CN101862457A

CN101862457A - 一种可降解高分子载体药物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101862457A
Application number: CN201010199982A
Authority: CN
Inventors: 关燕清; 刘俊明
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-06-11
Also published as: CN101862457B

Abstract

本发明公开了一种高分子载体药物及其制备方法和应用。本发明所述药物是TNF-α和IFN-γ，所述高分子载体为可降解生物材料。本发明高分子载体药物是通过将TNF-α和IFN-γ光固定化到可降解生物材料上，对其进行表面修饰得到的。本发明高分子载体药物所用的基材是生物塑料，无毒无刺激性，具有良好的生物相容性，可生物分解吸收，强度高，可塑性好，易于加工成型，制备成药物后可以使TNF-α和IFN-γ的药效更加持久有效，用于制备治疗卵巢癌的药物时，治疗效果好，毒副作用小，适于在医疗中广泛应用。

Description

一种可降解高分子载体药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及将药物固定在可降解材料上用于制备治疗疾病的药物领域，具体涉及一种可降解高分子载体药物及其制备方法和应用。

背景技术

卵巢癌是妇科三大肿瘤之一(宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌)，近20年发病率以每年0.1％的速度增长，女性一生中患卵巢癌的危险为1.5％。因卵巢位于盆腔深部，卵巢癌患者多无明显症状，察觉时已是晚期，很少能得到早期治疗。

一般早期卵巢癌患者5年存活率为67.7～82.3％，晚期患5年存活率为8.0～22.7％，13周的存活率仅为6.0～12.9％。晚期卵巢癌恶性程度高，复发率为40～60％，预后差。是目前威胁妇女生命最严重恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤首位(Banerjee and Gore.The Future of Targeted Therapies in Ovarian Cancer[J].Oncologist，2009；14：706-716.；Cannistra SA.Cancer of the ovary[J].N Engl J Med，2004；351：2519-29.；Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics [J].CA Cancer J Clin，2006；56：106-130.)。

卵巢癌的治疗原则是手术为主，加用化疗、放疗的综合治疗。多年的研究证明，卵巢癌患者的生存率难以进一步提高其主要原因是手术只是切除了肉眼可见的病灶而不能切除隐性转移灶。因此有效的化疗药物是消灭隐性灶的重要手段(杨国宏，穆寅东，刘志新，等.卵巢癌治疗的进展[J].牡丹江医学院学报，2007，(4).；崔恒.卵巢癌的诊治及其研究策略[J].中国妇产科临床杂志，2006，(5).；高永良.早期卵巢癌治疗进展[J].实用肿瘤杂志，2008，(4).)。

化疗药物，有时称为细胞毒药物，可杀灭肿瘤细胞。但在治疗中，患者普遍有明显的恶心呕吐等副作用，毒副作用持久，给病人带来极大的生理上和心理上的痛苦。同时，放射疗法则需要一些特殊设备，毒副作用持久，甚至终生存在，近年来手术后辅以放疗的已不多。

目前比较推崇生物疗法。而在生物疗法当中，重组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，重组干扰素-γ(IFN-γ)是治疗肿瘤的两种主要细胞因子。

