CN101862353B - 一种阿里红提取物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿里红中总三萜酸提取方法。该方法包括如下步骤：取阿里红，对所述阿里红用提取溶剂进行提取，得到所述阿里红的提取物；所述提取溶剂是60％-95％(体积百分比)乙醇水溶液；所述提取溶剂的用量是所述阿里红药材质量的8-12倍；所述提取的温度是80-100℃。结果显示：阿里红中三萜酸类成分的最佳提取工艺为80％乙醇加热回流提取两次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次加8倍量乙醇提取1.5h，此时提取物中总三萜酸含量平均值达84.03±0.77％，提取率平均值达22.45±0.38(％)，去氢硫色多孔菌酸含量达5.17±0.10％。
Description
技术领域
本发明涉及阿里红中总三萜酸提取方法。
背景技术
阿里红[Fomes officinialis(Vill.ex.Fr.)Ames]是多孔菌科层孔菌属的真菌子实体。俗名苦白蹄，新疆维文版的《维吾尔医常用药材》一书中称阿里红为“落叶松茸”，维吾尔语为“哈里坤”。外形呈马蹄形，边缘不规则，大小不等，大的直径可达到30～40cm，小的5～10cm，子实体外部为棕黄色或灰白色，内部白色。收载于中华人民共和国卫生部药品标准《维吾尔药分册》。阿里红是新疆维吾尔民族医生的常用药物，民间验方也用以治病。维医认为阿里红入药性燥、热，有温胃祛痰、降气平喘、祛风除湿、消肿利尿之功用，是维吾尔医常用的治疗慢性气管炎的药材之一。药理实验表明阿里红具有温肺化痰、降气、活血消肿、利尿作用。为维吾尔药复方阿里红片的主要成分之一，主要用于祛痰平喘。
国外学者对阿里红的化学成分研究表明其主要成分为三萜酸、脂肪酸等，《维吾尔药志》中报道其含有多种三萜、甾体化合物，其中三萜酸含量可高达16％。
三萜类成分是很多药用真菌的有效成分之一，药用真菌在提高人体免疫功能、抗衰老及其他许多保健功能方面已受到高度重视，其种类多、分布广、繁殖快，在中国现代医药中起着重要作用，是中草药的一个重要的组成部分。阿里红中三萜酸类化合物有不少研究，但对三萜化合物标准化的提取工艺研究及含量测定方法未见文献报道，使提取物的质量控制难以实现，生物活性的研究结果，也就变得难以肯定。因而我们设计了三水平四因素正交试验，进行了阿里红三萜化合物的标准化提取方法研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿里红的提取物的制备方法。
本发明提供的阿里红的提取物的制备方法，包括如下步骤：取阿里红，对所述阿里红用提取溶剂进行提取，收集提取液，得到所述阿里红的提取物；
所述提取溶剂是60％-95％(体积百分比)乙醇水溶液；所述提取溶剂的用量是所述阿里红质量的8-12倍；所述提取的温度是80-100℃。
为了充分提取，阿里红可在提取之前先粉碎，过10目筛。
上述提取的方法具体可以是回流提取，所述回流提取的次数是2-4次，每次1-4小时，所述回流提取的温度是80-100℃。
在一个实施例中，上述提取溶剂可以是95％(体积百分比)的乙醇水溶液；所述提取溶剂的用量是所述阿里红质量10倍；所述回流提取的温度是100℃；所述回流提取的次数是3次，每次1-3小时。
在另一实施例中，上述提取溶剂是60-80％(体积百分比)的乙醇水溶液；所述提取溶剂的用量是所述阿里红质量8-10倍；所述回流提取的温度是80-100℃；所述回流提取的次数是2次，每次1.5-3小时。
进一步，上述回流提取的次数是2次，第1次回流提取的提取溶剂的用量是所述阿里红质量的10倍，所述第1次回流提取的时间是3小时；第2次回流提取的提取溶剂的用量是所述阿里红质量的8倍，所述第2次回流提取的时间是1.5小时；所述提取溶剂是60％或70％或80％(体积百分比)的乙醇水溶液；所述回流提取的温度是100℃。
上述方法还包括将所述提取液经过减压浓缩然后真空干燥至恒重，得到作为所述阿里红的提取物的固体粉末。
更进一步，上述制备方法还包括测定上述的固体粉末中总三萜酸含量，其步骤如下：
a)往上述固体粉末中加入5％香草醛-冰醋酸和高氯酸，密塞混匀，在50-70℃条件下反应20-30分钟，然后迅速置于冰浴上停止反应，得到显色溶液；所述5％香草醛-冰醋酸是将5g香草醛溶于冰醋酸中，再用冰醋酸定容至100mL后得到的溶液；其中固体粉末与5％香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是(0.03-0.05)mg∶(0.2-0.8)ml∶(0.8-1.4)mL；
b)往步骤a)中的显色溶液中加入冰醋酸定容，在554nm波长处测吸光度值，然后根据标准曲线计算上述的方法制备得到的提取物中总三萜酸含量；其中定容后的体积与步骤a)中的固体粉末的配比是10mL∶(0.03-0.05)mg。
在步骤a)中，所述固体粉末与5％香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是0.04mg∶0.5mL∶1.0mL；所述反应温度是60℃，反应时间是25分钟。
为了防止假阳性的出现，上述制备方法还包括测定上述的固体粉末中去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)含量，其步骤如下：
I)将上述固体粉末用甲醇作为溶剂进行溶解，得到样品溶液；
II)将步骤I)得到的样品溶液稀释后用滤膜过滤得到滤液；
