KR20160045956A

KR20160045956A - 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 펩타이드 유사체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물

Info

Publication number: KR20160045956A
Application number: KR1020140140487A
Authority: KR
Inventors: 김남형; 남궁석; 방정규
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2016-04-28
Also published as: KR101650778B1

Abstract

본 발명은 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물에 관한 것이다. 상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염은 폴로 유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 난자 성숙을 저해하는 것을 특징으로 하여 우수한 피임용 조성물로 활용할 수 있다.

Description

폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 펩타이드 유사체 및 이를 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물{Peptide analog binding to polo-box domain of polo-like kinase-1 and pharmaceutical composition for contraception containing thereof}

본 발명은 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염 및 이의 피임 용도에 관한 것이다.

현재 사용되는 피임방법은 여러 가지가 있는데, 콘돔, 페미돔 등의 물리적인 방법, 호르몬제제에 의한 배란의 저해, 살정제 투여, 자궁 내 장치 등이 있다. 그러나 각각의 방법에는 특이적인 단점이 있는바, 예를 들면, 생식주기법의 경우 실패확률이 높고, 콘돔, 페미돔에서 야기되는 이질감이 있고, 자궁 내 장치의 경우 염증이나 통증 유발의 위험성이 있으며, 경구 호르몬 제제는 혈전 및 생리불순의 위험이 있다. 특히 호르몬 제제의 경우 피임을 위해서 호르몬을 투여할 경우, 피임의 목적은 충족시킬지라도 그외의 부작용(생리불순, 출혈, 혈전 등)이 야기된다. 영구적인 피임을 위한 수술의 경우, 수술 자체의 부담과 재건시 드는 높은 비용 등이 있다. 따라서, 현재까지 발명된 피임법들 중에 환자의 육체적, 심리적 부담과 비용등을 고려하였을 때, 완벽한 피임법은 금욕 외에는 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 감수분열 과정에서 폴로유사인산화효소-1 의 폴로박스도메인에 선택적으로 결합하는 단백질인 emi2의 구조에 기반하여 폴로박스도메인에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 유사체를 합성하였다.

폴로유사인산화효소-1 은 난구세포의 난자로의 성숙 및 정자 수정 이후 감수분열의 재개와 같은 난자의 성숙과 수정에 관련된 두 가지 단계에 모두 관여하는 핵심 조절 인자로써 폴로유사인산화효소-1 의 활성을 저해할 수 있는 펩타이드 유사체와 같은 화학물질은 난구세포의 성숙 및 수정 후의 감수분열 재개를 억제하여 궁극적으로 효과적인 피임제로 사용할 수 있다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0044307호

따라서 본 발명의 목적은 폴로 유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 유사체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 피임제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 폴로 유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드 유사체를 제공하며, 상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 인산화펩타이드 결합자리는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인 단백질의 414번 트립토판, 415번 발린, 416번 아스파르트산, 417번 타이로신, 481번 타이로신 및 485번 타이로신 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피임용 조성물은 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 1~500 μM 의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피임용 조성물은 난자 성숙을 저해할 수 있다.

또한, 시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 화합물을 주입하는 단계; 상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입하는 단계; 미성숙 난자의 세포 외 성숙(In vitro maturation)을 유도하는 단계; 및 세포 외 성숙 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 피임제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 화합물을 주입하고, 상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입한 군과 피임 후보 물질을 주입하지 않은 군을 비교하여, 피임 후보 물질을 주입한 군이 세포 외 성숙 정도가 더 감소한 경우, 상기 후보 물질을 신규한 피임제로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 신규한 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 이용하여 난자의 성숙을 저해하는 기작 등을 통하여 우수한 피임 효과를 나타낼 수 있어 피임용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 합성한 신규 펩타이드 유도체의 치환기에 따른 명명법을 나타낸 것이다.
도 2는 펩타이드 유사체가 폴로유사인산화효소-1과 결합된 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 미성숙 난자에 펩타이드 유사체 주입에 따른 난자성숙 저해력을 검증하기 위한 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 펩타이드 유사체의 주입에 따른 돼지 미성숙 난자의 성숙저해율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 펩타이드 유사체 AB103-8의 주입에 의한 생쥐 미성숙난자 성숙의 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 펩타이드 유사체 AB103-8의 주입에 의한 핵붕괴 저해를 나타낸 사진이다.
도 7은 생쥐의 단위발생(pathernogenetic activation)에 AB103-8 화합물이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 생쥐의 단위발생 개시 3시간 후의 생쥐 난자의 상태를 나타낸 사진이다.