干扰素-γ(IFN-γ)是在病毒感染后机体细胞产生的一种抗病毒的糖蛋白，是广谱抗病毒物质，它以诱导方式在细胞内抗RNA或DNA病毒(Hardy，Owczarek，Jermiin，et al.Characterization of the type I interferon locus and identification of novelgenes[J].Genomics，2004，84：331-345.)。它本身无毒性，也不影响正常细胞功能，可抗分裂(Hu R，Bekisz J，Schmeisser H，et al.Human IFN-γprotein engineering：the amino acid residues at positions 86 and 90 are important for ant proliferative activity[J].Immuno，2001，167：1482-1489.)，抗肿瘤(Ikeda H，Chamoto K，Tsuji T，et al.The critical role of type-1 innate and acquired immunity in tumor immunotherapy[J].Cancer Sci.，2004，95：697-703.)，临床可用于肿瘤的辅助治疗。然而，干扰素的毒副作用发生率比较高，最常见的是发热及流感样综合征，患者体重减轻、脱发、情绪激动，骨髓抑制致血细胞、血小板减少，轻度贫血，偶可发生神经系统损伤，影响内分泌系统功能，亦有产生干扰素抗体者。瑞典斯德哥尔摩的Karolinska医院(曾学清，段功香，蒋湘莲.干扰素在抗肿瘤方面的应用[J].中国生化药物杂志，2003，(4).)用IFN治疗癌症。根据他们的结果，将IFN对各种恶性肿瘤的疗效分疗效较高组，疗效中等组，疗效较低组，其中疗效较低组主要包括恶性黑色素瘤、卵巢瘤、结肠直肠癌等，在这一组中最高疗效不超过20％。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是1975年Carswell等发现的一种能直接杀伤肿瘤细胞的糖蛋白，主要由活化的单核一巨噬细胞和T淋巴细胞产生。由前者产生的肿瘤坏死因子-α，后者产生的为肿瘤坏死因子-β。二者的作用和结构大同小异。由于它能杀死恶性肿瘤细胞，科学家们对其产生和生物学作用进行了大量的研究。现已能用基因工程方法进行大量生产。适量的TNF-α可调节机体的免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵制各种致病因子具有重要意义(石裕明，何南详.肿瘤坏死因子介导肝细胞凋亡的研究进展[J].国外医学，1996，23(6)：266-267.)。肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)或称凋亡素配体(Apo.ZL)，是肿瘤坏死因子家族中的新成员。TRAIL以其选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而豁免正常细胞的特性，成为近年来研究的热点，并将为肿瘤的治疗带来新的契机。现研究发现不同的肿瘤细胞对TRAIL的敏感性不同，一些化疗药物可以逆转TRAIL细胞抵抗为TRAIL细胞敏感，从而克服肿瘤细胞耐药。并且TRAIL只引起肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无毒副作用(杨华.耐药性卵巢癌的耐药机制及治疗的研究进展[D].郑州大学，2006.)。因此将TRAIL和化疗药物联合具有很好的临床应用价值。

已有研究支持TNF和IFN两者共同使用，抗肿瘤的效果明显增强。1985年Aggarwal(Aggawal BB，Eessalu TE，Hass PE.Characterization of receptors for human tumor necrosis factor and their regulaion by r-interferon[J].Nature，1985，318，663.)等首次在Nature上报道了TNF和IFN两者的协同作用，他们的研究发现，TNF能够抑制本身受体的表达，而IFN能在不影响亲和常数的情况下，使TNF受体的表达增加2～3倍，从而提高对肿瘤的抑制作用。IFN能够增强和激活激活TNF(Belkacemi，Ynergistic L.stimulation of uridine phosphorylase expression in EMT6 breast cancer cells by TNF-α and IFN-γ[J].Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46.)。Neeraj(Neeraj K.Synergistic therapeutic activity of chimeric G250-TNF and IFN-γ for the treatment of renal cell cancer[J].Journal of Clinical Oncology，2008：16009.)研究表明低剂量IFN能够增强TNF抗肿瘤的活性且无明显副毒作用。在临床应用上，高效治疗和高毒副作用之间的矛盾成为临床应用的严重阻碍。因此，如何减低用药剂量，减少毒副作用，提高治疗效果是解决问题的关键。

我们实验室较早的对于子宫颈癌的研究表明，游离TNF-α/IFN-γ比共固定TNF-α/IFN-γ发挥药效稍快，但随着时间的增加，共固定化TNF-α/IFN-γ的药效比游离的TNF-α/IFN-γ更好、更持久有效(孙瑞芳，方泽钦，关燕清.Fas基因在共固定化细胞因子TNF-α/IFN-γ诱导HeLa细胞凋亡中的表达[J].生物医学工程学杂志，2009，(3).；Guan YQ，He LM，Cai SM，et al.Anti-cervix-cancer Effect of the Co-immobilized Tumor Necrosis Factor-α and Interferon-r[J].Journal of Materials Science&technology，2006，22(02)：200-204.)。

