CN101861160A - 亲吻肽拮抗剂及其用途 - Google Patents

亲吻肽拮抗剂及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101861160A
CN101861160A CN200880116666A CN200880116666A CN101861160A CN 101861160 A CN101861160 A CN 101861160A CN 200880116666 A CN200880116666 A CN 200880116666A CN 200880116666 A CN200880116666 A CN 200880116666A CN 101861160 A CN101861160 A CN 101861160A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
group
amino acid
sequence
residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880116666A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101861160B (zh
Inventor
罗伯特·彼得·米勒
安东尼娅·凯瑟琳·罗思韦尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medical Research Council
Original Assignee
Medical Research Council
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medical Research Council filed Critical Medical Research Council
Publication of CN101861160A publication Critical patent/CN101861160A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101861160B publication Critical patent/CN101861160B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。本发明还提供了某些定义的肽分子，其可以作为亲吻肽拮抗剂，用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。此外，本发明提供鉴定和/或使用亲吻肽拮抗剂和/或所述定义的肽及其药物组合物的方法。

Description

亲吻肽拮抗剂及其用途
本发明涉及亲吻肽(kisspeptin)拮抗剂及其在用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症中的用途。此外，本发明还涉及用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法。
RFamide是在其C-末端具有通常的Arg-Phe-NH2基序一组肽激素，并且都与G蛋白偶联受体结合。已表明RFamide参与全身的许多过程，包括炎症反应、对食物摄入和发育的控制。RFamide发挥作用的一个主要方面是生殖，其涉及两种RFamide：促性腺激素抑制激素(GnIH)和亲吻肽。
KiSS-1基因位于人染色体1q32上，由四个外显子-两个非翻译和两个部分翻译的外显子组成，产生145个氨基酸(aa)的肽[1]。前体肽被剪切成54个氨基酸的长度，还可以进一步被截短至14、13或10个氨基酸；这些截短物被统称为亲吻肽，并且在哺乳动物中高度保守。目前已知这些肽是孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)(在大鼠中被称为GPR54，在人中被称为AXOR12)的配体[2-4]。10aa的肽，YNWNSFGLRF-NH2足以激活受体。
GPR54受体具有396aa的开放阅读框架，并与甘丙肽(galanin)受体家族相关，但是其并不与甘丙肽结合。大鼠GPR54在且哺乳动物中高度保守，与人受体有81％的同源性，与小鼠有85％的同源性[2，4，5]。在脑和外周组织中的受体和配体已得到充分表征，其中GPR54和KiSS-1位于下丘脑、主动脉、卵巢、前列腺和胎盘，GPR54还表达于垂体中[2，4，6，7]。
考虑到受体和配体表达的位置，假设了它们在生殖中起作用，并且通过证明GPR54因杂合和纯合突变性功能缺失而引起特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(iHH)而得到证实，在iHH患者中表现青春期延迟或无青春期(failed puberty)，以低或无血浆促黄体激素(LH)脉冲为特征[8-13]。这也在GPR54-/-小鼠中观察到，其具有小的睾丸/卵巢，小的外生殖器和输精管，发育不全的Leydig细胞和子宫角，与在iHH人患者中看到的非常相似[14]。这就使得关注KiSS-1和GPR54在控制青春期尤其是其时机中起作用的假设。之后，发现青春期猴子的KiSS-1 mRNA水平比幼年期猴子更高[15]。小鼠在第10日(d10)没有KiSS-1神经元，从第25日开始在前腹侧室旁核(Anterioventral Paraventricular nucleus，AVPV)中出现KiSS-1神经元，并且雄性小鼠大约在第45日而雌性小鼠在第61日增加至成年水平。这与这些动物的青春期时机相一致[16]。然而，GPR54 mRNA水平在出生后的整个青春期保持恒定，因此，亲吻肽输注可在所有阶段刺激LH释放。因此，亲吻肽被认为青春期始发中GnRH分泌的主要调节剂[17]。
亲吻肽和GPR54在下丘脑中的表达产生了亲吻肽可能参与调控下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴的假设。已通过证明亲吻肽在雄性大鼠和人中以剂量依赖的方式快速增加血浆促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)和睾丸素(其中其对LH的强效作用是对FSH的10倍)[18-20]而证实了这种假设。还进一步证明可以通过施用促性腺激素释放激素受体(GnRHR)拮抗剂而消除所述促性腺激素的增加。这表明亲吻肽在下丘脑水平发挥作用以刺激GnRH释放[15]。有关下丘脑的中间隆起处的GnRH神经元具有GPR54受体，而90％的KiSS-1神经元纤维与GnRH-免疫反应性神经元共定位的发现进一步证实了这一点[21，22]。另外，GT1-7下丘脑细胞也表达KiSS-1和GPR54 mRNA，其因对雌二醇反应而增加，而亲吻肽在24小时后刺激这些细胞释放GnRH[23]。以上数据还表明亲吻肽并不在垂体水平起作用，但是尚未排除直接在垂体水平起作用。其他研究小组还证明亲吻肽在垂体中的促性腺激素细胞和生长激素细胞中表达，并且亲吻肽可以直接刺激LH和生长激素的释放[24，25]。
KiSS-1神经元定位于啮齿动物和灵长动物下丘脑的弓状核(ARC)和AVPV。然而在羊和大鼠中，仅在ARC中发现KiSS-1神经元[16，26，27]。现在已确定ARC参与类固醇的负调节，而AVPV参与促性腺激素释放的正反馈控制。首次注意到，在将雄性小鼠阉割之后，观察到在ARC中，KiSS-1细胞数量和mRNA表达水平增加，并且雌激素替代使其降低至正常水平，而在AVPV中，KiSS-1细胞数量减少，并且雌激素给药使其升高回正常水平[26]。现在已证明KiSS-1细胞体表达雌激素受体α(ERα)和黄体酮受体，表明KiSS-1在类固醇反馈环中的作用[27，28]。这表明ARC在负控制下调节LH脉冲，而AVPV在正控制下可能刺激LH激增和诱导排卵。这通过亲吻肽抗血清甚至在高雌激素存在下也抑制大鼠LH激增而得到证明，此外，还因为雌鼠AVPV中的KiSS-1神经元比雄鼠多10倍。该类固醇控制在整个发情周期是起作用的，因为在AVPV中的KiSS-1-阳性细胞数量在动情前期最高，而在动情间期最低，而在ARC中的情形则与其相反[16，29]。对于羊，作用于ARC上的正和负反馈产生与其它哺乳动物尾部区域促进LH激增相同的反应。除了类固醇控制，KiSS-1还通过褪黑素受到光周期的调节，而且KiSS-1神经元在其细胞体上具有Mel1c受体。与保持在长日照条件下的雌性西伯利亚仓鼠相比，保持在短日照下的雌性西伯利亚仓鼠对外源性亲吻肽的反应也降低[30-33]。瘦素(leptin)似乎也具有影响作用，因为严格禁食的啮齿动物具有降低的KiSS-1 mRNA、GnRH、LH和FSH以及延迟的青春期[34，35]。
还在HPG轴外部的诸如心脏血管系统的外周组织中发现亲吻肽，已证明亲吻肽-10/13作为主动脉平滑肌的血管收缩剂起作用[7，36]。GPR54还高度表达于中枢神经系统(CNS)，脑海马区域中，已证明其通过涉及MAP激酶的机理可逆地增强海马齿状回颗粒细胞中的突触传递，其中所述机理似乎受到钙-激活激酶和酪氨酸激酶的调控[37]。KiSS-1和GPR54 mRNA还定位于大鼠卵巢中，其在大鼠卵巢中的表达同样与动情周期相关。在卵巢中，KiSS-1定位于卵巢表面上皮细胞、间质腺、黄体以及在卵泡中，直至动情前期都存在于膜细胞中，而动情前期时表达移至卵泡细胞层[6]。最近，在子宫输卵管中发现KiSS mRNA，并且假设其参与防止异位妊娠[38]。然而，KiSS-1和GPR54的最高水平在胎盘中。
在胎盘中，KiSS-1和GPR54定位于小鼠[39]和人[40]的合体滋养层细胞；和大鼠的巨细胞[41]。GPR54还定位于外绒毛滋养层细胞，表明其可能有旁分泌作用[42]。在人中，妊娠前三个月配体和受体都以高水平存在，但是足月仅有KiSS-1存在，而在大鼠中到E18.5期二者都不存在。这与滋养层的侵入相一致，而KiSS-1由于其抗转移性质而被假设为该侵入的抑制剂[39，41]。
还已知亲吻肽是许多癌症组织例如胰腺癌、甲状腺癌和肝细胞癌中的抗转移因子[43-45]。已假设了此功能的不同机制，包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的拮抗作用，以抑制其趋化因子受体CXCR4的转移性质，以及上调调节性钙依赖磷酸酶-相作蛋白-1(modulatory calcineurin-interactin protein-1，MCIP-1)，MCIP-1是能够抑制钙依赖磷酸酶信号传导途径的趋化激素[46，47]。另一个假设是亲吻肽受到特异性蛋白1(SP1)和位于染色体区域6q16.3q23的其共激活因子DRIP130的调控。当此区域出现杂合性缺失(LOH)时，肿瘤常缺失KiSS-1，而这允许转移发生。这可由抑制侵入和迁移的SP1和DRIP130补救[48，49]。
在培养的细胞中也证明了这种抑制，并且作为输出(output)以研究亲吻肽所使用的信号传导途径。在中国卵巢仓鼠(CHO)细胞中，亲吻肽-10(Kp10)可以抑制趋化性、迁移、集落形成和生长以及可以引起细胞变圆。Kp-10还可以通过粘着斑激酶(FAK)和paxillin蛋白的磷酸化作用而引起粘着斑和应力纤维的形成[3，50，51]。已证明亲吻肽和GPR54提高肌醇-3-磷酸、细胞内钙和pERK，表明GPR54激活Gq/11信号传导途径[4]。这与抗转移性质不完全一致，因为这种途径通常刺激生长和迁移。因此，表明亲吻肽可能激活其它途径，如Rho和Rac/Cdc42途径[5，51]。
在这个背景下，本发明的发明人惊奇地发现，亲吻肽拮抗剂可以用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
因此，在第一方面，本发明提供了亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。第二方面，本发明提供了亲吻肽拮抗剂，其用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
具体而言，发现GPR54受体的拮抗剂通过在下丘脑抑制GnRH释放，而可用于调控与促性腺激素和性类固醇相关的疾病。因此，亲吻肽拮抗剂是一个重要的发现，因为它们可能替代用于抑制促性腺激素的GnRH激动剂和拮抗剂，并且它们的作用更快速和完全。
GnRH类似物以抑制型形态被用于抑制促性腺激素和性激素，并且它们已经在激素依赖性疾病(如前列腺癌、乳癌和卵巢癌)的治疗中获得广泛的治疗应用，并在体外受精用于诱导排卵，以及作为新一代的避孕药。
因此，由于亲吻肽是GnRH的主要刺激物(例如，已知亲吻肽受体GPR54的突变引起不育)，本发明的发明人发现亲吻肽拮抗剂可能与GnRH拮抗剂有相似的应用范围；此外，由于亲吻肽操纵GnRH神经元的上游，预期亲吻肽拮抗剂的作用应该比基于GnRH的治疗法更快速和有效。
本文中，“个体中的亲吻肽活性”包括亲吻肽在体外和/或体内的任何特性、活性或特征。因而，本文中的“亲吻肽拮抗剂”的含义包括能够防止和/或降低亲吻肽在体外和/或体内的任何特性、活性或特征的分子。例如，亲吻肽拮抗剂可以防止和/或降低亲吻肽物理性地与亲吻肽受体或其它细胞成分缔合或结合的能力。
因而，本发明的分子和拮抗剂能够可逆地或不可逆地结合亲吻肽受体和/或选择性地结合亲吻肽受体。所述“选择性地结合”包括本发明的分子和拮抗剂与亲吻肽受体结合的能力比与其它多肽结合的能力强至少10倍；优选地强至少50倍，和更优选地强至少100倍。优选地，本发明的分子和拮抗剂在生理条件下，例如在体内与亲吻肽受体结合。测量肽与其配体或受体结合或缔合的方法(无论是在体内或是在体外)是生物化学和细胞生物学领域的技术人员所熟知的。
例如，如以下实施例中所显示的，本发明的拮抗剂可以是亲吻肽的竞争性拮抗剂，其结合但并不激活亲吻肽同源受体(如GPR54)。
亲吻肽拮抗剂还可以阻止和/或降低亲吻肽刺激具体细胞行为的能力，例如细胞中(例如在转化或原代细胞系如CHO、HEK、COS、GnRH GTI神经元细胞系以及正常滋养层和细胞系如JEG中)亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成。本领域中熟知用于肌醇磷酸生成的细胞测量的生物化学测定法。
在尤其优选的方面，拮抗剂为亲吻肽的肽类似物。亲吻肽的肽类似物的结构/活性关系(SAR)受到的关注相对较少，直到现在仍完全集中于激动作用[52，53]。亲吻肽的氨基酸序列(又被称为亲吻肽1-54)为：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF.NH2。
因而，第三方面，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为：
X1-G/W-X2-R/(D)R-X3
其中：
X1为F或A或任意D-氨基酸残基；
X2为L或A或任意D-氨基酸残基；
X3为F或W；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且所述肽序列不为：
F-G-L-R-F；
F-G-L-R-W；或
F-G-(D)F-R-F。
优选地，本发明肽分子的C-末端氨基酸残基包含基团z的情况下，该C-末端残基上的负电荷被去除。
应理解，在本文中使用常规的用于表示氨基酸的单字母代码来定义本发明所述的肽分子。术语“氨基酸”包括水溶性有机化合物中具有与α-碳原子连接的羧基(-COOH)和氨基(-NH2)基团的任何基团。氨基酸可以用通式R-CH(NH2)COOH表示；R基团为氢或有机基团，并且决定了任意具体氨基酸的性质。α-碳原子周围的四个不同基团的四面体排列使氨基酸具有光学活性。两种镜像形式被称为L-异构体和D-异构体。通常，仅有L-氨基酸是蛋白质(如真核蛋白质)的组成成分。
除非另作说明，本发明的肽分子包含L-氨基酸。当D-氨基酸存在于本发明的肽分子时，用带有前缀“(D)”的常规单字母氨基酸代码表示。
如所述，本发明的分子可以包含在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列或由在特定位置具有“任意D-氨基酸”的肽序列组成。所述“任意D-氨基酸”包括在序列中在特定位置的任意天然或非天然(例如化学修饰的)D-氨基酸。天然D-氨基酸的实例如下：D-丙氨酸；D-天冬氨酸；D-半胱氨酸；D-谷氨酸；D-苯丙氨酸；D-甘氨酸；D-组氨酸；D-异亮氨酸；D-赖氨酸；D-亮氨酸；D-蛋氨酸；D-天冬酰胺；D-脯氨酸；D-谷氨酰胺；D-精氨酸；D-丝氨酸；D-苏氨酸；D-缬氨酸；D-色氨酸；D-酪氨酸。
非天然D-氨基酸的实例如下：萘基丙氨酸；D-吡啶基丙氨酸；D-叔丁基丝氨酸；D-鸟氨酸；D-ε氨基赖氨酸；D-高精氨酸；D-α甲基亮氨酸以及用卤素取代(如F)这些和其它非天然氨基酸中的质子。
通过形成肽键，氨基酸结合形成短链(肽)或较长的链(多肽)。已知蛋白质和/或肽由不同比例的大约20种常见氨基酸组成，其序列决定了蛋白质和/或肽的形状、性质和生物学作用。这种肽或多肽链中的氨基酸残基通常用它们在链上的排列位置来表示，第一位(即位点1)指定为链N-末端的氨基酸。
可以通过Lu et al(1981)J.Org.Chem.46，3433和其中的参考文献中公开的Fmoc-聚酰胺式固相肽合成法来合成本发明分子的肽序列。用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团提供临时的N-氨基保护。使用含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺进行该高度碱不稳定的保护基团的重复去除。可以将侧链官能团保护成其丁基醚(对于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况)、丁基酯(对于谷氨酸和天冬氨酸的情况)、丁基氧羧基衍生物(对于赖氨酸和组氨酸的情况)、三苯甲基衍生物(对于半胱氨酸的情况)和4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰衍生物(对于精氨酸的情况)。当C-末端残基为谷氨酰胺或天冬酰胺时，使用4，4′-二甲氧基二苯甲基基团保护侧链氨基官能团。固相载体基于由二甲基丙烯酰胺(主链单体)、双丙烯酰乙二胺(交联剂)和丙烯酰肌氨酸甲酯(功能化试剂)三种单体组成的聚二甲基-丙烯酰胺聚合物。所使用的肽-树脂可断裂连接剂为酸不稳定的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外，全部氨基酸衍生物均作为它们预制的对称酐衍生物加入，而使用反向N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶联方法加入天冬酰胺和谷氨酰胺。使用茚三酮、三硝基苯磺酸或吲哚醌(isotin)检测方法来监测所有的偶联和去保护反应。合成完成时，从树脂载体切下肽，同时用含有50％清除剂混合物的95％三氟乙酸处理去除侧链的保护基团。常用的清除剂为乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择取决于所合成的肽的氨基酸组成。通过真空蒸发去除三氟乙酸，接着通过用乙醚研磨而提供粗肽。通过简单的萃取步骤来去除存在的任何清除剂，其中通过冷冻干燥水相提供不含清除剂的粗肽。用于肽合成的试剂通常可购自Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd，Nottingham NG7 2QJ，UK。纯化可以通过例如体积排阻色谱法、离子交换色谱法和(主要地)反相高效液相色谱法等技术中的任意一种或组合来实现。肽的分析可以使用薄层色谱法、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析以及快速原子轰击(FAB)质谱分析来进行。
还可以使用化学和生物化学领域技术人员所熟知的液相法来合成本发明分子的肽序列。
本发明分子的肽序列可以包含肽模拟物化合物或由肽模拟物化合物组成。术语“肽模拟物”是指模拟作为治疗剂的特定肽的结构和理想特征，同时避免了不期望特征的化合物。例如，可以口服给药的化合物吗啡，是脑啡肽和/或内啡肽的肽模拟物。
一般而言，由于缺乏口服生物利用度和蛋白水解的降解，涉及肽的治疗应用是受限的，并且通常通过注射给药。通常，例如肽在体内被外肽酶和内肽酶快速降解，以致其生物半衰期通常非常短。肽作为潜在的治疗剂的另一个缺陷是它们缺乏口服给药生物利用度。肽在胃肠道被蛋白水解酶降解很可能是重要的影响因素。然而，因为已认识到即使是不易被快速代谢失活的小环形肽或包括D-氨基酸的肽，仍然显示出较差的口服生物利用度，而使得问题更加复杂。这可能是由于跨肠膜转运较差和通过肝提取而从血液快速清除并且接着排泄到肠中而造成的。这些结果表明，多个酰胺键可能干扰口服生物利用度。由此认为当肽药物被口服给药时，肽链中连接氨基酸残基的肽键可能断裂或被切割。
有许多不同的方法用于设计和合成肽模拟物。在一种方法中，例如Sherman和Spatola，J.Am.Chem.Soc.，112：433(1990)所公开的方法中，以基本等排(isoteric)的方式由多种化学官能团替代一个或更多个酰胺键。这种分步的方法在获得活性类似物方面取得一些成绩。在一些例子中，这些类似物显示比它们天然存在的对应物具有更长的生物半衰期。尽管如此，这种方法有些局限性。很少能成功替代多于一个的酰胺键。因而，所得到的类似物在分子的其它部位仍然对酶促失活敏感。替代肽键时，优选新的接头部分具有与肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面。
反转肽模拟物(Retro-inverso peptidomimetics)，其中的肽键是反向的，可以用本领域中已知的方法合成，例如
Figure GPA00001138954200081
et al(1997) J.Immunol.1593230-3237中所描述的方法。该方法包括制备含有涉及主链变化，但不涉及侧链定向变化的伪肽。反转肽包含NH-CO键而不是CO-NH肽键，对蛋白酶解具有更强的抗性。之前已合成了某些GnRH肽的反转肽模拟物(Fromme，2003，Endocrinology，144：3262-9)。
在另一种方法中，将各种非编码或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修饰哺乳动物肽。可选择地，通过共价修饰如环化，或者通过加入γ-内酰胺或其他类型的桥而稳定假定的生物活性构象。参见例如，Veber etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：2636(1978)和Thursell et al，Biochem.Biophys.Res.Comm.，111：166(1983)。
许多合成策略的共同主题是向基于肽的骨架中引入一些环化部分(moiety)。环化部分限制肽结构的构象空间，并且这常常产生对特定生物受体的亲合力增加的肽。这种策略的其他优势在于，向肽中引入环化部分还可获得对细胞肽酶的敏感性减小的肽。
合成环化稳定的肽模拟物的一种策略是闭环置换反应(RCM)。这种方法包括合成肽前体并使其接触RCM催化剂，从而产生限定构象的肽的步骤。合适的肽前体可以包含两个或更多个不饱和的C-C键。该方法可使用固相肽合成技术来进行。在这个实施方案中，锚定至固相载体的前体与RCM催化剂相接触，然后将产物从固相载体切下，从而产生限定构象的肽。
另一种方法，由D.H.Rich在Protease Inhabitors，Barrett和Selveson eds.，Elsevier(1986)中公开，已通过在酶抑制剂设计中应用过渡态类似物概念设计肽模拟物。例如，已知辛伐他汀(staline)的仲醇模拟胃蛋白酶底物中易断裂的酰胺键的四面体过渡态。然而，过渡态类似物概念与激素激动剂/拮抗剂设计没有明显关联。
为避免怀疑，用标准肽键连接肽序列中的氨基酸残基并不是必需的。例如，如上所述，可以用反向肽键连接氨基酸残基，或者可以通过模拟标准肽键的键长和空间定向的其它键将它们连接在一起。
在合成之后，可以使用本领域中已知的方法，如HPLC和色谱法纯化本发明的活性剂(agent)的肽序列。
本文所述的“分子”包括包含本发明的肽序列或由本发明的肽序列组成的分子的盐(如有机或无机酸加成盐)、酯和溶剂化物。应理解，该术语还包括与相关分子具有相同生物功能和/或活性的衍生物。此外，为了本发明的目的，该术语还包括相关分子的前药(例如，酯)。术语“前药”包括任意物质组分，其在口服或肠胃外给药后并且在给药后的预定时间内，在体内代谢形成相关活性剂，该活性剂的量是用实验方法可检测的。
本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(t1/2)的一个或更多部分组成，或者包含能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(t1/2)的一个或更多部分。因此，所述部分可以提高本发明分子的功效。优选地，当该分子包括包含D-氨基酸或由D-氨基酸组成的肽序列或者由包含D-氨基酸或由D-氨基酸组成的肽序列组成时，本发明的分子中可包含一个或更多所述部分，这是因为D-氨基酸残基尤其易于被修饰。
本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(t1/2)的一个或更多部分组成，或者包括能够使本发明的分子靶向和/或定位至靶细胞(如癌细胞)和/或能够增加本发明分子的半衰期(t1/2)的一个或更多部分。因此，所述部分可以提高本发明的分子的功效。优选地，当该活性剂包括包含D-氨基酸的肽序列或由包含D-氨基酸的肽序列组成时，本发明的分子中可包含一个或更多所述部分，这是因为那些D-氨基酸残基尤其易于被修饰。
优选地，所述一个或更多部分为类固醇激素分子(包括例如黄体酮、睾丸酮、雌二醇或皮质醇)，并且与D-氨基酸的侧链结合。类固醇激素分子能够结合血浆蛋白，且已被证明能降低肽的代谢清除率(Ratcliffe et al.，2006，Endocrinology，147：571-9)。例如，在WO2004/08725中描述了与类固醇激素结合的GnRH肽，该篇文献引入本文作为参考。可选择地，所述一个或更多部分为维生素，如维生素B12或维生素D，并且与亲吻肽类似物的NH2端或者天然或D-氨基酸的合适侧链结合。已证明维生素提高肽的口服生物利用度(Russell-Jones et al.，1995，Bioconjug.Chem.，6：34-42；Russell-Jones et al.，1995，Bioconjug.Chem.，6：459-465)。
优选地，本发明的分子作为亲吻肽拮抗剂的能力不受所述一个或更多部分影响和/或显著影响。
优选地，本发明提供用途，其中所述肽序列不为：
F-G-A-R-W；
F-G-L-(D)R-W；
F-G-(D)L-R-W；或
(D)F-G-L-R-W。
方便地，本发明提供用途，其中X1为(D)F。优选地，X2为选自(D)F、(D)L和(D)W的D-氨基酸残基。
更优选地，所述肽序列选自：
(D)F-W-L-R-W；或
F-G-(D)W-R-F。
在一个实施方案，本发明提供用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。通常，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
所述基团y可选自：乙酰基(在本申请全文中以“ac”表示)；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸(例如氨基通过加入其它化合物(如焦谷氨酸)或化学基团例如烷基(例如甲酰基、乙酰基、丙基、丁基和更长的烷基)而被修饰的氨基酸)。
优选地，本发明提供用途，其中X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
在一个实施方案中，本发明提供用途，其中所述序列选自：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z；
IV)ac.F-G-A-R-W.z；
V)ac.A-G-L-R-W.z；
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z；或
VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
在一个实施方案中，用去除该残基上的电荷的基团y替代以上(I)至(VI)的任意一种肽的N-末端残基上的乙酰基(以上和本申请中全文以“ac”表示)，并且所述基团y优选选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中，本发明第三方面的用途涉及在本发明第三方面的肽序列的N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第三方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
在优选的实施方案中，本发明第三方面的用途涉及在肽序列N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y组成的分子。
所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽(Antennapedia)的七肽序列，所述果蝇触足肽促进和/或提高细胞中肽序列的递送，从而提高本发明的肽的治疗用途。所述果蝇触足肽七肽描述于Fisher et al.，2003，J.Peptides Res.，55：163-72；和Wang et al.，2006，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters，16：2628-2631。
