CN101864399A - 一株肠道病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株肠道病毒及其应用。该肠道病毒，其名称为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，保藏登记号为CGMCC №.3674。实验证明，本发明的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以后减毒疫苗的制备奠定了基础。

Description

一株肠道病毒及其应用

技术领域

本发明涉及一株肠道病毒及其应用。

背景技术

手足口病(Hand-Foot-mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，近年来多爆发与亚太地区的热带区域，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒EV71型(肠道病毒71，Enterovirus 71，简称EV-71)和A组的柯萨奇病毒(CoxA)、埃克病毒(Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常导致严重的神经系统综合症。EV-71是单股正链RNA病毒，分为A、B、C3个基因型，B1-B4及C1-C4共8个亚型。

该病以前虽有报道但多以散发病例出现，而09年在我国的安徽、河南和河北多个地区呈爆发流行，对婴幼儿健康造成了严重的危害。因此，了解该病毒的特性对该疾病的预防和治疗具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株肠道病毒及其应用。

本发明所提供的肠道病毒，是肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，它是20-30nm，圆形无囊膜的RNA病毒。

肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1已于2010年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №3674。

将分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在Vero细胞上增殖并测得病毒的滴度后进行动物实验，实验证明，本发明的肠道病毒EV71型(Enterovirus71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以后减毒疫苗的制备奠定了基础。

附图说明

图1为肠道病毒EV71型重庆分离株1感染Vero细胞的电镜结果(30000倍)

图2为肠道病毒EV71型重庆分离株1感染Vero细胞的电镜结果(39000倍)

图3为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1抗原片与手足口病患者血清1∶10的稀释液间接免疫荧光检测结果

图4为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1抗原片与手足口病患者血清1∶40的稀释液间接免疫荧光检测结果

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法.

实施例1、肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的获得

1、肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的分离

本发明的发明人采集经过临床鉴定为手足口病患者血清样品，然后进行病毒分离，病毒分离的方法是将样品直接接种于Vero细胞，当细胞病变达到95％时，收集病毒培养上清液，经过三轮的蚀斑纯化后挑取单斑，感染Vero细胞进行病毒的增殖收集细胞悬液，得到病毒液，最终，发明人从重庆采集的样品中分离得到一株EV-71型病毒命名为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1。随后进行了病毒特性及致病性的研究。

肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，已于2010年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC №.3674。

2、形态学特征：

将步骤1获得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞(Invitrogen公司)，具体增殖方法为待Vero细胞长满单层25cm²方瓶培养瓶瓶底时，先用移液管吸出细胞培养液，取2ml已经冻融3次的细胞悬液，1000rpm离心5-10min取上清加入到培养瓶中，封口后放入37℃、5％CO₂孵育2h，中间每个30min轻轻摇晃一次，2h后吸出吸附液，补加8ml新鲜的含有2％FBS的DMEM维持液(向500mlDMEM液体中加入10m胎牛血清、100X Antibiotic-Antimycotic、100X NEAA、100ulHEPES，之后用实验室配制的经过0.22um滤膜过滤除菌的7.5％(质量百分比)NaHCO₃调节溶液的pH值至7.0-7.2，上述液体均为GIBCO公司产品)，继续放入培养箱中培养，观察细胞，当细胞出现95％的病变时收获细胞。感染Vero细胞(Invitrogen公司)后，37℃培养48小时后离心收集细胞沉淀做超薄切片进行电镜观察，结果表明在细胞胞浆内可见20-30nm的圆形的病毒颗粒(图1和图2)。

3、理化性质：

核型实验：将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1病毒液(用肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞，当感染后的Vero细胞出现95％左右的病变时，先吸出原有的细胞培养液，用一次性细胞刮刮起瓶底的细胞，之后用原有的培养液悬浮细胞，反复冻融3次后，2000rpm离心5-10min，收集上清后分装即为病毒液)分为加药组和无药组两组，加药组的细胞维持液加入5溴-2脱尿苷，使其终溶度为50ug/ml，无药组不做任何处理，之后用含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液(向500mlDMEM液体中加入10ml胎牛血清、100XAntibiotic-Antimycotic、100X NEAA、100ul HEPES，之后用实验室配置的经过过滤除菌的7.5％NaHCO_{3(质量百分比)}调节溶液的pH值为7.0-7.2。上述液体均为GIBCO公司产品)进行10倍系列稀释(分别10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍稀释)。最后将各稀释液接种于铺满单层Vero细胞(Invitrogen公司)的96孔板中，每个稀释度接种4孔，0.2ml/孔，37℃培养24-72小时连续观察记录细胞生长情况。结果加药组和无药组均出现细胞病变，并且滴度均为10^-5，证明步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为RNA病毒。

耐乙醚实验：将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1病毒液(用肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞，当感染后的Vero细胞出现95％左右的病变时，先吸出原有的细胞培养液，用一次性细胞刮刮起瓶底的细胞，之后用原有的培养液悬浮细胞，反复冻融3次后，2000rpm离心5-10min，收集上清后分装即为病毒液)分为实验组和对照组两份，实验组用终浓度为20％(体积百分比)的乙醚溶液处理，对照组不做任何处理，封口后都放入4℃放置过夜后，次日放入生物安全柜中使乙醚完全挥发，用含有2％(体积百分比)胎牛血清的细胞维持液进行10倍系列(分别10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释)稀释，分别接种于铺满单层Vero细胞的96孔板中，每个稀释度分别接种个4孔，0.2ml/孔，24-72小时连续观察记录细胞生长情况。结果两组均出现明显的细胞病变，滴度均为10^-4，证明步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为无囊膜病毒。