III)将步骤II)得到的滤液进行HPLC测定，根据去氢硫色多孔菌酸标准曲线，计算出上述固体粉末中的去氢硫色多孔菌酸含量。
在步骤I)中，所述甲醇与所述固体粉末的配比是(0.04-0.06)g∶(10-75)mL，优选配比是0.05g∶(10-75mL)；
在步骤II)中，所述滤膜的孔径是0.45μm；步骤III)中，所述HPLC条件是色谱柱：Agilent Technologies公司Zorbax Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)分析柱；流动相：乙腈-0.4％磷酸水溶液(61∶39)；流速：1.0mL/min；检测波长：242nm；柱温：25℃。
正交实验初步筛选显示：4个因素对其影响重要性依次为提取溶剂(A)＞提取方法(B)＞提取次数(D)＞提取时间(C)，直观分析综合评价R值，最佳提取工艺是A2B2C3D1，即95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时。
通过正交实验初步筛选结果，并考虑到成本和试剂的安全性，选用乙醇最为经济、安全，以乙醇为溶剂作进一步选择进行单因素分析。结果显示：阿里红中三萜酸类成分的最佳提取工艺为80％乙醇加热回流提取两次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次加8倍量乙醇提取1.5h，此时提取物中总三萜酸含量平均值达84.03±0.77％，提取率平均值达22.45±0.38(％)，去氢硫色多孔菌酸含量达5.17±0.10％。
大多数文献报道的对其他药材中三萜(酸)类成分提取方法优选中，仅对总三萜含量或提取率为指标进行分析，未考虑提取条件对其中某种有药理活性的单体成分含量，这样可能出现假阳性结果，使优选出的方法不可靠。本发明中为避免此现象的干扰，在测定总三萜酸含量并考虑其提取率同时，采用其中特征性成分去氢硫色多孔菌酸为对照品，测定该种三萜单体成分含量，进行综合分析评价，最终确定阿里红中三萜酸类化合物的标准化提取方法。
附图说明
图1去氢硫色多孔菌酸结构式。
图2对照品去氢硫色多孔菌酸高效液相色谱图。
图3阿里红药材供试品溶液高效液相色谱图。
图4去氢硫色多孔菌酸对照品在242nm波长处紫外吸收光谱图。
图5供试品保留时间为9.774min时在242nm波长处紫外吸收光谱图。
图6去氢硫色多孔菌酸对照品标准曲线。
图75％香草醛-冰醋酸用量考察结果。
图8供试品及对照品薄层色谱图，1.供试品I；2.去氢硫色多孔菌酸对照品；3.供试品II；4.去氢硫色多孔菌酸对照品。
图9去氢硫色多孔菌酸对照品(A)及供试品溶液(B)显色后可见光谱扫描图。
图10去氢硫色多孔菌酸对照品标准曲线(总三萜酸含量测定)。
图11正交实验1中阿里红药材水提取时供试品溶液高效液相色谱图。
图12正交实验2中阿里红药材水提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图13正交实验3中阿里红药材水提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图14正交实验4中阿里红药材95％乙醇提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图15正交实验5中阿里红药材95％乙醇提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图16正交实验6中阿里红药材95％乙醇提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图17正交实验7中阿里红药材二氯甲烷提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图18正交实验8中阿里红药材二氯甲烷提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图19正交实验9中阿里红药材二氯甲烷提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图20阿里红药材60％乙醇提取供试品溶液的高效液相色谱图。
图21阿里红药材70％乙醇提取时供试品溶液高效液相色谱图。
图22阿里红药材80％乙醇提取时供试品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
阿里红2007年10月购于新疆维吾尔医院，经新疆药物研究所刘庆华研究员鉴定为多孔菌科层孔菌属阿里红[Fomes officinialis(Vill.ex.Fr.)Ames]的子实体；为了便于提取阿里红中的成分，在以下实施例中先将阿里红粉碎成粗粉(过10目筛)。
