CN101857845A - 可利用非甲醇碳源诱导aox1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了几种可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，毕赤酵母菌株中PpHXT1基因发生突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性，进一步地，还有自噬基因PpATG30也发生突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性；或者毕赤酵母菌株中PpMIG1基因发生突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性，进一步地，毕赤酵母菌株中PpMIG2基因发生突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性，本发明的毕赤酵母菌株不仅具有现有毕赤酵母菌株的优势，而且可以采用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白，安全环保，操作简单，成本降低，还可用于食品或者添加剂的生产，适于大规模推广应用。

Description

可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株

技术领域

本发明涉及生物工程和生物制药技术领域，更具体地，涉及表达菌株技术领域，特别是指可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株。

背景技术

到2006年为止，已经有500多种外源蛋白在毕赤酵母中表达，这些蛋白来源于整个生物界，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和脊椎动物。毕赤酵母表达外源蛋白时所用启动子为AOX1(Alcohol oxidase 1，醇氧化酶基因)的启动子，该启动子调控规律为：甲醇可以诱导AOX1启动子的表达，其它碳源(如葡萄糖，果糖，甘油等)抑制AOX1启动子的表达。

之所以利用毕赤酵母表达系统表达如此之多的外源蛋白，是因为其具有其它表达系统不可比拟的优势，如毕赤酵母基因操作简单；外源蛋白表达量高，既可以胞内表达，也可以分泌表达；外源蛋白基因遗传稳定；作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能；含有特有的强有力的AOX1启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

但是目前的毕赤酵母表达系统在发酵放大过程中面临诸多的问题：

1、诱导外源重组蛋白表达时需使用甲醇作为碳源，甲醇有毒并且易燃，在工业化生产中车间需进行防暴设计，导致成本增大；

2、甲醇发酵强耗氧，一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求而需要通纯氧，消耗的甲醇越多需要的纯氧越多，这给实际的工业化生产带来很大的麻烦，另外消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；

3、甲醇作为一种石油化学产品，不适于用于食品或者添加剂的生产；

4、甲醇代谢会产生H₂O₂，会导致所表达蛋白的水解；

5、AOX1的高效转录离不开甲醇，在其它碳源中遭受碳源阻遏作用。

因此，如果能够通过基因工程的方法得到一株或一些突变菌株，使AOX1启动子的高效转录不依赖于甲醇，而可用其它碳源来诱导AOX1启动子的表达，这对于开发毕赤酵母非甲醇诱导表达系统具有积极意义。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，这些毕赤酵母菌株不仅具有现有毕赤酵母菌株的优势，而且可以采用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白，安全环保，操作简单，成本降低，还可用于食品或者添加剂的生产，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特点是，所述毕赤酵母菌株中PpHXT1基因发生第一突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

较佳地，所述第一突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。也就是说将PpHXT1基因突变的方法很多，可以是点突变，可以是插入突变，还可以是缺失突变，只要突变后的PpHXT1基因不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性即可。

较佳地，所述PpHXT1基因的序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

较佳地，所述PpHXT1基因编码的蛋白为SEQ ID NO：2所示的序列。

较佳地，所述PpHXT1基因的GenBank登录号为GU479989，编码一个己糖运载体蛋白，是酿酒酵母HXT基因的类似物。

较佳地，所述毕赤酵母菌株中自噬基因PpATG30发生第二突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

更佳地，所述第二突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。也就是说将PpATG30基因突变的方法很多，可以是点突变，可以是插入突变，还可以是缺失突变，只要突变后的PpATG30基因不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性即可。

在本发明的第二方面，还提供了一种可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特点是，所述毕赤酵母菌株中PpMIG1基因发生第三突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

较佳地，所述第三突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。也就是说将PpMIG1基因突变的方法很多，可以是点突变，可以是插入突变，还可以是缺失突变，只要突变后的PpMIG1基因不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性即可。