4、血清学特征：

用步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞制备抗原片，抗原片制备的方法如下所述：

实验前准备：把抗原片摆放在抗原架上，每个架上排放2排，1排4个，完毕后用罩子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行：

1)待25cm²方瓶的Vero细胞生长至80％左右的时候，用实验病毒株2ml感染细胞1小时后，吸出吸附液，补加新鲜的细胞维持液，放入培养箱中培养；

2)当细胞出现细胞病变的时候(约25％-50％)，按照细胞传代的方法消化细胞，用适量体积的培养液(含有10％胎牛血清的DMEM细胞生长液，具体配方：向500mlDMEM液体中加入50ml胎牛血清、100X Antibiotic-Antimycotic、100X NEAA、100ulHEPES，之后用实验室配制的经过0.22um滤膜过滤除菌的7.5％(质量百分比)NaHCO₃调节溶液的pH值至7.0-7.2，上述液体均为GIBCO公司产品)；3ml)悬浮细胞，每个抗原孔加入40ul细胞悬液，盖上盖子后放入培养箱中继续培养8小时；

3)取一烧杯内盛PBS溶液(0.01mol/L pH＝7.2)，将吸附后的抗原片缓缓放入溶液中，浸泡1min左右，取出放在工作台内晾干，约需30min；

4)将抗原片放入盛有丙酮(国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度≥99.5％)的烧杯中，-20℃30min或者过夜；

5)取出晾干后保存于低温(-40℃以下)冰箱中备用。

间接免疫荧光法：用山东临床鉴定为手足口病恢复期患者的血清稀释液以及荧光标记的IgG抗体分别进行间接免疫荧光检测，于显微镜下观察并照相。

血清制备方法：经过山东省成武县医院临床鉴定为手足口病患者，采集其恢复期患者血液放置于37℃培养箱孵育30min，经800rpm离心15min后吸取上清得到。

用0.005M pH值为7.2的PBS配制2％(质量百分比)BSA(牛血清白蛋白)作为血清稀释液，血清在使用前56℃水浴灭活30min，之后将血清按照实验要求进行稀释后进行间接免疫荧光实验，具体实验步骤如下：

1)从冰箱中取出抗原片，肉眼观察上面的细胞是否脱落，如果有脱落孔，放弃不用；

2)在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈，防止所加样品溢流；

3)根据实验的需要稀释所检测的血清后加样，每孔20-25ul，一般需要做复孔，故需要50ul，根据需要做倍比稀释；

例：首浓度按照1∶10，故需要加入10ul血清+90ul抗体稀释液，在漩涡混合器上充分混匀后取出50ul 1∶10稀释液+50ul血清稀释液(1∶20)，依此稀释下去，一般稀释至1∶160；

4)把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中，放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

5)取出抗原片，放入洗板槽内，向里面加入洗涤液(0.005M PBS+0.02％_{(体积百分 比)}Tween 20)，在水平振荡器上洗涤5min，重复3次；

6)待抗原片完全风干后，加入1∶50稀释的荧光抗体25ul/孔，放入饭盒后在37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

荧光抗体的稀释：取出针对所加入血清来源的适量荧光抗体，用0.02％(质量百分比)伊文斯兰溶液按照1∶50稀释抗体，该实验所使用的抗体为FITC conjugate GoatAnti-Human IgG购自Sigma公司。

7)重复步骤5)；

8)风干后，滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。

结果见图3和图4，根据间接免疫荧光检测的原理，图中的绿色点表明了所检测人血清中的抗体可以与抗原片上吸附固定的病毒抗原发生特异性的反应，而且血清的效价可以达到1∶40。

5、病毒全基因组序列测定和同源性分析：

按照步骤2的方法将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞后收集细胞以及培养上清，用试剂盒提取总的RNA，按照反转录酶的说明书进行反转录。合成8对引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均为5’-3’方向)，具体如下：

F1：TTAAAACAGCTGTGGGTTG；R1：ACTTCCAGTACCATCCCTTG。

F2：ATGGTCGGCTATGGTGAGTG；R2：AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT。

F3：TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC；R3：ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT。