본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 펩타이드 유사체를 제공함을 특징으로 한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은

으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 신규 펩타이드 유사체는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 입체이성질체 또는 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 염은 순수한 의학적 판단의 범위 내에서 과다한 독성, 자극 및 부작용 등의 유발 없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 염을 의미한다. 상기 약학적으로 허용되는 염은 당 분야에 잘 알려져 있다(S.M. Berge et al., 1977, J. Parmaceutical Sciences, 66:1). 상기 염은 본 발명의 유도체 화합물을 최종적으로 분리, 정제 및 합성하는 동안에 동일반응 계에서 제조하거나 별도로 무기 염기 또는 유기 염기와 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 염으로는 본 발명의 유도체 화합물이 산성기를 함유하고 있을 경우, 염기와 염을 형성할 수 있으며, 이러한 염으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 리튬염, 나트륨염 또는 칼륨염과 같은 알칼리금속과의 염; 바륨 또는 칼슘과 같은 알칼리토금속과의 염; 마그네슘염과 같은 기타 금속과의 염; 디시클로헥실아민과의 염과 같은 유기 염기염; 리신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산과의 염을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 유도체 화합물이 분자 내에 염기성 기를 함유하는 경우에는 산부가염을 형성할 수 있으며, 이러한 산부가염의 예로는, 이에 한정되지는 않으나, 무기산, 특히 할로겐화수소산(예컨대, 불소화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 또는 염소화수소산), 질산, 탄산, 황산 또는 인산과의 염; 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산 또는 에탄술폰산과 같은 저급알킬 술폰산과의 염; 벤젠술폰산 또는 p-톨루엔술폰산과의 염; 아세트산, 푸마르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 말산, 숙신산 또는 시트르산과 같은 유기카르복실산과의 염; 및 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 아미노산과의 염을 포함할 수 있다.

한편, 포유류의 난자는 난구세포 상태에서 성숙되어 수정이 가능한 난자가 되며 수정이 될 때까지 제1감수분열 상태를 유지하고, 수정후에 제2감수분열이 진행되는데, 난자의 성숙 및 수정과정에 이상이 생기거나 이러한 과정이 저해 또는 억제되면 궁극적으로 개체발생이 불가능하게 된다. 난자의 성숙과정을 조절하는 주된 인자는 metaphase promoting factor(MPF)이다(Heinkiheimo et al., 1998). MPF는 다수 단백질의 세린 및 쓰레오닌 잔기를 인산화하는 사이클린 의존성 키나아제 1(Cyclin Dependent Kinase 1, Cdk1) 와 사이클린 B(Cyclin B)로 구성된 이합체이다. 난자 내의 MPF의 활성은 주로 사이클린 B의 유비퀴틴 의존성 단백질 분해효소 경로에 의한 분해에 의해서 조절된다.

이러한 과정에 관여하는 단백질로서 Emi2가 있는데, Emi2 단백질은 특이적으로 수정후에 제 1 감수분열에서 제 2 감수분열로의 전이에 관여하는 단백질이다. Emi2는 사이클린 B 등에 반응하여 유비퀴틴을 결합하는 단백질 복합체인 APC/C와 결합하여 이 활성을 저해한다. 난자가 정자에 의해서 수정된 이후에는 칼슘 농도가 증가되는 것이 알려져 왔는데, 증가된 칼슘 농도는 칼모듈린 의존성 인산화효소(Calmodulin dependent Kinase)를 활성화하고, 칼모듈린 의존성 인산화효소는 Emi2 의 176번 쓰레오닌 잔기를 인산화한다는 것이 확인되었다(Hansen et al, 2006). 인산화된 emi2는 폴로유사인산화효소-1 에 의해서 인식되고, 추가적으로 인산화되고, 인산화된 emi2 는 궁극적으로 유비퀴틴 의존성 단백질 분해경로에 의해서 분해되고 이는 APC/C 의 활성화와 사이클린 B의 분해를 유도한다고 알려져 있다(Shisako et al, 2006).