较佳地，所述PpMIG1基因的序列为SEQ ID NO：3所示的序列。

较佳地，所述PpMIG1基因编码的蛋白为SEQ ID NO：4所示的序列。

较佳地，所述PpMIG1基因是酿酒酵母MIG1基因的类似物。

较佳地，所述毕赤酵母菌株中PpMIG2基因发生第四突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

更佳地，所述第四突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。也就是说将PpMIG2基因突变的方法很多，可以是点突变，可以是插入突变，还可以是缺失突变，只要突变后的PpMIG2基因不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性即可。

更佳地，所述PpMIG2基因的序列为SEQ ID NO：5所示的序列。

更佳地，所述PpMIG2基因编码的蛋白为SEQ ID NO：6所示的序列。

更佳地，所述PpMIG2基因也是酿酒酵母MIG1基因的类似物。

采用本发明的方法，利用分子生物学的手段，对毕赤酵母野生菌株进行了基因工程改造，得到碳源抑制相关基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)从而无法编码正确的碳源抑制相关蛋白的菌株，这些菌株能利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子的表达。这样可以避免采用甲醇诱导时产生的有毒、易燃易爆、高耗氧、高产热等问题，在毕赤酵母表达重组蛋白、基因制药等方面具有重要价值。

附图说明

图1是本发明的第一具体实施例的一PpHXT1基因缺失片段的构建示意图。

图2是本发明的第一具体实施例构建的Δhxt1菌株和野生型菌株WT分别采用不同碳源诱导的AOX1显色结果。其中1采用0.5％甲醇；2采用1％葡萄糖；3采用1％葡萄糖+0.5％甲醇；4采用1％果糖；5采用1％果糖+0.5％甲醇为碳源；A为Δhxt1菌株培养样品，B为野生型菌株WT培养样品。

图3是本发明的第一具体实施例构建的Δhxt1菌株和野生型菌株WT分别采用不同碳源诱导的AOX1酶活的测定结果。其中1采用0.5％甲醇；2采用1％葡萄糖；3采用1％葡萄糖+0.5％甲醇；4采用1％果糖；5采用1％果糖+0.5％甲醇为碳源。

图4是本发明的第一具体实施例构建的Δhxt1菌株和野生型菌株WT分别采用不同碳源诱导的AOX1蛋白的Western blotting检测结果。其中M是蛋白marker，1-5为Δhxt1菌株培养样品，6-10为野生型菌株WT培养样品；1和6分别采用0.5％甲醇；2和7分别采用1％葡萄糖；3和8分别采用1％葡萄糖+0.5％甲醇；4和9分别采用1％果糖；5和10分别采用1％果糖+0.5％甲醇为碳源。

图5是本发明的第一具体实施例的另一PpHXT1基因缺失片段的构建示意图。

图6是本发明的第一具体实施例采用的pPIC3.5k载体的图谱。

图7是本发明的第一具体实施例构建的Δhxt1-GFP菌株、Δhxt1-GFP-SKL菌株和Δatg30Δhxt1-GFP-SKL菌株分别采用不同碳源诱导的AOX1蛋白的Western blotting检测结果。其中A采用0.5％甲醇；B采用1％果糖；C采用1％果糖+0.5％甲醇；D采用1％葡萄糖；E采用1％葡萄糖+0.5％甲醇为碳源。

图8是本发明的第二具体实施例的PpMIG1基因缺失片段的构建示意图。

图9是本发明的第二具体实施例的PpMIG2基因缺失片段的构建示意图。

图10是本发明的第二具体实施例构建的Δmig1、Δmig2和Δmig1Δmig2和野生型菌株WT分别采用不同碳源诱导的AOX1显色结果。其中A采用1％甘油；B采用1％甘油+0.5％甲醇；C采用0.5％甲醇为碳源；1为野生型菌株WT；2为Δmig1；3为Δmig2；4为Δmig1Δmig2。

