例相同。

本发明组合物中所述的重组人血管内皮抑制素还可为PEG修饰的重组人血管内皮抑制素。

所述的PEG的分子量是5000～30000，PEG通过共价键与重组人血管内皮抑素相连。

本发明组合物中所述的地塞米松为地塞米松磷酸钠或地塞米松的其他药用盐类。

本发明组合物中所述的重组人血管内皮抑制素和地塞米松的质量比为10～100∶1，优选20～70∶1 。

本发明所述的组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述药物的剂型是注射剂或冻干制剂。

所述的抗肝癌药物以重组人血管内皮抑制素和地塞米松药用盐为有效成分，与溶剂(如注射用水)、保护剂(如多元醇、糖类、氨基酸、表面活性剂、人血白蛋白、EDTA、NaCl)、pH调节剂如(如醋酸-醋酸钠缓冲体系、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲体系)、等渗调节剂(如葡萄糖、NaCl)、赋形剂(如甘露醇)等药学上允许的辅料配制成注射剂或冻干制剂。

本发明未尽事宜，均为本领域内的常规技术。

本发明的有益效果：

本发明组合物中的重组人血管内皮抑制素可与地塞米松协同抑制内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成。体内试验结果表明，重组人血管内皮抑制素联合地塞米松对小鼠H22肝癌移植瘤和人Bel7402肝癌移植瘤生长具有协同抑制作用，表现出较高的抗肝癌活性。本发明组合物可在制备治疗肝癌的药物中广泛应用，为肝癌的临床治疗提供了非常有前景的高效预选药物。

附图说明

图1.人脐静脉内皮细胞克隆形成分析，数据以均数±标准差表示，***：p＜0.001，NS：无差异性。

图2.重组人血管内皮抑制素联合地塞米松磷酸钠协同抑制人脐静脉内皮细胞侵袭；

A：人脐静脉内皮细胞在药物作用下的侵袭细胞代表图，B：侵袭细胞计数(×200)；数据以均数±标准差表示；***：p＜0.001。

图3.重组人血管内皮抑制素联合地塞米松磷酸钠对小管形成的影响分析；

A：小管形成代表图，B：小管形成计数(×200)，数据以均数±标准差表示，***：p＜0.001。

图4.重组人血管内皮抑制素与地塞米松磷酸钠联合对大鼠主动脉环的联合增强抑制作用(×100)。

图5.重组人血管内皮抑制素与地塞米松磷酸钠联合对鸡胚尿囊膜的联合增强抑制作用(×20)。

图6重组人血管内皮抑制素与地塞米松磷酸钠联合对肝癌移植瘤的协同治疗作用；

A：荷H22昆明小白鼠治疗终止后各治疗组肿瘤重量比较图；

B：实验期间昆明小白鼠体重记录与变化图；

C：荷瘤裸鼠Bel7402肿瘤生长曲线；

D：实验期间BALB/c(nu/nu)裸鼠体重记录曲线；

*，**，***，分别代表p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001；NS，无显著性差异。

具体实施方式

本发明实施例中所使用的重组人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该序列构成的蛋白质的制备方法和专利号为ZL00107569.1的中国专利的制备实施例相同。地塞米松为地塞米松磷酸钠。昆明小白鼠和裸鼠BALB/c(nu/nu)由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，购自Sciencell公司。Bel7402细胞和H22细胞，购自中国医学科学院细胞库中心。如无特殊说明，本实施例中所涉及的试验用材料均可通过商业途径获得。

实施例1克隆形成分析本发明组合物对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响

用ECM培养基将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)稀释并接种于24孔中(100cells/well)，37℃孵育3天后加药物处理，实验分对照组(Control，即无血清的ECM培养基，下同)，重组人血管内皮抑制素组(下文和图中简写为Endo组，重组人血管内皮抑制素(以下简写为Endo)：12.5μg/ml)、地塞米松磷酸钠组(下文和图中简写为DXM组，地塞米松磷酸钠(以下简写为DXM)：0.5μg/ml)和联合组(Endo12.5μg/ml+DXM0.5μg/ml)。继续培养10天，于镜下观察并计算克隆形成数(图1)。以如下公式计算克隆形成率及联合组的协同作用指数(CDI，coefficient of drugs interaction)：