또한 폴로유사인산화효소-1은 Emi2 의 분해 이외에도 방추사의 형성에도 핵심적인 역할을 하는데, 선행연구에서 난구세포에서 폴로유사인산화효소-1을 폴로유사인산화효소-1에 특이적인 항체의 주입에 의해 저해하면 난구세포의 성숙과정이 저해되는 것이 보고되었다.

폴로유사인산화효소-1은 단백질의 N 말단에 위치하는 키나아제 도메인과 C 말단에 위치하는 폴로박스도메인으로 구성된 단백질로써, 키나아제 도메인은 목표단백질의 세린 혹은 쓰레오닌을 인산화하며 폴로박스도메인은 인산화된 쓰레오닌이 포함된 목표단백질을 인지하게 된다. 본 발명에서 제공되는 신규 펩타이드 유사체는 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 특징이 있으며, 난자의 성숙을 저해하는 기작을 통해 피임효과를 도출할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 신규 펩타이드 유사체가 결합할 수 있는 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인 부위는 서열번호 1에 기재된 폴로유사인산화효소-1 단백질의 아미노산 서열에서 414번째의 트립토판, 415번째 발린, 416번째 아스파르트산, 417번째 타이로신, 481번째 타이로신, 485번째 타이로신과의 상호작용을 통해서 결정되는 것일 수 있다. 상기 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 2로 기재된 염기서열로 암호화되어 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 상기 신규 펩타이드 유사체는 펩타이드와 화합물이 서로 결합된 결합체의 형태로 존재하며, 구체적인 화학구조식은 상기 기술한 바와 같다.

본 발명의 조성물에 함유된 유효성분인 상기 신규 펩타이드 유사체는 조성물 내에 1~500 μM 의 농도로 포함할 수 있는데, 이 범위를 벗어날 경우 목적하는 효과를 도출하지 못할 수 있다.

즉, 1 μM 미만으로 함유할 경우, 난자 성숙 저해 활성이 미비할 수 있고, 반면, 500 μM를 초과하여 함유할 경우, 500 μM 처리에 따른 효과 이상의 효과를 얻을 수 없는 바, 경제적이지 못한 문제점이 있다. 따라서 상기 기술된 범위 내로 함유하는 것이 바람직하다.

나아가 본 발명은 본 발명에서 제공하는 신규 펩타이드 유사체를 이용하여 포유류의 난자 성숙을 저해함으로써 피임을 유도하는 방법을 제공할 수 있으며, 또한, 새로운 피임제를 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 상기 스크리닝 방법은, 시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 청구항 제1항의 펩타이드 유사체를 주입하는 단계; 상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입하는 단계; 미성숙 난자의 세포 외 성숙(In vitro maturation)을 유도하는 단계; 및 세포 외 성숙 정도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법에서 피임 후보 물질이 피임제로 사용할 수 있음을 판별하는 과정은, 시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 본 발명에 따른 신규 펩타이드 유사체를 주입하고 상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입한 군과 피임 후보 물질을 주입하지 않은 군을 비교하여, 피임 후보 물질을 주입한 군에서 세포 외 성숙 정도가 감소한 경우, 상기 후보 물질을 새로운 피임제로 판정할 수 있으며, 더불어 이러한 피임제는 신규 펩타이드 유사체의 활성을 촉진 및 향상시킬 수 있는 물질로 볼 수 있다.

또한 상기 방법에서 난자의 성숙 정도를 측정하는 방법은 난자 성숙률을 측정함으로써 분석할 수 있는데, 여기서 성숙된 난자란 돼지의 미성숙란의 경우 세포외 성숙을 개시한 지 44시간 이후, 생쥐의 미성숙란의 경우 세포외 성숙을 개시한 지 12시간 이후에 제 1 극체 (First Polar Body)가 정상적으로 방출된 난자로 규정하며, 난자 성숙률과 성숙 저해률은 다음과 같은 계산식으로 정의된다.

