CN114796468A - 吉西他滨类化合物与靶向nkg2d配体的car-t细胞联合制备治疗恶性肿瘤的药物 - Google Patents

吉西他滨类化合物与靶向nkg2d配体的car-t细胞联合制备治疗恶性肿瘤的药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR‑T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途，还提供了一种治疗恶性肿瘤的药物，其包括吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR‑T细胞。本发明通过将靶向NKG2D配体的CAR‑T细胞和吉西他滨类化合物联用，二者可以产生协同增效作用，能够对恶性肿瘤产生优异疗效，并降低CAR‑T细胞的剂量以减少其导致的副作用，降低治疗成本。

Description

吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合制备治 疗恶性肿瘤的药物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及吉西他滨类化合物与靶向NKG2D 配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
背景技术
癌症等恶性疾病严重危害人类健康，嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，它是将经过基因工程修饰的T淋巴细胞(可以表达特异性嵌合抗原受体)回输至人体，激活人体自身免疫系统，从而持续地杀伤恶性肿瘤细胞。而NKG2D属于C型凝集素样受体家族，是一种 II型跨膜糖蛋白，几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达NK G2D配体，很少会出现在健康细胞的表面，因此靶向NKG2D配体的CAR-T将能够极大提高对肿瘤细胞的识别和杀伤作用。
虽然CAR-T细胞疗法在一些临床试验中取得了较好的效果，但是它在治疗过程中会产生较大的副作用(例如细胞因子释放综合征、神经毒性和脱靶效应等)，且对靶细胞的杀伤效果不足够强。此外，癌症患者的免疫系统往往比较弱，体内免疫细胞的数量较少、杀伤肿瘤细胞的能力并没有预想的强。因此，有必要进一步研究CAR-T细胞疗法以增强其对肿瘤细胞的杀伤效果。
吉西他滨(Gemcitabine)是一种新的胞嘧啶核苷衍生物，属于抗代谢类抗癌药，其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期，在临床上，吉西他滨对多种实体肿瘤有效。目前，业界还未见吉西他滨与CAR-T细胞在治疗肿瘤方面的联用报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T 细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新用途，二者的联用产生显著的协同杀死肿瘤细胞的作用。
第一方面，本发明提供了吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
本申请的申请人发现，吉西他滨类化合物可以上调恶性肿瘤表达NKG2D配体，进而明显增强靶向NKG2D配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、杀死效果，两者的联用表现出协同效应，可达到良好的治疗肿瘤效果，并可使靶向 NKG2D配体的CAR-T细胞的用量降低、降低单独的CAR-T细胞治疗导致的副作用。此外，吉西他滨类化合物为小分子有机化合物，价格便宜，能够降低CAR-T 细胞的免疫治疗成本。
本发明中，所述吉西他滨类化合物可以包括吉西他滨、其互变异构体及其药学上可接受的盐，以及本领域技术人员能够通过简单的化学方法(如还原、取代等方法)对吉西他滨的骨架上的侧链基团进行修饰和/去除，而仍然保留增强 CAR-T细胞杀伤功能的各种衍生物中的一种或多种。
可选地，所述吉西他滨类化合物包括吉西他滨(CAS号是95058-81-4，结构式如下式(Ⅰ)所示)、盐酸吉西他滨(CAS号是122111-03-9，结构式如下式 (Ⅱ)所示)、3'-表吉西他滨(吉西他滨的A异构体，CAS号是103882-85-5，结构式如下式(Ⅲ)所示)、1'-吉西他滨异构体盐酸盐(CAS号是122111-05-1，结构式如下式(Ⅳ)所示)、吉西他滨磷酸盐、吉西他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐、地西他滨(CAS号是2353-33-5，
Figure BDA0002921666520000021
)中的一种或多种，但不限于此。
Figure BDA0002921666520000031
其中，所述恶性肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、脑胶质瘤、结肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种，但不限于此，只有是可表达NKG2D配体的肿瘤即可。将吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联用后，特别是对胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌等实体肿瘤的治疗效果更显著。
可选地，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的给药方式为注射，例如，具体包括静脉注射、动脉注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射或肌内注射。可以将CAR-T细胞溶解或悬浮在适合于注射给药中可接受载体中的溶液，包括等渗无菌的注射水溶液和非水溶液。而吉西他滨类化合物的常见给药方式也为注射，但二者的具体注射方式可以相同或者不同。在一些实施方式中，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与吉西他滨类化合物的给药方式均为静脉注射。
当将吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合使用时，二者可以是通过注射的方式先后给药或同时给药。优选地，所述吉西他滨类化合物先给药，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞后给药，这样可以先通过吉西他滨类化合物激发患恶性肿瘤的患者体内产生较多NKG2D配体，进而增强靶向NKG2D 配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、治疗效果；且不会影响靶向NKG2D 配体的CAR-T细胞自身的细胞活性。
本申请一些实施方式中，所述靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞具有靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体CAR-NKG2D，其中，所述CAR-NKG2D包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D配体的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向NKG2D配体的单链抗体的氨基酸序列包括如 SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
其中，所述靶向NKG2D配体的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应，具有较高的安全性。可选地，所述靶向NKG2D配体的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
在本发明一实施方式中，所述胞外铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD 8跨膜区；所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3 ζ信号区。即，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D配体的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3 ζ信号区的氨基酸序列。可选地，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括如SEQ I D NO：2所示的氨基酸序列。进一步可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D配体的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。此时，所述CAR-NKG2D的编码基因可以包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列相比，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。其中，信号肽的编码基因可较好地指导CAR-NKG2D表达到T细胞表面，但在CAR-NKG 2D表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选地，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞中的T细胞来自自体T细胞、异体T细胞或iPSC诱导的T细胞。优选为来自患恶性肿瘤的患者的自体T细胞，以使将靶向NKG2D配体的CAR-T细胞回输至患者体内时的免疫反应降至最低。
第二方面，本发明还提供了一种治疗恶性肿瘤的药物，所述药物包括吉西他滨类化合物和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。