因此，本发明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成：
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-A-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-A-G-L-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W.z；或
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F.z。
任选地，如上所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
优选地，本发明第三方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第三方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的1至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的1至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第三方面的肽序列可以在其N-末端具有以下的序列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
可选择地，本发明第三方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
在第四方面，本发明提供肽分子或者其片段或变体在治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述肽分子包含以下序列或由以下序列组成：
XA-XB-XC-N-XD-XE-G-XF-R-F
其中：
XA为Y或任意的D-氨基酸残基；
XB为N或任意的D-氨基酸残基；
XC为W或任意的D-氨基酸残基；
XD为G或S或任意的D-氨基酸残基；
XE为F或(D)W或(D)L；
XF为W或L或任意的D-氨基酸残基；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且所述肽序列不为：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F；或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
优选地，XA为选自以下的D-氨基酸残基：(D)F和(D)Y和(D)A。通常，XB为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)N。在一方面，当XA或XB中的一个为(D)Y时，另一个不为(D)N。在另一方面，XA和XB不都为D-氨基酸残基。优选地，当XF为(D)W时，XA为(D)F。
优选地，本发明提供用途，其中XC为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)W。
在一个实施方案中，XD为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)W。优选地，当XD为S时，XF为(D)W和/或XA不为(D)Y，更优选地，当XD为S时，XF为(D)W和/或XA为(D)A。
优选地，XF为选自以下的D-氨基酸残基：(D)L和(D)W.
在一个实施方案中，当XE和XF都为(D)W时，XA不为(D)Y。优选地，当XE和XF都为(D)W时，XA为(D)A。
典型地，本发明提供用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。优选地，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。所述基团y选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个优选实施方案中，本发明提供用途，其中所述肽分子的C-末端F残基包含去除该残基上的电荷的基团z。
在一个实施方案，所述肽序列选自：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；
s)ac.(D)-A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
在一个实施方案中，本发明第四方面的用途涉及在本发明第四方面的肽序列的N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第四方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
在一个优选实施方案中，本发明第四方面的用途涉及在肽序列的N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y的分子，或者由在肽序列的N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y组成的分子。
如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明第四方面的肽可以包含以下序列或由以下序列组成：
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
任选地，如上所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
在特别优选的实施方案中，本发明第四方面的肽序列选自：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；或
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z。
如以下实施例中所显示的，本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的N-末端果蝇触足肽七肽。
优选地，本发明第四方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第四方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的1至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的1至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第四方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
可选择地，本发明第四方面的肽序列可以加入蛋白质如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
本文所述“个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症”包括个体中的此病症的症状和/或进展和/或结局是由亲吻肽活性引起、诱导、提高、增强和/或使加重的病症。
优选地，个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症选自：增殖性疾病；子宫内膜异位症；子宫肌瘤；性早熟；先兆子痫；胎儿宫内生长迟缓(IUGR)；异位妊娠；月经过多；高血压；冠心病；中枢神经系统(CNS)、胰腺和/或免疫系统疾病；阻抑或抑制排卵；生育病；化疗引起和/或放疗引起的生殖组织损伤；阻抑和/或抑制创伤愈合；阻抑和/或抑制生长激素生成。
例如，在由促性腺激素和性类固醇激素刺激的生殖组织中，亲吻肽拮抗剂将抑制GnRH分泌，从而抑制对生殖组织和生殖系统癌症的刺激。因此，亲吻肽拮抗剂可用于抑制内源性促性腺激素，使得外源性促性腺激素可以以受控的方式给药，以治疗患有阻抑或抑制排卵的个体，从而诱导或提高个体的排卵。因此，亲吻肽拮抗剂还可被用于降低或抑制生育力，从而获得男性和女性都适用的避孕方式。此外，亲吻肽拮抗剂对刺激生殖组织的抑制将允许它们应用于防止化疗引起或放疗引起的生殖组织损伤，从而保护接受化疗和/或放疗的癌症个体的生殖组织。
如以下实施例中所显示的，本发明的拮抗剂能够抑制和/或减小亲吻肽对细胞迁移的抑制作用。由于在创伤愈合中需要出现细胞迁移，因此，亲吻肽在抑制创伤愈合中发挥作用。因此，在一个实施方案中，本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以诱导和/或促进创伤愈合。
如以下实施例中所显示的，令人惊奇地，本发明的拮抗剂提高测试个体中的生长激素水平。因此，本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以促进和/或诱导生长激素生成。例如，本发明的拮抗剂可以与使用生长激素的现有疗法一起使用，例如用于肾衰竭的治疗。
亲吻肽独立地抑制滋养层侵入子宫壁(即植入)，如在先兆子痫或IUGR中所发生的。对于先兆子痫，已证明KiSS-1 mRNA增加，抑制母体血液供应的正确的滋养层侵入[54]。因而，亲吻肽拮抗剂可被用于减轻所述抑制，并且例如，允许在病态妊娠，如先兆子痫期间发生滋养层侵入。
已知亲吻肽独立地诱导血管收缩，并且因此亲吻肽拮抗剂可以被用于治疗高血压，例如在外周组织中作为高血压药物以降低血管的血管收缩。GPR54表达于CNS中，并且亲吻肽拮抗剂可用于调节CNS功能(如在海马齿状回颗粒细胞中)。
在一个实施方案中，由去除该残基上的电荷的基团y替代以上(e)至(s)的任意一种肽的N-末端残基上的乙酰基，并且所述基团y优选选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
已知亲吻肽以高水平在胎盘中表达，并且参与植入。植入不良可能导致先兆子痫和胎儿宫内生长迟缓，对于这些疾病至今(在本发明以前)未有有效的治疗。
亲吻肽及其受体(GPR54)还表达于滋养层和子宫细胞中(Hiden et al.，2007，Rev.Endocr.Metab.Disord.，8：31-39)，如以下实施例所显示的，本发明的发明人证明亲吻肽导致胎儿生长迟缓。因此，亲吻肽输入的调节将可应用于先兆子痫、胎儿宫内生长迟缓(IUGR)和异位妊娠。
此外，亲吻肽和GPR54诱导血管收缩增强(Mead et al.，2007，Endocrinology，148：140-147)，并且存在于动脉粥样硬化斑块中，因此亲吻肽拮抗剂可以用于治疗高血压和冠心病。
亲吻肽和它的受体(GPR54)还广泛表达于中枢神经系统、胰腺和免疫系统中(Muir et al.，2001，J.Biol.Chem.，276：28969-28975；Kotani et al.，2001，J.Biol.Chem.，276：34631-34636)，因此拮抗剂可以应用于这些组织的疾病。
优选地，由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症为动物的病症。所述动物可以是人，或可以是任何哺乳动物，如驯养哺乳动物(优选有农业或商业重要性的动物，包括鸡；猫；狗；猪；羊；牛；马)。
更优选地，所述增殖性疾病选自或包括：良性前列腺增生症；癌症；生殖组织的癌症；妇科癌症；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宫癌；宫颈癌；子宫内膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。
使用本发明的分子可能治疗所有表达亲吻肽受体的癌症。优选地，所述癌症为生殖系统癌症(包括前列腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌和乳癌)，这些病症全都表达亲吻肽受体。
用于检测细胞蛋白表达的方法是本领域中所熟知的。合适用于检测亲吻肽受体的方法包括：用于检测编码亲吻肽受体的mRNA存在的原位杂交和/或PCR；用于检测亲吻肽受体蛋白存在的放射性配体结合法；以及使用能够特异性结合亲吻肽受体的抗体的方法(例如免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫荧光法和ELISA)。
优选在本发明的第三和/或第四方面定义的肽分子为亲吻肽拮抗剂，或者其片段或变体为亲吻肽拮抗剂。
优选地，本发明提供根据本发明第一和/或第二方面的拮抗剂，或者本发明第三或第四方面定义的肽分子，其用于药物。更优选地，所述肽分子为亲吻肽拮抗剂。
在第五个实施方案中，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的的肽分子，或者其片段或变体：
X1-G/W-X2-R/(D)R-X3
其中：
X1为F或A或任意的D-氨基酸残基；
X2为L或A或任意的D-氨基酸残基；
X3为F或W；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且所述肽序列不为：
F-G-L-R-F；
F-G-L-R-W；
F-G-(D)F-R-F；
F-G-A-R-W；
F-G-L-(D)R-W；
F-G-(D)L-R-W；
A-G-L-R-W；或
(D)F-G-L-R-W。
优选地，本发明提供肽分子，其中X1为(D)F。通常，X2为选自以下的D-氨基酸残基：(D)F、(D)L和(D)W。
方便地，根据本发明的第五方面的肽分子选自：
(D)F-W-L-R-W；或
F-G-(D)W-R-F。
在一个优选实施方案中，所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。优选地，X1包含去除该残基上的电荷的基团y。尤其优选基团y选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中，X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
优选地，所述肽序列选自：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z；
IV)ac.F-G-A-R-W.z；
V)ac.A-G-L-R-W.z
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z；或
VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
在一个实施方案中，以上(I)至(VI)的任意一种肽的N-末端残基的乙酰基被去除该残基上的电荷的基团y替代，并且优选y基团选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中，本发明第五方面的肽分子涉及在本发明第五方面的肽序列N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的分子，或者由在本发明第五方面的肽序列N-和/或C-末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子，从而将所述肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第五方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
在优选实施方案中，本发明第五方面的肽分子包含在N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y，或者由在N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y组成。
如上所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明第五方面的肽分子可以包含以下序列或由以下序列组成：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-A-R-W.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-A-G-L-R-W.z
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W.z；或
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F.z。
任选地，如上所定义，所述N-末端残基可以在N-末端包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
优选地，本发明第五方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第五方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的1至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的1至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第五方面的肽序列可在其N-末端具有以下的序列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
可选择地，本发明第五方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
在第六方面，本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子，或者其片段或变体：
XA-XB-XC-N-XD-XE-G-XF-R-F
其中：
XA为Y或任意D-氨基酸残基；
XB为N或任意D-氨基酸残基；
XC为W或任意D-氨基酸残基；
XD为G或S或任意D-氨基酸残基；
XE为F或(D)W或(D)L；
XF为W或L或任意D-氨基酸残基；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且所述肽序列不为：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F；或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
优选地，在本发明第六方面肽分子提供XA为选自以下的D-氨基酸残基：(D)F和(D)Y和(D)A。优选XB为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)N。
在一个实施方案中，本发明提供肽分子，其中当XA或XB中的一个为(D)Y时，另一个不为(D)N。一个尤其优选的实施方案是其中XA和XB不都为D-氨基酸残基。在一个实施方案中，当XF为(D)W时，XA为(D)F。
优选地，XC为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)W。方便地，XD为选自以下的D-氨基酸残基：(D)A和(D)W。通常，XF为选自以下的D-氨基酸残基：(D)L和(D)W。
在一个实施方案中，当XD为S时，XF为(D)W和/或XA不为(D)Y。优选地，当XD为S时，XF为(D)W和/或XA为(D)A。
在一个实施方案中，当XE和XF都为(D)W时，XA不为(D)Y。优选地，当XE和XF都为(D)W时，XA为(D)A。
方便地，本发明提供了肽分子，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。在一个实施方案中，X1包含去除此该残基上的电荷的基团y。通常，基团y选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在优选实施方案中，肽分子的C-末端F残基包含去除此该残基上的电荷的基团z。
本发明第六方面的肽分子最优选包含选自以下的肽序列或由选自以下的肽序列组成：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；或
s)ac.(D)-A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
在一个实施方案中，由去除该残基上的电荷的基团y替代以上(e)至(s)的任意一种肽N-末端残基的乙酰基，并且基团y优选选自：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或N-末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中，本发明第六方面的肽分子涉及在本发明第六方面的肽序列N-和/或C-末端包含额外氨基酸残基或肽的分子，或者由在本发明第六方面的肽序列N-和/或C-末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子，从而将肽序列加入较大的多肽或蛋白质分子中。因而，本发明第六方面的肽序列在N-和/或C-末端可以包含0至10个氨基酸；或10至20个氨基酸；或20至30个氨基酸；或30至40个氨基酸；或40至50个氨基酸；或50至60个氨基酸；或60至70个氨基酸；或70至80个氨基酸；或80至90个氨基酸；或90至100个氨基酸；或多于100个氨基酸。
在优选实施方案中，本发明第六方面的肽分子涉及在肽序列N-末端包含额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y的分子，或者由在肽序列N-末端的额外肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y或ac.R-R-M-K-W-K-K-Y组成的分子。
如前所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此，本发明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成：
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
任选地，如上文所定义，所述N-末端残基在N-末端可以包含基团y，并且优选为乙酰基(ac)。
在尤其优选的实施方案中，所述肽序列选自：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；或
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z。
如以下实施例所显示的，本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的N-末端果蝇触足肽七肽。
优选地，本发明第六方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优选地，本发明第六方面的肽序列的N-末端可以延长至包含亲吻肽1-54的肽序列(即亲吻肽序列的1至54个氨基酸残基)和/或亲吻肽1-45的肽序列(即亲吻肽序列的1至45个氨基酸残基)的任意长度。例如，本发明第六方面的肽序列在其N-末端可具有以下的序列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
可选择地，本发明第六方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和/或免疫球蛋白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
在一个实施方案中，本发明提供了肽分子，其中所述z为NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N-丁基酰胺。
优选地，z具有的分子量小于200，优选小于150，优选小于100。优选地，z为NHR’，其中R’为H或C1至C4烷基或z为OR”，其中R”为C1至C4烷基。优选地，z为酰胺。优选地，z为NH2或N-丙基酰胺或N-乙基酰胺(NHEt)或N-甲基酰胺或N-丁基酰胺。
在第七实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的本发明的拮抗剂或本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂，或者由有效量的本发明的拮抗剂或本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂组成。
本文所述“有效量”是指本发明分子的量足够减轻和/或缓解和/或防止个体中与由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症相关的症状。例如，“有效量”可以通过在动物(并且，如果可能，人)中进行用于抑制促性腺激素和/或类固醇激素的剂量研究而确定；剂量范围可以是通过皮下或腹膜内或口服递送每日1-100mg。
还可以通过使用实施例中所描述的方法在体外确定有效量(例如，用于监测细胞中对亲吻肽与亲吻肽受体结合的拮抗作用和/或对亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的拮抗作用的方法)或通过监测个体中(如动物)与由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症相关的症状的减轻和/或缓解和/或防止而在体内确定所述有效量，其中所述症状是相关医药领域的技术人员所熟知的。
关于在体外监测亲吻肽拮抗作用的方法，本领域技术人员理解，可以监测其它或另外的细胞和酶活性来测量亲吻肽介导的刺激。例如，已知Gq G蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二酰基甘油，进而分别动员Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活细胞外调节激酶(ERK)和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联及其成员；因此，技术人员可监测那些细胞成分中任意一种或全部成分的活性和/或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
在第八个实施方案中，本发明提供治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：向所述个体施用本发明第七方面的药物组合物，或有效量的本发明第一或第二方面的亲吻肽拮抗剂，或有效量的本发明第二、第三、第四和/或第五方面的肽分子。
可以使用注射型缓释药物递送系统递送本发明的分子、药物和药物组合物。这些特别设计用于减少注射频率。所述系统的实例为Nutropin Depot，其将重组人生长激素(rhGH)封装在生物可降解的微粒中，一旦注射，在持续时间内缓慢释放rhGH。优选地，进行肌内(i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)递送。
可以通过将药物直接释放至所需位置的手术植入器械施用本发明的分子、药物和药物组合物。例如，Vitrasert直接释放更昔洛韦(ganciclovir)至眼睛，以治疗CMV视网膜炎。将该有毒活性剂直接施用至患病部位，来实现有效治疗而没有药物的明显全身副作用。
还可以利用电穿孔治疗(EPT)系统来施用本发明的活性剂、药物和药物组合物。向细胞递送脉冲电场的设备提高了细胞膜对药物的渗透性，导致细胞中的药物递送显著增强。
本发明的分子、药物和药物组合物还可以通过电导入(electroincorporation，EI)递送。当皮肤表面上直径至多30微米的小微粒经历与电穿孔中所使用的电脉冲相同或类似的电脉冲时，出现EI。在EI中，这些微粒被驱动通过角质层并进入更深层的皮肤。所述微粒可以负载或包被药物或基因，或者可以简单地作为“子弹”而在皮肤上产生药物可以进入的孔。
本发明的分子、药物和药物组合物的另外的递送方法是热敏的ReGel可注射系统。低于体温时，ReGel是可注射液体，而在体温下，其立即形成缓慢消蚀并溶解成已知安全的生物可降解聚合物的凝胶储库。活性物质随着生物聚合物溶解而被递送。
本发明的分子、药物和药物组合物还可以口服递送。所述过程利用体内口服摄入维生素B12和/或维生素D的自然过程来共递送蛋白质和肽。借助于维生素B12和/或维生素D的摄入系统，本发明的核酸、分子和药物制剂可以通过肠壁。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间形成复合物，其既保持复合物中维生素B12部分/维生素D部分对内因子(IF)的有效亲合力，又保持了复合物中活性物质的有效生物活性。
本发明的分子、药物和药物组合物可以通过“木马肽(Trojan peptide)”引入细胞。这些是一类称为穿透肽(penetratin)的多肽，其具有转位性质，并且能够携带亲水化合物穿过质膜。该系统允许将寡肽直接靶向细胞质和核，并且可以是非细胞类型特异性的和高度有效的。参见Derossi et al.(1998)，Trends Cell Biol 8，84-87。
优选地，本发明的药物和/或药物组合物为单位剂型，该单位剂型包含日剂量或单位、日亚剂量或其适当部分的活性成分。
本发明的分子、药物和药物组合物通常以包含活性成分的药物组合物的形式，以药学上可接受的剂型，通过口服或通过任何肠胃外途径施用，所述活性成分任选为无毒的有机或无机酸或碱、加成盐的形式。所述组合物可以以不同剂量施用，这取决于待治疗的疾病和患者以及给药途径。