F4：ACCATTCATGTCACCTGCGA；R4：CTAGATACGACACATTCCCAAA。

F5：ATCAGCAAATTCATGGATTGGCT；R5：ATGACATACACTAGCGATACAAC。

F6：TGCTTGTCATGCAATCCATCGC；R6：TAGCAGGCTTCCTCCATACTCAT。

F7：ACTAAGCTAGAGCCCAGTGT；R7：TCACGACCAGATTTCTGGTG。

F8：GAAAAATTTGTGAGCACAAT；R8：GCTATTCTGGTTATAACAAAT。

之后按照上述合成的引物进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶纯化试剂盒回收，之后送往上海英俊公司测序，经DNAstar Seqman软件拼接为全序列。采用Blast、DNAstar、Meg Aligen程序、Clustal W软件以及MEGA 4.0软件，对EV-71病毒株进行同源性比对和核苷酸序列进化进行分析。结果表明8个片段经过拼接后组成基因组全长，约7422个碱基(不包含poly(A)尾，序列如序列表中序列1所示)。基因组编码区起于自序列表中序列1的5’端第744位核苷酸，止于自序列表中序列1的5’端第7326位，共6582个碱基。5’和3’端各有一段非编码区，长度分别为743nt和97nt。碱基统计结果表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量为48％。将测得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的VP1的全序列(序列如序列表中序列1的5′第2439-3329位核苷酸)与不同流行区和不同时间分离的多株EV-71型病毒相对应序列进行同源性比对，结果表明其与本实验室分离肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2同源性高达95.3％，与首都儿科研究所2007年分离的BJ4211株同源性高达95.4％(编码VP1蛋白的序列如序列表中序列2(GenBank：EU024958.1))，与EV-71标准株BrCr(序列表中序列3，编码VP₁蛋白的序列如序列表中序列3的5′第2439-3329位核苷酸(GenBank：U22521.1))在核苷酸和氨基酸的同源性分别为83.4％和95.3％，而与CoxA16(编码VP₁蛋白的序列如序列表中序列4(GenBank：AF177911.1))则分别为59.5％和64.2％。用Meg Aligen程序进行分析表明所分离的C₁V₁病毒株在进化上属于C₄基因亚型。

二、肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的致病性鉴定：

将步骤1分离的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在Vero细胞上大量增殖后，并在其上测定病毒的TCID₅₀，结果表明该病毒的滴度为1×10⁷。从北京军事医学科学院实验动物中心领取2日龄Balb/c乳鼠进行该分离株致病性研究。实验采取腹腔接种和脑内注射两种不同的接种方式，病毒的接种量为1000TCID₅₀，同时设立对照组接种PBS溶液，共4组(每组接种乳鼠1窝，平均8只，雌雄均有，各个剂量组腹腔注射100ul、脑内注射20ul)。连续观察小鼠结果表明，实验组小鼠在接种后第3-7天内出现体重稍微减轻、精神状态不佳外，与对照组小鼠无任何差异，连续观察21天，实验组小鼠无死亡。结果表明，分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以后减毒疫苗的制备提供了依据。

序列表

<160>1

 

<210>1

<211>7422

<212>DNA

<213>肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)

 

<400>1

ttaaaacagc ctgtgggttg caccccctcc cagggccccc tgggcgcaag ccctttggta     60

cctcggtacc tttgtgcgcc tgttttatac cccccccccc agtgaaactt agaagcagca    120

aaccacgatc aatagcaggc ataacgctcc agttatgtct tgatcaagca cttctgtttc    180

cccggaccga gtatcaatag actgctcgcg cggttgaagg agaaaacgtt cgttatccgg    240

ctaactactt cgggaaacct agtaacacca tgaaagttgc ggagagcttc gttcagcact    300

cccccagtgt agatcaggtc gatgagtcac cgcattcccc acgggcgacc gtggcggtgg    360

ctgcgttggc ggcctgccca tggggtaacc catggggcgc tctaatacgg acatggtgcg    420

aagagtctac tgagctagtt agcagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcccaactgc    480

ggagcacacg cccacaagcc agcgggtagt gtgtcgtaac gggcaactct gcagcggaac    540

cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt atctttatat tggctgctta tggtgacaat    600

