CN101880717B

CN101880717B - 印度谷螟荧光pcr检测方法

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Publication number: CN101880717B
Application number: CN2010102245382A
Authority: CN
Inventors: 黄家兴; 安建东; 罗术东; 李继莲; 吴杰
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN101880717A

Abstract

本发明提供了用于印度谷螟荧光PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供了用于印度谷螟荧光PCR检测的TaqMan探针，该探针位于上述引物的扩增区域内，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明还提供了含有上述引物和探针的印度谷螟荧光PCR检测试剂盒以及印度谷螟荧光PCR检测方法。本发明能够快速诊印度谷螟污染，克服了传统形态学对印度谷螟卵的鉴定困难等问题，具有快速、准确、稳定性及重复性好、特异性及灵敏性高等优点；一次可以检测多个样品，费用低，适合于大批量样品的检测。

Description

印度谷螟荧光PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种印度谷螟污染的分子检测方法，具体地说，涉及一种印度谷螟荧光PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)属鳞翅目，螟蛾科，斑螟亚科，别名印度谷斑螟、印度谷蛾、印度粉蛾、枣蚀心虫、封顶虫，该虫广泛分布于除南极州外的世界各地，其食性杂，可危害豆类、干蔬菜、干果类、枸杞、菊花、鲜枣、中药材、糖类、稻、麦、食用菌及昆虫标本等，是主要的仓储物、家庭粮食制品等储粮害虫。由于印度谷螟幼虫喜食粮粒胚部，因此，对种子粮破坏性极大，其危害是在粮食内部及表面吐丝结网，把被害物连结成团，藏于其中，并可引起储粮发热，造成粮食结块变质；此外，印度谷螟在危害过程中还排出异味粪便，污染食物。因此，开展印度谷螟的检测技术研究，有助于提早撑握其动态信息，有助于为实际生产中做出科学预测报告和防治措施，对减少生产的经济损失具有重要的意义。

印度谷螟的形态特征，成虫：雌蛾稍大于雄蛾，雌蛾平均体长7.4mm，翅展15.4mm；雄蛾平均体长6.7mm，翅展13.3mm；体色基本一致，双翅密布灰白色和赤褐色鳞片；前翅狭长形，近基部2/5处为灰白色，其余部分为赤褐色，并散生不规则的黑色斑纹；后翅三角形，灰白色，缘毛灰色；头部赤褐色，呈三角形。下唇须发达并伸向前方；两复眼间有一向前突出的鳞片锥体，触角丝状。卵：卵乳白色，短椭圆形，平均长度为0.3mm，宽0.2mm，一端带一小尖，表面密布微细粒状突起。幼虫：初孵幼虫半透明乳白色，头部淡褐色，孵化数小时后腹部开始膨大；随着日龄的增大，幼虫体色逐渐变深，老熟幼虫体长平均为14.3mm，头部赤褐色，其余各节淡黄色至黄色，有单眼5个，腹足趾钩为双环状；雄性幼虫进入4日龄后，其第7腹节背中有一棕色或紫色斑块睾丸，极易辨认。蛹：蛹两头尖，呈纺锤形，淡黄色至深褐色，平均体长为6.6mm，宽1.8mm；腹部略向背面弯曲，末端具有8～12个较大的角质化突起，眼黑色。

印度谷螟在我国的发生规律为：在我国北方粮仓内1年发生3～4代，4月中旬越冬幼虫开始活动并取食，10月下旬幼虫进入越冬休眠，越冬期长达200天左右；在南方粮仓内1年发生4～6代，3月下旬开始活动，在11月份，随着气温的降低，幼虫进入越冬状态。

印度谷螟是熊蜂工厂化繁育过程中的重要害虫之一，其主要危害存贮的熊蜂饲料、蜂群内的剩余花粉及蜂蛹等。熊蜂工厂化繁育温度约28℃，湿度60％左右，此温湿度为印度谷螟生长发育的适合温度，因此利于印度谷螟的爆发。目前已有研究指出，印度谷螟主要取食花粉，但当花粉缺少时，会取食熊蜂蛹；印度谷螟是蜂花粉的主要危害之一，其主要污染源是花粉的贮藏和流通过程中出现的虫源；也有研究指出，熊蜂饲养中熊蜂饲料花粉是印度谷螟卵的主要来源；此外，还有研究指出，若用于饲喂熊蜂的蜜蜂花粉中含有印度谷螟虫卵污染，当采用-60℃处理3星期以上时，可以防止其感染；但在-20℃的温度下处理时，效果不明显。本发明人等经研究报道了我国明亮熊蜂繁育室内印度谷螟的危害，指出印度谷螟主要取食蜂巢中剩余花粉，但当花粉不足时，会取食蜂巢和蜂蛹，其在繁育室内每年的5～8月、11月～次年2月为危害高峰期，对熊蜂的规模化繁育造成较大危害。