在人治疗中，本发明的分子、药物和药物组合物可以单独给药，但是通常与根据要给药途径和标准药物实践而选择的合适的赋形剂、稀释剂或载体混合给药。
例如，本发明的分子、药物和药物组合物可以以可包含调味剂或着色剂的片剂、胶囊、卵形栓剂(ovule)、酏剂、溶液或混悬剂的形式口服、口含或舌下给药，用于速释、延时释放或控释。本发明的分子、药物和药物组合物还可以通过海绵体中注射给药。
所述片剂可以包含赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及颗粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可以包含润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。
相似类型的固体成分还可以用作明胶胶囊的填料。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，本发明的活性剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料组合，与乳化剂和/或助悬剂组合，以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合，及其组合物组合。
本发明的分子、药物和药物组合物还可以肠胃外给药，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸内、颅内、肌内或皮下，或它们可以通过输注技术给药。它们最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可包含其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。若有必要，水溶液应当适当缓冲(优选pH 3至9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂易于通过本领域技术人员所熟知的标准制药技术完成。
适合用于肠胃外给药的药物和药物组合物包括水和非水无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预定接受者的血液等渗的溶质；并且含水和非水无菌混悬剂可以包含助悬剂和增稠剂。所述药物和组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冻干条件下保存，在使用前仅需直接加入无菌液体载体例如用于注射的水。可以由之前描述的各种无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备即用型注射溶液和混悬剂。
对于向人患者的口服和肠胃外给药，本发明的分子、药物和药物组合物的日剂量水平通常为每成人每日单次或分次剂量给药0.1至100mg。
因而，本发明分子的片剂或胶囊例如可以包含0.1mg至100mg的活性剂，根据需要用于一次单片(粒)或两片(粒)或更多给药。无论如何，医生可确定最合适任何个体患者的实际剂量，并且随着具体患者的年龄、体重和反应而变化。以上剂量是示例性的平均情况。当然也可以有更高或更低剂量范围的个体实例，并且这些都在本发明的范围之内。
本发明的分子、药物和药物组合物还可以鼻内或通过吸入给药，并且以干粉末吸入器的形式或以从具有使用合适抛射剂的压力容器、泵、喷雾或雾化器提供的气雾剂喷雾的形式方便地被递送，所述抛射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA)、二氧化碳或其它合适的气体。对于压力气雾剂来说，可以通过提供递送计量的量的阀来确定剂量单位。所述压力容器、泵、喷雾或雾化器可以包含活性剂的溶液或混悬剂，例如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂，如失水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以配制成包含本发明的活性剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选配制气雾剂或干粉制剂，使得每个计量的剂量或“吸(puff)”包含至少0.1mg本发明的分子，用于递送至患者。应理解气雾剂的每日总剂量将因患者不同而改变，并且可以以单次剂量给药，或更常见是全天分次剂量给药。
可选择地，本发明的分子、药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓的形式给药，或它们可以以洗剂、溶液、乳膏、凝胶、软膏或扑粉(dusting powder)的形式局部应用。本发明的分子、药物和药物组合物还可以以透皮给药，例如，通过利用皮肤贴膏给药。它们还可以通过眼部途径给药，尤其是用于治疗眼部疾病的情况下。
对于眼科使用，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成在等渗的、pH经调节的无菌生理盐水中的微粒化混悬剂，或优选地，配制成在等渗的、pH经调节的无菌生理盐水中的溶液，任选地，与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。可选择地，它们可以配制于软膏，如矿脂中。
对于向皮肤的局部应用，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成合适的包含所述活性剂的软膏，所述活性剂悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂、乳化蜡和水。可选择地，它们可以配制成合适的洗剂或乳膏，悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中：矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨糖醇酯60、十六烷基酯蜡、十六醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
适合用于口腔局部给药的制剂包括糖锭，其包含在调味基质中的活性成分，所述调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；锭剂，其包含在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口水，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
通常，对于人，优选的途径是口服或肠胃外给药本发明的活性剂的分子、药物和药物组合物，这样最为方便。
对于兽医使用，可根据标准兽医实践将本发明的分子、药物和药物组合物作为合适的可接受的制剂施用，并且兽医将确定最适合具体动物的给药方案和给药途径。
方便地，所述制剂为药物制剂。
有利地，所述制剂为兽医用制剂。
尤其优选的是，使用医学和制药领域已知的肽制剂配制本发明的分子，如在GnRH肽激动剂制剂中使用的那些(例如，包括聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶悬浮液或由聚甘氨酰丙交酯共聚物和/或聚乙二醇和/或油和/或微晶悬浮液或由其组成的制剂，可以用于注射本发明的分子)。
在本发明的第九方面，本发明提供用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
i)提供待测试的化合物；
ii)确定(i)中的化合物结合亲吻肽受体的能力；
iii)确定(i)中的化合物拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力；和
iv)在所述化合物能够结合亲吻肽受体并能够拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的情况下鉴定该化合物作为亲吻肽拮抗剂。
因而，本发明第九方面的方法可以用于确定具体测试化合物或测试分子(例如，包含以下肽序列或由以下肽序列组成的测试化合物或测试分子：亲吻肽的部分或全部肽序列的类似物)是否具有结合亲吻肽受体和功能性拮抗细胞内(例如用人亲吻肽受体GPR54瞬时或稳定转染的细胞系，如CHO、HEK或COS细胞系)亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力。以下实施例描述适合用于确定化合物结合亲吻肽受体的能力和用于测量细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的方法。本领域技术人员已知其它适当的方法。
例如，如上所述，本领域技术人员将理解可以监测其它或另外的细胞和酶活性来测量亲吻肽介导的刺激。例如，已知Gq G蛋白激活磷脂酶(其生成IP和二酰基甘油，进而分别动员Ca2+和激活蛋白激酶C)和蛋白激酶C磷酸化并激活细胞外调节激酶(ERK)和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联及其成员；因此，技术人员可监测那些细胞成分的任意或全部成分的活性和/或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
优选地，若是其具有＜100nM的结合亲合力(即Kd)，则确认所述测试化合物或分子能够结合亲吻肽受体。
优选地，如以下实施例所描述，可根据能够拮抗10nM亲吻肽刺激细胞内肌醇磷酸生成的能力而鉴定所述测试化合物或分子。优选地，根据能够达到至少40％抑制10nM亲吻肽刺激而鉴定所述测试化合物或分子；更优选地，可达到至少50％或60％或70％或80％或90％或100％抑制。
例如，能够达到40％或以下地抑制10nM亲吻肽刺激的化合物不被认为是拮抗剂。能够达到40％至80％地抑制10nM亲吻肽刺激的化合物可以被认为是“弱”拮抗剂。能够达到80％或以上地抑制10nM亲吻肽刺激的化合物可以被认为是“强”拮抗剂。
优选地，本发明第九方面的方法还包括以下步骤或由以下步骤组成：根据本文描述的方法或本领域中已知的方法，制备或合成在步骤(iv)中鉴定为亲吻肽拮抗剂的化合物或分子。
更优选地，所述方法还包括以下步骤或由以下步骤组成：根据在此描述的方法或本领域中已知的方法，将本发明第九方面鉴定的化合物或分子(或合成的化合物或分子)配制成药物组合物或药物。
在本申请中列出或讨论的在先公开文件不应当必然地被视为承认所述文件是现有技术的一部分或公知常识。
优选地，现在将参考以下附图描述具体体现本发明的某些方面的非限制性实施例：
表1：亲吻肽类似物刺激肌醇磷酸(IP)和抑制10nM亲吻肽刺激IP。
图1：A-GPR54稳定转染的CHO细胞中亲吻肽的结合剂量反应。
B-GPR54稳定转染的CHO细胞中亲吻肽的IP剂量反应。
图2：A-在完整的雄性大鼠中重复注射化合物210(0、60、120min)干扰亲吻肽-10(100pmol)(120min)的有效LH-和睾丸酮释放作用的能力。
B-在完整的雄性大鼠中重复注射化合物234干扰亲吻肽-10(100pmol)的有效LH-和睾丸酮释放作用的能力。
C-在睾丸切除雄性大鼠中重复注射化合物210(0、60、120min)降低升高的LH水平的能力。
图3：中央输注亲吻肽拮抗剂抑制OVX母羊中LH的分泌脉冲。显示用亲吻肽拮抗剂处理的母羊(实心柱)或对照母羊(空心柱)中LH的浓度。箭头指示如材料和方法中定义的LH脉冲。
图4：剂量反应结合曲线和剂量反应IP曲线和肽拮抗剂的IP竞争试验。
图5：用拮抗剂234抑制亲吻肽刺激的GnRH神经元放电。
图6：亲吻肽处理导致较差植入，降低胎儿体重。因此亲吻肽在胎儿生长迟缓中发挥作用，表明拮抗剂可以用于治疗有较差植入(其将导致例如流产和先兆子痫)病史的女性。
图7：N-末端取代和C-末端截短产生部分激动剂。在亲吻肽-10的N-末端进行氨基酸取代并在c-末端进行截短。截短至7个氨基酸(a)或5个氨基酸(b)长度引起部分激动作用。当截短至5个氨基酸并与在Leu8位有(D)-Leu组合时进一步增强了所述部分激动作用(c)。
图8：对人gpr-54受体的氨基酸取代产生拮抗剂，其中用Gly55和D-Trp8取代是关键的。(a，b)用甘氨酸或D-Ala氨基酸取代丝氨酸5和用D-氨基酸取代Leu8的组合产生部分激动剂。(c，d)进一步用D-Ala或D-Tyr取代Tyr1增强了该拮抗作用，进一步产生对gpr-54受体的完全拮抗剂。然而，从Tyr1位为D-氨基酸的拮抗剂去除Gly5和D-Trp8降低或消除类似物的拮抗特性。(e)当用D-Tyr替代Tyr1时，这是最为明显的，因为一个或两个取代的去除即消除了拮抗作用。(f)用D-Ala替代Tyr1时的作用不太明显，但拮抗作用仍被降低(*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001)。
图9：肽234以与亲吻肽-10相同的亲合力结合。当I125-标记的亲吻肽-10与亲吻肽-10(a)或肽234(b)竞争时，它们结合的亲合力都为2nM。
图10：肽234拮抗亲吻肽-10对GnRH神经元的刺激。GnRH神经元放电频率随着时间变化的代表性记录。(a)在1nM亲吻肽-10(柱)之后增加的GnRH放电频率。下行的峰值是个体的动作电流。(b)肽234(1nM，柱)抑制亲吻肽-10(1nM)的刺激作用。(c)总柱状图显示在基线(白柱)和亲吻肽-10(黑柱)期间放电频率倍数变化的平均值±SEM，亲吻肽-10显著增加了GnRH神经元的放电活动(n＝7，*p＜0.002)。对亲吻肽-10的反应随着1、10、100nM肽234的出现而显著降低(1nM n＝5，10nM n＝6，100nM n＝7，#p＜0.001所有组)。
图11：肽234阻抑体内GnRH释放。显示来自肽234对GnRH释放的影响和组平均值(±sem，n＝6)的代表性实例。(a)通过输注10nM肽234至柄-中间隆起区域，阻抑GnRH在下丘脑的脉冲式释放(深色阴影柱)。短箭头指示用PULSAR确定的GnRH峰。(b)相反地，作为对照的载体输注未引起GnRH释放的任何显著变化(浅色阴影柱)。(c)数据分析表明，与肽234使用之前以及载体对照的水平相比，肽234显著阻抑了GnRH释放(p＜0.05)。(d)载体输注未引起任何显著变化。基于我们之前的评估，相似尺寸的透析膜通过～10％的肽，估计肽234在柄-中间隆起区域的浓度为1nM。与肽234处理之前相比，*p＜0.05；与相应时间段的对照相比，p＜0.05。
图12：肽234对完整和阉割的雄性大鼠中基础和亲吻肽-10刺激的血浆LH的影响。在完整的雄性大鼠中，肽234(a)抑制亲吻肽-10诱导的LH分泌。在0和60min时给动物两次推注肽234，接着在120min一次输注亲吻肽-10。根据所计算的曲线下面积(AUC；p＜0.05)，所述肽显著抑制此后2小时的LH生成。还用柱图显示亲吻肽输注60min之后(即在实验180-min)的睾丸酮水平。此外，阉割雄性大鼠接受三次输注肽234，其抑制LH分泌(b)。
图13：中央输注肽234抑制OVX母羊中LH的分泌脉冲。显示用肽234处理的母羊(实心柱)或对照母羊(空心柱)中的LH浓度。箭头指示材料和方法中定义的LH脉冲。分析显示在肽234输注之后平均LH浓度和脉冲幅度显著降低。
表2：在用肽234输注之前、期间和之后的平均LH脉冲幅度、LH浓度和GH浓度(ng/ml)。在载体和肽-234处理母羊之前(0-180min)、期间(180-240min)和之后(240-360min)输注的数据为平均值±SEM。重复测量ANOVA显示处理和时间之间的显著相互作用(P＜0.05)。显示各时间段的个体P值。
图14：中央输注拮抗剂234对OVX母羊中GH的影响。显示用肽234处理的母羊(实心柱)或对照母羊(空心柱)中的GH浓度。分析显示在肽234输注期间平均GH浓度显著增加。
图15：中央输注拮抗剂234对OVX母羊中催乳素的影响。显示用肽234处理的母羊(实心柱)或对照母羊(空心柱)中的催乳素浓度。分析显示肽234输注对催乳素无影响。
图16：中央输注拮抗剂234对OVX母羊中皮质醇的影响。显示用肽234处理的母羊(实心柱)或对照母羊(空心柱)中的皮质醇浓度。分析显示肽234输注对皮质醇无影响。
图17：拮抗剂对细胞迁移的影响
肽233、234和273在HUVEC和CHO细胞中作为人gpr-5的拮抗剂起作用，因为它们几乎完全抑制亲吻肽对迁移的作用。(A)在CHO(中国卵巢仓鼠)细胞中，100nM亲吻肽抑制了50％的细胞迁移。肽234完全消除了这种抑制。(B)在HUVEC(人脐静脉内皮细胞)中，1nM亲吻肽抑制了50％向伤口内的迁移。然而，存在肽233、234或273时，抑制减少至仅为10％。
实施例1-关于亲吻肽类似物的实验数据
材料和方法
用于表1中剂量反应结合(IC50)栏的方法
全细胞受体结合试验-以1∶1000稀释比在加入125I-标记的亲吻肽的HEPES改良的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle′smedium，DMEM)中制备亲吻肽-10和类似物，以形成100,000每分钟计数(cpm)。将单层细胞置于冰上并接触0.5ml肽(10pM-1uM)；然后在4℃孵育所述细胞4h。4h之后，用冰冷的杜氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲液(DPBS；含有钙和镁)洗涤细胞两次，然后加入0.5ml 0.1M氢氧化钠(NaOH)至细胞，保持20分钟，摇动裂解细胞。将裂解物转移至塑料管，并在γ计数仪上进行结合放射性计数60秒。测量IC50，其为受体结合的50％被类似物竞争的浓度。
用于表1中剂量反应IP(EC50)栏的方法
肌醇-3-磷酸刺激试验-在37℃下将单层细胞在加入1％青霉素/链霉素的0.5ml HEPES改良的DMEM中放置30min，以阻止IP3降解。然后在37℃下用0.5ml以1∶1000稀释于上述培养基的亲吻肽-10和类似物(10pM-1uM)刺激细胞1h，接着将所述细胞在4℃下置于10mM甲酸1h，以裂解细胞。然后将裂解物转移至含有0.5ml Dowex树脂的塑料管，以结合放射性IP3，接着用1ml H2O冲洗树脂。随后，再用60mM NH4甲酸盐/5mM四硼酸钠冲洗该树脂，接着用1M NH4甲酸盐/0.1M甲酸冲洗，以释放结合的放射物。然后将800μl放射性溶液转移至含有2.5ml闪烁液的闪烁瓶中，并在β-计数仪上进行放射性计数60秒。测量EC50，其为刺激出现50％最大刺激反应的浓度。
用于表1中拮抗剂IP抑制(IC50)栏的方法
肌醇-3-磷酸拮抗作用试验-在37℃下将单层细胞在加入1％青霉素/链霉素的0.5ml HEPES改良的DMEM中放置30min，以阻止IP3降解。然后在37℃下用以1∶1000稀释于上述培养基的0.25ml 10nM亲吻肽-10和0.25ml10nM亲吻肽-10或类似物(10pM-10uM)刺激细胞1h，接着将所述细胞在4℃下置于10mM甲酸1h，以裂解细胞。然后将裂解物转移至含有0.5ml Dowex树脂的塑料管，以结合放射性IP3，并且接着用1ml H2O冲洗树脂。随后再用60mM NH4甲酸盐/5mM四硼酸钠冲洗该树脂，接着用1M NH4甲酸盐/0.1M甲酸冲洗，以释放结合的放射物。然后将800μl放射性溶液转移至含有2.5ml闪烁液的闪烁瓶中，并在β-计数仪上进行放射性计数60秒。计算作为50％抑制10nM亲吻肽-10刺激所需浓度的IC50。
使用学生T-检验计算P-值，并且提供各类似物的最显著值。
IP刺激是指可估计的内在残留激动剂活性。
IC50为50％抑制10nM亲吻肽-10刺激IP所需的拮抗剂剂量。
亲吻肽拮抗剂中央处理OVX母羊
所有的实验步骤都在Monash学院生物医学″A″动物道德委员会(MonashSchool of Biomedical Sciences″A″Animal Ethics Committee)认可的协议下进行。
在自然光照下饲养成年考力代(Corriedale)母羊，并在任何实验处理前至少一个月对其进行双侧卵巢切除(OVX)。接着按照之前描述的外科手术步骤植入永久存在于第三脑室(3V)的套管(Barker-Gibb et al.，1995，J.Endocrinol.，147：565-79)。3V外科手术之后大约2周，向一支颈外静脉插入套管以采集血样，并将动物饲养于单独的圈内；套管用肝素化盐水保持通畅。
母羊被分配成两个处理组(n＝4/组)：亲吻肽拮抗剂(稀释于人工脑脊液，aCSF；150mM NaCl，1.2mM CaCl2，1mM MgCl2，2.8mM KCl)或对照(仅有aCSF)。第二天，将输注管道连接至3V套管，在07.00h开始采集血样。每隔10分钟收集样品。取样3h之后，在1h内以40μg/h的剂量将亲吻肽拮抗剂(或对照)输注入3V中，初始剂量为10μg。亲吻肽拮抗剂和载体都用
Figure GPA00001138954200361
MS16A输注泵(Smith Medical Australasia Pty.Ltd.)以200μl/h的速度输注1h。输注之后，3V管道保持于原位，并继续采集血样2h(总计6h)。立即从样品收集血浆，并在试验前冷冻于-20℃。
使用Lee等的方法(1976，J.Reprod.Fertil.，46：1-6)，用NIH-oLH-S18作为标准，测量血浆LH浓度，一式两份。使用Burger等的程序(1972，J.Lab.Clin.Med.，80：302-12)计算试验结果。试验的灵敏度为0.08ng/ml，并且试验组间变异系数在0.3-12.8ng/ml范围之内小于10％。基于描述用于GnRH的方法(Clarke，1993，Endocrinology，133：1624-32)进行LH数据的脉冲分析。
结果
亲吻肽拮抗剂中央处理OVX母羊
中央输注亲吻肽拮抗剂似乎抑制OVX母羊的LH分泌脉冲(图3)。LH脉冲分析显示，在对照处理的OVX母羊-和在亲吻肽拮抗剂处理之前的OVX母羊中-可明显地分辨出LH的主要分泌期。通过心室施用亲吻肽拮抗剂后分泌脉冲的数量减少。在鉴别出LH脉冲的情况下，发现这些脉冲具有降低的振幅。
实施例2-关于亲吻肽类似物的进一步实验数据
概述
促性腺激素释放激素(GnRH)是生殖系统的主要调节剂，并且GnRH类似物被广泛用于治疗不育和激素依赖性疾病，如前列腺癌和子宫内膜异位症。GnRH神经元活动受许多因素调节，包括光周期、营养、应激和类固醇激素。关于gpr-54中的突变引起低促性腺激素型性腺功能减退症的发现导致认识到其同源配体(亲吻肽)介导这些在GnRH神经元上的作用。我们报道了亲吻肽拮抗剂的开发并将其应用于阐明亲吻肽在青春期和类固醇激素反馈中的作用。通过亲吻肽-10中的氨基酸取代确定了一系列的有效拮抗剂。选择的拮抗剂抑制小鼠大脑中的GnRH神经元放电和消除青春期雌性恒河猴的GnRH脉冲；后者支持亲吻肽在青春期开始时的关键作用。此外，所述拮抗剂减弱了大鼠中黄体生成激素(LH)对外源性亲吻肽的反应，以及抑制母羊、大鼠和小鼠在性腺切除之后的LH增加，间接地证明了亲吻肽-神经元是性类固醇反馈作用的靶标。因而，亲吻肽拮抗剂的开发提供了用于探寻亲吻肽在调节生殖中的生理学和病理生理学作用的新工具，以及用于干扰激素相关疾病的治疗法。
引言
促性腺激素释放激素(GnRH)是促性腺激素分泌的主要效应物，促性腺激素对于睾丸和卵巢生成配子和类固醇激素的下游调节至关重要。生成GnRH的神经元受许多因素调节，包括光周期、代谢信号、应激和生殖腺类固醇，它们通过激活或抑制下丘脑中的神经回路而控制GnRH分泌，但是传导这些作用以改变GnRH分泌的机理仍然不清楚(1-3)。现在通过发现被称为低促性腺激素型性腺功能减退症的独特不育类型与G蛋白偶联受体(gpr-54)突变有关而发现了这些机理(4，5)。Gpr-54是被称为亲吻肽的神经肽家族的同源受体(6，7)，并且亲吻肽/gpr-54信号传导作为生殖过程的神经内分泌调节枢纽出现(8)。确实已显示亲吻肽(由Kiss1基因编码)是有效的GnRH促分泌素，并且GnRH神经元表达亲吻肽受体(9，10)。此外，亲吻肽神经元已作为将环境和激素输入传递至GnRH神经元的通路而参与(11-16)。
通过调节下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴，GnRH类似物广泛地应用于治疗激素依赖性疾病，包括前列腺癌、乳癌、卵巢癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤和性早熟，以及用于不育和IVF中的排卵诱导(17，18)。由于亲吻肽对GnRH和促性腺激素分泌产生如此有力的刺激作用，在亲吻肽/gpr-54系统水平的干扰可能具有用于治疗这些病症的潜力，并且可能获得比由GnRH类似物所实现的更强且更有效的控制。
在怀孕期间亲吻肽显著提高(19)并由滋养层生成(20)，并且通过滋养层细胞和子宫上皮中的gpr-54受体抑制基质金属蛋白酶(MMP)而抑制滋养层细胞侵入(植入)(21)。因而亲吻肽/gpr-54调节异常可能在胎盘和胎儿病理如先兆子痫、胎盘植入(acretia)、异位妊娠和胎儿宫内生长迟缓中发挥作用，但是对此缺少直接证据。在人脉管中的选择区域，通过gpr-54，亲吻肽也是有效的血管收缩剂(22)。
因而，亲吻肽拮抗剂的开发为阐明亲吻肽在对GnRH细胞的正和负性腺反馈中的作用以及在介导对生殖系统的代谢和应激效应中的作用提供了必要的条件。亲吻肽拮抗剂还提供了在许多激素依赖性疾病中的潜在治疗干扰，还可能用于胎盘和脉管功能失调的治疗。
我们报道了对亲吻肽类似物的系统性结构-活性研究和在实验室啮齿动物、羊和非人的灵长动物具有体外和体内活性的有效和特异性的拮抗剂。这些研究表明亲吻肽在青春期和类固醇激素反馈中的关键作用，表明了这些拮抗剂的广泛应用。
结果
亲吻肽-10中氨基酸的取代对稳定表达人gpr-54的CHO细胞中刺激肌醇磷酸(IP)释放的影响
由于亲吻肽-10是用于全部受体结合和激活所需的最小序列，我们研究了系统取代该范围内氨基酸的影响，监测稳定表达人gpr-54的细胞中的IP生成。因为在这个巨大而古老肽家族中C-末端序列的RF.NH2是保守的，我们推断这对于受体结合来说是必须的，并将我们的注意力集中于在前的八个氨基酸。我们截去N-末端的5个氨基酸，并引入不同的D-氨基酸取代。这导致IP生成效率降低和减弱了抑制10nM-亲吻肽-10刺激IP的能力(图7；表1)。这表明最前的5个氨基酸与受体激活有关。然后我们在全长10个氨基酸肽中取代单个或组合的残基，并且监测所述取代对内在IP刺激的影响，和这些取代对用10nM亲吻肽-10刺激IP的任何抑制作用。氨基酸的这一系统取代使得我们开发出对此受体具有部分刺激和拮抗性质的一系列类似物(表1)。许多这些类似物加入了取代Ser6的甘氨酸并与在Leu8位的D-氨基酸(色氨酸或亮氨酸)相组合。虽然这些取代单独显著抑制了10nM亲吻肽-10的刺激IP(P＜0.01)，但是它们通常没将此刺激降低至基础水平(图8a，b；表1)。
为开发完全拮抗剂，在Tyr1、Asn2和Trp3位进一步进行D-氨基酸取代。在这些位点取代中，最有效的拮抗剂是肽230、232、233、234、235和236，它们单独几乎没有或没有刺激IP，但是具有＜10-8M的IC50和最大抑制66-93％的亲吻肽刺激IP(图8b-d；表1)。用D-Ala1取代(表1中234；图8d)实现了最完全的抑制。这种取代组合抑制93％的10nM亲吻肽-10刺激IP，具有的IC50为7nM，并且没有内在IP刺激，表明其高拮抗剂活性。这些研究还突出显示了在Ser6位的甘氨酸取代和在Leu8位的D-Trp取代的重要意义，因为从以上类似物中将这些取代中的一个或两个都去除，当在D-Tyr取代Tyr1时降低了拮抗剂活性(图8e)，或当D-Ala被取代时减小了拮抗作用(图8f)。这表明这些残基对于受体激活来说具有重要意义。使用125I-亲吻肽-10，所述活性类似物显示高结合亲合力，例如肽234具有的结合亲合力为2.7nM(图9)。
肽234抑制亲吻肽-10刺激的GnRH神经元放电
如之前所证明(23)(J.Pieleka-Fortuna，Z Chu，SM Meonter，EndocrineSociety Meeting 2006，Abstract P1-8)，1nM亲吻肽-10显著增强GnRH神经元放电活动(图10a，c)。在这些实验条件下，单独的肽234对GnRH神经元放电活动没有影响(1nM之前0.18±0.12Hz，之后0.27±0.08Hz，n＝5，P＞0.05；10nM之前0.34±0.15Hz，之后0.29±0.17Hz，n＝6，P＞0.05；100nM之前0.45±0.12Hz，0.62±0.14Hz，n＝7，P＞0.05，成对t检测)。与肽234缺少对基础放电的作用相反，与用亲吻肽-10单独处理细胞(图10b，c)相比，用肽234预处理阻断了对1nM亲吻肽-10的反应(所有剂量P＜0.001)。
肽234抑制雌性恒河猴脉冲式GnRH释放
由于肽234抑制GnRH神经元放电，我们使用之前描述的方法(24)，测试这是否导致抑制青春期雌性恒河猴的GnRH释放。在30min内，通过位于柄-中间隆起区域的微透析探针输注10nM肽234迅速且持续地阻抑GnRH脉冲以及平均GnRH水平(图11a，c)。相反地，通过探针输注载体并未引起GnRH释放发生显著变化(图11b，d)。肽234-诱导的GnRH阻抑与在肽234输注之前以及载体对照的值具有显著差异(两种情况下均为p＜0.05)。基于我们之前的评估，用相似尺寸的透析膜通过～10％的肽(25)，估计肽234在柄-中间隆起区域中的浓度为1nM。
肽234抑制完整雄性大鼠中亲吻肽-10刺激的LH并在阉割之后LH增加