난자 성숙률 (%)= [성숙된 난자수]/[미세주입후 6시간 후에 생존한 전체 난자수] x 100

성숙저해률 (%) = 100 - 난자 성숙률

본 발명에서 제공하는 신규 화합물들에 대한 합성 과정 및 이의 활성에 대해서는 하기 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

피임제 활성을 갖는 신규 화합물( 펩타이드 유사체)의 합성

본 발명자들은 본 발명의 펩타이드 유사체를 합성하기 위하여 0.61mmol/g 으로 로딩된 Rink 아마이드 레진을 사용하였으며, Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl) 고상 합성법(Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS)로 합성하였다. 합성 전의 레진은 N,N-디메틸포라마이드(N,N-dimethylforamide, DMF)에 45분간 부풀린 후 펩타이드 서열 연장을 위해 아미노산 및 아로마틱 유도체에 상응하는 Fmoc 아미노산 및 벤조 아미노산 유도체를 2ml의 DMF 용액에 녹인 후 1-O-벤조트리아졸-N,N,N'N'-테트라메틸우로니움헥사플루오로인산(1-O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluronium, HBTU)(5.0 eq), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt)(5.0 eq), N,N-다이이소프로필에틸렌아민(N,N-diisopropylethylamine, DIEA)(10.0 eq)를 활성화 시약으로 처리한 후 2분간 활성화시켰다.

이후 활성화 된 용액을 레진과 섞고 1시간 동안 결합반응을 수행하였다. DMF로 레진을 세정한 후 DMF에 녹인 20%의 피페리딘(piperidine)에 의해서 Fmoc 보호기를 제거하였다. 그 이후 레진을 다시 세척한 후 각각의 아미노산 서열에 따른 Fmoc 보호화 된 아미노산으로 반응을 수행하였다. 전체 아미노산 서열의 합성이 완료된 다음에 레진은 DMF, 메탄올, 디클로로메탄 및 에테르에 의해서 세정된 이후 진공에서 건조하였다. 합성이 완료된 펩타이드는 5% 트라이이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS) 및 5%의 물이 함유된 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 이용하여 레진에서 분리하였다. 레진에서 분리된 펩타이드 유사체는 냉각된 에테르를 이용하여 침전시킨 후 여과시켰다. 그 이후 펩타이드는 Vydac C₁₈ 컬럼을 이용하여 역상(reverse-phase, RP) HPLC로 정제하였다. 펩타이드의 순도는 역상 HPLC로 측정하였으며 최종적인 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry)로 측정하였으며 사용된 벤조아미노산 유도체에 따른 펩타이드 유도체의 명명은 도 1에 나타낸 바와 같다.

도 1에 있는 유사체들은 상기의 방법을 이용하여 합성되었다. 다만 마지막 잔기의 유사체들은 Fmoc-beta-Ala-OH 대신 다음에 기술된 화합물을 사용하였다. AB103의 경우 벤조산(Benzoic acid), AB113의 경우에는 6-히드록시-3-나프톨릭산 (6-hydroxy-2-naphthoic acid), AB112의 경우에는 나프탈렌-1,4-디카르복실산(naphthalene-1,4-dicarboxylic acid), AB116의 경우에는 펜타토익산(pentanoic acid), AB103-1의 경우에는 사이클로헥산카르복실산 (cyclohexanecarboxylic acid), AB103-2의 경우에는 4-프로필사이클로헥산카르복실산(4-propylcyclohexanecarboxylic acid), AB103-6의 경우에는 4-프로포옥실사이클로헥산카르복실산(4-propoxycyclohexanecarboxylic acid), AB103-10의 경우에는 4-(메틸설포닐)벤조익산 (4-(methylamino)benzoic acid), AB103-15의 경우에는 4-아미노부타노익산 (4-aminobutanoic acid), AB103-8의 경우에는 4-(메틸아미노) 벤조익산 (4-(methylamino)benzoic acid), AB10699의 경우에는 4-브로모-2-클로로벤조익산(4-bromo-2-chlorobenzoic acid), AB10700의 경우에는 2-브로모-4-플루오로벤조익산(2-bromo-4-fluorobenzoic acid), AB10701의 경우에는 4-브로모벤조익산(4-bromo-benzoic acid), AB10702의 경우에는 3-브로모-4-메톡시벤조익산 (3-bromo-4-methoxybenzoic acid), AB10703의 경우에는 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조익산 (3,5-bis(trifluoromethyl)benzoic acid), AB10704의 경우에는 4-메톡시벤조익산 (4-methoxybenzoic acid), AB10705의 경우에는 4-브로모-3,5-디메톡시벤조익산(4-bromo-3,5-dimethoxybenzoic acid), AB10706의 경우에는 3-브로모-5-니트로벤조익산(3-bromo-5-nitrobenzoic acid), AB10707의 경우에는 4-클로로-3,5-다이니트로벤조익산(4-chloro-3,5-dinitrobenzoic acid), AB10708은 [1,1'-비스페닐]-4-카르복실산([1,1'-biphenyl]-4-carboxylic acid)이다.