克隆形成率＝治疗组克隆形成数/对照组克隆形成数×100％；

CDI＝AB/(A×B)，A和B分别为两个单药的克隆形成率，AB为A和B联合组的克隆形成率，，CDI指数＞1为拮抗，＝1为相加，＜1为协同。

由实验结果计算得：Endo组的克隆形成率为63％，DXM组的克隆形成率为55％，联合组的克隆形成率为30％，两种成分联合对HUVEC克隆形成协同指数为0.86。克隆形成实验表明：本发明组合物中的地塞米松能够协同增强重组人血管内皮抑制素对内皮细胞增殖的抑制作用。

本实施例中各给药组溶液配置方法如下：

Endo组：6.25mg重组人血管内皮抑制素溶解于500mL生理氯化钠溶液，即得12.5μg/ml重组人血管内皮抑制素溶液。

DXM组：6.25mg地塞米松磷酸钠溶解于500mL生理氯化钠溶液，即得0.5μg/ml地塞米松磷酸钠溶液。

联合组：500mL生理氯化钠溶液中加入0.25mg地塞米松磷酸钠，溶解后再加入6.25mg重组人血管内皮抑制素，即得地塞米松磷酸钠的浓度为0.5μg/ml，重组人血管内皮抑制素的浓度为12.5μg/ml的组合物溶液。

实施例2 Transwell法分析本发明组合物对HUVECs侵袭的影响

将Transwell小室置于24孔板中，每个小室用无血清培养基平衡过夜，然后于小室上层加Matrigel胶包被，并接种HUVEC细胞于Transwell上室中，于下室加ECM培养基，然后再加药物于37℃处理18小时，实验分对照组(Control)、Endo组(250μg/ml)、DXM组(5μg/ml)和联合组(Endo250μg/ml+DXM5μg/ml)。取出小室并用苏木素染色，擦除未过膜的细胞，对穿膜细胞进行拍照、计数(图2)，并按下式计算细胞侵袭率及协同指数(CDI)：

细胞侵袭率＝治疗组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数×100％；

CDI＝AB/(A×B)，A和B分别为两个单药的细胞侵袭率，AB为A和B联合组的细胞侵袭率，CDI指数＞1为拮抗，＝1为相加，＜1为协同。

由实验结果计算得：Endo组的细胞侵袭率为56％，DXM组的细胞侵袭率为53％，联合组的细胞侵袭率为16％，两种成分联合对HUVEC克隆形成协同指数为0.53。Transwell侵袭实验表明本发明组合物中两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松联合可明显减少内皮细胞迁移数量，二者可协同抑制内皮细胞的侵袭。

本实施例中各给药组溶液配制方法同实施例1。

实施例3小管形成实验分析本发明组合物对HUVEC小管形成的影响

将HUVEC细胞接种于100μl Matrigel包被的96孔板中(2×10⁴cells/well)，并加药处理。实验分对照组(Control)、Endo组(250μg/ml)、DXM组(5μg/ml)和联合组(Endo250μg/ml+DXM5μg/ml)。37℃孵育24小时后，于倒置显微镜下拍照(×200)，计数HUVEC细胞形成的管状结构(图3)，并按下式计算抑制率及协同指数：

抑制率＝[1-(治疗组小管形成数/对照组小管形成数)]×100％；

CDI＝AB/(A×B)，A＝Endo组小管形成数/对照组小管形成数，B＝DXM组小管形成数/对照组小管形成数，AB＝联合组小管形成数/对照组小管形成数，CDI指数＞1为拮抗，＝1为相加，＜1为协同。

由实验结果计算得：Endo组的抑制率为21％，DXM组的抑制率为45％，联合组的抑制率为74％，两种成分联合对HUVEC克隆形成协同指数为0.6。小管形成实验表明本发明组合物中两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松可协同抑制小管形成。