使用成年雄性大鼠在体测试肽234的推定的亲吻肽拮抗剂活性作用。为了评估拮抗剂对基础LH水平的可能作用，药理学测试包括重复(x3)脑内注射化合物和连续取血样。为了监测肽234抑制亲吻肽-10通过刺激GnRH而刺激LH和睾丸酮的能力，第三次注射同时还有亚最大剂量(100pmol)的亲吻肽-10和1nmol剂量的肽234共同施用。在注射15、60、75和120min之后，icv施用1nmol肽234并没有显著改变基础LH水平；向载体处理的动物中央注射1pmol亲吻肽-10(在120min)引起预期的血清LH水平升高(图12a)。尽管缺少对基础水平的作用，共同施用肽234显著减弱由中央注射亲吻肽-10诱导的LH分泌反应，并且在共同注射肽234和亲吻肽-10之后120min的时间内显著(P＜0.01)减少LH净分泌量(AUC)。与此一致的是，联合注射肽234和亲吻肽-10之后60min时的睾丸酮水平显著(P＜0.01)低于单独注射亲吻肽-10的动物(图12a)。在240min监测期内，阉割大鼠的LH水平升高。在0、60和120min向阉割雄性大鼠施用1nmol肽234有降低血清LH水平的趋势；降低在240min达到统计学显著性(图12b)。
肽234抑制卵巢切除母羊的LH脉冲频率和振幅
在肽234施用之前，对照卵巢切除母羊和经处理母羊的LH主要分泌期是明显不同的(图13)。在经心室施用肽234之后，分泌脉冲数量减少。在鉴别出LH脉冲的情况下，肽234输注后这些LH脉冲的振幅减小(P＜0.05，表2)。在输注之前和期间，平均LH水平相似，但在肽234输注后减小(P＜0.05)。
输注肽234显著(P＜0.05)增加OVX母羊中GH的平均浓度(图14和表2)。这种作用仅在输注期间观察到，而输注之前和之后，对照母羊和肽234处理母羊之间的平均GH水平相似。有趣的是，这种刺激作用似乎比对LH的抑制作用更直接。在输注之前、期间或之后，肽234对催乳素或皮质醇的浓度没有影响(图15和图16)。
如图15所示，令人惊奇地，拮抗剂施用升高羊的生长激素水平。因此，本发明的拮抗剂可以用于促进和/或诱导个体生长激素生成。例如，本发明的拮抗剂可以与使用生长激素疗法的现有治疗一起使用，例如用于肾衰竭的治疗。
肽234抑制卵巢切除母羊中LH脉冲频率和振幅
使用从新生儿脐带分离的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，因为它们内源性地表达gpr-54，而gpr-54被认为参与胎盘内的细胞迁移。使用稳定表达人gpr-54受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为创伤愈合试验的模型细胞系。
用移液管尖端从12-孔细胞培养板中的各孔中间刮下稳定表达人gpr-54的WT HUVEC或CHO细胞的单层细胞，然后用PBS清洗细胞培养板，以去除任何松散细胞。在各个细胞类型中，与完全培养基一起加入最佳浓度的亲吻肽-10以抑制细胞迁移(创伤愈合)：对于HUVEC细胞，在有和没有拮抗剂233、234、273和276存在下，加入1nM亲吻肽-10；对于CHO细胞，在有和没有拮抗剂234存在下，加入100nM亲吻肽-10。然后将细胞在37℃下含5％CO2的空气中孵育22小时。细胞在axiovert 2000显微镜上以20x倍放大率进行相差拍照(Hori et al.，2001.Metastin suppresses the motility andgrowth of CHO cells transfected with its receptor.Biochem Biophys ResCommun 286，958-963；Stafford et al.，2002，Identification and characterizationof mouse metastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled.Cancer Res 62，5399-5404)。
在图17(A)中，结果表明，在CHO细胞中，100nM亲吻肽抑制50％的细胞迁移，而肽234完全消除了这种抑制。在图17(B)中，结果表明，在HUVEC中，1nM亲吻肽抑制50％向伤口的迁移。然而，当肽233、234或273存在时，此抑制降低至仅为10％。
基于此，我们认为肽233、234和273在这些细胞中作为对人gpr-54的拮抗剂起作用，因为它们几乎完全抑制了亲吻肽对迁移的作用。因此，本发明的拮抗剂可以用于诱导和/或促进创伤愈合。
向肽234的N-末端添加果蝇触足肽七肽
如上所述，所述R-R-M-K-W-K-K-Y序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。向肽234的N-末端添加所述肽序列R-R-M-K-W-K-K-Y，所得到的肽命名为肽271。
因此，肽271的序列为：
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z
如表1所示，包含N-末端果蝇触足肽七肽的肽271保持了亲吻肽拮抗剂的功能。
讨论
亲吻肽作为抗转移剂和在调节HPG轴以及可能调节植入、血管收缩和CNS神经元中的多效作用使得gpr-54受体成为引人注意的治疗靶。迄今主要的重点在于开发作为抗转移剂的亲吻肽激动剂(26-28)。然而，大多数在亲吻肽在HPG轴、植入和血管收缩中的治疗干预作用需要开发拮抗剂。为实现这个目的，我们系统地取代了生物活性所需的最小亲吻肽结构(亲吻肽-10)中的氨基酸，并且开发在体外和体内具有高结合亲合力和效力的拮抗剂。寻求亲吻肽激动剂的研究已确定Phe6、Arg9和Phe10.NH2构成结合药效团(26)。RF.NH2部分在巨大而古老的肽家族中的进化保守性预示这些C-末端残基对于受体结合是必需的，这与其在药效团中的认定相一致。我们对亲吻肽氨基酸取代的初探研究证实RF.NH2部分中的变化可减低结合。因此，在寻找拮抗剂结构时，我们将注意力集中于其它残基。我们首先截去啮齿动物和人亲吻肽-10序列中的N-末端5个氨基酸，并发现这降低激动剂活性和拮抗剂性能。在这些截短肽中取代Phe6或Leu8显示，用D-Trp取代Leu8产生最有前景的拮抗剂。在十肽全长序列中加入该取代产生更好的拮抗剂，尤其是当同时用非手性氨基酸Gly取代Ser5的情况下，Gly使肽的柔韧性更大，并且能够避免其它具有庞大侧链的氨基酸(如D-Trp)取代的一些立体位阻。
进一步研究显示，用D-氨基酸取代N-末端Tyr1对于拮抗活性来说也是可以接受的，但是若是D-Tyr1或D-Trp1同时还有D-Trp8取代则不可以。如所预期的，药效团残基Phe6的取代导致激动剂活性下降并产生一些拮抗剂活性(如211和212)。然而，与单独用D-Trp8取代相比，用D-Trp6取代Phe6并与用D-Trp8取代Leu8相组合降低了拮抗作用(用210与213、245和246比较)。Asn2(如232和236)和Trp3(如231和235)的某些取代与用D-Trp8取代Leu8组合对于拮抗作用来说也是可接受的。总的说来，用于拮抗作用的共有序列为X1-X2-X3-N-G-F-G-X8-R-F.NH2，其中X1为D-Tyr或D-Ala，X2为Asn或D-Ala或D-Trp，X3为Trp或D-Trp或D-Ala以及X8为D-Leu、D-Phe或D-Trp。
我们的研究还鉴定出看起来参与受体激活的氨基酸，因为Ser6、Leu8的取代，和某种程度上Tyr1、Asn2和Trp3的取代有助于拮抗作用。这是令人感兴趣的，因为迄今的研究数据表明N-末端包含活性结构域，而C-末端包含结合结构域。然而，我们的研究表明，该两个区域交叠，因为已证明Phe6、Arg9和Phe10构成用于结合的药效团(26)，因此Leu8活性残基位于结合位点中。
在显示较好的体外拮抗剂活性的类似物中，我们选择肽234用于离体和体内研究。由于认为亲吻肽在HPG轴的作用主要是通过刺激GnRH分泌(10，29)，我们首先研究了肽234抑制亲吻肽-10刺激GnRH神经元放电的能力，使用新鲜制备的小鼠脑切片进行记录。发现100nM、10nM，甚至1nM肽234都阻断亲吻肽-10刺激的GnRH神经元放电，所述浓度与用于刺激GnRH神经元的亲吻肽-10浓度相同。
通过肽234抑制亲吻肽对GnRH神经元放电的作用表明，所述拮抗剂可以在体内减少下丘脑的GnRH释放。因此，我们通过直接向青春期雌性恒河猴柄-中间隆起区域施用肽234，确定亲吻肽是否改变脉冲式GnRH释放。在肽234输注期间阻抑GnRH释放首次提供了直接证据证明来自下丘脑中亲吻肽神经元的输入是GnRH释放的明显重要信号。亲吻肽在GnRH脉冲中的重要性进一步得到之前观察的支持，其中表明亲吻肽-54释放是脉冲式的，并且亲吻肽-54脉冲与GnRH脉冲有75％的时间是一致的(24)。然而，因为临床研究表明具有gpr-54突变的患者表现具有近似正常脉冲频率的减弱LH脉冲(4，5)，(30)，亲吻肽神经元是否是GnRH脉冲产生的关键，或其仅是GnRH脉冲幅度的调节剂的问题，仍然有待研究。因此，完全消除猴模型的GnRH脉冲和卵巢切除羊的LH脉冲可以简单地反映对振幅而不是频率的完全抑制。
肽234还在2小时期间内阻断成年雄性大鼠亲吻肽-10对LH和睾丸酮的刺激(图12a)，估计是通过阻断亲吻肽-10对GnRH分泌的作用。用肽234抑制完整雌性恒河猴GnRH分泌表明，前一种解释是最有可能的。在阉割雄性大鼠中，肽234阻断了随阉割和去除负反馈之后发生的LH增加。该发现表明，去除性腺类固醇导致亲吻肽活性升高，而这被转化成增加的GnRH和LH分泌。以前证明，性腺切除的雄性和雌性大鼠弓状核中KiSS-1基因表达增加(10，29)和用GnRH拮抗剂消除所导致的LH上升的能力(10)，与猜测亲吻肽形成神经元是性类固醇反馈作用的靶标的假设相一致(11)。然而，mRNA水平可能没有反映结合GnRH神经元中gpr-54的亲吻肽的生物合成和分泌。我们现在用新亲吻肽拮抗剂的研究提供了亲吻肽通过性腺负反馈调节GnRH神经元的直接证据，并且强调了亲吻肽拮抗剂用于阐明生理学机理的价值。
反复取血样(每隔10min)以及在卵巢切除母羊中的拮抗剂处理允许我们探究内源性亲吻肽对LH脉冲频率和振幅的作用。通过icv施用肽234显著降低LH脉冲的频率和振幅，表明GnRH分泌的振幅减小以及其频率也可能降低。这与我们验证的肽234抑制小鼠GnRH神经元放电频率和抑制恒河猴GnRH脉冲相一致。这些发现暗示，亲吻肽的内源性分泌本质上是脉冲式的，并且促使GnRH节律性分泌。用亲吻肽-10增加GnRH神经元放电的能力和用亲吻肽拮抗剂降低GnRH神经元放电的能力表明亲吻肽类似物在与LH脉冲频率功能失调有关的病理病症中的治疗潜力，如多囊卵巢综合征特有的LH脉冲频率增加(31)和在心理疾病、应激(32)和营养不足(如神经性厌食症)中发现的LH脉冲频率降低(33)。
肽234的作用看起来是特异性的，因为它对卵巢切除母羊催乳素和皮质醇分泌没有影响(图15和图16)，并且不结合GnRH或LH受体(数据未显示)。全部4只母羊在输注肽234期间生长激素看起来增加，表明内源性亲吻肽抑制生长激素(图14)。我们尚未深入检测这种现象，但是已观察到亲吻肽受体(gpr-54)唯一地表达于垂体中的生长激素细胞中。在啮齿动物和羊中显示雌激素的正反馈诱导排卵的LH激增，同时伴随着下丘脑特定区域中Kiss-1基因表达的增加(34-36)。
雌性大鼠(37)和女性(38)的研究还显示，在排卵LH激增时LH对外源性亲吻肽有更大的灵敏度，表明增加亲吻肽输入介导雌激素的正反馈(37)。这与雌激素治疗后KiSS-1基因表达增加的证明(34，35)，以及在雌性大鼠中通过施用亲吻肽抗血清而消除的LH激增相一致(35)。我们目前利用肽234来确定亲吻肽在对GnRH和LH分泌正反馈中的作用。
我们通过icv施用拮抗剂的研究主要是为了使亲吻肽输入更直接干预GnRH神经元，并更清楚地阐述亲吻肽在HPG轴的生理调控中的作用。然而，系统性给药是亲吻肽类似物治疗应用的前提。由于静脉注射和皮下注射施用亲吻肽刺激男性(39)和女性(38)LH释放，因此所述肽显然进入了大脑，或作用于血-脑屏障之外的位置如弓状核或中间隆起，并且作用于GnRH神经元。因此，有理由认为系统性递送亲吻肽拮抗剂也会到达在中间隆起处的GnRH神经元或它们的轴突，由此提供了有效的和可行的治疗靶。
许多病理与HPG轴的功能失调有关，并且性类固醇刺激使许多症状加重。这些包括不育、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、月经出血过多、青春期延迟和性早熟、以及乳癌、前列腺癌和卵巢癌。获得强力、特异且有效的亲吻肽拮抗剂将提供用于这些病症的新疗法和用于探寻HPG轴的生理调节作用的可能性。除了这些主要的适应症，亲吻肽拮抗剂还可能具有调节血管收缩(22)、CNS功能(40)和滋养层侵入以及形成充足的母体血液供应(19，21，41)的潜力。
方法
肽
材料
人亲吻肽-10以及肽类似物186-191、200-203、206-213和228-248(10μg)由EZBiolabs按常规方法合成。其他全部试剂来源都在文中指明。
体外测试拮抗活性
细胞培养
稳定表达人gpr-54受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO/gpr-54)由布鲁塞尔大学(Univ.Brussels)G.Vassart教授提供。在37℃，5％CO2，加湿环境下，将细胞保存于添加10％胎牛血清、2％谷氨酰胺和1％青霉素(10,000单位/ml)/链霉素(10,000mg/ml)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Sigma)中。
肌醇磷酸(IP)刺激试验
在刺激CHO/gpr-54细胞之前，用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS；不含钙或镁)冲洗细胞两次，然后在37℃下用含有1％青霉素/链霉素的3H-肌醇标记的HEPES改良的DMEM孵育过夜。向细胞添加1％青霉素/链霉素和1％氯化锂(0.5ml)的HEPES改良的DMEM，在37℃下保持30分钟以阻止IP水解。然后，用以1∶100的配比稀释于上述培养基的0.5ml亲吻肽-10和类似物(10pM-1μM)于37℃下刺激细胞1h，再用10mM甲酸于4℃下裂解细胞1h。将裂解物转移至含有0.5ml Dowex树脂的塑料管中以结合放射性IP，再用1ml水冲洗树脂。然后用60mM甲酸铵/5mM四硼酸钠冲洗树脂。接着用1M甲酸铵/0.1M甲酸冲洗树脂，以释放结合的放射物。然后将800μl放射性溶液转移至含2.5ml闪烁液的闪烁瓶中，于β-粒子计数仪上进行放射性计数60sec。重复实验3-5次。IP产量以平均值±SEM标出，并通过学生t-检验进行分析(p≥0.05)。
肌醇磷酸(IP)拮抗试验
单独用0.25ml亲吻肽(10nM)或与0.25ml肽类似物(100pM-1μM)组合刺激CHO/gpr-54单层细胞，以研究对亲吻肽刺激IP生成的抑制。重复实验3-5次。IP产量以平均值±SEM标出，并通过学生t-检验进行分析(p≥0.05)。
GnRH神经元放电
动物
记录来自转基因雌性小鼠的脑切片中GnRH神经元的放电，该小鼠中GFP遗传性地靶向GnRH神经元(42)。小鼠在14小时光照/10小时黑暗循环下饲养，并有1630小时关灯，按Harlan 2916啮齿动物食谱(Harlan)喂食和随意饮水。所有方法均经维吉尼亚大学动物关怀和应用委员会(Animal Care andUse Committee of University of Virginia)认可，并按照美国国家研究委员会关于实验室动物的关怀和应用指南(Nsyionsl Research Council’s Guild for theCare and Use ofLaboratory Animals)的准则进行。成年雌性GnRH-GFP小鼠在异氟烷(Abbott Laboratories)麻醉下切除卵巢。用长效局部麻醉剂(0.25％布比卡因；7.5μl/位点；Abbott Laboratories)提供术后无痛。手术时，小鼠接受含有于芝麻油中的0.625μg雌二醇的硅橡胶(Silastic)(Dow Corning)胶囊。手术之后2-4日在AM时进行记录，在AM时已证明雌二醇有负反馈作用(43)。记录来自于单只动物的不多于4个细胞，全部在不同的切片中。
脑切片制作
使用之前描述的方法(44)制作脑切片。简要而言，在整个试验过程中以及在接触组织之前至少15min，向所有溶液中通入95％O2/5％CO2混合物使溶液起泡。迅速取下大脑并置于冰冷的高糖盐溶液中，该溶液含有250mM蔗糖、3.5mM KCl、26mM NaHCO3、10mM葡萄糖、1.25mM Na2HPO4、1.2mM MgSO4和2.5mM MgCl2。用Vibratome 3000(Technical Products，International，Inc.，St.Louis，MO)切取冠状300-μm脑切片。切片于30-32℃下在溶液中孵育30min，所述溶液为50％高糖盐溶液和50％生理盐溶液(NS)，其含有135mM NaCl、3.5mM KCl、10mM葡萄糖、1.3mM Na2HPO4、1.2mM MgSO4和2.5mM CaCl2。然后将切片转移至室温下的100％NS溶液中，并记录之前保持至少30min，但不超过6h。
电生理记录
使用靶向细胞外记录(又被称为松膜片)来研究亲吻肽-10和肽234对GnRH神经元放电活动的影响(45)。由于低阻封接(＜50MΩ)不会影响细胞膜，这种方法是用于监测单个细胞内源性电学活性的微创方法。虽然这些事件不是动作电位本身，但是它们精确地反映了动作电位放电频率的变化。简要而言，我们使用词组放电频率、放电模式和/或放电活动来指代这些事件。
将个体脑切片置于用氧化NS溶液连续灌注的记录槽中，并保持在29-31℃。用Olympus BX50WI正置荧光显微镜和红外微分干涉相衬显微镜(Opelco)使细胞成像。通过由470nm的短暂照明成像的GFP信号来鉴别GnRH神经元。用标准HEPES缓冲溶液装满范围为1.5-3ΩM的膜片硼硅酸盐移液管(World Precision Instruments)，所述标准HEPES缓冲溶液含有150mM NaCl、10mM HEPES、10mM葡萄糖、2.5mM CaCl2、1.3mM MgCl2和3.5mM KCl。使用MP-285显微操纵器(Sutter Instruments)放置移液管，使其与GnRH神经元相接触。封接电阻范围从8MΩ开始并且在记录期间保持稳定或增加达到高达50MΩ。使用EPC-8放大器(HEKA)获得电流追踪记录，并用在G4 Macintosh计算机(Apple Computer)上的Igor Pro软件(Wavemetrics)运行的脉冲Control XOP软件(Instrutech)获得数据。使用电压钳模式进行记录，其中吸管的钳制电位(holding potential)为0mV，在10kHz进行过滤，并使用ITC-18获得界面(ITC-18 acquisition interface，Instrutech)进行数字化。
实验设计
通过孵育池应用人亲吻肽-10，1nM(Phoenix Pharmaceuticals)。使用不同剂量(1nM，10nM，100nM)的肽234来检测它对亲吻肽-10活化的gpr-54的拮抗作用。对于阳性对照细胞，记录10-min的稳定基线，然后用亲吻肽-10处理5min，接着冲洗15-min。对于实验细胞，记录在NS中的5-min稳定基线，接着在肽234(1，10或100nM)中记录10min，然后在亲吻肽-10和相同剂量的拮抗剂中记录5min，接着用NS清洗。用含有拮抗剂的溶液清洗产生相似结果(1nM肽234，n＝5个细胞，未显示)。在10nM肽234组中的一个细胞显示没有活性；加入15mM KCl以确定细胞的生存能力和记录完整性。
数据分析
使用为Igor Pro编写的程序，以1-min的间隔计数和储存细胞外记录的事件，由此确定GnRH神经元放电频率的变化。使用微软Excel(MicrosoftCorp)分析储存的事件数据，从而分析在亲吻肽-10处理之前(基线，注意在拮抗剂治疗组中，这是在肽234处理细胞期间)、亲吻肽-10应用(处理)期间和洗脱期间的平均放电频率。对于拮抗剂处理组的细胞，还比较了在亲吻肽-10应用之前在NS中与在拮抗剂中的放电频率。通过由检测到的事件总数除以在每个条件下的记录期间确定平均放电频率；药物变化之后略过两分钟以排除过渡期。由于GnRH神经元放电活动随时间变化(44，45)，计算各治疗组的倍数变化。先后使用ANOVA和Bonferroni事后比较检验(Bonferroni post hoctest)对所述组进行比较。
肽234对雌性恒河猴GnRH释放的影响
动物
本研究中使用生长并喂养于威斯康星国家灵长类研究中心(WisconsinNational Primate Research)的四只雌性恒河猴。动物成对地喂养(笼172×86×86cm)于12h光照和12h黑暗，并且控制温度(22℃)的房间。每日用Harlan 20％蛋白质灵长动物饮食(Protein Primate Diet)的标准饮食饲喂动物两次，每周补充几次新鲜水果。随意饮水。本研究的协议经威斯康星大学动物关怀和应用委员会(Animal Care and Use Committee，University of Wisconsin)审阅和批准，并且在NIH和USDA制定的准则下进行全部实验。
实验设计
使用微透析法检测肽234对GnRH释放的影响。如前所述(25)，(24)，这种方法允许在肽234通过半透膜输注时，收集用于GnRH测量的透析液样品。通过微透析探针将溶解于CNS输注液的肽234输注入柄中间隆起区域，输注30min同时连续收集透析液。对于对照，类似地输注载体。在同一实验中，对每只动物按随机顺序检测肽234(10nM浓度)或载体，在两次测试之间最小间隔为2小时。四只动物中的两只在单独的实验中检测两次，总计6次实验。在整个实验期间，猴子置于同伴猴附近，持续供给食物和水，并经常提供水果、谷物、葡萄干和其他小吃。样本的平均年龄为33.1±0.4个月。
颅基架(cranial pedestal)植入
如前所述(24)，为了收集柄-中间隆起区域中的输注液，我们使用微透析法。实验之前，让年龄为29.1±1.2个月的猴子(体重：3.6±0.1kg)充分适应灵长动物椅子、实验环境和研究者。使用类似于之前所述推挽式灌流法中的方法(46)，在异氟醚麻醉下向所述动物植入颅基架。在实验之前，允许动物恢复至少1个月。
微透析法
实验当天，将猴子在氯胺酮(ketamine，15mg/kg b.w.)和美托咪啶(medetomidine，0.03-0.05mg/kg b.w.)麻醉下置于立体定位仪中。定制的导向套管(CMA 12)由不锈钢轴(长76.0mm，外径(o.d.)0.91mm)和从导向套管末端伸出20mm的可移动不锈钢通管针(长96.0mm，外径(o.d.)0.6mm)组成。用液压微驱动装置(MO95-B)将其插入至颅骨S-ME上方5mm处。该微驱动装置可以精确地调整末端的三维位置。使用脑室造影术计算S-ME的x、y和z坐标，并且在颅基架植入手术期间得到最终的射线照片。用射线拍照成像确认套管放置。在放置导向套管后，将猴子从立体定位仪移走，并置于灵长动物椅子中。如前所述(25)，(24)，当恰当的放置于椅子中时，将内部的通管针从导向套管移出，并将配置有膜(长5mm，外径0.5mm)的定制微透析探针(不锈钢轴，长96.0mm，外径0.6mm)通过导向套管插入至S-ME。为逆转美托咪啶的作用，向动物注射(i.v.)阿替美唑(atipamazole，0.15-0.25mg/kg)。在探针插入之后1h内，动物完全清醒。
用装配1或2.5ml Hamilton气密注射器(Reno)的CMA/102微透析泵以2μl/min的速度通过流入管道输注加入杆菌肽(4U/ml)的CNS输注液(购自CMA/Microdialysis)，所述CNS输注液由NaCl 147mM，KCl 2.7mM，CaCl21.2mM，MgCl20.85mM组成。在冰上使用部分收集器(Model FC203B)以10min的间隔将通过流出管道的输注液连续收集至12×75mm硼硅酸盐试管中，连续收集达12h。立即用干冰冷冻输注液样品，并贮存于-80℃。
GnRHRIA
如前所述(46)，用Dr.Terry Nett(科罗拉多州立大学，Colorado StateUniversity)馈赠的抗血清R42进行RIA。试验灵敏度为0.02pg/管，并且组内和组间变异系数分别为8.1％和11.3％。
数据分析
如前所述(47)，使用PULSAR算法确定GnRH释放峰。计算各实验中在肽234(或载体)测试之前和之后30min时间内收集的GnRH的平均值。接着，计算全部实验中各时间段期间的平均值(±sem)，用于统计学比较。先后使用双因素方差分析和Tukey多重比较法检验分析处理之前、期间和之后(治疗之内)，以及治疗(肽234vs.载体)之间的差异。P＜0.05被认为是差异显著。
肽234抑制雄性大鼠LH的动力学研究
实验设计
使用饲养于科尔多瓦大学(University of Córdoba)动物园的成年雄性大鼠(BW：280-310g)。动物饲养于光照(14h光照，从0700h开始)和温度(22℃)恒定的条件下，并且在套管植入之前，以每笼四只大鼠为一组饲养，自由取食粒状食物和自来水。实验步骤经科尔多瓦大学动物实验道德委员会(Córdoba University Ethical Committee for animal experimentation)认可，并且按照欧盟关于实验动物的关怀和应用规范(European Union normative for careand use of experimental animals)进行。
动物在轻度乙醚麻醉下植入icv套管，此后单只分笼饲养。为了将化合物递送至侧脑室，套管低于颅骨表面下方4mm深度；插入点为前囟后部1mm和侧向1.2mm。在植入套管至少24-48h之后进行功能测试。
完整雄性大鼠的药理学测试包括以60min间隔注射(icv)含1nmol剂量的肽234的5μl注射物。最后一次注射时，同时注射有效剂量(但为亚最大量)的100pmol亲吻肽-10(Phoenix Pharmaceuticals Ltd)。用载体(生理盐水)注射的动物作为对照。在每次icv注射之后15-min和60-min，通过颈部静脉穿刺采集血样(250μL)。此外，在开始实验之前(时间：0-min)和最后一次注射之后120-min(时间：240-min)立即采集血样。基于之前的研究(16，34，48)选择实验步骤和亲吻肽剂量。对于各时间点，每组采集10-12份样品。
此外，还在睾丸切除(ORX)大鼠中进行肽234的重复icv注射。通过阴囊途径对动物实施双侧ORX，并且在手术一周之后进行如前所述的套管植入。测试包括三次脑内注射拮抗剂(1nmol；在该方法中的0-min、60-min和120-min)，并且在基础条件(0-min)和每次icv注射之后15-min通过颈部静脉穿刺采集血样。在中央施用肽234之后180-min和240-min采集额外的血样。对于各时间点，每组采集10-12份样品。
激素测量
使用双抗法和NIH(Dr.AF Parlow，NIDDK)提供的放射性免疫测定试剂盒测量50μl体积中的血清LH水平。参照制造商(Pierce)的说明书，使用Iodo-Gen涂层试管用125I标记大鼠LH-I-10，并且使用参照制剂LH-RP-3作为标准表示激素浓度。试验组内和组间变异系数分别低于8％和10％。试验的灵敏度为5pg/管。此外，对在共施用kp-10和肽234之后60-min(时间：180-min)采集的血样选择性地进行血清睾丸酮(T)测量。为此，参照制造商的说明书，使用购自MP Biomedicals的商业试剂盒。试验的灵敏度为0.1ng/管，且试验组内变异系数为4.5％。对于各激素，全部样品都在相同试验中测量。通过评定大鼠血清样品已知激素浓度作为外部对照，证实激素确定的准确度。
数据分析
进行激素测定，一式两份，每组最少总计10份样品。适当时，除单独的时间点测量外，按照梯形法则计算作为曲线下面积(AUC)的累积LH分泌反应。激素数据表示为平均值±SEM。先后使用学生t-检验或ANOVA和Student-Newman-Keuls多重范围检验(SigmaStat 2.0)对结果进行统计学显著性差异分析。P≤0.05被认为是显著。
肽234对卵巢切除母羊LH的影响
实验过程
全部实验步骤都在莫纳什学院生物医学动物道德委员会(Monash SchoolofBiomedical Sciences Animal Ethics Committee)认可的协议下进行。在自然光照下饲养成年考力代母羊，并在任何实验操作前至少一个月对其进行双侧卵巢切除(OVX)。随后按照如前所述的外科手术步骤(49)植入永久存在于第三脑室(3V)的套管。3V外科手术之后大约2周，向一支颈外静脉插入套管以采集血样，并将动物饲养于单独的圈内；套管用肝素化盐水保持通畅。母羊被分配成两个治疗组(4/组)；肽234(用人工脑脊液稀释，aCSF；150mM NaCl、1.2mM CaCl2、1mM MgCl2、2.8mM KCl)或对照(仅有aCSF)。第二天，将输注管道连接至3V套管，在07.00h开始采集血样。每隔10分钟收集样品。取样3h之后，在1h内以40μg/h的剂量将肽234(或对照)输注至3V，初始剂量为10μg。肽234和载体都用
Figure GPA00001138954200531
MS16A输注泵(Smith MedicalAustralasia Pty.Ltd.)以200μl/h的速度输注。输注之后，3V管道保持于原位，并继续进一步采集血样2h(总计6h)。立即从样品收集血浆，并在试验前冷冻于-20℃。