纯化后的去氢硫色多孔菌酸对照品(纯度99.5％)，去氢硫色多孔菌酸的结构式如图1所示。其中纯化后的对照品的制备方法：阿里红干燥子实体5Kg，用95％的乙醇回流提取2次，合并提取液回收溶剂后得浸膏约700克，浸膏溶于适量95％的乙醇中，用100-200目硅胶拌样，依次以石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮和甲醇洗脱，其中氯仿萃取物240g(Fr.B)。Fr.B经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇(10∶0～6∶4～0∶10)梯度洗脱，分为Fr.1～6六个部分。Fr.3部分经反复硅胶柱色谱(氯仿-甲醇10∶1～6∶4～0∶10)得到去氢硫色多孔菌酸粗品，将去氢硫色多孔菌酸粗品溶于少量吡啶中，C18硅胶色谱柱经甲醇-水(5∶5)400mL平衡，湿法加样，以甲醇-水(6∶4～7∶3～8∶2)梯度洗脱，收集各浓度梯度洗脱液。按每份250mL接收洗脱流份，分别得流份(1)-(11)，(12)-(15)，(16)-(24)。各流份减压蒸干溶剂后用少量甲醇溶解，进行薄层检识，展开剂为氯仿-甲醇(9∶1)，显色剂为10％硫酸。根据薄层色谱斑点位置与去氢硫色多孔菌酸对照品比较，点样后与对照品在相同位置显现紫色斑点，且未见杂质斑点，表明为目标化合物，将其溶剂挥干并真空干燥，得白色固体粉末，即为纯化后的对照品，经检测纯化后的对照品中纯度为99.5％。
实施例1、阿里红中去氢硫色多孔菌酸含量测定方法的建立及其检测
一、阿里红中去氢硫色多孔菌酸含量测定方法的建立
1、提取溶剂的选择
精密称取阿里红粗粉6份，各2g，分置6个50mL具塞三角瓶中，分别加入50mL甲醇、70％甲醇、无水乙醇、70％乙醇、50％乙醇、水，密塞，称定重量，均超声(35kHz)提取1h，放冷，再称重，用各溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，滤渣再分别以各自溶剂重复操作一次，分别合并滤液，减压蒸干，残渣以甲醇转溶至25mL量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得六种溶剂提取所得的供试品溶液，各进样5μL，采用HPLC测定各峰面积值，以峰面积代表其中去氢硫色多孔菌酸含量。
其中HPLC检测条件是：色谱柱：Agilent Technologies公司Zorbax EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)分析柱；流动相：乙腈-0.4％磷酸水溶液(61∶39)；流速：1.0mL/min；检测波长：242nm；柱温：25℃。
结果见表1所示：甲醇提溶液去氢硫色多孔菌酸的峰面积最大，其中去氢硫色多孔菌酸含量最高，且过滤时间相对较短，水溶液去氢硫色多孔菌酸含量最低，故最终优选甲醇为供试品溶液制备的最佳提取溶剂。
表1不同溶剂提取考察结果
2、提取方法的选择
在步骤1已经确定甲醇为提取溶剂的基础上，设置以下三组实验来确定最佳的提取方法：
1)超声提取法：取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，置100mL具塞三角瓶中，加入甲醇60mL，密塞，称定重量，超声(35kHz)提取1h，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤渣重复操作一次，合并滤液，减压浓缩，再用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2)回流提取法：取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入甲醇60mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤渣重复操作一次，合并滤液，减压浓缩，再用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
3)索氏提取法：取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，置于索氏提取器中，加入 甲醇70mL，索氏提取3h，提取液减压浓缩至适量，再用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
以上供试品溶液各进样5μL，采用HPLC(检测条件与步骤1相同)测定各峰面积值，以峰面积代表其中去氢硫色多孔菌酸含量。
表2不同提取方法考察结果
结果如表2所示，超声法对药材中去氢硫色多孔菌酸的提取率最高，且操作时间相对较短，较为简单方便，故选择超声法为供试品溶液制备的最佳提取方法。
3、提取时间的选择
在步骤1和2的基础上，设置不同提取时间的实验：
精密称取3份阿里红药材粗粉，各2g，分置100mL具塞三角瓶中，加入甲醇60mL，密塞，称定重量，分别超声(35kHz)处理20min、40min、60min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液减压浓缩至近干，再用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同提取时间的供试品溶液，均各进样5μL，采用HPLC(检测条件与步骤1相同)测定各峰面积值，以峰面积代表其中去氢硫色多孔菌酸含量。
表3不同提取时间考察结果
结果如表3所示，超声提取60min可将阿里红药材中的去氢硫色多孔菌酸较完全地提取出，故最终选择以甲醇超声提取60min为供试品溶液制备最佳提取方法。
4、阿里红中去氢硫色多孔菌酸含量测定的最佳方法
1)对照品溶液的制备
精密称定去氢硫色多孔菌酸5.57mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1mL含去氢硫色多孔菌酸对照品0.557mg)。
2)供试品溶液的制备