taaagagttg ttaccatata gctattggat tggccatccg gtgtgtaaca gagcaattgt    660

ctacctattt attggtttcg taccattaac cttgaagtct gtgactaccc ttaattatat    720

cttgactctc aatacagcta aacatgggtt cgcaggtgtc tacacagcgc tccggttccc    780

acgaaaactc aaactcagcc actgagggtt ccaccataaa ctacaccacc attaattact    840

acaaagactc ttatgctgcc acagcaggta aacagagtct caagcaagat ccagacaagt    900

ttgcaaatcc tgttaaagac atctttactg aaatggcagc accactgaaa tccccatccg    960

ctgaggcatg tggatacagt gatcgagtgg cgcaattaac tattggcaat tccaccatca   1020

ccacgcaaga agcagctaac atcatagttg gttatggcga gtggccttcc tactgctcgg   1080

attctgacgc tacagcagtg gataaaccaa cgcgcccgga tgtttcagtg aacaggtttt   1140

acacattgga cactaaattg tgggagaaat cgtccaaggg ttggtactgg aagttcccgg   1200

atgtgttaac tgaaactggg gtttttgggc agaatgcaca attccactac ctctaccgat   1260

cagggttctg tattcacgtg cagtgcaatg ctagcaaatt ccaccaagga gcactcctag   1320

ttgctgtcct gccagagtac gtcattggga cagtggcggg cggtacaggg acggaagaca   1380

gtcacccccc ttacaagcag actcaacccg gcgccgatgg cttcgaattg caacacccgt    1440

acgtacttga tgctggcatc ccgatatcac agttaacagt gtgcccacac cagtggatta    1500

atttgaggac caacaattgt gctacaataa tagtgccata cattaacgca ctaccttttg    1560

actctgcttt gaaccactgt aacttcggcc tattagttgt gcccatcagc ccgctagatt    1620

acgaccaagg agcgacgcca gtaatcccta taactatcac attggcccca atgtgttctg    1680

aattcgcagg tcttaggcaa gcagtcacgc aagggtttcc caccgagctg aaacctggca    1740

caaatcaatt tttgaccact gatgatggcg tttcagcacc tattctacca aacttccacc    1800

ccaccccgtg catccatata cctggtgaag ttaggaactt gctagagtta tgtcaggtgg    1860

agaccatttt agaggtcaac aatgtgccca cgaatgccac tagcttaatg gagaggctgc    1920

gctttccggt ctcagcacaa gcagggaaag gcgagctgtg tgcggtgttc agagccgatc    1980

ctgggcgaaa tggaccgtgg cagtccacct tgctgggtca gctgtgcggg tactacaccc    2040

aatggtcagg atcattggaa gtcaccttca tgtttactgg atccttcatg gccaccggca    2100

agatgctcat agcctataca ccgccaggag gccctttgcc caaggaccgg gcgaccgcca    2160

tgttgggcac gcacgtcatc tgggactttg ggctgcaatc gtctgttacc cttgtaatac    2220

catggatcag caacactcac tacagagcgc atgcccgaga tggagtgttt gactactaca    2280

ccacagggtt agttagtata tggtaccaga caaattacgt ggttccaatt ggggcgccca    2340

atacagccta cataatagca ctagcggcag ctcaaaagaa cttcaccatg aagttgtgca    2400

aggatgctag tgatatcctg cagacgggca ccatccaggg agatagggtg gcagatgtaa    2460

ttgaaagttc cataggagat agtgtgagca gagccctcac ccaagctcta ccagcaccca    2520

caggccagaa cacacaagtg agcagtcatc gtctggatac aggtaaggtc ccagcactcc    2580

aagctgctga aattggagca tcatcaaatg ctagtgatga gagcatgatt gagacacgct    2640

gtgttcttaa ctcgcacagc acagctgaga ccactcttga tagtttcttc agcagagcgg    2700

gattagttgg ggagatagat ctccctctta aaggtacaac taacccaaat ggttatgcta    2760

actgggacat agatataaca ggttacgcgc aaatgcgtag aaaggtggag ctattcacct    2820

acatgcgctt tgatgcagag ttcacttttg ttgcatgcac acccaccggg gaagttgtcc    2880

cacaattgct ccaatatatg tttgtgccac ctggagcccc taagccagat tccagggaat    2940

ccctcgcatg gcaaactgcc accaacccct cagtttttgt caagctgtca gaccctccag    3000

cacaagtttc agtaccattt atgtcacctg cgagtgctta ccaatggttt tatgacggat    3060

atcccacatt cggggaacac aaacaggaga aagatcttga atatggggca tgtcctaaca    3120

atatgatggg cacgttctca gtgcggactg tggggacctc caagtccaag taccctttag    3180

tggttaggat atacatgaga atgaagcacg tcagggcatg gatacctcgc ccgatgcgca    3240

accagaatta cctgttcaaa gccaacccaa attatgctgg caactccatt aagccaactg    3300

gtaccagtcg cacagcgatc actactcttg gaaaatttgg gcaacagtct ggggccatat    3360

atgtgggtag ctttagagtg gtcaatcgtc atcttgccac tcacaatgat tgggcaaatc    3420

ttgtttggga agacagttct cgcgatttgc tcgtgtcatc caccaccgcc caaggttgtg    3480

acactattgc ccgttgcaat tgccagacag gggtgtacta ctgtaactcg aggagaaaac    3540

actacccagt cagtttttca aaacccagcc tgatctatgt agaggctagt gagtactatc    3600

cagctaggta ccagtcacat ctcatgctcg cacagggtca ctcagaacct ggtgattgcg    3660

gtggtatcct tagatgtcaa catggcgtcg tcggtatagt gtctactggt ggcaatgggc    3720

tcgttggctt tgcagatgtc agggacctct tgtggttgga tgaagaagct atggagcagg    3780

gcgtgtccga ctacattaag ggtctcggag atgctttcgg gacaggcttc actgatgcag    3840

tctcaaggga ggttgaagct ctcaaaaact atcttatagg atccgaagga gcagttgaga    3900

aagttttaaa aaatcttatt aaactaatct ctgcactggt gattgtaatc aggagtgatt    3960

acgacatggt cacccttact gcaaccttag cgctgatagg ttgtcatggc agtccttggg    4020

cttggattaa agccaaaaca gcttccatct taggtatccc tatcgctcaa aagcaaagcg    4080