图11是本发明的第二具体实施例构建的Δmig1、Δmig2和Δmig1Δmig2和野生型菌株WT分别采用不同碳源诱导的AOX1蛋白的Western blotting检测结果。其中A采用1％甘油；B采用1％甘油+0.5％甲醇；C采用0.5％甲醇为碳源；1为野生型菌株WT；2为Δmig1；3为Δmig2；4为Δmig1Δmig2。

具体实施方式

下列实施例中的材料与方法为：

所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

毕赤酵母总蛋白提取技术参照冷泉港公司提供的酵母蛋白提取手册。

SDS-PAGE，Western blotting技术参照Millipore公司提供的蛋白质印迹手册。

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：

质粒pUC18、质粒pPIC3.5k、大肠杆菌Top10、毕赤酵母菌株GS115购自Invitrogen公司，毕赤酵母菌株PPY12 Δatg30由美国加州大学圣地亚哥分校教授SureshSubramani友好提供。

实施例1葡萄糖或果糖可诱导AOX1启动子表达的毕赤酵母菌株

1.1PpHXT1体外缺失片断的构建

PpHXT1基因长1614bp(SEQ ID NO：1)，编码537个氨基酸(SEQ ID NO：2)。采用PCR，酶切连接的方法，以pUC18为载体在体外构建了一段PpHXT1基因缺失片段(如图1所示)，分别由PpHXT1基因上游200bp、G418抗性基因1517bp和PpHXT1基因下游200bp组成。所得PpHXT1基因缺失片段缺失了该基因的整个开放阅读框。

1.2电转毕赤酵母和Δhxt1缺失株的筛选

将PpHXT1缺失片段电转毕赤酵母菌株GS115，涂于4块加G418的YPD平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+G418液体培养基中，30℃摇床培养后，提取基因组用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确(即含有PpHXT1缺失片段)的毕赤酵母菌株命名为Δhxt1。

1.3AOX1显色反应

将各菌株(Δhxt1菌株和野生型菌株WT)分别在0.5％甲醇、1％葡萄糖、1％葡萄糖+0.5％甲醇、1％果糖和1％果糖+0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养，生长到对数生长期后取样1ml，在离心后的菌体中加入AOX1酶活显色液显色(参见“StasykO.V.，T.Y.Nazarko，and A.A.Sibirny.2008.Methods of Plate Pexophagy Monitoringand Positive Selection for ATG Gene Cloning in Yeasts.Methods in enzymology.451：229-239”。显色底物为o-dianisidine。)。

从图2可以看到在含有葡萄糖或者果糖的培养基中生长后，只有菌株Δhxt1中有AOX1酶活，野生菌株中没有酶活。

1.4AOX1酶活的测定

将各菌株(Δhxt1菌株和野生型菌株WT)在MGY液体培养基中过夜预培养，然后分别转移到含有0.5％甲醇、1％葡萄糖、1％葡萄糖+0.5％甲醇、1％果糖和1％果糖+0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中，培养10小时后取样提取总蛋白，经Bradford法蛋白定量后进行AOX1酶活的测定(方法参见“Verduyn，C.，J.P.van Dijken，and W.A.Scheffers.1984.Colorometric alcohol assays with alcohol oxidase.J.Microbiol.Methods 2：15-25.”。显色底物为2，2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonate)，ABTS。)。

由图3可知，菌株Δhxt1在含有葡萄糖或者果糖的培养基中均可以诱导AOX1的表达，野生菌株不能诱导AOX1的表达。

1.5 AOX1蛋白的Western blotting检测

将各菌株(Δhxt1菌株和野生型菌株WT)在MGY液体培养基中过夜预培养，然后分别转移到含有0.5％甲醇、1％葡萄糖、1％葡萄糖+0.5％甲醇、1％果糖和1％果糖+0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中，培养10小时后取样提取总蛋白，经Bradford法蛋白定量后进行SDS-PAGE，1号和6号电泳孔中点样15μg，其余每个电泳孔中点样20μg，电泳后进行AOX1蛋白的Western blotting检测。