取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，置于100mL具塞三角瓶中，加入甲醇60mL，密塞，称定重量，超声(35kHz)处理60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液减压浓缩至近干，再用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀。从中精密吸取0.5mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，再将其稀释两倍，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3)检测
将步骤1)的对照品溶液和步骤2)的供试品溶液各进样10μl，采用HPLC(色谱条件与步骤1相同)进行测定，记录去氢硫色多孔菌酸峰面积值，外标法计算含量。
对照品溶液及供试品溶液的高效液相色谱图分别如图2和图3所示，去氢硫色多孔菌酸的出峰时间分别是9.871min和9.833min。
对照品溶液及收集的保留时间为9.774分钟时的供试品溶液在242nm波长处紫外吸收光谱图分别如图4和图5所示，发现供试品溶液与对照品溶液均在242nm波长处有最大吸收，且空白对照无干扰，故最终选择242nm作为阿里红中去氢硫色多孔菌酸含量测定的检测波长。
二、阿里红中去氢硫色多孔菌酸含量测定方法的检测
1、标准曲线的制备
分别精密吸取步骤一中的去氢硫色多孔菌酸对照品溶液(0.557mg/mL)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL分置于5mL量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列去氢硫色多孔菌酸对照品溶液。上述六个浓度对照品溶液分别进样10μl，采用HPLC测定各峰面积值(结果见表4)，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝6450.95x+5.48972，r＝0.9997，结果表明：去氢硫色多孔菌酸在0.0223-0.1337mg/ml范围内呈良好的线性关系。标准曲线见图6。
表4去氢硫色多孔菌酸标准曲线数据测定结果
2、精密度试验
精密称取阿里红粗粉2g，按照步骤一的步骤4中的方法制成供试品溶液，按照步骤一中的色谱条件进行HPLC检测。重复进样5次，测定峰面积。结果如表5所示，相对标准偏差(RSD)为0.37％(n＝5)，精密度良好。
表5精密度试验结果(n＝5)
3、稳定性试验
精密称取阿里红粗粉2g，按照步骤一的步骤4中的方法制成供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24h进样10μl，采用HPLC测定各峰面积值。结果如表6所示，平均峰面积为539.01，其稳定性的RSD为1.80％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
表6稳定性试验结果(n＝7)
4、重复性试验
分别精密称取5份阿里红药材粗粉2g，按照步骤一的步骤4中的方法制备5份供试品溶液，各进样10μl，并进对照品溶液10μl，采用HPLC测定各峰面积值，用外标法计算其中去氢硫色多孔菌酸含量。结果如表7所示，其方法重复性的RSD为1.20％(n＝5)。
表7重复性试验结果(n＝5)
5、加样回收率试验
精密称取已知去氢硫色多孔菌酸含量为3.9124％的阿里红药材粗粉6份，每份0.025g，加入一定量去氢硫色多孔菌酸对照品，分别加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声(35kHz)处理60min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用甲醇定容至25mL量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。样品与对照品溶液均各进样10μl，采用HPLC测定峰面积值，计算去氢硫色多孔菌酸含量，其加样回收率均值为100.68％，RSD＝1.97％(n＝6)。结果见表8。
表8加样回收率试验结果(n＝6)
实施例2、阿里红总三萜酸成分含量测定方法的建立及其检测
一、阿里红总三萜酸成分含量测定方法的建立
1、显色剂(5％香草醛-冰醋酸)用量的选择
供试品溶液的制备：取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，置于索式提取器中，加入二氯甲烷70mL，提取2.5h，提取液减压蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，即得本实施例的供试品溶液。
再精密吸取0.1mL供试品溶液置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。从中分别精密吸取0.2，0.5，0.8，1.1，1.4mL分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，摇匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热20min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀，随行空白溶液对照，分别在554nm波长处测定吸光度。