本实施例中各给药组溶液配制方法同实施例1。

实施例4大鼠主动脉环分析本发明组合物对主动脉环发芽能力的影响

将200g Sprague-Dawley大鼠胸主动脉分离并去掉结缔组织，冠状切割成1mm左右的环，将动脉环包埋于250μl Matrigel预包被的24孔板中。37℃培养4天后，加药处理，实验分对照组(Control)、Endo组(500μg/ml)、DXM组(25μg/ml)和联合组(Endo500μg/ml+DXM25μg/ml)。37℃继续培养5天。然后于倒置显微镜下拍照(图4)。由图4可看出联合组大鼠主动脉环的微血管数明显少于对照组及单药组。大鼠主动脉环分析证实本发明组合物中两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松联合可获得增强的抗血管生成作用。

本实施例中各给药组溶液配制方法同实施例1。

实施例5鸡胚尿囊膜实验分析发明组合物对鸡胚尿囊膜血管生长的影响

将Leghorn受精鸡蛋随机均分为4组，于37℃培养7天。然后将蛋壳开一小窗，加药处理，实验分对照组(Control)、Endo组(250μg/egg)、DXM组(12.5μg/egg)和联合组(Endo250μg/egg+DXM12.5μg/egg)。然后用胶带密封小窗继续培养4天。用4％的多聚甲醛固定鸡胚尿囊膜2小时，然后剥离出来，铺展于载玻片上，风干后于体视显微镜下拍照(图5)。血管生长评价指标为血管粗细和血管数目。由图5可看出联合组鸡胚尿囊膜的微血管数目明显少于对照组，联合组血管的微血管粗细程度也明显细于对照组及单药组。鸡胚尿囊膜实验证实本发明组合物中两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松联合可获得增强的抗血管生成作用。

本实施例中Endo组Endo溶液浓度为：50mg/ml，DXM组DXM溶液的浓度为2.5mg/ml，联合组溶液中Endo浓度为50mg/ml，DXM浓度为2.5mg/ml；各给药组溶液配制方法同实施例1。

实施例6 H22和Bel7402皮下移植瘤实验

6.1移植于昆明白鼠的小鼠肝癌H22的实验治疗

小鼠H22肝癌细胞在体外培养扩增，取对数生长期细胞计数，用RPMI-1 640培养液稀释成2×10⁷/ml细胞悬液，接种于裸鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤生长并传代一次后用于治疗试验。(1)无菌取H22肿瘤，剔包膜与坏死组织，将肿瘤组织切成直径为2mm小块，每只裸鼠右侧腋窝皮下接种1块。(2)于接种肿瘤后开始给药，Endo经尾部静脉注射给药，每3天1次，共3次；DXM经腹腔注射给药，每3天1次，共3次；注射量均为0.2ml/20g体重。实验共设6组，即对照组(生理盐水)，Endo组1(Endo：50mg/kg)、Endo组2(Endo：100mg/kg)、DXM组(DXM：2mg/kg)、联合组1(Endo50mg/kg+DXM 2mg/kg)和联合组2(Endo 100mg/kg+DXM 2mg/kg)。(3)实验期间记录小鼠体重，于接种肿瘤后14天结束试验，处死动物，剥取肿瘤并称重。按下列公式计算抑瘤率(T/C％)并对各组瘤重进行统计学处理，以P＜0.05为判断有无显著性差异的标准，同时以如下公式计算各联合组剂量间的协同作用指数(CDI，coefficient of drugs interaction)。

T/C(％)＝[1-(W_t/Wc)]×100％，其中W_t为治疗组的瘤重，Wc为对照组的瘤重。

CDI＝AB/(A×B)，A＝W_Endo/W_对照，B＝W_DXM/W_对照，AB＝W_联合/W_对照，CDI指数＞1为拮抗，＝1为相加，＜1为协同。

统计学处理：结果用Microsoft Excel计算，并进行统计学分析，以P＜0.05为标准判断差异有无显著性。

第一次给药前与动物处死前瘤重比较图与体重变化图见图6A、图6B。

对H22肝癌移植瘤，Endo组1的抑瘤率(T/C％)为13％，Endo组2的抑瘤率为30％，DXM组的抑瘤率为44％，联合组1和联合组2的抑瘤率分别为66％和68％，协同指数分别为0.7和0.82。可见本发明组合物两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松可协同抑制肿瘤生长。且用药前后联合组小鼠体重较之对照组小鼠体重无明显变化，说明联合组所用组合物对受试动物体重无影响。