从目前的研究报道中可以看出，花粉是印度谷螟危害熊蜂饲料的主要途径之一，熊蜂饲养的温湿度利于印度谷螟的生长发育，因此易于印度谷螟的爆发。同时，由于熊蜂对化学农药十分敏感，在熊蜂饲养中发生印度谷螟污染很难用药剂加以防治，给生产带来不便。为此，建立一套熊蜂饲料中印度谷螟污染的快速检测方法，是预防其爆发的一项重要技术环节。

TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent PCR)是在常规PCR基础上加入一条特异性的荧光探针。所述探针为一段寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团；当探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光检测系统无法接收到荧光信号；当PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统接收到荧光信号，所以，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，即每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。因此，通过TaqMan探针实时荧光定量PCR方法可以对起始模板进行定性和定量检测。Taqman探针是最早用于定量的方法，该方法已应用于多个研究领域，主要有临床检测、微生物检测、食品检测、基因定量检测、突变分析、等位基因分析和单核苷酸多态性分析，是一项重要的检测技术。

目前，印度谷螟的检测方法主要是根据形态学进行鉴定，该方法需要鉴定者具有较强的昆虫分类学知识和技能，并且鉴定时仅仅针对成虫标本才能鉴定，而对于卵的鉴定准确度将大大降低。本发明采用分子生物学技术，设计了TaqMan探针，通过TaqMan探针荧光PCR检测方法，能够快速、准确地对印度谷螟幼虫或卵进行检测，不仅方便了检疫部门对进出口产品进行抽样检测，也对大型仓储库的存粮印度谷螟的抽样检测和防治措施的制定具有重要的指导意义。到目前为止，还未见有利用荧光定量PCR对熊蜂饲料中印度谷螟污染进行检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供用于印度谷螟荧光PCR检测的引物和TaqMan探针。

本发明的另一目的在于提供用于印度谷螟荧光PCR检测的试剂盒。

本发明的目的还在于提供印度谷螟荧光PCR检测方法。

为了实现本发明的目的，本发明用于印度谷螟荧光PCR检测的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。其中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为正向引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为反向引物。

本发明用于印度谷螟荧光PCR检测的TaqMan探针，该探针针对上述引物的扩增区域内，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

上述探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TRAMA，即本发明所述的TaqMan探针为：FAM-AAGACCATTCATTCAGTATCGTTCGTT-TRAMA。

特别地，上述用于印度谷螟荧光PCR检测的引物及TaqMan探针，其为根据GeneBank登录号AY743338的印度谷螟IMM313微卫星序列，用Primer primer5.0软件设计得到的。

本发明选取印度谷螟微卫星序列IMM313部分片段为靶目标，通过对该序列搜索比对结果显示其无同源序列，与其他物种序列相似性较低，故采用此序列进行特异性引物和荧光探针的设计。本发明所述的引物和TaqMan探针由北京赛白胜科技有限公司合成及标记，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

本发明还提供含有上述引物及TaqMan探针的印度谷螟荧光PCR检测试剂盒。

所述试剂盒还包括：扩增缓冲液，DNA聚合酶、Mg²⁺溶液和dNTPs。

本发明的印度谷螟荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)以样品基因组DNA作为DNA扩增模板，用上述引物和TaqMan探针，进行荧光定量PCR检测；根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。

其中，所用检测试剂的具体组成如下：2μL 10×扩增缓冲液，2.0mmol/L MgCl₂，各20μmol/L的4种dNTP混合物，终浓度均为500nmol/L的前述引物，终浓度为50nmol/L的前述TaqMan探针，1UTaq DNA聚合酶，补水至20μL。