由图4可知，葡萄糖和果糖均可以诱导菌株Δhxt1表达AOX1蛋白，但是野生株WT中AOX1蛋白的表达只能依靠甲醇为唯一碳源。

1.6菌株Δatg30Δhxt1的构建

采用PCR，酶切连接的方法，以pUC18为载体在体外构建了另外一段PpHXT1基因缺失片段(如图5所示)，分别由PpHXT1基因上游200bp、Zeocin抗性基因1321bp和PpHXT1基因下游200bp组成。所得PpHXT1基因缺失片段同样缺失了该基因的整个开放阅读框。

将该PpHXT1缺失片段电转毕赤酵母菌株PPY12Δatg30，涂于4块加Zeocin的YPD平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+Zeocin液体培养基中，30℃摇床培养后，提基因组用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确(即含有PpHXT1缺失片段)的毕赤酵母菌株命名为Δatg30Δhxt1。

1.7 AOX1为启动子在非甲醇碳源中诱导表达绿色荧光蛋白GFP

1.7.1 GFP表达载体的构建

在载体pPIC3.5k(如图6所示)的AOX1启动子下游分别插入GFP和GFP-SKL的编码序列(SKL是信号肽，可将表达的蛋白定位于过氧化物酶体中)，分别得到GFP表达载体pP-GFP和pGS。

1.7.2毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选

分别将表达载体pP-GFP和pGS电转Δhxt1菌株，涂于不含组氨酸的YND(0.67％YNB+1％葡萄糖+2％琼脂粉)平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-time PCR验证GFP拷贝数(方法参见Xuan，Y.J.，X.S.Zhou，W.W.Zhang，X.Zhang，Z.W.Song，andY.X.Zhang.2009.An upstream activation sequence controls the expression of AOX1gene in Pichia pastoris.FEMS Yeast Res.9：1271-1282)。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母GFP表达菌株分别命名为Δhxt1-GFP和Δhxt1-GFP-SKL。同理构建了表达菌株Δatg30Δhxt1-GFP-SKL。

1.7.3流式细胞仪检测GFP表达量

将各GFP表达菌株(Δhxt1-GFP、Δhxt1-GFP-SKL和Δatg30Δhxt1-GFP-SKL)在MGY液体培养基中过夜预培养，然后分别转移到含有0.5％甲醇、1％果糖、1％果糖+0.5％甲醇、1％葡萄糖和1％葡萄糖+0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中，分时间段取样，用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。

由图7可知，在菌株Δhxt1中，葡萄糖和果糖均可以诱导GFP的表达，但定位于过氧化物酶体的GFP(GFP-SKL)和定位于细胞质的GFP的表达量明显不同，GFP-SKL的表达量在生长后期有明显的下降趋势，怀疑是由于过氧化物酶体自噬所致(参见Farré，J.C.，R.Manjithaya，R.D.Mathewson，and S.Subramani.2008.PpAtg30 TagsPeroxisomes for Turnover by Selective Autophagy.Developmental Cell 14：365-376)。

为了验证GFP-SKL蛋白表达量在生长后期急速下降的现象为过氧化物酶体自噬所致，我们在一株过氧化物酶体自噬阻断菌株PPY12 Δatg30中进一步缺失PpHXT1基因，并且表达了单拷贝的GFP-SKL，发现下降趋势明显缓和(如图7所示)。

实施例2甘油可诱导AOX1启动子表达的毕赤酵母菌株

2.1 PpMIG1、PpMIG2体外缺失片断的构建

毕赤酵母的PpMIG基因编码的是一种转录阻遏因子，PpMIG1基因长1335bp(SEQID NO：3)，编码444个氨基酸(SEQ ID NO：4)；PpMIG2长1365bp(SEQ ID NO：5)，编码454个氨基酸(SEQ ID NO：6)。