表95％香草醛-冰醋酸用量考察结果
结果如表9和图7所示，随着取样量成倍数增大，吸光度成比例增加，且线性关系良好，r＝0.9985。证明0.5mL香草醛-冰醋酸可与所取样品中的三萜酸类成分完全反应，且取用0.5mL操作方便准确，故显色剂用量为0.5mL较为合适。
2、显色剂(高氯酸)用量的选择
精密称取阿里红药材粗粉2g，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，再精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.5mL，共6份，分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，再各精密加入依次为高氯酸0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL，混匀，密塞，置60℃水浴中加热20min，取出立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀，随行空白溶液对照，分别在554nm波长处测定吸光度。
表10高氯酸用量用量考察结果
结果如表10所示，随着高氯酸用量的上升，吸光度增加，达到1.0mL时吸光度最大，此后再增加其用量吸光度降低，故选择1.0mL为高氯酸最佳用量。
3、水浴温度(反应温度)的选择
精密称取阿里红药材粗粉2g，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，再精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.5mL，共6份，分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，分别置于40，50，60，70，80，90℃水浴中反应20min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀，随行空白溶液对照，分别在554nm波长处测定吸光度。
表11不同温度考察结果
结果如表11所示，在40-90℃范围内随水浴温度的上升，吸光度增加，而在50-70℃范围内吸光度相对比较稳定，故选择60℃作为显色时的水浴温度。
4、显色时间的选择
精密称取阿里红药材粗粉约2g，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，再精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.5mL，共6份，分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，分别置于60℃水浴中，依次加热5，10，15，20，25，30min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀，随行空白溶液对照，分别在554nm波长处测定吸光度。
表12不同显色时间考察结果
结果如表12所示，在5-25min范围内，随显色加热时间的延长，吸光度增加，当超过25min后吸光度下降，而在20-30min范围内吸光度相对比较稳定，故选择25min作为显色时间。
最终选择用5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，60℃加热显色25分钟为阿 里红中总三萜酸成分最佳显色方法。
5、二氯甲烷作为提取溶剂的可行性分析
精密称取阿里红药材粗粉2.0053g，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液。
精密称取去氢硫色多孔菌酸对照品2.02mg，置于10mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.202mg/mL的去氢硫色多孔菌酸对照品溶液。
分别吸取供试品及去氢硫色多孔菌酸对照品溶液(0.202mg/mL)，点样于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10％硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，供试品与去氢硫色多孔菌酸对照品溶液薄层色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点。置紫外光灯(365nm)下检视，供试品及对照品色谱中均未出现荧光斑点。表明用二氯甲烷作溶剂可将阿里红中三萜酸类成分较完全地提取出来。其薄层色谱见附图8。
6、检测波长的选择
取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，再精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中，精密吸取对照品溶液2mL置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取稀释后的供试品溶液0.5mL与对照品溶液1.0mL，分置10mL具塞试管中，分别水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，摇匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热20min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。随行空白溶液对照，分别在400～800nm波长范围内扫描，发现供试品溶液与对照品溶液均在554nm波长处有最大吸收，且空白对照无干扰，故最终选择554nm作为阿里红总三萜酸类成分含量测定的检测波长。其可见光谱扫描图见图9。