步骤2)中的PCR反应程序为：95℃2min、94℃30sec、56℃1min、然后72℃30sec，循环40次。

步骤1)提取样品基因组DNA的具体步骤为：将样品放入1.5mL离心管，加入20μL双蒸水，再用一次性塑料研磨杵研磨；然后加入50μL含5％(重量)鳌合树脂Chelex100的水溶液和1μL 20mg/mL蛋白酶K水溶液，在56℃温度下消化30min；然后煮沸8min后立刻放入冰盒冷却10min；然后在温度4℃、转速10000rpm/min的条件下离心1min，吸取上清液作为DNA扩增模板。

所述样品为印度谷螟的幼虫和/或卵，或者为经80目筛网初筛的熊蜂饲料水溶液。

本发明中检测结果的判定标准为：根据样品扩增出具有指数增长期的荧光扩增曲线，当其Ct值小于30，且样品与阴性对照之间Ct值差异大于5时，说明该样品受到印度谷螟污染；反之，则不是印度谷螟污染。

本发明中所述的水均为无核酸酶污染的双蒸水。

此外，本发明还提供阳性质粒的制备方法，用来验证荧光扩增是否为设计引物的目的片段，具体步骤如下：利用所设计的前述引物进行普通PCR扩增，产物进行2％的琼脂糖电泳，切胶回收，把目的片段克隆到pMD19-T载体，挑取白斑克隆，37℃摇菌过夜，提取白斑克隆的菌液质粒，利用EcoRI和HindIII双酶切鉴定，取阳性克隆菌液进行双向测序；然后，进行BLAST比对验证是否为所设计引物的目的片段。

本发明中还可以通过标准曲线验证所设计的引物和探针的扩增效率，一般来说扩增效率为90～110％时才可接受扩增的结果。所述标准曲线是以前述DNA扩增模板的连续5个数量级的稀释作为样品，每个样品重复扩增3次得到的平均Ct值为纵坐标，模板起始浓度为横坐标的关系曲线，结果如图2所示。

本发明的优点在于：

1、特异性高：本发明利用印度谷螟微卫星序列进行设计特异性引物，目的片段的数据库搜索比对结果显示其相似度高的序列少，此外，本发明还设计了一条特异性荧光探针，从而在荧光检测的过程中可以对靶目标进行双重控制，因此，保证了检测的特异性，使得假阳性检测的结果极低。

2、重复性好：利用本发明所设计的引物和探针对不同样品和阳性克隆质粒进行重复检测，结果表明，所有的阳性样品均能出现阳性扩增曲线。

3、灵敏度高：利用不同稀释浓度的阳性质粒对本发明所设计的引物和荧光探针的灵敏度进行检测，结果发现所设计的引物和荧光探针能够检测到的阳性质粒最低拷贝数为10²，说明本发明所设计的引物和荧光探针灵敏度较高。

4、本发明所涉及的操作方法简单、易行，能够在较短时间内完成对印度谷螟的检测；一次可以检测多个样品，特别适合于大批量的抽样检查。

5、利用本发明对印度谷螟进行检测费用低，适合于大批量样品的检测；整个检测过程电脑件实时监测，可以随时掌握检测样品的扩增动态变化。

附图说明

图1为本发明所采用的TaqMan探针原理图。

图2为本发明的荧光定量PCR标准曲线。

图3为本发明所克隆的目的片段普通PCR结果。

图4为印度谷螟和大蜡螟荧光检测结果；其中A为印度谷螟，B为大蜡螟和阴性对照。

图5为本发明不同质粒拷贝数的荧光检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1印度谷螟的荧光PCR检测

1)根据GeneBank登录号AY743338的印度谷螟IMM313微卫星序列，设计、合成引物及TaqMan探针；

所述引物为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为正向引物，SEQID No.2所示的核苷酸序列为反向引物。

所述TaqMan探针为：FAM-AAGACCATTCATTCAGTATCGTTCGTT-TAMRA；

2)提取样品基因组DNA：用镊子挑取印度谷螟幼虫和卵，放入1.5mL离心管，加入20μL双蒸水，再用一次性塑料研磨杵研磨；然后加入50μL含鳌合树脂Chelex100的水溶液和1μL20mg/mL蛋白酶K水溶液，在56℃温度下消化30min；然后煮沸8min后立刻放入冰盒冷却10min；然后在温度4℃、转速10000rpm/min的条件下离心1min；吸取上清液作为DNA扩增模板；

3)取2μL上述样品基因组DNA作为DNA扩增模板，用步骤1)的引物及探针，进行荧光定量PCR检测；

所用试剂的具体组成如下：2μL10×扩增缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，各20μmol/L的4种dNTP混合物，终浓度均为500nmol/L的步骤1)所述的正向引物及反向引物，终浓度为50nmol/L的步骤1)所述的TaqMan探针，1U Taq DNA聚合酶，补水至20μL；