采用PCR，酶切连接的方法，以pUC18为载体在体外构建了一段PpMIG1基因缺失片段(如图8所示)，分别由PpMIG1基因上游728bp、Zeocin抗性基因1321bp和PpMIG1基因3’端及其下游1011bp组成。所得PpMIG1基因缺失片段共缺失了该基因的前315个氨基酸。

采用同样的方法构建了PpMIG2基因缺失片段(如图9所示)，不同的是Zeocin抗性基因换成了G418抗性基因KAN，该片段缺失了PpMIG2的整个开放阅读框。

2.2电转毕赤酵母和Δmig1、Δmig2缺失株的筛选

将PpMIG1缺失片段电转毕赤酵母菌株GS115，涂于4块加Zeocin的YPD平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+Zeocin液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确(即含有PpMIG1缺失片段)的毕赤酵母菌株命名为Δmig1。

将PpMIG2缺失片段电转毕赤酵母菌株GS115，涂于4块加G418的YPD平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+G418液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确(即含有PpMIG2缺失片段)的毕赤酵母菌株命名为Δmig2。

2.3利用经典遗传学中杂交的方法构建Δmig1Δmig2双缺失菌株

参见James M.Cregg等编著的《Pichia Protocols》。

2.4.AOX1显色反应

将各菌株(野生型菌株WT、Δmig1菌株；Δmig2菌株和Δmig1Δmig2菌株)分别在1％甘油、1％甘油+0.5％甲醇和0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养，生长到对数生长期后取样1ml，在离心后的菌体中加入AOX1酶活显色液显色。

从图10可以看到在甘油和甘油+甲醇的培养基中，只有菌株Δmig1和Δmig1Δmig2中有酶活。

2.5.AOX1酶活的测定

将各菌株(野生型菌株WT、Δmig1菌株；Δmig2菌株和Δmig1Δmig2菌株)分别在1％甘油、1％甘油+0.5％甲醇和0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养，生长到对数生长期后取样提取总蛋白，经Bradford法蛋白定量后进行AOX1酶活的测定。

由表1可知，菌株Δmig1和Δmig1Δmig2在含有甘油或者甘油+甲醇的培养基中均可以诱导AOX1的表达。

表1

2.6.AOX1蛋白的Western blotting检测

将各菌株分别在1％甘油，1％甘油+0.5％甲醇和0.5％甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养，生长到对数生长期后取样提取总蛋白，经Bradford法蛋白定量后进行SDS-PAGE，每个电泳孔中点总蛋白20μg，电泳后进行AOX1蛋白的Western blotting检测。

由图11可知，甘油可以不同程度的诱导菌株Δmig1和Δmig1Δmig2中AOX1蛋白的表达。

上述试验结果表明，通过在毕赤酵母野生菌株GS115中敲除了一个编码几糖运载体的基因PpHXT1，构建了基因缺失菌株Δhxt1；在毕赤酵母过氧化物酶体自噬阻断菌株PPY12Δatg30缺失了PpHXT1，构建了双缺失菌株Δatg30Δhxt1；经AOX1酶活和Western blotting的检测发现，葡萄糖或者果糖均可以诱导Δhxt1和Δatg30Δhxt1菌株AOX1启动子的表达，并且用流式细胞仪检测了绿色荧光蛋白GFP以AOX1为启动子时在非甲醇碳源中的诱导表达量；在毕赤酵母野生菌株GS115中分别缺失了碳源抑制相关基因PpMIG1和PpMIG2，构建了基因缺失菌株Δmig1和Δmig2，以及双缺失菌株Δmig1Δmig2；经AOX1酶活和Western blotting的检测发现，甘油可以诱导Δmig1和Δmig1Δmig2菌株AOX1启动子的表达。