二、阿里红总三萜酸成分含量测定方法的检测
1、标准曲线的制备
精密称取去氢硫色多孔菌酸对照品2.02mg，置于10mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。再分别精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL置于6个10mL具塞试管中(表13中编号分别是1、2、3、4、5和6)，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm 波长处测吸光度值(其结果见表13)，以对照品溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝23.84C+0.0297，r＝0.9989，结果表明：去氢硫色多孔菌酸标准品在0.0040-0.0242mg/ml范围内线性关系良好。标准曲线见图10。
表13去氢硫色多孔菌酸标准曲线数据测定结果
2、精密度试验
取上述步骤1中编号为4的经显色后的对照品溶液，在554nm波长处连续测其吸光度5次，结果见表14，RSD为0.17％(n＝5)，精密度良好。
表14精密度试验结果(n＝5)
3、重复性试验
分别取5份阿里红药材粗粉各约2g，精密称定，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中，再从中精密吸取0.5mL，分置10mL具塞试管中。水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm波长处测吸光度值，随行去氢硫色多孔菌酸对照品进行吸光度测试，计算阿里红中总三萜酸含量，结果见表15，其方法重复性的RSD为2.82％(n＝5)。
表15重复性试验结果(n＝5)
4、稳定性试验
取阿里红药材粗粉约2g，精密称定，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，再精密吸取0.1mL置于25mL量瓶中。水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm波长处测吸光度值，随行去氢硫色多孔菌酸对照品进行吸光度测试，分别在0、10、20、30、60、90、120和150分钟时，波长554nm处测吸光度，结果见表16。
表16稳定性试验结果
结果表明阿里红中总三萜酸成分经显色后60min内，吸光度变化较小，RSD为2.59％，90min时RSD上升至3.32％，随着时间延长，吸光度不断下降，所以该方法测定应在显色后60min内完成，此期间溶液稳定性较好。
5、加样回收率试验
精密称取已知含量的阿里红粗粉6份，每份约0.004g，加入一定量去氢硫色多孔菌酸对照品，按本实施例的步骤一中的步骤1的方法制备供试品溶液，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm波长处测吸光度值，随行去氢硫色多孔菌酸对照品进行吸光度测试，在波长554nm处测吸光度，计算阿里红中总三萜酸含量，其加样回收率均值为98.56％，RSD＝1.89％(n＝6)。结果见表17。
表17加样回收率试验结果(n＝6)
实施例3、阿里红中三萜酸成分的标准化提取方法研究
一、针对提取溶剂、提取方法、提取时间和提取次数进行正交试验的研究
1、干浸膏的制备
取阿里红药材，粉碎成粗粉(过10目筛)，精密称取共27份，每份约5g，按表19的正交实验设计方案进行提取，每个样本重复提取操作3次。每次均加入10倍量各溶剂，称定重量，用各溶剂补足减失的重量，摇匀，将提取物粗滤后收集提取液，将3次提取液合并减压浓缩，置已干燥至恒重的蒸发皿中，进行真空干燥(-0.09MPa)。其中95％乙醇提取物干燥12h，二氯甲烷提取物干燥5h，水提取物干燥40h以上，得固体粉末，分别称重，即可求得干浸膏粉末量。
其中表19的正交试验方案中的各因素水平如表18所示，采用常规的四因素三水平正交设计法，选用L9(34)正交实验表，以提取溶剂、提取方法、提取时间和提取次数为实验因素，每个因素设3个水平，以药材中总三萜酸的提取率及去氢硫色多孔菌酸含量为指标进行提取工艺条件的初步筛选。
表18正交实验因素和水平表
表19正交实验设计方案
2、阿里红中总三萜酸成分含量的测定
分别精密称取各提取物干浸膏粉末，每份约0.01g，置25mL量瓶中，用适量甲醇溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀。
然后提取物如果是水提取物，从25mL量瓶中精密吸取0.5mL，分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸 1.0mL，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm波长处测吸光度值。
