CN101864498A - 一种禽流感h5n1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含RNA提取液、禽流感H5N1病毒核酸恒温扩增反应液、禽流感H5N1病毒阳性对照、阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；可同时满足高通量和低通量的样品检测，且整个反应过程不需要复杂的仪器。

Description

一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

人禽流感，即人禽流行性感冒，是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病。1997年5月，中国香港特别行政区1例3岁儿童死于不明原因的多脏器功能衰竭，同年8月经美国疾病预防和控制中心以及世界卫生组织(WHO)，荷兰鹿特丹国家流感中心鉴定为禽甲型流感病毒H5N1引起的人类流感，这是世界上首次证实禽甲型流感病毒H5N1感染人类。

禽甲型流感病毒H5N1引起的禽流感称高致病性禽流感，发病率和病死率都很高，危害巨大。其潜伏期一般为1～3天，通常在7天以内。早期表现类似普通型流感，主要为发热，体温大多持续在39℃以上，热程1～7天，一般为3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛和全身不适。部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征等多种并发症。预防禽甲型流感病毒H5N1应尽可能减少接触，特别是少年儿童与禽、鸟类的不必要接触，尤其是与病、死禽类的接触；公众要增强自防自控意识，改变不良生活习惯，注意家庭和个人卫生，勤洗手，注意室内外通风，加强体育锻炼，不过度疲劳，增强机体抵抗力；饮食方面注意将生熟刀具和刀板分开，食品存放时也要生熟分开，少吃生食物或半熟食物；当出现发热、畏寒等异常症状时要及时就医；

近年来的发展起来针对禽流感H5N1病毒的荧光定量PCR(Fluorescence QuantitativePCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在禽流感H5N1病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前禽流感H5N1检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于禽流感H5N1核酸定量检测试剂盒。

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程，此交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用本申请人之前已申请专利(申请号：200810134583.1)。在此方法的基础上制备了本发明的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒特异性好，灵敏度高，步骤简单，反应速度快。

本发明所提供的禽流感H5N1病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒，包括下列组成：

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-GGAGTTCTTCTGGACAA-3’(SEQ ID NO1)；

反向外围引物序列为5’-GTCGCAAGGACTAATCT-3’(SEQ ID NO2)；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3’(SEQ IDNO3)；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-GATAAACTCTAGTATGCCA-FitC-3’(SEQ ID NO4)；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-ATGGTGAGAGGGTGTATTCATTGCTCCAGAATATGC-3’(SEQ ID NO5)；

扩增正向引物5’-TCATTGCTCCAGAATATGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3’(SEQ ID NO6)；

(3)阳性对照模板：为含有禽流感H5N1病毒HA基因片段的转录产物。

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

恒温扩增反应液中所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

本发明试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。

本发明提供的禽流感H5N1病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了禽流感H5N1病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种应用本发明试剂盒的禽流感H5N1病毒核酸恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤：

(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；

(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置(申请号：200610109620.4)中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有禽流感H5N1病毒核酸。

本发明的试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测禽流感H5N1病毒的要求。本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。

故本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；

2.反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；

3.整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；

4.可同时满足高通量和低通量的样品检测；

5.整个反应过程不需要复杂的仪器。

附图说明

图1实施例3的检测禽流感H5N1病毒核酸的特异性；

图中从左至右依次为：甲型H3N2、甲型H5N1、甲型H9N7、禽流感H5N1流感、季节性流感B、禽流感H5N1、人季节性流感H1N1；

图2实施例4的检测禽流感H5N1病毒核酸的灵敏度；

图中从左至右分别表示10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10拷贝/微升、阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

试剂盒的组成与配制

a)RNA提取试剂：RNA提取试剂盒

b)反应液：两条外围引物(0.05μmol)，两条探针(0.5μmol)，和两条交叉引物(0.5μmol)，1×Thermol buffer，MgSO₄(6mmol)，dNTPs溶液(0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(10U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为16μl。其中：

外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-GGAGTTCTTCTGGACAA-3’(SEQ ID NO1)；

反向外围引物序列为5’-GTCGCAAGGACTAATCT-3’(SEQ ID NO2)；

两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3’(SEQ IDNO3)；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-GATAAACTCTAGTATGCCA-FitC-3’(SEQ ID NO4)；

扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-ATGGTGAGAGGGTGTATTCATTGCTCCAGAATATGC-3’(SEQ ID NO5)；

扩增正向引物5’-TCATTGCTCCAGAATATGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3’(SEQ ID NO6)；