测量血浆LH浓度，一式两份，使用NIH-oLH-S18作为标准(49)。试验的灵敏度为0.1ng/ml，并且试验组间变异系数在0.3-12.8ng/ml范围之内小于10％。血浆LH数据的脉冲分析如前所述(36)。使用标准NIDDK-oGH-I-4和NIDDK-抗-oGH-2抗血清化验血浆样品GH(50)，一式两份。试验的灵敏度为1ng/ml，试验组间CV在4-51ng/ml之间小于10％，并且试验组内CV为20％。
测量血浆催乳素浓度，一式两份，使用Sigma，Lot 114F-0558，NOL-7135作为标准(50)。试验的灵敏度为1ng/ml。试验组间CV在1-22ng/ml之间小于10％。
使用抗血清no.3368(Bioquest Ltd)和125I-标记皮质醇(AmershamPharmacia Biotech Ltd)化验血浆皮质醇浓度，一式两份。试验的灵敏度为3ng/ml。试验组间CV在3-18ng/ml之间小于10％，并且试验组内CV为15％。
数据分析
对于LH、GH、催乳素和皮质醇的数据分析，计算输注之前(0-180min)、期间(180-240min)和之后(240-360min)的时间段内各母羊的平均血浆值。此外，还计算注射之前、期间和之后各母羊的平均LH脉冲幅度。使用重复测量ANOVA来确定各时间段内肽234处理对激素水平的影响，利用适当的单因素ANOVA评估各时间段内统计学差异。
实施例3-示例性药物制剂
尽管本发明的分子可以单独施用，但是更优选与一种或更多种可接受的载体一起作为药物制剂提供。载体必须是“可接受的”，意指其与本发明的活性剂相容并且对其接受者没有危害。通常，载体为无菌和无热源的水或盐水。
以下实例举例说明了本发明的药物和药物组合物，其中所述活性成分为本发明的分子。
优选以10μg至500mg的量提供本发明的分子。应理解，可以制备含有10μg至500mg量的本发明分子的以下示例性药物和药物组合物。例如，本发明的活性剂的存在量可以为以下示例性药物和药物组合物中所示量的1/10或1/100或1/200或1/500，同时相应地改变其余成分的量。
实例A：片剂
活性成分         1mg
乳糖             200mg
淀粉             50mg
聚乙烯吡咯烷酮   5mg
硬脂酸镁         4mg
片剂通过以下方法制备：用以上成分通过湿法制粒，随后压制。
实例B：眼用溶液
活性成分        1mg
氯化钠，分析级  0.9g
硫柳汞          0.001g
加纯水至        100ml
pH调节至        7.5
实例C：片剂制剂
以下制剂A和B通过以下方法制备：将所述成分和聚维酮溶液通过湿法
制粒，接着加入硬脂酸镁并压制。
制剂A
                     mg/片    mg/片
(a)活性成分          1        1
(b)乳糖B.P.          210      26
(c)聚维酮B.P.        15       9
(d)羟基乙酸淀粉钠    20       12
(e)硬脂酸镁          5        3
                     -
                     251     51
制剂B
                      mg/片  mg/片
(a)活性成分           11
(b)乳糖               150      -
(c)Avicel PH 101
Figure GPA00001138954200551
                      60       26
(d)聚维酮B.P.         15       9
(d)羟基乙酸淀粉钠     20       12
(e)硬脂酸镁           5        3
                      -
                      251      51
制剂C
                    mg/片
活性成分            1
乳糖                200
淀粉                50
聚维酮              5
硬脂酸镁            4
                -
                260
以下制剂D和E通过直接压制混合成分制备。制剂E中使用的乳糖为直接压制型。
制剂D
                mg/胶囊
活性成分        1
预胶化淀粉NF15  150
                -
                151
制剂E
                mg/胶囊
活性成分        1
乳糖            150
Avicel                100
                -
                251
制剂F(控释制剂)
所述制剂制备方法如下：将(以下)成分和聚维酮溶液通过湿法制粒，接着加入硬脂酸镁并压制。
                       mg/片
(a)活性成分            1
(b)羟丙基甲基纤维素    112
(Methocel K4M Premium)
(c)乳糖B.P.            53
(d)聚维酮B.P.C.     28
(e)硬脂酸镁         7
                    -
                    201
药物释放发生在大约6-8小时期间，并在12小时之后完成。
实例D：胶囊制剂
制剂A
胶囊制剂通过以下方法制备：混合以上实施例C中制剂D的成分，装入由两部分组成的硬明胶胶囊中。以类似的方法制备(以下)制剂B。
制剂B
                      mg/胶囊
(a)活性成分           1
(b)乳糖B.P.           143
(c)羟基乙酸淀粉钠     25
(d)硬脂酸镁           2
                      -
                      171
制剂C
                      mg/胶囊
(a)活性成分           1
(b)聚乙二醇4000BP     350
                      -
                      351
胶囊通过以下方法制备：熔化聚乙二醇4000 BP(Macrogol 4000 BP)，将活性成分分散于所述熔体中，并将所述熔体装入由两部分组成的硬明胶胶囊中。
制剂D
               mg/胶囊
活性成分       1
卵磷脂         100
花生油         100
               -
               201
胶囊通过以下方法制备：将活性成分分散于卵磷脂和花生油中，并将分散体装入弹性明胶软胶囊中。
制剂E (控释胶囊)
以下控释胶囊制剂通过以下方法制备：使用挤压机挤出成分a、b和c，接着滚圆挤出物并干燥。然后用控释膜(d)包被干燥的丸粒，并装入由两部分组成的硬明胶胶囊中。
                   mg/胶囊
(a)活性成分        1
(b)微晶纤维素      125
(c)乳糖BP          125
(d)乙基纤维素      13
                   -
                   264
实例E：注射型制剂
活性成分                            1mg
加入无菌无热源磷酸盐缓冲液(pH7.0) 至10ml
将活性成分溶解于大部分磷酸盐缓冲液中(35-40℃)，然后定容并通过无菌微孔过滤器过滤至无菌的10ml琥珀色玻璃小瓶(1型)中，用无菌盖和顶部封条密闭。
实例F：肌内注射
活性成分           1mg
苯甲醇             0.10g
                1.45g
加入注射用水q.s.至 3.00ml
将活性成分溶解于四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)中。然后加入苯甲醇并溶解，并加入水至3ml。然后通过无菌微孔过滤器过滤混合物，并密封于无菌3ml玻璃小瓶(1型)。
实例G：糖浆混悬剂
活性成分                    1mg
山梨糖醇溶液                1.5000g
甘油                        2.0000g
可分散纤维素                0.0750g
苯甲酸钠                    0.0050g
调味剂，Peach 17.42.3169    0.0125ml
加入纯水q.s.至              5.0000ml
将苯甲酸钠溶解于部分纯水中，并加入山梨糖醇溶液。加入活性成分并分散。在甘油中分散增稠剂(可分散纤维素)。混合两种分散物并加纯水定容至需要的体积。按需要通过额外剪切悬浮液实现进一步增稠。
实例H：栓剂
                                        mg/栓剂
活性成分(63μm)*                         1
固体脂肪BP(Witepsol H15-Dynamit Nobel)   1770
                                         -
                                         1771
*使用的活性成分为粉末，其中至少90％颗粒的粒径为63μm或更小。
在最高45℃下将五分之一的Witepsol H15熔化于蒸汽夹套盘中。活性成分通过200μm筛，在使用装配有刀头的silverson搅拌机混合下加入至熔化的基质中，直至获得均匀的分散体。混合物保持于45℃，将剩余的Witepsol H15加入至悬浮液中，并搅拌确保混合均匀。全部悬浮液通过250μm不锈钢丝网，并连续搅拌，并使其冷却至40℃。在38℃至40℃的温度下，将2.02g混合物装入合适的塑料模具中。使栓剂冷却至室温。
实例I：阴道栓
                    mg/阴道栓
活性成分            1
无水葡萄糖          380
马铃薯淀粉          363
硬脂酸镁            7
                    -
                    751
通过以下方法制备：直接混合以上成分并直接压制所得到的混合物。
本发明的活性剂还可以按照用于诺雷德(Zoladex)、亮脯利特(Leuprolide)、替维瑞克(Teverelix)、阿巴瑞克(Abarelix)、加尼瑞克(Ganarelix)、戈舍瑞林(Goserelin)等的方式进行制备。
实施例4-使用本发明的活性剂治疗增殖性疾病
对前列腺癌患者(该患者对抗雄激素治疗没有反应)每日肌内施用本发明的活性剂1mg，或者根据本发明的方法递送该剂量的长效制剂(depotpreparation)。该拮抗剂降低雄激素。
实施例5-使用本发明的活性剂治疗增殖性疾病
对子宫内膜异位症或子宫肌瘤或乳癌患者每日肌内注射施用本发明的活性剂1mg，或者根据本发明的方法递送该剂量的长效制剂。
实施例6-使用本发明的活性剂治疗先兆子痫
对先兆子痫患者每日肌内注射施用本发明的活性剂1mg，或者根据本发明的方法递送该剂量的长效制剂。
参考文献
说明书中引用的编号的参考文献
1.West，A.，et al.，Chromosome localization and genomic structure of theKiSS-1 metastasis suppressor gene(KISS1).Genomics，1998.54(1)：p.145-8.
2.Lee，D.K.，et al.，Discovery of a receptor related to the galanin receptors.FEBS Lett，1999.446(1)：p.103-7.
3.Kotani，M.，et al.，The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodeskisspeptins，the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54.J Biol Chem，2001.276(37)：p.34631-6.
4.Muir，A.I.，et al.，AXOR12，a novel human G protein-coupled receptor，activated by the peptide KiSS-1.J Biol Chem，2001.276(31)：p.28969-75.
5.Stafford，L.J.，et al.，Identification and characterization of mousemetastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled receptor.Cancer Res，2002.62(19)：p.5399-404.
6.Castellano，J.M.，et al.，Expression of KiSS-1 in rat ovary：putative localregulator of ovulation？Endocrinology，2006.147(10)：p.4852-62.
7.Yamada，S.，et al.，Inhibition of Metastin(Kisspeptin-54)-GPR 54Signaling in the Arcuate Nucleus-Median Eminence Region during Lactation inRats.Endocrinology，2007.
8.Seminara，S.B.，et al.，The GPR54 gene as a regulator of puberty.N EnglJ Med，2003.349(17)：p.1614-27.
9.de Roux，N.，et al.，Hypogonadotropic hypogonadism due to loss offunction of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.Proe Natl Acad Sci U S A，2003.100(19)：p.10972-6.
10.Semple，R.K.，et al.，Two novel missense mutations in gprotein-coupled receptor 54 in a patient with hypogonadotropic hypogonadism.JClin Endocrinol Metab，2005.90(3)：p.1849-55.
11.Lanfranco，F.，et al.，Role of sequence variations of the GnRH receptorand G protein-coupled receptor 54 gene in male idiopathic hypogonadotropichypogonadism.Eur J Endocrinol，2005.153(6)：p.845-52.
12.Cerrato，F.，et al.，Coding sequence ahalysis of GNRHR and GPR54 inpatients with congenital and adult-onset forms of hypogonadotropichypogonadism.Eur J Endocrinol，2006.155 Suppl 1：p.S3-S10.
13.Pallais，J.C.，et al.，Neuroendocrine，gonadal，placental，and obstetricphenotypes in patients with IHH and mutations in the G-protein coupled receptor，GPR54.Mol Cell Endocrinol，2006.254-255：p.70-7.
14.Funes，S.，et al.，The KiSS-1 receptor GPR54 is essential for thedevelopment of the murine reproductive system.Biochem Biophys Res Commun，2003.312(4)：p.1357-63.
15.Shahab，M.，et al.，Increased hypothalamic GPR54 signaling：apotential mechanism for initiation of puberty in primates.Proc Natl Acad Sci U SA，2005.102(6)：p.2129-34.
16.Clarkson，J.and A.E.Herbison，Postnatal development of kisspeptin 亲吻肽 neurons in mouse hypothalamus；sexual dimorphism and projections togonadotropin-releasing hormone neurons.Endocrinology，2006.147(12)：p.5817-25.
17.Han，S.K.，et al.，Activation of gonadotropin-releasing hormoneneurons by kisspeptin as a neuroendocrine switch for the onset of puberty.JNeurosci，2005.25(49)：p.11349-56.
18.Thompson，E.L.，et al.，Central and peripheral administration ofkisspeptin-10 stimulates the hypothalamic-pituitary-gonadal axis.JNeuroendocrinol，2004.16(10)：p.850-8.
19.Navarro，V.M.，et al.，Effects of KiSS-1 peptide，the natural ligand ofGPR54，on follicle-stimulating hormone secretion in the rat.Endocrinology，2005.146(4)：p.1689-97.
20.Dhillo，W.S.，et al.，Kisspeptin-54 stimulates thehypothalamic-pituitary gonadal axis in human males.J Clin Endocrinol Metab，2005.90(12)：p.6609-15.
21.Messager，S.，et al.，Kisspeptin directly stimulatesgonadotropin-releasing hormone release via G protein-coupled receptor 54.ProcNatl Acad Sci U S A，2005.102(5)：p.1761-6.
22.Pompolo，S.，et al.，Colocalization of kisspeptin andgonadotropin-releasing hormone in the ovine brain.Endocrinology，2006.147(2)：p.804-10.
23.Jacobi，J.S.，et al.，17-Beta-Estradiol Directly Regulates theExpression of Adrenergic Receptors and Kisspeptin/GPR54 System in GT1-7GnRH Neurons.Neuroendocrinology，2007.
24.Gutierrez-Pascual，E.，et al.，Direct pituitary effects of kisspeptin：activation of gonadotrophs and somatotrophs and stimulation of luteinisinghormone and growth hormone secretion.J Neuroendocrinol，2007.19(7)：p.521-30.
25.Suzuki，S.，H.Kadokawa，and T.Hashizume，Direct kisspeptin-10stimulation on luteinizing hormone secretion from bovine and porcine anteriorpituitary cells.Anim Reprod Sci，2007.
26.Smith，J.T.，et al.，Differential regulation of KiSS-1 mRNA expressionby sex steroids in the brain of the male mouse.Endocrinology，2005.146(7)：p.2976-84.
27.Estrada，K.M.，et al.，Elevated KiSS-1 expression in the arcuatenucleus prior to the cyclic preovulatory gonadotrophin-releasinghormone/lutenising hormone surge in the ewe suggests a stimulatory role forkisspeptin in oestrogen-positive feedback.J Neuroendocrinol，2006.18(10)：p.806-9.
28.Franceschini，I.，et al.，Kisspeptin immunoreactive cells of the ovinepreoptic area and arcuate nucleus co-express estrogen receptor alpha.NeurosciLett，2006.401(3)：p.225-30.
29.Adachi，S.，et al.，Involvement of Anteroventral PeriventricularMetastin/Kisspeptin Neurons in Estrogen Positive Feedback Action on LuteinizingHormone Release in Female Rats.J Reprod Dev，2007.
30.Mason，A.O.，et al.，Suppression of kisspeptin expression andgonadotropic axis sensitivity following exposure to inhibitory day lengths infemale Siberian hamsters.Horm Behav，2007.
31.Revel，F.G.，et al.，Kisspeptin mediates the photoperiodic control ofreproduction in hamsters.Curr Biol，2006.16(17)：p.1730-5.
32.Revel，F.G.，et al.，KiSS-1：a likely candidate for the photoperiodiccontrol of reproduction in seasonal breeders.Chronobiol Int，2006.23(1-2)：p.277-87.
33.Greives，T.J.，et al.，Environmental Control of Kisspeptin：Implicationsfor Seasonal Reproduction.Endocrinology，2006.
34.Luque，R.M.，R.D.Kineman，and M.Tena-Sempere，Regulation ofhypothalamic expression of KiSS-1 and GPR54 genes by metabolic factors：Analyses using mouse models and a cell line.Endocrinology，2007.
35.Castellano，J.M.，et al.，Changes in hypothalamic KiSS-1 system andrestoration of pubertal activation of the reproductive axis by kisspeptin inundernutrition.Endocrinology，2005.146(9)：p.3917-25.
36.Mead，E.J.，et al.，Kisspeptins are novel potent vasoconstrictors inhumans，with a discrete localization of their receptor GPR54，to atherosclerosisprone vessels.Endocrinology，2006.
37.Arai，A.C.，et al.，Cancer metastasis-suppressing peptide metastinupregulates excitatory synaptic transmission in hippocampal dentate granulecells.J Neurophysiol，2005.94(5)：p.3648-52.
38.Gaytan，M.，et al.，Expression of KiSS-1 in rat oviduct：possibleinvolvement in prevention of ectopic implantation？Cell Tissue Res，2007.
39.Janneau，J.L.，et al.，Transcriptional expression of genes involved incell invasion and migration by normal and tumoral trophoblast cells.J ClinEndocrinol Metab，2002.87(11)：p.5336-9.
40.Horikoshi，Y.，et al.，Dramatic elevation of plasma metastinconcentrations in human pregnancy：metastin as a novel placenta-derivedhormone in humans.J Clin Endocrinol Metab，2003.88(2)：p.914-9.
41.Terao，Y.，et al.，Expression of KiSS-1，a metastasis suppressor gene，in trophoblast giant cells of the rat placenta.Biochim Biophys Acta，2004.1678(2-3)：p.102-10.
42.Bilban，M.，et al.，Kisspeptin-10，a KiSS-1/metastin-deriveddecapeptide，is a physiological invasion inhibitor of primary human trophoblasts.J Cell Sci，2004.117(Pt 8)：p.1319-28.
43.Masui，T.，et al.，Metastin and its variant forms suppress migration ofpancreatic cancer cells.Biochem Biophys Res Commun，2004.315(1)：p.85-92.
44.Ringel，M.D.，et al.，Metastin receptor is overexpressed in papillarythyroid cancer and activates MAP kinase in thyroid cancer cells.J ClinEndocrinol Metab，2002.87(5)：p.2399.
45.Schmid，K.，et al.，KiSS-1 overexpression as an independentprognostic marker in hepatocelluar carcinoma：an immunohistochemical study.Virchows Arch，2007.
46.Navenot，J.M.，et al.，Kisspeptin-10-induced signaling of GPR54negatively regulates chemotactic responses mediated by CXCR4：a potentialmechanism for the metastasis suppressor activity of kisspeptins.Cancer Res，2005.65(22)：p.10450-6.
47.Stathatos，N.，et al.，KiSS-1/G protein-coupled receptor 54 metastasissuppressor pathway increases myocyte-enriched calcineurin interacting protein 1expression and chronically inhibits calcineurin activity.J Clin Endocrinol Metab，2005.90(9)：p.5432-40.