6.2移植于BALB/c(nu/nu)裸鼠的人肝癌Bel7402的实验治疗

人肝癌Bel7402细胞在体外培养扩增，取对数生长期细胞计数，稀释成2×10⁷/ml的细胞悬液，接种于裸鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤生长并传代一次后用于治疗试验。(1)无菌操作取Bel7402肿瘤，剔去包膜与坏死组织，将肿瘤组织切成直径为2mm的小块，每只裸鼠的右侧腋窝皮下接种1块。(2)待接种的肿瘤生长至＞100mm³后给药处理，Endo经尾部静脉注射给药，每3天1次，共5次；DXM经腹腔注射给药，每3天1次，共5次；注射量均为0.2ml/20g体重。实验共设6组，即对照组(PBS)，Endo组1(Endo：50mg/kg)、Endo组2(Endo：100mg/kg)、DXM组(DXM：2mg/kg)、联合组1(Endo50mg/kg+DXM 2mg/kg)和联合组2(Endo 100mg/kg+DXM 2mg/kg)。(3)实验期间记录肿瘤长、短径与体重，于接种肿瘤后30天(Day 30)结束试验，处死动物剥取肿瘤，并称取瘤重(W)。按下列公式计算肿瘤抑制率(T/C％)并进行统计学处理，判断有无显著性差异，同时以如下公式计算各联合组剂量间的协同作用指数(CDI，coefficient of drugs interaction)：

T/C(％)＝[1-(W_t/W_c)]×100％，其中W_t为治疗组的瘤重，Wc为对照组的瘤重。

并以如下公式计算联合指数：CDI＝AB/(A×B)，A＝W_Endo/W_对照，B＝W_DXM/W_对照，AB＝W_联合/W_对照，CDI指数＞1为拮抗，＝1为相加，＜1为协同。

实验期间肿瘤生长曲线和裸鼠体重记录曲线见图6C和图6D。

对人Bel7402肝癌移植瘤，Endo组1的肿瘤抑制率(T/C％)为12％，Endo组2的肿瘤抑制率为16％，DXM组的肿瘤抑制率为24％，联合组1和联合组2的肿瘤抑制率分别为46％和50％，协同指数分别为0.81和0.78，可见本发明组合物两有效成分重组人血管内皮抑制素与地塞米松可协同抑制肿瘤生长。其且用药期间联合组裸鼠体重较之对照组裸鼠体重无明显下降，说明联合组所用组合物对受试动物体重无影响。

本实施例中各给药组溶液配制方法同实施例1。

序列表

<110>江苏先声药物研究有限公司

<120>一种药物组合物及其应用

<160>1

<210>1

<211>192

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组人血管内皮抑制素

<400>1

Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe

1 5 10 15

Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly

20 25 30

Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Asn Cys Phe Gln Gln

35 40 45

Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser

50 55 60

Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg

65 70 75

Ala Ala Vla Pro Ile Val Ash Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro

80 85 90

Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Lys Lys Pro

95 100 105

Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His

110 115 120

Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn

125 130 135

Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu

140 145 150

Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg

155 160 165

Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val

170 175 180

Leu CysIle Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys

185 190

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于该组合物含有治疗有效量的重组人血管内皮抑制素和地塞米松。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制素是在人血管内皮抑制素编码氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0～4个任意氨基酸和2～8个组氨酸序列。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制素的起始氨基酸Met可以被切除。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制素的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制素还可为PEG修饰的重组人血管内皮抑制素。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述的PEG的分子量是5000～30000，PEG通过共价键与重组人内皮抑素相连。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的地塞米松为地塞米松磷酸钠或地塞米松的其他药用盐类。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的组合物，其特征在于所述的组合物中重组人血管内皮抑制素和地塞米松的质量比为10～100∶1，优选20～70∶1。

9.权利要求1所述的组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。