< 실시예 2>

펩타이드 유사체의 난자 성숙 저해활성의 측정

본 발명자들은 합성된 펩타이드 유사체의 난자 성숙 저해능을 검증하기 위하여 돼지 및 생쥐 미성숙란에 미세주입법을 이용하여 펩타이드 유사체를 주입한 후, 해당 화합물의 주입이 미성숙란의 세포 외 성숙(In vitro maturation)의 효율에 미치는 영향을 측정하였다.(도 3)

<2-1> 돼지 미성숙란을 이용한 측정

먼저 도살장에서 구입한 돼지 난소는 생리 식염수 하에서 37℃를 유지하여 운반하였다. 그 후 난자-난구세포 복합체(Cumulus oocyte complex)를 18게이지 주사기를 이용하여 난소로부터 흡입하여 채취하였다. 그리고 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 300 μM 농도의 펩타이드를 미세주입기(Femtojet, 에펜도르프사)를 이용하여 5~10 pl을 주입한다. 대조군으로는 인산화가 되지 않은 펩타이드를 이용하였으며, 주입된 돼지 난자-난구세포 복합체는 0.1% 폴리비닐알콜, 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 피루브산나트륨, 0.57 mM 시스테인, 10 ng/ml 상피세포 성장인자(Epidermal growth Factor), 10IU/ml PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotropin), 10 IU/ml hCG(Human Chronic Gonadotropin), 75 mg/ml 페니실린 G, 50 mg/ml 황산스트렙토마이신이 함유된 TCC-199 배지에서 38.5℃, 5% 이산화탄소를 유지한 채 배양하였다. 그 이후 전체 미세주입된 난자에 대해 제1극체가 방출되어 성숙이 완료된 난자의 비율로써 펩타이드의 난자성숙 저해율을 계산하였다.

대조군 화합물로써 인산화쓰레오닌이 아닌 쓰레오닌을 포함하고 있는 대조군 화합물인 Bg34를 미세주입한 결과 총 135개의 난자에서 109개의 난자는 정상적으로 성숙된 반면 26개의 난자는 성숙하지 못함으로써 19% (26/135)의 저해율을 보였다.

반면, AB103, AB103-1, AB103-2, AB103-8, AB103-10, AB103-15, AB112, AB113, AB116, AB10699, AB10700, AB10701, AB10702, AB10703, AB10704, AB10705, AB10706, AB10707 및 AB10708 화합물의 경우 각각 52% (19/10), 31%(14/44), 33%(7/21), 70% (14/20), 47% (51/108), 35% (7/20), 23% (4/17), 16% (7/42), 13% (6/43), 32%(12/37), 66% (22/33), 37% (12/32), 52% (27/51), 55% (11/20), 32% (8/25), 20% (5/24), 38% (14/37), 52% (17/33), 54% (14/26), 54%(21/39) 의 저해율을 보였다.(도 4)

<2-2> 생쥐 미성숙란을 이용한 측정

먼저 6~8 주령의 ICR(Imprinting Control Region) 생쥐에 5 단위의 PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotropin)를 주사하여 과배란을 유도한 후 난소에서 난자를 채취하였다. 상기 <2-1>의 돼지 미성숙란과 동일하게 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 300 μM 농도의 펩타이드를 미세주입기(Femtojet, 에펜도르프사)를 이용하여 5~10 pl 주입한 후 M16 배지(시그마사)에서 37℃로 16시간 동안 배양한 후 제1극체의 방출여부에 따라서 펩타이드의 난자성숙 저해율을 계산하였다.