48.Shirasaki，F.，et al.，Loss of expression of the metastasis suppressorgene KiSS1 during melanoma progression and its association with LOH ofchromosome 6q16.3-q23.Cancer Res，2001.61(20)：p.7422-5.
49.Mitchell，D.C.，et al.，Transcriptional regulation of KiSS-1 geneexpression in metastatic melanoma by specificity protein-1 and its coactivatorDRIP-130.Oncogene，2007.26(12)：p.1739-47.
50.Ohtaki，T.，et al.，Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptideligand of a G-protein-coupled receptor.Nature，2001.411(6837)：p.613-7.
51.Hori，A.，et al.，Metastin suppresses the motility and growth of CHOcells transfected with its receptor.Biochem Biophys Res Commun，2001.286(5)：p.958-63.
52.Niida，A.，et al.，Design and synthesis of downsized metastin(45-54)analogs with maintenance of high GPR54 agonistic activity.Bioorg Med ChemLett，2006.16(1)：p.134-7.
53.Orsini，M.J.，et al.，Metastin(KiSS-1)mimetics identified from peptidestructure-activity relationship-derived pharmacophores and directed smallmolecule database screening.J Med Chem，2007.50(3)：p.462-71.
54.Qiao，C.，et al.，[Clinical significance of KiSS-1 and matrixmetalloproteinase-9 expression in trophoblasts of women with preeclampsia andtheir relation to perinatal outcome of neonates].Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2005.40(9)：p.585-90.
实施例2中引用的编号的参考文献
1.Porkka-Heiskanen，T.，Khoshaba，N.，Scarbrough，K.，Urban，J.H.，Vitaterna，M.H.，Levine，J.E.，Turek，F.W.，and Horton，T.H.1997.Rapidphotoperiod-induced increase in detectable GnRH mRNA-containing cells inSiberian hamster.Am J Physiol 273：R2032-2039.
2.Richardson，H.N.，Nelson，A.L.，Ahmed，E.I.，Parfitt，D.B.，Romeo，R.D.，and Sisk，C.L.2004.Female pheromones stimulate release of luteinizing hormoneand testosterone without altering GnRH mRNA in adult male Syrian hamsters(Mesocricetus auratus).Gen Comp Endocrinol 138：211-217.
3.Centeno，M.L.，Sanchez，R.L.，Cameron，J.L.，and Bethea，C.L.2007.Hypothalamic gonadotrophin-releasing hormone expression in female monkeyswith different sensitivity to stress.J Neuroendocrinol 19：594-604.
4.Seminara，S.B.，Messager，S.，Chatzidaki，E.E.，Thresher，R.R.，Acierno，J.S.，Jr.，Shagoury，J.K.，Bo-Abbas，Y.，Kuohung，W.，Schwinof，K.M.，Hendrick，A.G.，et al.2003.The GPR54 gene as a regulator of puberty.N Engl J Med349：1614-1627.
5.de Roux，N.，Genin，E.，Carel，J.C.，Matsuda，F.，Chaussain，J.L.，andMilgrom，E.2003.Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function ofthe KiSS1-derived peptide receptor GPR54.Proc Natl Acad Sci U S A100：10972-10976.
6.Kotani，M.，Detheux，M.，Vandenbogaerde，A.，Communi，D.，Vanderwinden，J.M.，Le Poul，E.，Brezillon，S.，Tyldesley，R.，Suarez-Huerta，N.，Vandeput，F.，et al.2001.The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodeskisspeptins，the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54.J Biol Chem 276：34631-34636.
7.Muir，A.I.，Chamberlain，L.，Elshourbagy，N.A.，Michalovich，D.，Moore，D.J.，Calamari，A.，Szekeres，P.G.，Sarau，H.M.，Chambers，J.K.，Murdock，P.，etal.2001.AXOR12，a novel human G protein-coupled receptor，activated by thepeptide KiSS-1.J Biol Chem 276：28969-28975.
8.Seminara，S.B.，and Kaiser，U.B.2005.New gatekeepers of reproduction：GPR54 and its cognate ligand，KiSS-1.Endocrinology 146：1686-1688.
9.Gottsch，M.L.，Cunningham，M.J.，Smith，J.T.，Popa，S.M.，Acohido，B.V.，Crowley，W.F.，Seminara，S.，Clifton，D.K.，and Steiner，R.A.2004.A role forkisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.Endocrinology 145：4073-4077.
10.Irwig，M.S.，Fraley，G.S.，Smith，J.T.，Acohido，B.V.，Popa，S.M.，Cunningham，M.J.，Gottsch，M.L.，Clifton，D.K.，and Steiner，R.A.2004.Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulationof KiSS-1 mRNA in the male rat.Neuroendocrinology 80：264-272.
11.Smith，J.T.，Dungan，H.M.，Stoll，E.A.，Gottsch，M.L.，Braun，R.E.，Eacker，S.M.，Clifton，D.K.，and Steiner，R.A.2005.Differential regulation ofKiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse.Endocrinology 146：2976-2984.
12.Estrada，K.M.，Clay，C.M.，Pompolo，S.，Smith，J.T.，and Clarke，I.J.2006.Elevated KiSS-1 expression in the arcuate nucleus prior to the cyclicpreovulatory gonadotrophin-releasing hormone/lutenising hormone surge in theewe suggests a stimulatory role for kisspeptin in oestrogen-positive feedback.JNeuroendocrinol 18：806-809.
13.Revel，F.G.，Saboureau，M.，Masson-Pevet，M.，Pevet，P.，Mikkelsen，J.D.，and Simonneaux，V.2006.Kisspeptin mediates the photoperiodic control ofreproduction in hamsters.Curr Biol 16：1730-1735.
14.Revel，F.G.，Saboureau，M.，Masson-Pevet，M.，Pevet，P.，Mikkelsen，J.D.，and Simonneaux，V.2006.KiSS-1：a likely candidate for the photoperiodiccontrol of reproduction in seasonal breeders.Chronobiol Int 23：277-287.
15.Greives，T.J.，Mason，A.O.，Scotti，M.A.，Levine，J.，Ketterson，E.D.，Kriegsfeld，L.J.，and Demas，G.E.2006.Environmental Control of Kisspeptin：Implications for Seasonal Reproduction.Endocrinology.
16.Castellano，J.M.，Navarro，V.M.，Fernandez-Fernandez，R.，Nogueiras，R.，Tovar，S.，Roa，J.，Vazquez，M.J.，Vigo，E.，Casanueva，F.F.，Aguilar，E.，et al.2005.Changes in hypothalamic KiSS-1 system and restoration of pubertalactivation of the reproductive axis by kisspeptin in undernutrition.Endocrinology146：3917-3925.
17.Millar，R.P.，Lu，Z.L.，Pawson，A.J.，Flanagan，C.A.，Morgan，K.，andMaudsley，S.R.2004.Gonadotropin-releasing hormone receptors.Endocr Rev25：235-275.
18.Conn，P.M.，and Crowley，W.F.，Jr.1994.Gonadotropin-releasinghormone and its analogs.Annu Rev Med 45：391-405.
19.Horikoshi，Y.，Matsumoto，H.，Takatsu，Y.，Ohtaki，T.，Kitada，C.，Usuki，S.，and  Fujino，M.2003.Dramatic elevation of plasma metastinconcentrations in human pregnancy：metastin as a novel placenta-derivedhormone in humans.J Clin Endocrinol Metab 88：914-919.
20.Janneau，J.L.，Maldonado-Estrada，J.，Tachdjian，G.，Miran，I.，Motte，N.，Saulnier，P.，Sabourin，J.C.，Cote，J.F.，Simon，B.，Frydman，R.，et al.2002.Transcriptional expression of genes involved in cell invasion and migration bynormal and tumoral trophoblast cells.J Clin Endocrinol Metab 87：5336-5339.
21.Bilban，M.，Ghaffari-Tabrizi，N.，Hintermann，E.，Bauer，S.，Molzer，S.，Zoratti，C.，Malli，R.，Sharabi，A.，Hiden，U.，Graier，W.，et al.2004.Kisspeptin-10，a KiSS-1/metastin-derived decapeptide，is a physiological invasioninhibitor of primary human trophoblasts.J Cell Sci 117：1319-1328.
22.Mead，E.J.，Maguire，J.J.，Kuc，R.E.，and Davenport，A.P.2006.Kisspeptins are novel potent vasoconstrictors in humans，with a discretelocalization of their receptor GPR54，to atherosclerosis prone vessels.Endocrinology.
23.Han，S.K.，Gottsch，M.L.，Lee，K.J.，Popa，S.M.，Smith，J.T.，Jakawich，S.K.，Clifton，D.K.，Steiner，R.A.，and Herbison，A.E.2005.Activation ofgonadotropin-releasing hormone neurons by kisspeptin as a neuroendocrineswitch for the onset of puberty.J Neurosci 25：11349-11356.
24.Keen，K.L.，Wegner，F.H.，Bloom，S.R.，Ghatei，M.A.，and Terasawa，E.2008.An Increase in Kisspeptin-54 Release Occurs with the Pubertal Increasein LHRH-1 Release in the Stalk-Median Eminence of Female Rhesus Monkeys InVivo.Endocrinology.
25.Frost，S.I.，Keen，K.L.，Levine，J.E.，and Terasawa，E.2008.Microdialysis methods for in vivo neuropeptide measurement in the stalk-medianeminence in the Rhesus monkey.J Neurosci Methods 168：26-34.
26.Orsini，M.J.，Klein，M.A.，Beavers，M.P.，Connolly，P.J.，Middleton，S.A.，and Mayo，K.H.2007.Metastin(KiSS-1)mimetics identified from peptidestructure-activity relationship-derived pharmacophores and directed smallmolecule database screening.J Med Chem 50：462-471.
27.Tomita，K.，Niida，A.，Oishi，S.，Ohno，H.，Cluzeau，J.，Navenot，J.M.，Wang，Z.X.，Peiper，S.C.，and Fujii，N.2006.Structure-activity relationship studyon small peptidic GPR54 agonists.Bioorg Med Chem 14：7595-7603.
28.Clements，M.K.，McDonald，T.P.，Wang，R.，Xie，G.，O′Dowd，B.F.，George，S.R.，Austin，C.P.，and Liu，Q.2001.FMRFamide-related neuropeptidesare agonists of the orphan G-protein-coupled receptor GPR54.Biochem BiophysRes Commun 284：1189-1193.
29.Gottsch，M.L.，Clifton，D.K.，and Steiner，R.A.2006.Kisspepeptin-GPR54 signaling in the neuroendocrine reproductive axis.Mol CellEndocrinol 254-255：91-96.
30.Tenenbaum-Rakover，Y.，Commenges-Ducos，M.，Iovane，A.，Aumas，C.，Admoni，O.，and de Roux，N.2006.Neuroendocrine Phenotype Analysis inFive Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism Due to a L102PInactivating Mutation of GPR54.J Clin Endocrinol Metab.
31.Blank，S.K.，McCartney，C.R.，and Marshall，J.C.2006.The originsand sequelae of abnormal neuroendocrine function in polycystic ovary syndrome.Hum Reprod Update 12：351-361.
32.Li，X.F.，Kinsey-Jones，J.S.，Knox，A.M.，Wu，X.Q.，Tahsinsoy，D.，Brain，S.D.，Lightman，S.L.，and  O′Byrne K，T.2007.Neonatallipopolysaccharide exposure exacerbates stress-induced suppression of LH pulsefrequency in adulthood.Endocrinology.
33.Dong，Q.，Li，B.，Rintala，H.，Blair，S.，Spaliviero，J.，and Handelsman，D.J.1993.LH pulsatility，biopotency，and clearance during undernutrition inorchidectomized mature rats.Am J Physiol 265：E304-313.
34.Adachi，S.，Yamada，S.，Takatsu，Y.，Matsui，H.，Kinoshita，M.，Takase，K.，Sugiura，H.，Ohtaki，T.，Matsumoto，H.，Uenoyama，Y.，et al.2007.Involvement of anteroventral periventricular metastin/kisspeptin neurons inestrogen positive feedback action on luteinizing hormone release in female rats.JReprod Dev 53：367-378.
35.Kinoshita，M.，Tsukamura，H.，Adachi，S.，Matsui，H.，Uenoyama，Y.，Iwata，K.，Yamada，S.，Inoue，K.，Ohtaki，T.，Matsumoto，H.，et al.2005.Involvement of central metastin in the regulation of preovulatory luteinizinghormone surge and estrous cyclicity in female rats.Endocrinology146：4431-4436.
36.Clarke，I.J.1993.Variable patterns of gonadotropin-releasing hormonesecretion during the estrogen-induced luteinizing hormone surge inovariectomized ewes.Endocrinology 133：1624-1632.
37.Roa，J.，Vigo，E.，Castellano，J.M.，Navarro，V.M.，Fernandez-Fernandez，R.，Casanueva，F.F.，Dieguez，C.，Aguilar，E.，Pinilla，L.，and Tena-Sempere，M.2006.Hypothalamic expression of KiSS-1 system andgonadotropin-releasing effects of kisspeptin in different reproductive states of thefemale Rat.Endocrinology 147：2864-2878.
38.Dhillo，W.S.，Chaudhri，O.B.，Thompson，E.L.，Murphy，K.G.，Patterson，M.，Ramachandran，R.，Nijher，G.K.，Amber，V.，Kokkinos，A.，Donaldson，M.，et al.2007.Kisspeptin-54 stimulates gonadotropin release mostpotently during the preovulatory phase of the menstrual cycle in women.J ClinEndocrinol Metab 92：3958-3966.
39.Dhillo，W.S.，Chaudhri，O.B.，Patterson，M.，Thompson，E.L.，Murphy，K.G.，Badman，M.K.，McGowan，B.M.，Amber，V.，Patel，S.，Ghatei，M.A.，et al.2005.Kisspeptin-54 stimulates the hypothalamic-pituitary gonadal axis in humanmales.J Clin Endocrinol Metab 90：6609-6615.
40.Arai，A.C.，Xia，Y.F.，Suzuki，E.，Kessler，M.，Civelli，O.，andNothacker，H.P.2005.Cancer metastasis-suppressing peptide metastinupregulates excitatory synaptic transmission in hippocampal dentate granule cells.J Neurophysiol 94：3648-3652.
41.Hiden，U.，Bilban，M.，Knofler，M.，and Desoye，G.2007.Kisspeptinsand the placenta：Regulation of trophoblast invasion.Rev Endocr Metab Disord.
42.Suter，K.J.，Song，W.J.，Sampson，T.L.，Wuarin，J.P.，Saunders，J.T.，Dudek，F.E.，and Moenter，S.M.2000.Genetic targeting of green fluorescentprotein to gonadotropin-releasing hormone neurons：characterization ofwhole-cell electrophysiological properties and morphology.Endocrinology141：412-419.
43.Christian，C.A.，Mobley，J.L.，and Moenter，S.M.2005.Diumal andestradiol-dependent changes in gonadotropin-releasing hormone neurone firingactivity.Proc Natl Acad Sci U S A 102：15682-15687.
44.Nunemaker，C.S.，DeFazio，R.A.，and  Moenter，S.M.2002.Estradiol-sensitive afferents modulate long-term episodic firing patterns of GnRHneurons.Endocrinology 143：2284-2292.
45.Pielecka，J.，and Moenter，S.M.2006.Effect of steroid milieu ongonadotropin-releasing hormone-1 neuron firing pattern and luteinizing hormonelevels in male mice.Biol Reprod 74：931-937.
46.Gearing，M.，and Terasawa，E.1988.Luteinizing hormone releasinghormone(LHRH)neuroterminals mapped using the push-pull perfusion methodin the rhesus monkey.Brain Res Bull 21：117-121.
47.Merriam，G.R.，and Wachter，K.W.1982.Algorithms for the study ofepisodic hormone secretion.Am J Physiol 243：E310-318.
48.Navarro，V.M.，Castellano，J.M.，Fernandez-Fernandez，R.，Tovar，S.，Roa，J.，Mayen，A.，Nogueiras，R.，Vazquez，M.J.，Barreiro，M.L.，Magni，P.，et al.2005.Characterization of the potent luteinizing hormone-releasing activity ofKiSS-1 peptide，the natural ligand of GPR54.Endocrinology 146：156-163.
49.Barker-Gibb，M.L.，Scott，C.J.，Boublik，J.H.，and Clarke，I.J.1995.The role of neuropeptide Y(NPY)in the control of LH secretion in the ewe withrespect to season，NPY receptor subtype and the site of action in thehypothalamus.J Endocrinol 147：565-579.
50.Thomas，G.B.，Mercer，J.E.，Karalis，T.，Rao，A.，Cummins，J.T.，andClarke，I.J.1990.Effect of restricted feeding on the concentrations of growthhormone(GH)，gonadotropins，and prolactin(PRL)in plasma，and on theamounts of messenger ribonucleic acid for GH，gonadotropin subunits，and PRLin the pituitary glands of adult ovariectomized ewes.Endocrinology126：1361-1367.
序列表
<110>医药研究委员会
<120>亲吻肽拮抗剂及其用途
 