如果提取物是有机溶剂提取物，其与水提取物的区别在于：在水浴蒸干步骤之前，先从25mL量瓶中精密吸取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL，分置10mL具塞试管中，之后操作及测定方法同水提取物。
将吸光度值代入回归方程，计算各样品中总三萜酸含量及提取率。正交实验结果见表20，方差分析见表21。
通过正交实验提取及含量测定后，直观分析结果(见表20)表明：以阿里红中总三萜酸提取率为指标，4个因素对其影响重要性依次为提取溶剂(A)＞提取方法(B)＞提取次数(D)＞提取时间(C)，由直观分析计算得出其最佳提取工艺是A2B2C3D1，即95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时。方差分析结果(见表21)显示溶剂类型对提取率有非常显著的影响(P＜0.01)，其他因素的影响不显著。方差分析可得R2＝0.992(调整的R2＝0.966)，说明该多因素方差模型对总三萜酸提取率数据的总体拟合程度较高。
表20正交实验结果与分析(I)
总三萜酸含量(％)＝(干浸膏中总三萜酸质量/取用干浸膏质量)×100％；提取率(％)＝[(总三萜酸含量×所得总干浸膏质量)/取用阿里红药材质量]×100％
表21方差分析(I)
F0.10(2，2)＝9.0 F0.05(2，2)＝19.0 F0.01(2，2)＝99.0
3、去氢硫色多孔菌酸含量的测定
取已制得的提取物干浸膏粉末，水提取物每份约0.05g，分别精密称定，置5mL量瓶中，用适量甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。95％乙醇提取物每份约0.01g，分别精密称定，置于25mL量瓶中，用适量甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。二氯甲烷提取物每份约0.05g，分别精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，再从中精密吸取5mL于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。各溶液均用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按照实施例1中的色谱条件进行HPLC检测，进样量10μL。各溶剂不同提取方法供试品溶液的高效液相色谱图如图11-图19所示。根据峰面积值及对照品去氢硫色多孔菌酸线性回归方程，计算各样品中三萜单体成分含量。结果见表22。
表22正交实验结果(II)
去氢硫色多孔菌酸含量(％)＝(干浸膏中去氢硫色多孔菌酸质量/取用干浸膏质量)×100％；
4、正交实验结果的综合分析
对正交实验结果采用综合评价方法，以总三萜酸提取率加权系数0.7，去氢硫色多孔菌酸含量加权系数0.3作为综合评价指标。
综合评价分值＝总三萜酸提取率×0.7+去氢硫色多孔菌酸含量×0.3。结果见表23。
按综合评价指标，表23结果显示：4个因素对其影响重要性依次为提取溶剂(A) ＞提取方法(B)＞提取次数(D)＞提取时间(C)，直观分析综合评价R值，最佳提取工艺是A2B2C3D1，即95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时。方差分析(见表24)表明溶剂类型对实验结果有非常显著的影响(P＜0.01)，其他因素的影响不显著。方差分析可得R2＝0.992(调整的R2＝0.969)，说明该多因素方差模型对三萜酸类成分综合评价数据的总体拟合程度较高。
表23正交实验结果与分析(III)
表24方差分析(II)
F0.10(2，2)＝9.0 F0.05(2，2)＝19.0 F0.01(2，2)＝99.0
二、不同浓度的乙醇作为提取溶剂的考察
考虑到实际生产省时及成本问题，进行单因素实验，考察不同浓度乙醇对阿里红中总三萜酸含量、提取率以及去氢硫色多孔菌酸含量的影响。为便于实验设计和工业生产，按常规提取方法将提取次数选定为两次。
1、干浸膏的制备
取阿里红药材，粉碎成粗粉(过10目筛)，精密称取共9份，每份约5g。分别用60％、70％和80％的乙醇加热回流提取两次，第1次加10倍量乙醇，提取3h，第二次加8倍量乙醇，提取1.5h，每个样本重复提取操作3次。9份样品每次提取时均在放冷后补充损失的溶剂至原重量，摇匀。将提取物粗滤后收集提取液，将3次提取液合并减压浓缩，置已干燥至恒重的蒸发皿中，真空干燥(-0.09MPa)，60％、70％和 80％的乙醇提取物分别干燥30h、22h、16h，得固体粉末，分别称重，即可求得干浸膏粉末重量。
2、总三萜酸成分含量的测定
分别精密称取提取物干浸膏粉末，每份约0.01g，置25mL量瓶中，用适量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。从中精密吸取2mL，置l0mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取0.5mL，分置10mL具塞试管中，水浴蒸干，取出放至室温，分别精密加入5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL(即粉末与5％香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是0.04mg∶0.5ml∶1.0ml)，混匀，密塞，置60℃水浴中恒温加热25min，取出，立即置冰水浴中冷却，转移至10mL量瓶中，加入冰醋酸稀释至刻度，摇匀。以不加供试品溶液而直接加5％香草醛-冰醋酸0.5mL，高氯酸1.0mL，用冰醋酸稀释至刻度的混合溶液为空白对照，分别在554nm波长处测吸光度值，利用回归方程计算各样品中总三萜酸含量及提取率。结果见表25。