cttcctggct caagaaattc aatgacatgg ccaacgctgc taaggggtta gagtgggttt    4140

ccaataaaat cagcaaattc attgattggc ttaaggagaa aatagtacca gcagccaagg    4200

agaaagttga attcctgaac aacttgaaac agttgccatt gctagaaaat cagatctcaa    4260

acttggaaca atctgccgct tcacaagagg accttgaagt catgtttggg aatgtgtcgt    4320

atctagccca cttctgtcgc aagttccagc cgctatacgc cacggaagcc aaaagagttt    4380

atgccctgga gaagagaatg aataactata tgcagttcaa gagcaaacac cgaattgaac    4440

ctgtatgtct cattgttagg ggctcaccag gcactgggaa gtctctagcc acaggtatca    4500

tcgctcgagc aatcgccgat aagtaccact ccagcgtgta ctcgcttcca ccagacccag    4560

atcatttcga tggttacaag caacaggtgg ttacagtgat ggatgacttg tgtcaaaacc    4620

ccgacggcaa ggatatgtct ctattctgtc aaatggtgtc caccgtagac ttcatcccac    4680

caatggcttc tcttgaggag aagggagtct ccttcacctc taagtttgtt atcgcatcta    4740

ctaatgccag taacatcata gtgccaacag tgtctgactc tgacgctatt cgccgcaggt    4800

tctacatgga ttgtgacatt gaggtgacag attcgtacaa aacagatcta ggtagactgg    4860

atgcagggcg agccgccaaa ctgtgctctg aaaacaacac tgcaaatttc aaacgttgca    4920

gcccattagt gtgtgggaaa gctatccaac ttagggatag gaagtctaaa gttagataca    4980

gtgtggatac ggtagtttca gaacttatta gggagtacag caacagatcc gccattggca    5040

acacaatcga ggctcttttc caaggtccac ccaagttcag gccaatcagg attagccttg    5100

aagagaaacc agctccagat gctattagcg atctccttgc tagtgtagat agtgaagaag    5160

tgcgccaata ctgcagggat caaggctgga tcattcctga aactcccacc aacgtagagc    5220

ggcaccttaa tagagcagtg cttgtcatgc aatccatcgc cacaatagtg gcggttgtct    5280

cgttggtgta tgtcatctac aagctctttg cagggtttca gggtgcgtat tctggtgctc    5340

ctaggcaagt gcttaagaaa cctgctcttc gcacagcaac agtgcagggc ccgagtcttg    5400

attttgccct ctccctgttg aggaggaacg ttaggcaagt ccaaacagat caggggcatt    5460

ttaccatgtt gggtgttagg gatcgtttag cagtcctccc acgtcactca caacccggca    5520

aaactatttg gattgagcac aaactcgtga atatccttga tgcagttgaa ttggtggatg    5580

agcaaggagt caacttggag ttaaccctca tcactcttga cacgaacgaa aagtttaggg    5640

atatcaccaa attcatccca gaaaatatta gcactgccag tgatgccacc ctagtgatca    5700

acacggagca catgccctca atgtttatcc cggtgggtga tgttgtacag tatggcttct    5760

tgaatcttag tggtaagcct acccatcgca ccatgatgta caactttcct actaaagcag    5820

gtcagtgtgg aggagtggtg acatctgttg ggaaggttat cggcatccac attggtggca    5880

atggtagaca aggtttttgc gcaggcctca aaagaagtta ttttgctagt gaacaaggag    5940

agatccagtg ggttaagccc aataaagaaa ctggaagact caacatcaat ggaccaaccc    6000

gcaccaagtt agaacccagt gtattccatg atgtcttcga gggaaataag gaaccagctg    6060

ttttgcacgg caaagatccc cgactcgagg tagaatttga gcaggccctg ttctctaaat    6120

atgtgggaaa cacactatat gaacctgacg agtacatcaa agaggcagcc cttcattatg    6180

caaatcagtt aaagcaacta gaaattaata cttctcaaat gagcatggag gaggcttgct    6240

acggtactga gaatcttgag gctattgatc ttcatactag tgcaggttac ccctatagtg    6300

ccctggggat aaagaagaga gacatcttag accctaccac cagggacgtg agtaaaatga    6360

agttctacat ggacaaatat ggccttgatc tcccttactc cacttatgtt aaggatgagc    6420

tgcgctcaat tgataaaatc aagaaaggga agtcccgtct gattgaggcc agtagtttaa    6480

atgattcagt gtacctcaga atgacttttg gtcacttgta tgagactttc cacgcgaatc    6540

ctgggacgat aactggatca gccgtggggt gcaaccctga cacattctgg agtaagctgc    6600

caatcttact ccctggttca ctctttgcct ttgactactc aggttatgat gctagcctta    6660

gccctgtctg gttcagagca ttagaattgg tccttaggga gatagggtat agtgaaggag    6720

caatctcact cattgaggga atcaaccaca cacaccatgt gtatcgtaat aagacctatt    6780

gtgtgcttgg tgggatgccc tcaggctgtt cgggaacgtc cattttcaac tcaatgatta    6840

acaacattat tatcagggca ctgctcataa aaacatttaa gggcattgat ctggatgaac    6900

tcaacatggt cgcttatgga gatgatgtgc tcgctagtta ccccttccca attgattgtt    6960

tggagttagc aaagactggt aaggagtatg gtctaaccat gactcctgca gataagtctc    7020

cttgcttcaa tgaagtcaat tggggtaacg cgaccttcct caagaggggc tttttacccg    7080

atgaacagtt tccatttttg atccacccca ctatgccaat gagggagatc catgagtcca    7140

ttcgatggac caaggacgca cgaaacactc aagatcatgt acgatccttg tgccttctag    7200

cgtggcataa tggtaagcaa gaatatgaga aatttgtgag cacaattagg tctgtcccag    7260

taggaagagc attggctatc ccaaattatg aaaatcttag acgcaattgg ctcgagttgt    7320

tttagaggct acacacacct caaccccacc agaaatctgg tcatgaatat gactggtggg  7380

ggtaaatttg ttataaccag aatagcaaaa aaaaaaaaaa aa                     7422

<210>2

<211>891

<212>DNA

<213>肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)

 