분석 결과, 대조군의 경우 20%의 난자(11/51)에서 극체 방출이 억제되는 반면, 60%(61/99)의 난자에서 극체 방출이 억제되는 것을 관찰하였다 (도 5). 상기 난자의 핵 및 방추사를 면역형광염색법으로 염색하여 주사공초점현미경으로 관찰한 결과 AB103-8 화합물이 미세주입된 난자에서는 핵붕괴(Germinal Vesicle Breakdown)가 일어나지 않은 채 성숙이 저해되는 것을 확인하였다 (도 6).

< 실시예 3>

단위발생( pathernogenetic activation )에 의한 펩타이드 유사체의 난자 수정 저해활성의 측정

난자 수정 저해활성을 측정하기 위하여 염화스트론튬(SrCl₂)에 의한 단위발생 유도를 수행하였다. 생쥐(B6D2F1)에서 5 단위의 PMSG와 5 단위의 hCG를 주사하여 과배란 유도 후 48시간 후에 수란관에서 성숙난자를 채취하였다. 그 이후 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 300 μM 농도의 펩타이드를 미세주입기(Femtojet, 에펜도르프사)를 이용하여 5~10 pl 주입한 후 CZM 배지에 2시간 배양하였다. 그 이후 2 mM의 EGTA(Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)와 5 mM 의 염화스트론튬(SrCl₂)을 첨가하여 단위발생을 유도한 후 1시간 간격으로 역상현미경으로 관찰하여 제2극체 방출을 관찰하였다.

분석 결과, 도 6에 나타낸 것과 같이 대조군인 DMSO 주입군은 비주입군과 차이가 없는 반면, AB103-8 화합물 주입군은 제2극체 방출이 지연되는 것이 관찰되었다. 상기 난자의 핵 및 방추사를 면역형광염색법으로 염색하여 주사공초점현미경으로 관찰한 결과 AB103-8 화합물이 미세주입된 난자에서는 핵막붕괴(Germinal Vesicle Breakdown)가 일어나지 않은 채 성숙이 저해되는 것을 확인하였다 (도 8).