目前，由于载体药物可以通过剂型改变，控制药物释放速度，避免间歇给药使血药浓度呈波形变化，从而使释放到体内的药物浓度比较稳定(翟颐华，邹国林.高分子聚合物在药物上的应用[J].中国生化药物杂志，1996，17(6)：51-59.；关燕清，邱李莉.高分子药物研究进展[J].华南师范大学学报(自然科学版)，2005(2)：126-135.)，还可以通过释放体系使药物送达到体内特定部位，而对身体的其它部位不起作用，具有缓释、长效优势，已成为新型药物的发展方向之一。

利用光化学固定法可以将各种多肽、酶、生长因子、蛋白质等接枝到生物医用高分子材料表面，制备出具有各种活性、各种用途的的生物材料(Matsuda T.Sugawara T.Photochemical protein fixation on polymer surfaces via derivatized phenyl azido group[J].Langmuir，1995，11：2272-2276.)。

聚乳酸及其共聚物(Julia S，Uwe G，Roger T，et al.Controlled release of gentamicin from calcium phosphate-poly lactic acid-co-glycolic acid)composite bone cement[J].Biomaterials，2006，27：4239-4249.；Franziska G，Simone F，Jochen R，et al.Emulsion-based synthesis of PLGA-microspheres for the in vitro expansion of porcine chondrocytes[J].Biomolecular Engineering，2007：1-6.；Minuth，Strehl，Schumacher R，et al.TissueEngineering-Von der Zellbiologie zum kunstlichen Gewebe[J].Wiley-VCH，EWeinhein，pp，2003：179-181.)是生物塑料，无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性，可生物分解吸收，强度高，不污染环境，可塑性好，易于加工成型。

发明内容

本发明的目的在于根据现有载体药物中存在的不易降解，对人体的副作用较大的问题，提供一种以可降解生物材料为基底的可降解高分子载体药物。

本发明另一目的在于提供上述可降解高分子载体药物的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述可降解高分子载体药物的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明可降解高分子载体药物，是将药物固定在高分子载体上，所述药物是TNF-α和IFN-γ，所述可降解高分子载体为可降解生物材料。

上述可降解可降解生物材料优选为聚乳酸或其共聚物，最优选为聚乳酸-乙醇酸共聚薄膜(PLGA)、外消旋聚乳酸薄膜(PDLLA)或聚乙二醇-聚乳酸共聚薄膜(PLGA-PEG-PLGA)。由于外消旋聚乳酸PDLLA优良的生物相容性，其降解产物能参与人体代谢，已被美国食品医药局(FDA)批准，可用作医用手术缝合线、注射用胶囊、微球及埋植剂等。生物可降解材料PLGA有良好的生物相容性和安全性，在体内降解为二氧化碳和水，故常用于制备注射微球制剂。PLGA还可以通过改变自身共聚物中乳酸LA与羟基乙酸GA的比例很容易地改变共聚物材料PLGA降解速率，使其降解时间满足所包埋药物的要求。聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PLGA-PEG-PLGA)是无定型聚合物，比聚乳酸具有更大的亲水性，可用于药物缓释载体和组织工程细胞培支架。可降解高分子材料聚乳酸-乙醇酸共聚薄膜(PLGA)、外消旋聚乳酸薄膜(PDLLA)、聚乙二醇-聚乳酸共聚薄膜(PLGA-PEG-PLGA)三种生物材料的结构如下所示：

PDLLA PLGA

PLGA-PEG-PLGA

本发明可降解高分子载体药物的制备方法包括如下步骤：(1)将TNF-α和IFN-γ分别加入到N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液中，冰浴条件下搅拌反应，反应结束后用超滤膜纯化，冷冻干燥，此时的TNF-α和IFN-γ具有光活性；(2)将光活性TNF-α和IFN-γ嫁到可降解生物材料薄膜上，经干燥后，紫外光照射，将药物固定在薄膜上；(3)用PBS溶液洗涤薄膜，得到可降解高分子载体药物。

作为一种优选方案，步骤(1)中，所述TNF-α、IFN-γ和N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶100。