<400>2

 

ggagataggg tggcagatgt aattgaaagt tccataggag atagcgtgag cagagccctc     60

actcaagctc taccagcacc cacaggccag aacacacagg tgagcagtca tcgattggat    120

acaggcaagg ttccagcact ccaagctgcc gaaattggtg catcatcaaa tgctagtgac    180

gagagcatga ttgagacacg ctgcgttctt aactcgcaca gcacagctga gaccactctt    240

gatagtttct tcagcagagc gggattagtt ggagaggtag atctccctct tgaaggcaca    300

actaacccaa atggttatgc caactgggac atagatataa caggttacgc gcaaatgcgt    360

agaaaggtgg agctattcac ctacatgcgc tttgatgcag agttcacttt tgtagcgtgc    420

acacccaccg gggaagttgt cccacaactg ctccaatata tgtttgtgcc acctggagcc    480

cctaagccag attccaggga atctcttgca tggcaaaccg ccactaaccc ctcagttttt    540

gtcaagctgt cagaccctcc agcacaggtt tcagtaccat tcatgtcacc tgcgagtgct    600

taccaatggt tttatgacgg atatcccaca ttcggagaac ataaacagga gaaagatctt    660

gagtatggag catgtcctaa taacatgatg ggcacgttct cagtgcggac tgtagggacc    720

tccaagtcca agtacccttt agtggtcagg atttacatga gaatgaagca cgtcagggcg    780

tggatacctc gcccgatgcg taaccaaaac tacctattca aagccaaccc aaattatgct    840

ggcaactcca ttaagccaac tggtgccagt cgcacagcga tcaccactct t             891

<210>3

<211>7408

<212>DNA

<213>肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)

 

<400>3

ttaaaacagc tgtgggttgt cacccaccca cagggtccac tgggcgctag tacactggta     60

tctcggtacc tttgtacgcc tgttttatac cccctccctg atttgcaact tagaagcaac    120

gcaaaccaga tcaatagtag gtgtgacata ccagtcgcat cttgatcaag cacttctgta    180

tccccggacc gagtatcaat agactgtgca cacggttgaa ggagaaaacg tccgttaccc     240

ggctaactac ttcgagaagc ctagtaacgc cattgaagtt gcagagtgtt tcgctcagca     300

ctccccccgt gtagatcagg tcgatgagtc accgcattcc ccacgggcga ccgtggcggt     360

ggctgcgttg gcggcctgcc tatggggtaa cccataggac gctctaatac ggacatggcg     420

tgaagagtct attgagctag ttagtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcctaact     480

gcggagcaca tacccttaat ccaaagggca gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga     540