可选地，所述药物中，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与所述吉西他滨类化合物可以单独分开存在，也可以混合存在。其中，当靶向NKG2D配体的CAR-T 细胞与吉西他滨类化合物分开存在时，二者的具体给药方式可相同或不同，可以同时给药或分开给药。例如，当靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与吉西他滨类化合物以混合态存在时，所述药物可以是注射制剂，靶向NKG2D配体的CAR-T 细胞与吉西他滨类化合物二者均以注射方式同时给药。此时，该药物中还可以含有药学上可接受的载体，如水、生理盐水、葡萄糖水溶液以及其他非水性溶剂等至少一种稀释剂，以及稳定剂等中的至少一种，但不限于此。优选地，靶向NKG2D 配体的CAR-T细胞与吉西他滨类化合物单独分开存在，以发挥出更好的治疗恶性肿瘤的效果。
可选地，所述治疗恶性肿瘤的药物还包括其他治疗恶性肿瘤的活性成分。其中，所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分包括化疗剂和免疫检查点抑制剂等中的至少一种。其中，对于免疫检查点抑制剂，可以列举抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM抗体、抗CTLA-4抗体等中的一种或多种。免疫检查点抑制剂可以通过解除免疫抑制来增强其与CAR-T细胞的抗肿瘤效果。化疗剂可以包括烷化剂(如环磷酰胺、莫司丁等)、抗代谢药(如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素(如阿霉素等)、抗肿瘤动植物成分药(如长春新碱、紫杉醇等)、抗肿瘤激素类(如地塞米松、丙酸睾丸素等)、铂类化疗药物(如顺铂、卡铂等)等中的至少一种。化疗剂可根据具体的恶性肿瘤来选择。
可选地，所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分可以单独存在，或者与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞及吉西他滨类化合物中的至少一种混合在一起。所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分的给药方式可以是口服或注射(如静脉注射、皮下注射或肌内注射)。可根据具体的其他治疗恶性肿瘤的活性成分及分布状态来选择给药方式、给药顺序等。例如，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分同时给药或不同时给药，二者的给药方式相同或不同。
本发明通过将靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和与之有协同增效作用的吉西他滨类化合物联用，能够在保证疗效的前提下，通过降低CAR-T细胞的剂量来减少其导致的副作用，同时能够增强CAR-T细胞疗法的治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例提供的带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒感染T细胞后表达嵌合抗原受体CAR-NKG2D的流式检测结果图；
图2为各实验组对Panc-1细胞的体外杀伤曲线图；
图3为各实验组对Panc-1细胞的体外杀伤率统计图；
其中，GMT代表盐酸吉西他滨，NKG2D CAR-T代表靶向NKG2D配体的 CAR-T细胞。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明提供了吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。
本申请的申请人发现，吉西他滨类化合物可以上调恶性肿瘤表达NKG2D配体，进而明显增强靶向NKG2D配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、杀死效果，两者的联用表现出协同效应，可达到良好的治疗肿瘤效果，并可使靶向 NKG2D配体的CAR-T细胞的用量降低、降低单独的CAR-T细胞治疗导致的副作用。此外，吉西他滨类化合物为小分子有机化合物，价格便宜，能够降低CAR-T 细胞的免疫治疗成本。
下面通过具体的实施例来验证靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和吉西他滨类化合物之间的协同增效作用。
首先，制备靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，包括以下步骤：
(1)构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒
将序列如SEQ ID NO：4所示的CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD 载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α (EF1α)之后，以EF1α为启动子。其中在将CAR-NKG2D的编码基因插入到 pWPXLD载体时，在CAR-NKG2D的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG) 与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA) 与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒。
(2)重组慢病毒构建
将上述获得的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒与包装质粒psPAX2、包膜质粒 pMD2G三者通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染培养好的HEK293T细胞，48小时后离心获得带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒。
(3)靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞的制备
采集并分离得到健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，加入CD3/CD28免疫磁珠进行孵育，筛选得到CD3阳性T淋巴细胞；向其中加入上述重组慢病毒进行培养，获得靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，保存在回输专用的细胞冻存液中，以待后续使用。
同时采用流式细胞仪检测靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的表达，结果如图1所示。经检测，经上述重组慢病毒感染的T细胞中，CAR-NK G2D的阳性率约为39％。这表明成功制得得到靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。
肿瘤细胞的体外杀死实验
1、复苏液氮中冻存的Panc-1细胞(胰腺癌细胞)，以其作为靶细胞，将其在含血清的DMEM完全培养基中传代培养。复苏冻存的靶向NKG2D配体的CA R-T细胞，CAR-NKG2D的阳性率约为39％(参见图1，UTD代表未经处理的P BMC细胞)，将其在含IL-2(50IU/mL)的581培养基中传代培养。
2、采用实时细胞功能分析仪(xCElligence RTCA SP)进行肿瘤细胞的杀伤实验：首先在该仪器配套的E-Plate板中加入50μL的DMEM完全培养基，置于仪器中进行Blank扫描，然后加入50μL含有6000个Panc-1细胞的DMEM完全培养基至E-Plate的各孔中。
3、实验共分为4组：对照组、NKG2D CAR-T细胞组、GMT组、联合给药组。待Panc-1细胞接种24h后，根据分组情况分别加入相应的药物进行处理，其中，对照组和NKG2D CAR-T细胞组加入的均是PBS缓冲液，GMT组和联合给药组加入的均是盐酸吉西他滨的PBS缓冲溶液，盐酸吉西他滨在对应孔中的终浓度为2μM。
4、加药处理约24h后，根据分组情况分别加入空白培养基或靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。其中，对照组和GMT组加入的均是DMEM完全培养基，NK G2D CAR-T细胞组和联合给药组加入的均是含6000个靶向NKG2D配体的CA R-T细胞的DMEM完全培养基。
5、加入靶向NKG2D配体的CAR-T细胞杀伤30h后，停止实验，根据实时细胞功能分析仪的细胞指数CI值对杀伤效果进行分析。其中，CI值越大，代表活的Panc-1细胞的数目越多，杀伤效果越差。
图2、图3汇总了对Panc-1细胞的杀伤结果。从图2-图3可以获知，单独使用盐酸吉西他滨或单独使用靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，对Panc-1肿瘤细胞的杀伤作用均较弱，但当二者联用后，对肿瘤细胞的杀伤作用显著增强。这表明，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和吉西他滨类化合物联用，可以实现协同杀死肿瘤细胞的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
145 150 155 160
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
180 185 190
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
195 200 205
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
245 250 255