表25不同浓度乙醇对提取的影响结果(I)(n＝3)
根据表20中正交实验结果与分析以及表25中不同浓度乙醇对提取率的影响可以看出，用80％乙醇时的提取率平均值为22.4874％(RSD＝1.69％，n＝3)，与正交实验中提取率最大值(23.4006％)相近，该方法稳定、可行。
3、去氢硫色多孔菌酸含量的测定
取已制得的提取物干浸膏粉末，60％乙醇提取物、70％乙醇提取物、80％乙醇提取物每份分别约0.05g，精密称定，置10mL量瓶中，用适量甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。其中70％乙醇提取物再从中精密吸取5mL于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。80％乙醇提取物从中精密吸取2mL于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。各溶液均用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
按照实施例1中的色谱条件进行HPLC检测，进样量10μL。60％、70％、80％乙醇提取的供试品溶液高效液相色谱图如图20-图22所示。根据峰面积值及对照品去氢硫色多孔菌酸线性回归方程，计算各样品中去氢硫色多孔菌酸含量及提取率。结果见表26。
表26不同浓度乙醇对提取的影响结果(II)(n＝3)
根据表25及表26中的结果以及本实施例中的综合评价方法可计算得出，用80％乙醇时综合评价分值为17.2902，与正交实验中最大值(18.1349)接近，方法可行。同时考虑到总三萜酸提取率及指标成分去氢硫色多孔菌酸含量的影响，故确定阿里红中三萜酸类成分的最佳提取工艺为80％乙醇加热回流提取两次，第一次加10倍量乙醇提取3h，第二次加8倍量乙醇提取1.5h。
提取过程中有机溶剂提取效率明显高于水提取，80％乙醇提取可减少水溶性杂质，有利于进一步分离纯化，并且溶剂无毒、残留、可回收反复利用，生产成本较低。该提取工艺提取率较高，以期成为阿里红中三萜类成分的标准化提取方法，为筛选阿里红药理活性提供稳定可靠的样品制备方法。
Claims (4)
1.一种阿里红提取物的检测方法，包括如下步骤：取阿里红，对所述阿里红用提取溶剂进行提取，收集提取液，得到所述阿里红的提取物；
所述提取的方法是回流提取；所述回流提取的次数是2次，第1次回流提取的提取溶剂的用量是所述阿里红质量的10倍，所述第1次回流提取的时间是3小时；第2次回流提取的提取溶剂的用量是所述阿里红质量的8倍，所述第2次回流提取的时间是1.5小时；所述提取溶剂是80％(体积百分比)的乙醇水溶液；所述提取的温度是80-100℃；
将所述提取液经过减压浓缩然后真空干燥至恒重，得到作为所述阿里红的提取物的固体粉末；
所述检测方法包括测定所述的固体粉末中总三萜酸含量，其步骤如下：
a)往所述的固体粉末中加入5％香草醛-冰醋酸和高氯酸，密塞混匀，在50-70℃条件下反应20-30分钟，然后迅速置于冰浴上停止反应，得到显色溶液；所述5％香草醛-冰醋酸是将5g香草醛溶于冰醋酸中，再用冰醋酸定容至100mL后得到的溶液；其中固体粉末与5％香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是(0.03-0.05)mg∶(0.2-0.8)mL∶(0.8-1.4)mL；
b)往步骤a)中的显色溶液中加入冰醋酸定容，然后在554nm波长处测吸光度值，然后根据标准曲线计算制备得到的提取物中总三萜酸含量；其中定容后的体积与步骤a)中的固体粉末的配比是10mL∶(0.03-0.05)mg；
所述检测方法还包括测定所述固体粉末中去氢硫色多孔菌酸含量，其步骤如下：
I)将所述的固体粉末用甲醇作为溶剂进行溶解，得到样品溶液；
II)将步骤I)得到的样品溶液稀释后用滤膜过滤得到滤液；
III)将步骤II)得到的滤液进行HPLC测定，根据去氢硫色多孔菌酸标准曲线，计算出所述的固体粉末中的去氢硫色多孔菌酸含量；
所述HPLC条件是色谱柱：Agilent Technologies公司Zorbax Eclipse XDB-C18分析柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈∶0.4％磷酸水溶液＝61∶39；流速：1.0mL/min；检测波长：242nm；柱温：25℃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述固体粉末与5％香草醛-冰醋酸以及高氯酸的配比是0.04mg∶0.5mL∶1.0mL；所述反应温度是60℃，反应时间是25分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤I)中，所述甲醇与所述固体粉末的配比是(0.04-0.06)g∶(10-75)mL。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤II)中，所述滤膜的孔径是0.45μm。
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