PCR反应程序为：95℃2min、94℃30sec、然后56℃1min、72℃30sec，循环40次。

实施例2熊蜂饲料花粉中印度谷螟的荧光PCR检测

1)引物及TaqMan探针与实施例1相同；

2)提取样品基因组DNA：将熊蜂饲料花粉溶于水，用80目筛网对花粉水溶液进行初筛；然后，放入1.5mL离心管，加入20μL双蒸水，再用一次性塑料研磨杵研磨；然后加入50μL含鳌合树脂Chelex100的水溶液和1μL 20mg/mL蛋白酶K水溶液，在56℃温度下消化30min；然后煮沸8min后立刻放入冰盒冷却10min；然后在温度4℃、转速10000rpm/min的条件下离心1min；吸取上清液作为DNA扩增模板；

3)其余步骤与实施例1相同。

试验例1本发明检测方法对印度谷螟的特异性考核

按实施例1方法对5粒印度谷螟卵的基因组DNA进行检测；用鳞翅目昆虫大蜡螟代替印度谷螟，按实施例1方法对5个大蜡螟基因组DNA进行检测作为对照组；并设置阴性对照，检测结果如图4所示，其中A为印度谷螟，B为大蜡螟和阴性对照。

结果表明，印度谷螟Ct值小于30，为阳性；而大蜡螟扩增曲线与阴性对照组重合，其Ct值大于35，故定为阴性，说明利用本发明所建立的方法能够特异性检测印度谷螟。

试验例2本发明方法的灵敏性和重复性考核

利用实施例1中的引物进行普通PCR扩增，产物进行2％的琼脂糖电泳，切胶回收，把目的片段克隆到pMD19-T载体，挑取白斑克隆，37℃摇菌过夜，提取白斑克隆的菌液质粒，即得到印度谷螟阳性质粒。

将上述印度谷螟阳性质粒测量浓度并算出拷贝数，用双蒸水稀释到3.5×10⁷拷贝数后，再分级作10倍稀释，分别得到3.5×10⁶、3.5×10⁵、3.5×10⁴、3.5×10³、3.5×10²、3.5×10¹、3.5×10⁰(单位为Copies/mL)，各取1μL作为模板按实施例1中步骤3)的方法进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测，结果如图5所示。

结果表明，利用本发明的探针体系可以检测到最低为3.5×10²Copies/mL的阳性克隆质粒。

并且，结合试验例1及试验例2可以看出，按照实施例1方法对印度谷螟的5粒卵进行检测，结果表明所有的样品检测结果均为阳性，说明该方法对不同卵提取的基因组DNA具有良好的重复性。同时，利用该方法对6个阳性质粒样品(浓度为10²Copies/mL)进行检测，结果显示所检测质粒检测结果也具有良好的重复性，5粒卵和6个阳性质粒都能检测出阳性扩增信号，因此，本发明所建立的荧光定量PCR检测体系对印度谷螟基因组DNA和阳性质粒的检测具有较好的重复性，结果如图4及图5所示。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及试验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于印度谷螟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其含有核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的荧光PCR引物以及荧光PCR检测的TaqMan探针；所述探针是在核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示的荧光PCR引物的扩增区域内，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TRAMA。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、Mg²⁺溶液和dNTPs。

3.一种印度谷螟荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取样品基因组DNA；

2)以样品基因组DNA作为DNA扩增模板，用权利要求1所述试剂盒，进行荧光定量PCR检测，根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中的PCR反应程序为：95℃2min、94℃30sec、56℃1min、然后72℃30sec，循环40次。

5.如权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，其中步骤1)提取样品基因组DNA的具体步骤如下：将样品放入1.5mL离心管，加入20μL双蒸水，再用一次性塑料研磨杵研磨；然后加入50μL含5％(重量)鳌合树脂Chelex100的水溶液和1μL 20mg/mL蛋白酶K水溶液，在56℃温度下消化30min；然后煮沸8min后立刻放入冰盒冷却10min；然后在温度4℃、转速10000rpm/min的条件下离心1min；吸取上清液作为DNA扩增模板。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述样品为印度谷螟的幼虫和/或卵，或者为经80目筛网初筛的熊蜂饲料水溶液。