accgactact ttgggtgtcc gtgtttcttt ttattcttgt attggctgct tatggtgaca     600

attaaagaat tgttaccata tagctattgg attggccatc cagtgtcaaa cagagctatt     660

gtatatctct ttgttggatt cacacctctc actcttgaaa cgttacacac cctcaattac     720

attatactgc tgaacacgaa gcgatgggct cccaggtctc cacacagcga tccggctcgc     780

atgagaattc caactcagcc acggaaggct ccactataaa ttacacaacc attaattact     840

acaaagactc gtatgctgcc actgctggaa agcaaagtct caaacaagat cctgacaagt     900

ttgcgaaccc tgtgaaggac atctttactg aaatggcagc gcccttaaag tctccctctg     960

ctgaagcatg tggctatagc gaccgagtgg cacagcttac cattggaaat tccaccatta    1020

ctacacaaga agcagcaaac ataatagttg ggtatggtga gtggccttca tactgctctg    1080

ataatgatgc aacagcggta gacaaaccta cacggcctga tgtctcagta aatagatttt    1140

acacgctaga cactaagcta tgggagaaat catccaaggg gtggtactgg aagttcccag    1200

atgtactgac tgaaaccgga gtttttggtc caaatgcaca atttcactac ttataccgtt    1260

cagggttctg catccacgtt caatgtaacg ctagcaaatt tcaccaaggg gcgctactcg    1320

ttgcggtatt gcccgagtat gtcattggaa cagtggcagg cggcacaggc acagagaaca    1380

gtcaccctcc ttataaacaa acccaacccg gcgctgatgg atttgaatta caacatccat    1440

atgttcttga tgctggaatt ccaatatctc agttgacagt gtgccctcac cagtggatca    1500

atttacgaac caacaattgt gccaccataa tagtgccata catgaacaca ctaccttttg    1560

attccgcatt gaaccactgt aatttcggac tattggtggt gcctatcagc ccgctggatt    1620

tcgaccaagg ggcgacaccg gtaattccta tcactatcac gttggctccg atgtgttctg    1680

agtttgcggg tctcaggcag gcagttacgc agggttttcc cactgaattg aaacctggca    1740

ctaatcagtt cttaaccacg gatgatggtg tgtcagcacc tatattgcca aatttccacc    1800

ccaccccgtg cattcacata cctggcgagg ttagaaactt actagaactg tgccaggtag    1860

aaaccatttt agaagtcaac aatgtgccca ccaacgcaac cagtttgatg gaaaggctac    1920

ggtttccagt gtcagcccaa gcagggaaag gtgagttgtg tgcagtgttc agggccgacc    1980

ctgggaggga tggtccttgg caatccacca tgctaggcca gttgtgtgga tattacaccc    2040

aatggtcagg gtctttggaa gtcactttta tgttcaccgg atcctttatg gcaactggta    2100

aaatgcttat agcttacaca cccccagggg gccctttgcc taaagataga gccacagcta    2160

tgctggggac gcacgtcatc tgggactttg gcttgcaatc gtccgtcacc ctcgtcatac    2220

catggatcag taacactcac tatagggcgc atgctcgaga tggggtgttt gattactaca    2280

ccacaggttt ggttagtata tggtaccaaa caaattatgt agtccctatt ggagcaccta    2340

atactgccta tataatagcg ttggcagcag cccaaaagaa tttcactatg aaattgtgca    2400

aggacaccag tgacattttg gaaacggcca ctattcaagg ggacagagtg gcagatgtga    2460

ttgagagctc tataggagat agtgtgagta aggccctcac cccagcttta cctgcaccca    2520

caggcccaga cacccaagtg agcagtcatc gcttagacac tggaaaagta ccagcacttc    2580

aagccgccga aatcggagct tcgtcgaatg ctagtgatga gagtatgatt gagactcggt    2640

gtgttcttaa ctcacatagc acagctgaaa ccacccttga tagtttcttc agcagagcag    2700

gcttagttgg ggagatagat cttcctctaa agggcaccac caatccgaac gggtatgcca    2760

actgggacat agacataacc ggttatgcgc agatgcgcag aaaagtggaa ctattcacct    2820

atatgcgctt tgacgcagag ttcacttttg tcgcgtgcac acctaccgga agggtcgttc    2880

cacagctgct tcaatacatg tttgttccac ccggggcccc caaaccagac tccagagact    2940

ctttggcttg gccaacggcc acgaacccct cagtttttgt caaatcatcc gacccaccag    3000

cacaagtctc agtgccattt atgtcacctg caagcgcata ccaatggttt tatgacggat    3060

accctacatt tggagagcac aagcaagaga aggatctcga gtatggggca tgcccgaata    3120

acatgatggg cacattctca gtgcggactg tgggatcgtc aaagtcagaa tattccttag    3180

tcatcagaat atacatgaga atgaagcacg tcagagcgtg gatacctcgg ccgatgcgca    3240

atcagaacta tttgttcaaa tccaacccaa actatgctgg tgattccatt aaaccaactg    3300

gtaccagccg aacggcaatc actacgctcg ggaaattcgg tcagcagtct ggggctattt    3360

atgtgggcaa ctttagggta gtaaacagac acctagccac ccatactgac tgggccaact    3420

tggtgtggga agacagctct agagacctcc tagtttcttc aactaccgct caagggtgtg    3480

acaccattgc tcgatgtaac tgccaaaccg gagtgtatta ctgtaactct cgcagaaaac    3540

actatccagt cagtttttcg aaacctagtt tggtgtttgt agaagctagt gagtattatc    3600

cagctagata tcagtcccat cttatgcttg ctgagggcca ttcagaacct ggtgattgtg    3660

gcggtattct tagatgccaa cacggtgtgg tgggaattgt ctccactggc ggaagtggcc    3720

ttgtgggatt tgctgacgtt agagatcttc tgtggctaga tgaggaagcg atggagcagg    3780

gggtatctga ttacatcaaa ggtctcggtc gagccttcgg cacaggtttc actgacgcag    3840

tgtctaggga agtggaagcg ttgaagaacc acttaatcgg ctccgaaggg gctgttgaga    3900

agatcttgaa gaacttggtg aagctaattt cagccttagt tatagtcatc agaagtgatt    3960

atgatatggt caccctcaca gccacactag ctctgatcgg gtgccacggg agtccttggg    4020

cgtggatcaa atcaaagaca gcttccatac tgggcattcc catggcacaa aaacagagtg    4080

cctcatggct aaagaagttc aatgacatgg caaatgctgc aaaagggctt gagtggattt    4140

tcaacaagat cagtaagttc attgactggc ttaaagagaa gatcattcca gctgccaaag    4200

agaaagttga gtttttgaac aacctaaaac agctcccctt gttggagaac caagtctcca    4260

atcttgaaca gtctgctgcc tcacaagaag acttagaagc tatgtttggt aatgtgatat    4320