<130>MEDBX/P41814PC
 
<150>GB0719592.8
<151>2007年10月10日
 
<160>77
 
<170>SeqWin99
 
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
 
<221>misc_feature
<222>1..10
<223>亲吻肽1-10序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>NH2基团
 
<400>1
Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe
1               5                  10
 
<210>2
<211>54
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>misc_feature
<222>1..54
<223>亲吻肽1-54序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(54)..(54)
<223>NH2基团
 
<400>2
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly
            20                  25                  30
Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn
        35                  40                  45
Ser Phe Gly Leu Arg Phe
    50
 
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>F或A或任意D-氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>G或W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>L或A或任意D-氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>R或(D)R
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>F或A或任意D-氨基酸
 
<400>3
Xaa Gly Xaa Arg Xaa
1               5
 
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>4
Phe Gly Leu Arg Phe
1               5
 
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>5
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)F
 
<400>6
Phe Gly Phe Arg Phe
1               5
 
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>7
Phe Gly Ala Arg Trp
1               5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>(D)R
 
<400>8
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)L
 
<400>9
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)F
 
<400>10
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)F
 
<400>11
Phe Trp Leu Arg Trp
1               5
 
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)W
 
<400>12
Phe Gly Trp Arg Phe
1               5
 
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)F
 
<400>13
Phe Gly Phe Arg Trp
1               5
 
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)L
 
<400>14
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>(D)R
 
<400>15
Phe Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>16
Phe Gly Ala Arg Trp
1               5
 
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>17
Ala Gly Leu Arg Trp
1               5
 