作为一种优选方案，步骤(1)中所述冰浴的温度为0～10℃，反应时间为24～96h。

作为一种优选方案，步骤(2)中所述干燥的温度为0～10℃。

作为一种优选方案，步骤(2)中所述紫外光照射是15～120W的紫外光于2～15cm处照射15s～30min。

作为一种优选方案，步骤(3)中所述PBS溶液的pH为7.4，洗涤次数为20次以上。

本发明可降解高分子载体药物对卵巢癌细胞OVCAR-3的周期阻滞具有材料特异性，可以诱导OVCAR-3细胞死亡，可以作为体内埋植剂，用于制备预防或治疗卵巢癌的药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过简单高效的光化学接枝方法，把TNF-α和IFN-γ共固定在可降解生物材料上，制备生物功能材料，避免了游离药物的物理和生物学性质的损失、生物材料表面活性和其他表面性能降低的缺陷，而且所用的基材是生物塑料，无毒无刺激性，具有良好的生物相容性，可生物分解吸收，强度高，可塑性好，易于加工成型，制备成药物后可以使TNF-α和IFN-γ的药效更加持久有效，用于制备治疗卵巢癌的药物时，治疗效果好，毒副作用小，适于在医疗中广泛应用。特别当所用高分子载体为PDLLA、PLGA或PLGA-PEG-PLGA时，由于PDLLA、PLGA或PLGA-PEG-PLGA有优良的生物相容性和安全性，PDLLA的降解产物能参与人体代谢，PLGA可在体内降解为二氧化碳和水，还可通过改变自身共聚物乳酸LA与羟基乙酸GA的比例很容易地改变共聚物材料PLGA降解速率，使其降解时间满足所包埋药物的要求。PLGA-PEG-PLGA比聚乳酸具有更大的亲水性；作为药物的载体时，可以对卵巢癌细胞OVCAR-3周期的阻滞具有特异性，且当以PDLLA为基体材料时，能将OVCAR-3较高的阻滞在G₂期，对OVCAR-3细胞3天死亡诱导率为48.2％，对卵巢癌的治疗具有重大意义。

附图说明

图1为光固定高分子载体的制备图；

图2为AFM分析可降解生物材料表面粗糙度，其中，A为PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ；B为PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ；C为PLGA-PEG-PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ；

图3为流式细胞仪分析共固定TNF-α/IFN-γ诱导OVCAR-3细胞周期阻滞(72h)，其中，第一行是PLGA组(A：对照组，B：游离组，C：固定组)；第二行是PDLLA组(D：对照组，E：游离组，F：固定组)；第三行是PLGA-PEG-PLGAG组(G：对照组，H：游离组，I：固定组)；

图4为共固定TNF-α/IFN-γ诱导OVCAR-3细胞周期阻滞比率图(72h)；

图5为游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ诱导OVCAR-3细胞凋亡72h流式图，其中，第一行是PLGA组(A：对照组，B：游离组，C：固定组)；第二行是PDLLA组(D：对照组，E：游离组，F：固定组)；第三行是PLGA-PEG-PLGA(G：对照组，H：游离组，I：固定组)；

图6为共固定TNF-α/IFN-γ生物材料促进OVCAR-3细胞死亡率(72h)。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

材料：主要试剂：重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)购自上海赛达生物药业有限公司；重组人干扰素-γ(IFN-γ)购自珠海丽珠生物工程制药厂；二甲基甲酰胺(DMF)、N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺购自sigma公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)、胰酶为GIBCOBRI公司产品；新小牛血清购自杭州四季春生物工程材料研究所；卵巢癌细胞(OVCAR-3细胞系)由中山医科大学动物中心提供。外消旋聚乳酸薄膜(PDLLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚薄膜(PLGA)聚乙二醇-聚乳酸共聚薄膜(PLGA-PEG-PLGA)购自济南岱罡生物科技有限公司。

仪器：78-1磁力搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；HY-5调速多用振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；HV-85高压灭菌器(浩鑫企业有限公司)；培养箱(37℃5％CO₂)(Thermo Company)；超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；超滤过滤器(Nalge Company)；倒置相差显微镜(Olympus Company)。