상기 실시예에서 분석한 바와 같이 본 발명자들이 합성한 신규 펩타이드 유사체를 이용하여 난자의 성숙을 저해할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서 신규 펩타이드 유사체를 피임용 조성물로 활용할 수 있음이 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Peptide analog binding to polo-box domain of polo-like kinase-1 and pharmaceutical composition for contraception containing thereof <130> PN1409-271 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 603 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Asn Ala Ala Ala Lys Ala Gly Lys Leu Ala Arg Ala Pro Ala Asp 1 5 10 15 Leu Gly Lys Gly Gly Val Pro Gly Asp Ala Val Pro Gly Ala Pro Val 20 25 30 Ala Ala Pro Leu Ala Lys Glu Ile Pro Glu Val Leu Val Asp Pro Arg 35 40 45 Ser Arg Arg Gln Tyr Val Arg Gly Arg Phe Leu Gly Lys Gly Gly Phe 50 55 60 Ala Lys Cys Phe Glu Ile Ser Asp Ala Asp Thr Lys Glu Val Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Ile Val Pro Lys Ser Leu Leu Leu Lys Pro His Gln Lys Glu 85 90 95 Lys Met Ser Met Glu Ile Ser Ile His Arg Ser Leu Ala His Gln His 100 105 110 Val Val Gly Phe His Asp Phe Phe Glu Asp Ser Asp Phe Val Phe Val 115 120 125 Val Leu Glu Leu Cys Arg Arg Arg Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Arg 130 135 140 Arg Lys Ala Leu Thr Glu Pro Glu Ala Arg Tyr Tyr Leu Arg Gln Ile 145 150 155 160 Val Leu Gly Cys Gln Tyr Leu His Arg Asn Gln Val Ile His Arg Asp 165 170 175 Leu Lys Leu Gly Asn Leu Phe Leu Asn Glu Asp Leu Glu Val Lys Ile 180 185 190 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Val Glu Tyr Glu Gly Glu Arg Lys 195 200 205 Lys Thr Leu Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser 210 215 220 Lys Lys Gly His Ser Phe Glu Val Asp Val Trp Ser Ile Gly Cys Ile 225 230 235 240 Met Tyr Thr Leu Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Thr Ser Cys Leu 245 250 255 Lys Glu Thr Tyr Leu Arg Ile Lys Lys Asn Glu Tyr Ser Ile Pro Lys 260 265 270 His Ile Asn Pro Val Ala Ala Ser Leu Ile Gln Lys Met Leu Gln Thr 275 280 285 Asp Pro Thr Ala Arg Pro Thr Ile His Glu Leu Leu Asn Asp Glu Phe 290 295 300 Phe Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Ala Arg Leu Pro Ile Thr Cys Leu Thr 305 310 315 320 Ile Pro Pro Arg Phe Ser Ile Ala Pro Ser Ser Leu Asp Pro Ser Ser 325 330 335 Arg Lys Pro Leu Lys Val Leu Asn Lys Gly Val Glu Asn Pro Leu Pro 340 345 350 Asp Arg Pro Arg Glu Lys Glu Glu Pro Val Val Arg Glu Thr Asn Glu 355 360 365 Ala Ile Glu Cys His Leu Ser Asp Leu Leu Gln Gln Leu Thr Ser Val 370 375 380 Asn Ala Ser Lys Pro Ser Glu Arg Gly Leu Val Arg Gln Glu Glu Ala 385 390 395 400 Glu Asp Pro Ala Cys Ile Pro Ile Phe Trp Val Ser Lys Trp Val Asp 405 410 415 Tyr Ser Asp Lys Tyr Gly Leu Gly Tyr Gln Leu Cys Asp Asn Ser Val 420 425 430 Gly Val Leu Phe Asn Asp Ser Thr Arg Leu Ile Leu Tyr Asn Asp Gly 435 440 445 Asp Ser Leu Gln Tyr Ile Glu Arg Asp Gly Thr Glu Ser Tyr Leu Thr 450 455 460 Val Ser Ser His Pro Asn Ser Leu Met Lys Lys Ile Thr Leu Leu Asn 465 470 475 480 Tyr Phe Arg Asn Tyr Met Ser Glu His Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asn 485 490 495 Ile Thr Pro Arg Glu Gly Asp Glu Leu Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Arg 500 505 510 Thr Trp Phe Arg Thr Arg Ser Ala Ile Ile Leu His Leu Ser Asn Gly 515 520 525 Thr Val Gln Ile Asn Phe Phe Gln Asp His Thr Lys Leu Ile Leu Cys 530 535 540 Pro Leu Met Ala Ala Val Thr Tyr Ile Asn Glu Lys Arg Asp Phe Gln 545 550 555 560 Thr Tyr Arg Leu Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Cys Cys Lys Glu Leu 565 570 575 Ala Ser Arg Leu Arg Tyr Ala Arg Thr Met Val Asp Lys Leu Leu Ser 580 585 590 Ser Arg Ser Ala Ser Asn Arg Leu Lys Ala Ser 595 600 <210> 2 <211> 1812 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagtgctg cagtgactgc agggaagctg gcacgggcac cggccgaccc tgggaaagcc 60 ggggtccccg gagttgcagc tcccggagct ccggcggcgg ctccaccggc gaaagagatc 120 ccggaggtcc tagtggaccc acgcagccgg cggcgctatg tgcggggccg ctttttgggc 180 aagggcggct ttgccaagtg cttcgagatc tcggacgcgg acaccaagga ggtgttcgcg 240 ggcaagattg tgcctaagtc tctgctgctc aagccgcacc agagggagaa gatgtccatg 300 gaaatatcca ttcaccgcag cctcgcccac cagcacgtcg taggattcca cggctttttc 360 gaggacaacg acttcgtgtt cgtggtgttg gagctctgcc gccggaggtc tctcctggag 420 ctgcacaaga ggaggaaagc cctgactgag cctgaggccc gatactacct acggcaaatt 480 gtgcttggct gccagtacct gcaccgaaac cgagttattc atcgagacct caagctgggc 540 aaccttttcc tgaatgaaga tctggaggtg aaaatagggg attttggact ggcaaccaaa 600 gtcgaatatg acggggagag gaagaagacc ctgtgtggga ctcctaatta catagctccc 660 gaggtgctga gcaagaaagg gcacagtttc gaggtggatg tgtggtccat tgggtgtatc 720 atgtatacct tgttagtggg caaaccacct tttgagactt cttgcctaaa agagacctac 780 ctccggatca agaagaatga atacagtatt cccaagcaca tcaaccccgt ggccgcctcc 840 ctcatccaga agatgcttca gacagatccc actgcccgcc caaccattaa cgagctgctt 900 aatgacgagt tctttacttc tggctatatc cctgcccgtc tccccatcac ctgcctgacc 960 attccaccaa ggttttcgat tgctcccagc agcctggacc ccagcaaccg gaagcccctc 1020 acagtcctca ataaaggctt ggagaacccc ctgcctgagc gtccccggga aaaagaagaa 1080 ccagtggttc gagagacagg tgaggtggtc gactgccacc tcagtgacat gctgcagcag 1140 ctgcacagtg tcaatgcctc caagccctcg gagcgtgggc tggtcaggca agaggaggct 1200 gaggatcctg cctgcatccc catcttctgg gtcagcaagt gggtggacta ttcggacaag 1260 tacggccttg ggtatcagct ctgtgataac agcgtggggg tgctcttcaa tgactcaaca 1320 cgcctcatcc tctacaatga tggtgacagc ctgcagtaca tagagcgtga cggcactgag 1380 tcctacctca ccgtgagttc ccatcccaac tccttgatga agaagatcac cctccttaaa 1440 tatttccgca attacatgag cgagcacttg ctgaaggcag gtgccaacat cacgccgcgc 1500 gaaggtgatg agctcgcccg gctgccctac ctacggacct ggttccgcac ccgcagcgcc 1560 atcatcctgc acctcagcaa cggcagcgtg cagatcaact tcttccagga tcacaccaag 1620 ctcatcttgt gcccactgat ggcagccgtg acctacatcg acgagaagcg ggacttccgc 1680 acataccgcc tgagtctcct ggaggagtac ggctgctgca aggagctggc cagccggctc 1740 cgctacgccc gcactatggt ggacaagctg ctgagctcac gctcggccag caaccgtctc 1800 aaggcctcct aa 1812