atctggctca cttttgccgc aaattccaac cactctacgc aactgaggcc aagagagtct    4380

acgctttaga gaaaaggatg aataactaca tgcagttcaa gagcaaacac cgtattgaac    4440

ctgtatgctt gatcatcaga ggttcccccg gaacgggcaa atcgctcgcc acaggcatta    4500

tagctagagc cattgctgac aagtatcgct ctagtgtata ctcactcccc ccagacccag    4560

atcactttga tgggtataag caacaggtgg tcgcggtcat ggatgatctc tgccagaacc    4620

cggacggaaa agacatgtcc ctattttgtc aaatggtttc tacagtagat tttgtaccac    4680

ccatggcatc actagaggag aaaggagtgt ccttcacctc taagtttgtc attgcatcga    4740

ccaatgctag taacatcata gtccccacag tttcagattc agatgcaatt cgcaggcgat    4800

tctatatgga ctgcgatata gaagtgacag attcttacaa gacagacctc ggtcggctgg    4860

acgcaggtag agctgccaag ctttgtacag aaaataacac tgctaatttt aagagatgca    4920

gcccactggt gtgtggtaag gctattcagc tgagagacag gaagtccaaa gtgagatata    4980

gcgtcgacac cgtggtatcg gaactgatca gagagtacaa caatagatct gctattggga    5040

atactataga agcactcttt caaggacccc ctaaattcag gcctataaga attagtctcg    5100

aagaaaagcc agccccagat gccattagcg atctcctcgc tagtgtagat agcgaggagg    5160

tgcgtcagta ctgcagggaa caaggctgga tcatccctga aactcccacc aatgttgagc    5220

gtcacctcaa tagagcagta ttggtaatgc agtccatcgc cactgtggtt gcagttgtgt    5280

ctcttgttta tgtcatttat aagctgtttg ccgggttcca gggtgcttac tctggagcgc    5340

ccaagcccat tctcaagaag cccgtgttaa gaacagccac ggtccaaggg cccagcttag    5400

acttcgcctt gtctcttttg aggcgcaaca ttagacaagc gcaaactgac caaggacact    5460

tcaccatgct aggagtgcga gatcgcctag ccatcctgcc gcgccactcg caaccaggga    5520

agaccatctg ggtagagcat aaattaatca atgtactaga tgcagttgag ttggtggatg    5580

agcaaggtgt aaacttggaa ctcacactgg taactttgga caccaatgaa aaatttaggg    5640

atatcaccaa gtgtatccca gaagtgatca ccggggcgag tgacgcaact ctagtcatca    5700

acactgagca cattccctca atgtttgtgc cggtgggtga cgttgtgcag tacggtttct    5760

tgaaccttag tggtaaaccc acacacagaa ccatgatgta taacttcccc acgaagccag    5820

gacagtgtgg gggggtggtt acctcagttg gtaagatcat tggaatccac attggcggga    5880

atggacgcca ggccttttgc gctggcctaa agaggagtta ttttgccagc gagcaaggag    5940

agatccagtg gatgaagcct aacagagaaa ccgggaggtt gaatattaat ggtccaaccc    6000

gaactaagct ggaacccagt gtattccatg atgtgttcga gggcaacaag gaaccagcgg    6060

tcctgactag taaggacccc agacttgagg ttgattttga gcaagctttg ttctccaagt    6120

atgtgggtaa caccctgcat gaacctgatg agtacgtgac acaggctgct ctccactacg  6180

caaatcagct gaagcaactg gacatcaaca ccagcaagat gagcatggaa gaagcgtgct  6240

atggcacaga atatttagaa gctatagact tgcacaccag tgctggatac ccttatagtg  6300

ctttgggcat caagaaaaga gacatcctcg acccagttac cagagacacc tccaggatga  6360

agttatatat ggataagtat gggttggact tgcctaattc cacttatgta aaggatgagc  6420

ttagttctct agataagatc agaaaagggg agtctcgcct gattgaggct agcagcttaa  6480

atgatcctgt ctaccctaga ttgacttttg gacaccttta tgaagtgttt cacgccaacc  6540

cagggactgt aacaggatct gcagttgggt gcaaccctga tgtattttgg agcaagttac  6600

caattttgtt accgggttca ctctttgcat ttgactactc aggatatgat gcaagcctta  6660

gtcctgtgtg gttcagagct ctagagttgg ttctgagaga gatcggttac tcggaggagg  6720

ctgtgtcact catagaaggg atcaatcaca cccaccacgt gtaccgaaac aagacatatt  6780

gtgtacttgg tggaatgccc tcaggctgct ccggtacttc cattttcaat tccatgatta  6840

acaacataat catcagaacc ctcctgatta aaacattcaa aggtatagac ttagatgagc  6900

tgaaaatggt agcttatgga gatgacgtgt tggccagcta cccgtttcct attgattgct  6960

tggaatgggg taaaacaggc aaagaatatg ggctgactat gactcctgct gataaatcac  7020

cttgtttcaa tgaggttacc tgggagaatg caaccttctt aaaacggggt tttctaccgg  7080

accatcagtt cccttttctg atccatccca ctatgcccat gagggaaatc catgagtcca  7140

tccgctggac caaggacgcg cgcaatactc aagatcatgt gcgctccctt tgtctcctgg  7200

catggcataa tggaaaagag gagtatgaga aatttgtgag tacaattaga tcagtcccca  7260

ttggaagggc tttagcaatt ccaaatttgg agaacttgag aagaaattgg ctcgagttat  7320

tttaaactta cagctcaatg ctgaacccca ccagaaatct ggtcgtgtca atgactggtg  7380

ggggtaaatt tgttataacc agaatagc                                     7408

 

<210>4

<211>459

<212>DNA

<213>肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)

 

<400>4

tgggcctccc ggtgtctaac agagctattg tttacctatt cgtgggatac gtccctctta     60

atctcgaagc cattcaaaat cttgactata tattgctcct caactgtagg aaatggggtc    120

acaagtcgcc acccagcgat ccgggtcaca tgagaactca aactccgcat cggagggttc    180

gactataaat tacacaacta taaactacta caaggatgca tacgctgcaa gtgcggggcg    240

ccaggatatg tcccaagacc cgaagaaatt tactgaccct gtcatggacg ttatacatga    300

gatggctcca ccgctcaagt ctccaagcgc tgaggcatgc ggttatagtg atcgtgtggc    360

tcagcttacc attgggaact ctaccatcac gacacaggaa gcagctaaca tagttatagc    420

ctatggggag tggcctgagt actgctcaga tacagatgc                           459

Claims (2)

1.一株肠道病毒，其名称为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，保藏登记号为CGMCC №.3674。

2.权利要求1所述的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在制备手足口病减毒疫苗中的应用。

Images