实施例1可降解高分子载体药物的制备

1.共固定化细胞因子的制备

将TNF-α(40g，0.002μmol)、IFN-γ(45μg，0.02μmol)分别加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺(60μg，0.2μmol)的二甲基甲酰胺DMF/PBS(pH7.4)(4∶1，20mL)溶液中，冰浴(4℃)条件下搅拌反应48h。合成结束后，用超过滤膜(Millipore Molecut II，10kNa)纯化叠氮苯基衍生的TNF和IFN，冷冻干燥。

2.光固定化生物材料的制备

将光活性TNF-α和IFN-γ按浓度10ng/well加到PDLLA，PLGA，PLGA-PEG-PLGA薄膜上，每个浓度一行(6个孔)，经干燥(4℃)一个星期后，通过紫外光(15W，2cm处)照射(20min)，利用叠氮基十分活泼的特点，将药物固定在PDLLA，PLGA，PLGA-PEG-PLGA薄膜上。光固定化后用PBS(pH7.4)溶液反复洗涤基薄膜20次以上，制备流程见图1。

实施例2可降解高分子载体药物的表征

1.XPS光电子能谱表征

将制备好的光固定可降解生物化材料，放冰箱晾干(4℃)，用元素分析仪和X-射线光电子能谱仪检测分析光固定生物化材料其表面元素含量化。

表1可降解生物材料表面元素及含量

表1是光电子能谱检测可降解生物材料表面元素表。从上表可以看出，把TNF-α/IFN-γ共固定在PLGA、PDLLA、PLGA-PEG-PLGA后，与空白组相比N元素的含量明显上升。共固定化生物材料PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面N元素含量比PLGA增加了5.49％；PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面N元素的含量比PDLLA增加了1.8％；PLGA-PEG-PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面N元素的含量比PLGA-PEG-PLGA增加了1.51％。光电子能谱检测结果初步证明三种光固定化可降解生物材料制备成功。

2.AFM原子力表征

将制备好的光固定可降解生物化材料，放冰箱晾干(4℃)，用原子力显微镜检测光固定化生物材料表面。图2是使用原子力显微镜(AFM)观察剂量为20ng/well的共固定化TNF-α/IFN-γ在三种聚乳酸共聚物材料表面的图像。从图中可以看出，三种聚乳酸共聚物材料表面均比较粗糙，TNF-α/IFN-γ在紫外线的照射下都能够固定在PLGA/PDLLA/PLGA-PEG-PLGA表面上。在PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ(图2A)中，PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面的平均高度为9.18nm，最高为32.10nm，最低为9.03nm，共固定化TNF-α/IFN-γ蛋白颗粒相对高度为23.07nm，TNF-α/IFN-γ均匀固定在PLGA薄膜上；在PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ(图2B)中，PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面的平均高度为23.86nm，最高为61.08nm，最低为22.32nm共固定化TNF-α/IFN-γ蛋白颗粒相对高度为38.76nm，TNF-α/IFN-γ均匀的固定在PLGA薄膜上；在PLGA-PEG-PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ中，PLGA-PEG-PLGA-AzPhTNF-α/IFN-γ表面的平均高度为26.64nm，最高为68.53nm，最低为25.22nm共固定化TNF-α/IFN-γ蛋白颗粒相对高度为43.31nm，TNF-α/IFN-γ均匀固定在PLGA薄膜上。AFM原子力表面分析进一步证明得到三种光固定化生物材料。

实施例3对体外OVCAR-3细胞的生长抑制实验

使用DMEN培养基(含10％新生小牛血清、0.06mg/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素，pH7.2～7.4)，在37℃，5％CO₂培养箱中进行常规继代培养。取处于对数生长期的细胞，用含胰蛋白酶0.25％(W/V)和EDTA 0.02％(W/V)的PBS(-)溶液消化，并先后使用血清培养基和无血清培养基洗涤.最后，以无血清培养基调整为1×10⁶cell/ml的细胞悬液。