1×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

阳性对照：含有禽流感H5N1HA基因[NCBI gene bank number：CY058832.1(768-1041)]的RNA片段。阳性对照为含有长267bp的禽流感H5N1病毒HA基因序列，序列如下：GGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCTATCAATTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGAC (SEQ ID NO7)

c)阳性对照的制备步骤：利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以禽流感H5N1病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的RiboMAX^TM LargeScale RNA Production Systems转录出目的的RNA片段。用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

d)阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2

用本发明试剂盒检测禽流感H5N1病毒核酸的具体方法

a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA。

b)取标本RNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在60℃进行扩增反应90分钟，其中标本RNA 4μl，反应液16μl；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。当样本中含有禽流感H5N1病毒核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。

实施例3

用本发明试剂盒检测禽流感H5N1病毒的专一性

按照实施例2的方法检测甲型H3N2、甲型H5N1、甲型H9N7、甲型H1N1流感、季节性流感B、禽流感H5N1、人季节性流感H1N1。其结果如表1，见图1

表1禽流感H5N1病毒的专一性检测结果

序号	名称	检测结果
			1	甲型H3N2	-
2	甲型H5N1	-
			3	甲型H9N7	-
4	甲型H1N1流感	-
			5	季节性流感B	-

序号	名称	检测结果
			6	禽流感H5N1	+
7	人季节型流感H1N1	-

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性

从表1测试结果可见，用本发明试剂盒检测禽流感H5N1病毒核酸具有很强的专一性。

实施例4

用本发明试剂盒检测禽流感H5N1病毒核酸的灵敏度

提取培养的禽流感H5N1病毒病毒的RNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10¹拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测禽流感H5N1病毒核酸的灵敏度。结果如图2所示，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测禽流感H5N1病毒的要求。

序列表

<110>上海国际旅行卫生保健中心，杭州优思达生物技术有限公司

 

<120>一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

 

<160>7

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

ggagttcttc tggacaa                                                      17

 

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

gtcgcaagga ctaatct                                                      17

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

gagtcccctt tcttgacaat                                                   20

 

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

gataaactct agtatgcca                                                    19

 

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>5

atggtgagag ggtgtattca ttgctccaga atatgc                                 36

 

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>6

tcattgctcc agaatatgca tggtgagagg gtgtat                                 36

 

<210>7

<211>267

<212>DNA

<213>禽流感H5N1病毒HA基因序列

 

<400>7

ggagttcttc tggacaattt taaagccgaa tgatgctatc aatttcgaga gtaatggaaa       60

tttcattgct ccagaatatg catacaaaat tgtcaagaaa ggggactcag caattatgaa      120

aagtgaattg gaatatggta actgcaacac caagtgtcaa actccaatgg gggcgataaa      180

ctctagtatg ccattccaca acatacaccc tctcaccatc ggggaatgcc ccaaatatgt      240

gaaatcaaac agattagtcc ttgcgac                                          267

Claims (7)

1.一种禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：包括下列组成：

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-GGAGTTCTTCTGGACAA-3’，SEQ ID NO1；

反向外围引物序列为5’-GTCGCAAGGACTAATCT-3’，SEQ ID NO2；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5-biotin-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3’，SEQ ID NO3；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5-GATAAACTCTAGTATGCCA -FitC-3’，SEQID NO4；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-ATGGTGAGAGGGTGTATTCATTGCTCCAGAATATGC-3’，SEQ ID NO5；

扩增正向引物5’-TCATTGCTCCAGAATATGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3’，SEQ ID NO6；

(3)阳性对照模板：为含有禽流感H5N1病毒HA基因片段的转录产物；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.根据权利要求1所述的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的恒温扩增反应液中1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.根据权利要求1所述的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为含有长267bp的禽流感H5N1病毒HA基因序列，序列如下：GGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCTATCAATTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGAC，SEQ ID NO7。

4.根据权利要求1所述的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照通过下列步骤制备：

利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以禽流感H5N1病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物转录出目的的RNA片段，用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μl，-20℃保存。

5.一种应用权利要求1试剂盒的禽流感H5N1病毒恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤：

(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；

(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有禽流感H5N1病毒核酸。

6.根据权利要求5所述的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于：所述的反应液中两条外围引物为0.05μmol，两条探针为0.5μmol，两条交叉引物为0.5μmol，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液为0.4mmol，Bst DNA聚合酶为10U。

7.根据权利要求6所述的禽流感H5N1病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于：标本RNA4μl，总反应液16μl。

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