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
260 265 270
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
275 280 285
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
290 295 300
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
305 310 315 320
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
325 330 335
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360 365
<210> 3
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60
gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120
ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180
agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240
cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300
attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360
gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420
caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 480
tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 540
acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 600
ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 660
ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 720
tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 780
cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 840
cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 900
ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 960
aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1020
cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1080
atgcaggccc tgccgcctcg g 1101
<210> 4
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 120
gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 180
ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 240
agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 300
cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 360
attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 420
gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 480
caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 540
tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 600
acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 660
ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 720
ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 780
tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 840
cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 900
cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 960
ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1020
aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1080
cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1140
atgcaggccc tgccgcctcg g 1161
<210> 5
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60
gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120
ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180
agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240
cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300
attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360
gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420
caaaggactg tg 432

Claims (10)

1.吉西他滨类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述吉西他滨类化合物包括吉西他滨、吉西他滨的互变异构体及其药学上可接受的盐中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞具有靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体CAR-NKG2D，其中，所述CAR-NKG2D包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D配体的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向NKG2D配体的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向NKG2D配体的嵌CAR-T细胞中所用的T细胞来自自体T细胞、异体T细胞或iPSC诱导的T细胞。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述吉西他滨类化合物与所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的给药方式均为注射，且所述吉西他滨类化合物先给药，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞后给药。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述恶性肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、脑胶质瘤、结肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种。
7.一种治疗恶性肿瘤的药物，其特征在于，所述药物包括吉西他滨类化合物和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述吉西他滨类化合物包括吉西他滨、盐酸吉西他滨、3'-表吉西他滨、1'-吉西他滨异构体盐酸盐、吉西他滨磷酸盐、吉西他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐、地西他滨。
9.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物还包括其他治疗恶性肿瘤的活性成分，所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分包括化疗剂和免疫检查点抑制剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分单独分开存在，或者与所述吉西他滨类化合物和所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞中的至少一种以混合状态存在。
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