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)F
 
<400>18
Phe Trp Leu Arg Trp
1               5
 
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)W
 
<400>19
Phe Gly Trp Arg Phe
1               5
 
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
 
<220>
<221>misc_feature
<222>1..8
<223>果蝇触足肽N末端序列
 
<400>20
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr
1               5
 
<210>21
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>(D)F
 
<400>21
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Phe Arg Trp
1               5                   10
 
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>(D)L
 
<400>22
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Leu Arg Trp
1               5                   10
 
<210>23
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>(D)R
 
<400>23
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Leu Arg Trp
1               5                   10
 
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<400>24
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Ala Arg Trp
1               5                   10
 
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<400>25
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Gly Leu Arg Trp
1               5                   10
 
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)F
 
<400>26
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Trp Leu Arg Trp
1               5                   10
 
<210>27
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>(D)W
 
<400>27
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>28
<211>49
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>misc_feature
<222>1..49
<223>亲吻肽1-45序列
 
<400>28
Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly
            20                  25                  30
Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn
        35                  40                  45
Ser
 
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Y或任意D-氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>N或任意D-氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>W或任意D-氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>G或S或任意D-氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>F或(D)W或(D)L
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>W或L或任意D-氨基酸
<400>29
Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Gly Xaa Arg Phe
1               5                   10
 
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>30
Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe
1               5                   10
 
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)N
 
<400>31
Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)N
 
<400>32
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)N
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)W
 
<400>33
Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)N
 
<400>34
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<400>35
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu Arg Phe
1               5                   10
 
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)L
 
<400>36
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu Arg Phe
1               5                   10
 
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
<400>37
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>(D)W
 
<400>38
Tyr Asn Trp Asn Gly Trp Gly Leu Arg Phe
1               5                   10
 
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>39
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>40
Tyr Asn Trp Asn Trp Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>41
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>42
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)N
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>43
Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>44
Tyr Asn Trp Asn Ala Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>45
Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>46
Tyr Asn Ala Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>47
Tyr Ala Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
<400>48
Trp Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽1-10
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)F
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>49
Phe Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>50
Tyr Asn Trp Asn Gly Trp Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
<400>51
Ala Asn Trp Asn Gly Trp Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>52
Ala Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<400>53
Asp Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>(D)S
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)W
 
<400>54
Ala Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10
 
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>(D)L
 
<400>55
Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu Arg Phe
1               5                   10
 
<210>56
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<400>56
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>57
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)L
 
<400>57
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>58
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>58
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10                  15
 
<210>59
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>(D)W
 
<400>59
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>60
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>60
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe
1               5                   10                  15
 
<210>61
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>61
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Trp Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>62
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>62
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
<210>63
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>63
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>64
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>(D)N
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>64
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>65
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>65
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Ala Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>66
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>66
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>67
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>果蝇触足肽N末端序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>67
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Ala Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>68
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>果蝇触足肽N末端序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>68
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Ala Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>69
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>69
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Trp Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>70
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)F
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>70
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>71
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)Y
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>71
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Trp Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
<210>72
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>(D)W
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>72
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Gly Trp Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>73
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>73
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>74
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<400>74
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
<210>75
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>(D)S
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>75
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Ser Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>76
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)L
 
<400>76
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Leu
1               5                   10                  15
Arg Phe
 
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有N末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>(D)A
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>(D)W
 
<400>77
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Arg Phe

Claims (72)

1.亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途。
2.亲吻肽拮抗剂，其用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症。
3.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为：
X1-G/W-X2-R/(D)R-X3
其中：
X1为F或A或任意D-氨基酸残基；
X2为L或A或任意D-氨基酸残基；
X3为F或W；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且其中所述肽序列不为：
F-G-L-R-F；
F-G-L-R-W；或
F-G-(D)F-R-F。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述肽序列不为：
F-G-A-R-W；
F-G-L-(D)R-W；
F-G-(D)L-R-W；或
(D)F-G-L-R-W。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其中X1为(D)F。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的用途，其中X2为选自由(D)F、(D)L和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其中所述肽序列选自由下述序列组成的组：
(D)F-W-L-R-W；或
F-G-(D)W-R-F。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
9.根据权利要求8所述的用途，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中基团y选自由下述基团组成的组：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的用途，其中X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的用途，其中所述序列选自由下述序列组成的组：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z；
IV)ac.F-G-A-R-W.z；
V)ac.A-G-L-R-W.z；
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z；或
VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
13.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的用途，或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的药物中的用途，所述序列为：
XA-XB-XC-N-XD-XE-G-XF-R-F
其中：
XA为Y或任意D-氨基酸残基；
XB为N或任意D-氨基酸残基；
XC为W或任意D-氨基酸残基；
XD为G或S或任意D-氨基酸残基；
XE为F或(D)W或(D)L；
XF为W或L或任意D-氨基酸残基；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且其中所述肽序列不为：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F；或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
14.根据权利要求13所述的用途，其中XA为选自由(D)F和(D)Y和(D)A组成的组中的D-氨基酸残基。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中XB为选自由(D)A和(D)N组成的组中的D-氨基酸残基。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的用途，其中当XA或XB中的一个为(D)Y时，另一个不为(D)N。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中XA和XB不都为D-氨基酸残基。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的用途，其中当XF为(D)W时，XA为(D)F。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的用途，其中XC为选自由(D)A和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的用途，其中XD为选自由(D)A和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的用途，其中当XD为S时，XF为(D)W和/或XA不为(D)Y。
22.根据权利要求13至20中任一项所述的用途，其中当XD为S时，XF为(D)W和/或XA为(D)A。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的用途，其中XF为选自由(D)L和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的用途，其中当XE和XF都为(D)W时，XA不为(D)Y。
25.根据权利要求13至23中任一项所述的用途，其中当XE和XF都为(D)W时，XA为(D)A。
26.根据权利要求13至25中任一项所述的用途，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
27.根据权利要求26所述的用途，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中基团y选自由以下基团组成的组：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
29.根据权利要求13至28中任一项所述的用途，其中所述肽分子的C-末端F残基包含去除该残基上的电荷的基团z。
30.根据权利要求13至29中任一项所述的用途，其中所述序列选自由以下序列组成的组：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；
s)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的用途，其中所述个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症选自包含下述病症的组：增殖性疾病；子宫内膜异位症；子宫肌瘤；性早熟；先兆子痫；胎儿宫内生长迟缓(IUGR)；异位妊娠；月经过多；高血压；冠心病；中枢神经系统(CNS)、胰腺和/或免疫系统疾病；阻抑或抑制排卵；生育病；化疗引起和/或放疗引起的生殖组织损伤；阻抑或抑制创伤愈合；阻抑或抑制生长激素生成。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述增殖性疾病选自包含下述病症的组：良性前列腺增生症；癌症；生殖组织的癌症；妇科癌症；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宫癌；宫颈癌；子宫内膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。
33.如权利要求3至32中任一项所定义的肽分子，其中所述肽分子为亲吻肽拮抗剂或者其片段或变体，该片段或变体为亲吻肽拮抗剂。
34.权利要求1或2中所定义的拮抗剂或权利要求3至33中任一项所定义的肽分子，其用于药物中。
35.根据权利要求34所述的肽分子，其中所述肽分子为亲吻肽拮抗剂。
36.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体，所述序列为：
X1-G/W-X2-R/(D)R-X3
其中：
X1为F或A或任意D-氨基酸残基；
X2为L或A或任意D-氨基酸残基；
X3为F或W；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且其中所述肽序列不为：
F-G-L-R-F；
F-G-L-R-W；
F-G-(D)F-R-F；
F-G-A-R-W；
F-G-L-(D)R-W；
F-G-(D)L-R-W；
A-G-L-R-W；或
(D)F-G-L-R-W。
37.根据权利要求36所述的肽分子，其中X1为(D)F。
38.根据权利要求36或37所述的肽分子，其中X2为选自由(D)F、(D)L和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的肽分子，其中所述肽序列选自由以下序列组成的组：
(D)F-W-L-R-W；或
F-G-(D)W-R-F。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的肽分子，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
41.根据权利要求40所述的肽分子，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
42.根据权利要求40或41所述的肽分子，其中基团y选自由以下基团组成的组：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的肽分子，其中X3包含去除该残基上的电荷的基团z。
44.根据权利要求36至43中任一项所述的肽分子，其中所述肽序列选自由以下序列组成的组：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z；
IV)ac.F-G-A-R-W.z；
V)ac.A-G-L-R-W.z；
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z；或
VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
45.包含以下序列的肽分子或者其片段或变体，所述序列为：
XA-XB-XC-N-XD-XE-G-XF-R-F
其中：
XA为Y或任意D-氨基酸残基；
XB为N或任意D-氨基酸残基；
XC为W或任意D-氨基酸残基；
XD为G或S或任意D-氨基酸残基；
XE为F或(D)W或(D)L；
XF为W或L或任意D-氨基酸残基；且
其中所述肽分子的C-末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团z；
并且其中所述肽序列不为：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F；或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
46.根据权利要求45所述的肽分子，其中XA为选自由(D)F和(D)Y和(D)A组成的组中的D-氨基酸残基。
47.根据权利要求45或46所述的肽分子，其中XB为选自由(D)A和(D)N组成的组中的D-氨基酸残基。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的肽分子，其中当XA或XB中的一个为(D)Y时，另一个不为(D)N。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的肽分子，其中XA和XB不都为D-氨基酸残基；
50.根据权利要求45至49中任一项所述的用途，其中当XF为(D)W时，XA为(D)F。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的肽分子，其中XC为选自由(D)A和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的肽分子，其中XD为选自由(D)A和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
53.根据权利要求45至52中任一项所述的用途，其中当XD为S时，XF为(D)W和/或XA不为(D)Y。
54.根据权利要求45至52中任一项所述的用途，其中当XD为S时，XF为(D)W和/或XA为(D)A。
55.根据权利要求45至54中任一项所述的肽分子，其中XF为选自由(D)L和(D)W组成的组中的D-氨基酸残基。
56.根据权利要求45至55中任一项所述的用途，其中当XE和XF都为(D)W时，XA不为(D)Y。
57.根据权利要求45至55中任一项所述的用途，其中当XE和XF都为(D)W时，XA为(D)A。
58.根据权利要求45至57中任一项所述的肽分子，其中所述N-末端残基包含去除该残基上的电荷的基团y。
59.根据权利要求58所述的肽分子，其中X1包含去除该残基上的电荷的基团y。
60.根据权利要求58或59所述的肽分子，其中基团y选自由下述基团组成的组：乙酰基；三氟乙酰基；环化氨基酸；或在N-末端不带电荷的合成氨基酸。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的肽分子，其中所述肽分子的C-末端F残基包含去除该残基上的电荷的基团z。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的肽分子，其中所述肽序列选自由以下序列组成的组：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z；
s)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z；或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
63.如权利要求3至62中任一项所定义的肽分子，其中z为NH2或N-丙酰胺或N-乙酰胺(NHEt)或N-甲酰胺或N-丁酰胺。
64.如权利要求3至63中任一项所定义的肽分子，其中所述肽在N-末端还包含序列：R-R-M-K-W-K-K-Y。
65.如权利要求64所定义的肽分子，其中所述肽序列选自由以下序列组成的组：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z；或
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z。
66.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1或2中所定义的拮抗剂或者权利要求63至65中任一项所述的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
67.一种治疗个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症的方法，所述方法包括向所述个体施用权利要求66所述的药物组合物，或者有效量的权利要求1或2中所定义的亲吻肽拮抗剂，或者有效量的权利要求63至65中任一项所述的肽分子的步骤。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述个体中由亲吻肽活性引起和/或使恶化的病症选自由以下病症组成的组：增殖性疾病；子宫内膜异位症；子宫肌瘤；性早熟；先兆子痫；胎11宫内生长迟缓(IUGR)；异位妊娠；月经过多；高血压；冠心病；中枢神经系统(CNS)、胰腺和/或免疫系统疾病；阻抑或抑制排卵；生育病；化疗引起和/或放疗引起的生殖组织损伤；阻抑或抑制创伤愈合；阻抑或抑制生长激素生成。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述增殖性疾病选自由以下病症组成的组：良性前列腺增生症；癌症；生殖组织的癌症；妇科癌症；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；子宫癌；宫颈癌；子宫内膜癌；黑色素瘤；胰腺癌；胃癌。
70.一种鉴定亲吻肽拮抗剂的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供待测试的化合物；
ii)确定(i)中的化合物结合亲吻肽受体的能力；
iii)确定(i)中的化合物拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力；和
iv)在所述化合物能够结合亲吻肽受体并能够拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的情况下，将该化合物鉴定为亲吻肽拮抗剂。
71.基本如本文描述的拮抗剂或肽分子或药物组合物。
72.基本如本文描述的用途或方法。
CN200880116666.6A 2007-10-08 2008-10-08 亲吻肽拮抗剂及其用途 Expired - Fee Related CN101861160B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97817907P 2007-10-08 2007-10-08
GBGB0719592.8A GB0719592D0 (en) 2007-10-08 2007-10-08 Compound, use and method
US60/978,179 2007-10-08
GB0719592.8 2007-10-08
PCT/GB2008/003426 WO2009047513A2 (en) 2007-10-08 2008-10-08 Antagonists of kisspeptin and uses thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310349596.1A Division CN103495154A (zh) 2007-10-08 2008-10-08 亲吻肽拮抗剂及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101861160A true CN101861160A (zh) 2010-10-13
CN101861160B CN101861160B (zh) 2014-07-16

Family

ID=38739273

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880116666.6A Expired - Fee Related CN101861160B (zh) 2007-10-08 2008-10-08 亲吻肽拮抗剂及其用途
CN201310349596.1A Pending CN103495154A (zh) 2007-10-08 2008-10-08 亲吻肽拮抗剂及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310349596.1A Pending CN103495154A (zh) 2007-10-08 2008-10-08 亲吻肽拮抗剂及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (2) US8916681B2 (zh)
EP (1) EP2211891B1 (zh)
JP (2) JP5492776B2 (zh)
CN (2) CN101861160B (zh)
GB (1) GB0719592D0 (zh)
WO (1) WO2009047513A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109206481A (zh) * 2017-07-05 2019-01-15 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
CN110167522A (zh) * 2017-12-12 2019-08-23 科丝美诗株式会社 包括亲吻素的抗老化或抗炎症的组合物
CN114599385A (zh) * 2019-06-07 2022-06-07 总医院公司 预测和治疗青春期延迟的亲吻肽

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0719592D0 (en) * 2007-10-08 2007-11-14 Medical Res Council Compound, use and method
WO2010137022A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Yeda Research And Development Co. Ltd Gpr54 agonists or antagonists for treatment of diseases presenting behavioral abnormalities
CN104350064A (zh) 2012-03-14 2015-02-11 耶达研究及发展有限公司 修饰的吻素肽和其用途
WO2015112703A1 (en) * 2014-01-22 2015-07-30 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating diabetes
WO2019243605A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Universidad de Córdoba In vitro method for the diagnosis of ectopic pregnancy

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1157097A4 (en) 1999-02-24 2005-02-16 Merck & Co Inc GALANINE RECEPTOR-LIKE G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR
US6420123B1 (en) * 1999-04-06 2002-07-16 Arpad Furka Spatially defined synthesis
AU2001244609A1 (en) 2000-03-30 2001-10-15 Takeda Chemical Industries Ltd. Novel protein, dna thereof and process for producing the same
DE10259933A1 (de) 2002-12-20 2004-07-01 Bayer Healthcare Ag Substituierte 4-Aryl-Pyridine
JP4804714B2 (ja) 2002-12-26 2011-11-02 武田薬品工業株式会社 メタスチン誘導体およびその用途
KR20050090420A (ko) 2002-12-26 2005-09-13 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 메타스틴 유도체 및 이의 용도
US6800611B2 (en) 2003-01-06 2004-10-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Metastin derivatives and their use
GB0304021D0 (en) 2003-02-21 2003-03-26 Pfizer Ltd Treatment of hypertension
WO2004087125A1 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Ionix Pharmaceuticals Limited Amino acid derivatives as inhibitors of mammalian sodium channels
WO2004101747A2 (en) 2003-05-07 2004-11-25 The General Hospital Corporation Identification and use of gpr54 and its ligands for reproductive disorders and contraception
US20070270339A1 (en) * 2004-04-23 2007-11-22 Serono, Inc. Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility
AU2005249373A1 (en) 2004-04-23 2005-12-15 Laboratoires Serono Sa Use of GPCR54 ligands for the treatment of infertility
JPWO2007018319A1 (ja) * 2005-08-11 2009-02-19 武田薬品工業株式会社 ピリジルフェノール化合物およびその用途
WO2007084211A2 (en) 2005-11-11 2007-07-26 The General Hospital Corporation Use of gpr54 ligands for treatment of reproductive disorders, proliferative disorders, and for contraception
GB0719592D0 (en) * 2007-10-08 2007-11-14 Medical Res Council Compound, use and method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙妍等: "GPR54 /k isspeptin的生殖内分泌作用研究进展", 《国际病理科学与临床杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109206481A (zh) * 2017-07-05 2019-01-15 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
CN109206481B (zh) * 2017-07-05 2023-08-18 尚华医药科技(江西)有限公司 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
CN110167522A (zh) * 2017-12-12 2019-08-23 科丝美诗株式会社 包括亲吻素的抗老化或抗炎症的组合物
CN110167522B (zh) * 2017-12-12 2022-05-31 科丝美诗株式会社 包括亲吻素的抗老化或抗炎症的组合物
CN114599385A (zh) * 2019-06-07 2022-06-07 总医院公司 预测和治疗青春期延迟的亲吻肽

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013107896A (ja) 2013-06-06
EP2211891A2 (en) 2010-08-04
JP5492776B2 (ja) 2014-05-14
CN103495154A (zh) 2014-01-08
US20150057430A1 (en) 2015-02-26
CN101861160B (zh) 2014-07-16
GB0719592D0 (en) 2007-11-14
US20110046068A1 (en) 2011-02-24
JP2010540678A (ja) 2010-12-24
WO2009047513A2 (en) 2009-04-16
WO2009047513A3 (en) 2009-08-13
EP2211891B1 (en) 2016-02-24
US8916681B2 (en) 2014-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101861160B (zh) 亲吻肽拮抗剂及其用途
Millar et al. Current and future applications of GnRH, kisspeptin and neurokinin B analogues
Pawson et al. Type II gonadotrophin-releasing hormone (GnRH-II) in reproductive biology
JP5290163B2 (ja) 薬剤、方法および使用
JP6203215B2 (ja) プロミニン−１ペプチド断片およびその使用
Espigares et al. The forebrain-midbrain acts as functional endocrine signaling pathway of Kiss2/Gnrh1 system controlling the gonadotroph activity in the teleost fish European sea bass (Dicentrarchus labrax)
KR20080086438A (ko) 메타스틴 유도체 및 그의 용도
KR102623470B1 (ko) Bph 증상의 악화 또는 진행을 개선하거나 예방하는 방법
AU2005249373A1 (en) Use of GPCR54 ligands for the treatment of infertility
Hu et al. Advances in clinical applications of kisspeptin-GnRH pathway in female reproduction
CN108348570B (zh) 基于spexin的甘丙肽2型受体激动剂及其用途
CN110381984B (zh) 用于改善性功能的组合物和方法
US10155790B2 (en) Antagonists of neurokinin B in fish reproduction
JP2003526674A (ja) ボンベシン受容体３の使用
RU2684315C2 (ru) Медицинское применение
US20070270339A1 (en) Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility
Newton et al. Modulators of GnRH Secretion and Therapeutic Applications
KR20160045956A (ko) 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 펩타이드 유사체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물
US20240252516A1 (en) Combination bph therapy with fexapotide triflutate, a 5-ari, and an alpha blocker
Leaños-Miranda et al. Identification of new gonadotrophin-releasing hormone partial agonists
Pandey LEPTIN, THE MEDIATOR OF ENERGY RESERVE HAS ROLE IN FERTILITY: A REVIEW.
Misu Development of Neuropeptide Receptor Ligands for the Control of Reproductive Systems

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140716

Termination date: 20171008