分别对三种材料PDLLA，PLGA，PLGA-PEG-PLGA薄膜上作以下2个分组处理：A板(IFN-γ/TNF-α)：将20ng/ml可溶性TNF-α和IFN-γ加到三种薄膜上；B板(IFN-γ/TNF-α)：将20ng/ml固定化的TNF-α/IFN-γ加到三种薄膜上；同时作不加细胞因子的空白对照组。

用70％(V/V)的乙醇溶液对已进行光固定化的三种薄膜进行灭菌(浸泡30min)，然后用无菌水反复冲洗3～4遍。最后，每孔都加入1ml含1×10⁵cell/ml的细胞悬液，各作12个平行膜，在37℃，5％CO₂培养箱中培养72h。消化、洗涤后收集细胞。

实施例4流式细胞仪分析OVCAR-3细胞周期阻滞

细胞培养同实施例3，将每孔的培养液分别吸取到10mL的玻璃离心管，再加入1mL的胰酶到培养板上，消化贴附在材料上的细胞。将消化完的溶液移到离心管中与前面的培养液混合，在1000rpm的转速下离心5min。倒掉上清液，调整细胞浓度为5×10⁵～1×10⁶个/mL，取1mL细胞，1000rpm，4℃离心10min，弃上清；加入1mL冷的PBS，轻微震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10min，弃上清；将细胞重悬于1mL 75％乙醇溶液，置于-20℃固定过夜保存；PBS清洗两次，随后温育于40μL PC缓冲液中，约30min。再次洗涤细胞后，用10μg/mLPI和0.1％RnaseA在室温下进行DNA染色20min，进行流式细胞分析(图3～4)。

图3是流式细胞仪分析游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γOVCAR-3细胞周期图。由图5可看出，三种不同聚乳酸共聚物材料中游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ对细胞的周期与对照组相比，有明显变化。在PLGA中对照组(图3A)G1期细胞为68.8％，S期细胞为24.6％，游离TNF-α/IFN-γ组(图3B)S期细胞上调，为26.1％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图3C)G1期细胞上调，为69.4％；在PDLLA中对照组(图3D)G2期细胞为3.9％；游离TNF-α/IFN-γ组G2期细胞为11.7％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图3F)G2期细胞为12.9％；在PLGA-PEG-PLGA中对照组(图3G)细胞S期细胞为29.6％；游离TNF-α/IFN-γS期细胞为32.4％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图3I)S期细胞为38.0％。

图4是游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ对OVCAR-3细胞周期比率图。从图4中可以看出，在PLGA薄膜中对于空白组而言，游离组主要把细胞阻滞在S期；共固定组主要把细胞阻滞在G1期；在PDLLA薄膜中对于空白组而言，游离组和共固定组主要把细胞阻滞在G2期；在PLGA-PEG-PLGA薄膜中对于空白组而言，游离组和共固定组主要把细胞阻滞在S期。

图3和图4表明，培养72h，游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ在三种不同的聚乳酸共聚物，对卵巢癌OVCAR-3细胞的周期阻滞具有材料特异性。其中PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ阻滞效果最好，把细胞明显阻滞在G2期进而引起细胞走向死亡，是三种当中阻滞OVCAR-3细胞最好的可降解生物材料。

实施例5Annexin V/PI双染法检测OVCAR-3细胞程序性死亡

细胞培养方法同实施例3，将每孔的培养液分别吸取到10mL的玻璃离心管，再加入1mL的胰酶到培养膜上，消化贴附在培养膜上的细胞。将消化完的溶液移到离心管中与前面的培养液混合，在1000rpm的转速下离心5min。倒掉上清液，调整细胞浓度为5×10⁵～1×10⁶个/mL，取1mL细胞，1000rpm，4℃离心10min，弃上清；加入1mL冷的PBS，轻微震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10min，弃上清(重复3、4次)；将细胞重悬于200μL Binding Buffer；加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15min或4℃反应30min；加入300μL Binding Buffer；在1h内上机检测。