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은

으로부터 선택되는 어느 하나이다.
제1항의 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 피임용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염은 폴로 유사인산화효소-1(PLK1)의 폴로박스 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
제3항에 있어서.
상기 결합은 폴로 유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인의 인산화펩타이드 결합자리에 결합하는 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 폴로 유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 인산화펩타이드 결합자리는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴로유사인산화효소-1의 폴로박스 도메인의 아미노산 서열에서 414번째 트립토판, 415번째 발린, 416번째 아스파르트산, 417번째 타이로신, 481번째 타이로신 및 485번째 타이로신인 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 신규 펩타이드 유사체, 또는 이의 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 염은 상기 조성물 내에 1~500 μM 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 피임용 조성물은 난자 성숙을 저해하는 것을 특징으로 하는 피임용 조성물.
시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 청구항 제1항의 펩타이드 유사체를 주입하는 단계;
상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입하는 단계;
미성숙 난자의 세포 외 성숙(In vitro maturation)을 유도하는 단계; 및
세포 외 성숙 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 폴로 유사인산화효소-1(PLK1)의 폴로박스도메인에 특이적으로 결합하는 피임제 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
시험관 내에서 포유류의 미성숙 난자에 청구항 제1항의 펩타이드 유사체를 주입하고, 상기 미성숙 난자에 피임 후보 물질을 주입한 군과 피임 후보 물질을 주입하지 않은 군을 비교하여, 피임 후보 물질을 주입한 군이 세포 외 성숙 정도가 더 감소한 경우, 상기 후보 물질을 신규한 피임제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.