综上所述，本发明的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株不仅具有现有毕赤酵母菌株的优势，而且可以采用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白，安全环保，操作简单，成本降低，还可用于食品或者添加剂的生产，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>华东理工大学

 

<120>可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株

 

<160>6

 

<210>1

<211>1614

<212>DNA

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1614)

<223>毕赤酵母菌株中的PpHXT1基因

 

<400>1

atgagttcaa cagatatcca aggtgatcaa ggtgacaatg aaaagatata cgccattgag      60

agcagtccct ccaatgagca aataaaagat attcatgagg ctccggccga caacaaaagt     120

gaactagaca tcccagtcaa acccaagggt tcctatatct tggtgtctgt gttatgtctt     180

ctagtcgcat tcggtggttt cgtgttcggt tgggataccg gtaccatctc aggtttcgtt     240

aacatgtctg actttacgag acgtttcgga cagtttaacg gtgaaacgta ttacctttct     300

aaagtgagag ttggtttaat tgtttctatt ttcaacattg gttgtgctat cggaggtgtc     360

actctaggta aacttggtga catttggggt agaaagaagg ctttgatgtt cgtcatggtc     420

atctatatgg tcggtatttt gattcaaatt gcttccattg acaaatggta ccagtatttc     480

attggaagaa ttattgcagg tctggccgtc ggtgcagttt ccgttttatc ccccatgttc     540

atcagtgaga cttctcctaa acacatcaga ggttccttag tctcctgcta ccaattaatg     600

attacagccg gtattttctt gggttactgt accacttacg gaaccaagac ttacaccgac     660

tccacccaat ggagagttcc tttgggattg tgtttcgctt gggccattct gatgattgtt     720

ggtatgacct tcatgccaga gtccccacgt ttcttggttg aggttaacag agtcgacgag     780

gctatgaagt ccattgccag agttaacaag gtctctatcg acgatccatc tgtctacaat     840

gagatgagac ttatttctga cggtattgag aaggagaagg aggctggtag cgtttcttgg     900

ggtgaactgt tcactggtaa gccaaagatt ttctaccgtc tattgattgg tattttcatg     960

caatctttgc aacaattgac cggtaacaac tatttcttct actacggaac taccattttc    1020

aaggctgtcg gattggacga ttctttccaa acttctatca ttcttggtgt tgtcaatttt    1080

gcttccacat tcctaggtat ctacaccatg gataaatttg gtagaagaag aacactttta    1140

ggaggttctg gagccatggt tgtttgtttg gtcattttca gttccgttgg tgtcaagtct    1200

ctttatgaga acggtaagga tgatccatcc aaaccagcag gtaacgccat gattgtcttc    1260

acctgtctgt tcattttctt ctttgcatgt acctgggctc caggtgtttt cgtcgttgtg    1320

tctgaaacct acccacttag aattagatcc aagggtatgg ccatcgctca aggttccaat    1380

tggctttggg gtttcctcat tgccttcttc actccattta tctcaggtgc cattgatttc    1440

gcctacggtt acgtctttat gggatgtact ctgttcgcct tcttctttgt gtacttcttc    1500

gttcctgaaa ccaagggtct gtcgctggaa gacgttgatg aagtctatga gaaccttacc    1560

ttcggaagag catatgcata cagccacacg attaaagaca agggcgccct ataa          1614

 

<210>2

<211>537

<212>PRT

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>peptide

<222>(1)…(537)

<223>毕赤酵母菌株中的PpHXT1基因编码的蛋白

 

<400>2

Met Ser Ser Thr Asp Ile Gln Gly Asp Gln Gly Asp Asn Glu Lys Ile

 1               5                  10                  15

Tyr Ala Ile Glu Ser Ser Pro Ser Asn Glu Gln Ile Lys Asp Ile His

            20                  25                  30

Glu Ala Pro Ala Asp Asn Lys Ser Glu Leu Asp Ile Pro Val Lys Pro

        35                  40                  45

Lys Gly Ser Tyr Ile Leu Val Ser Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Phe