图5是游离TNF-α/IFN-γ共固定TNF-α/IFN-γ诱导OVCAR-3细胞72h流式图。由四个象限组成的细胞直方图，右上象限Annexin V+/PI+显示晚期凋亡细胞或者坏死细胞；右下象限Annexin V+/PI-显示早期凋亡细胞；左下象限Annexin V-/PI-显示阴性正常细胞。由图3可看出，三种不同聚乳酸共聚物材料中游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ对细胞的凋亡率的影响与对照组相比，有明显变化：在PLGA中对照组(图5A)细胞凋亡率为29.20％，其中细胞早期凋亡率为11.75％，晚期凋亡率为11.69％；游离TNF-α/IFN-γ组(图5B)细胞凋亡率为35.22％，其中细胞早期凋亡率为23.10％，晚期凋亡率为12.12％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图5C)细胞凋亡率为40.21％，其中细胞早期凋亡率为25.81％，晚期凋亡率为14.40％；在PDLLA中对照组(图5D)细胞凋亡率为27.96％，其中细胞早期凋亡率为12.01％，晚期凋亡率为15.95％；游离TNF-α/IFN-γ组(图5E)细胞凋亡率为41.43％，其中细胞早期凋亡率为17.51％，晚期凋亡率为23.91％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图5F)细胞凋亡率为48.20％，其中细胞早期凋亡率为24.45％，晚期凋亡率为23.75％；在PLGA-PEG-PLGA中对照组(图5G)细胞凋亡率为29.64％，其中细胞早期凋亡率为22.99％，晚期凋亡率为6.65％；游离TNF-α/IFN-γ组(图5H)细胞凋亡率为35.77％，其中细胞早期凋亡率为25.76％，晚期凋亡率为10.01％；共固定TNF-α/IFN-γ组(图5I)细胞凋亡率为39.77％，其中细胞早期凋亡率为23.70％，晚期凋亡率为16.07％。

图6显示游离TNF-α/IFN-γ、共固定TNF-α/IFN-γ促进OVCAR-3的细胞死亡率。从图中可以看出，三种聚乳酸共聚物材料的空白组的细胞死亡率最低，游离TNF-α/IFN-γ组、共固定TNF-α/IFN-γ组相对于空白组而言，细胞死亡率有明显的提高，且共固定组的效果要比游离组的效果要明显；其中可降解生物材料PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ的死亡率最高。以上结果表明，培养72h后，OVCAR-3细胞在PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ死亡效果最好，推测PDLLA-AzPhTNF-α/IFN-γ是3种可降解生物材料中诱导OVCAR-3死亡的最好的一种。

Claims

1.一种可降解高分子载体药物，是将药物固定在高分子载体上，其特征在于所述药物是TNF-α和IFN-γ，所述高分子载体为可降解生物材料。

2.根据权利要求1所述可降解高分子载体药物，其特征在于所述可降解生物材料为聚乳酸或其共聚物。

3.根据权利要求2所述可降解高分子载体药物，其特征在于所述可降解生物材料为聚乳酸-乙醇酸共聚薄膜、外消旋聚乳酸薄膜或聚乙二醇-聚乳酸共聚薄膜。

4.权利要求1或2或3所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将TNF-α和IFN-γ分别加入到含N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液中，冰浴条件下搅拌反应，反应结束后用超滤膜纯化，冷冻干燥，分别得到光活性的TNF-α和IFN-γ；(2)将光活性TNF-α和IFN-γ加到可降解生物材料薄膜上，经干燥后，紫外光照射，将药物固定在薄膜上；(3)用PBS溶液洗涤薄膜，得到可降解高分子载体药物。

5.根据权利要求4所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述TNF-α、IFN-γ和N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶100。

6.根据权利要求4所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述冰浴的温度为0～10℃，反应时间为24～96h。

7.根据权利要求4所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述干燥的温度为0～10℃。

8.根据权利要求4所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述紫外光照射是15～120W的紫外光于2～15cm处照射15s～30min。

9.根据权利要求4所述可降解高分子载体药物的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述PBS溶液的pH为7.4，洗涤次数为20次以上。

10.权利要求1或2或3所述可降解高分子载体药物在制备预防或治疗卵巢癌的药物中的应用。