    50                  55                  60

Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val

65                  70                  75                  80

Asn Met Ser Asp Phe Thr Arg Arg Phe Gly Gln Phe Asn Gly Glu Thr

                85                  90                  95

Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Val Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn

            100                 105                 110

Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Val Thr Leu Gly Lys Leu Gly Asp Ile

        115                 120                 125

Trp Gly Arg Lys Lys Ala Leu Met Phe Val Met Val Ile Tyr Met Val

    130                 135                 140

Gly Ile Leu Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asp Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe

145                 150                 155                 160

Ile Gly Arg Ile Ile Ala Gly Leu Ala Val Gly Ala Val Ser Val Leu

                165                 170                 175

Ser Pro Met Phe Ile Ser Glu Thr Ser Pro Lys His Ile Arg Gly Ser

            180                 185                 190

Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu Gly

        195                 200                 205

Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Asp Ser Thr Gln Trp

    210                 215                 220

Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ala Ile Leu Met Ile Val

225                 230                 235240

Gly Met Thr Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Val Glu Val Asn

                245                 250                 255

Arg Val Asp Glu Ala Met Lys Ser Ile Ala Arg Val Asn Lys Val Ser

            260                 265                 270

Ile Asp Asp Pro Ser Val Tyr Asn Glu Met Arg Leu Ile Ser Asp Gly

        275                 280                 285

Ile Glu Lys Glu Lys Glu Ala Gly Ser Val Ser Trp Gly Glu Leu Phe

    290                 295                 300

Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Tyr Arg Leu Leu Ile Gly Ile Phe Met

305                 310                 315                 320

Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly

                325                 330                 335

Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Gln Thr Ser

            340                 345                 350

Ile Ile Leu Gly Val Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Leu Gly Ile Tyr

        355                 360                 365

Thr Met Asp Lys Phe Gly Arg Arg Arg Thr Leu Leu Gly Gly Ser Gly

    370                 375                 380

Ala Met Val Val Cys Leu Val Ile Phe Ser Ser Val Gly Val Lys Ser

385                 390                 395                 400

Leu Tyr Glu Asn Gly Lys Asp Asp Pro Ser Lys Pro Ala Gly Asn Ala

                405                 410                 415

Met Ile Val Phe Thr Cys Leu PheIl e Phe Phe Phe Ala Cys Thr Trp

            420                 425                 430

Ala Pro Gly Val Phe Val Val Val Ser Glu Thr Tyr Pro Leu Arg Ile

        435                 440                 445

Arg Ser Lys Gly Met Ala Ile Ala Gln Gly Ser Asn Trp Leu Trp Gly

    450                 455                 460

Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Ser Gly Ala Ile Asp Phe

465                 470                 475                 480

Ala Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Thr Leu Phe Ala Phe Phe Phe

                485                 490                 495

Val Tyr Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Asp Val

            500                 505                 510

Asp Glu Val Tyr Glu Asn Leu Thr Phe Gly Arg Ala Tyr Ala Tyr Ser

        515                 520                 525

His Thr Ile Lys Asp Lys Gly Ala Leu

    530                 535

 

<210>3

<211>1335

<212>DNA

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1335)

<223>毕赤酵母菌株中的PpMIG1基因

 

<400>3

atgaccactg cctatcccaa cgcacgtgtg gcaagtgtca gatcgtcggg ggactctgtg      60

ggtgatatca aagtgggctc caggaagtcc gcggagtctt ctaacgcaaa ctccagctcc     120

agctctaaaa aatcagagtt atcacgcccc taccaatgtc ccatgtgtga aaaggctttc     180

cacagattag agcatcaaac aagacacata cggactcaca cgggtgagaa gccccaccac     240

tgtaattatc ccggctgttt caagaagttt tcaaggtcgg atgagttgac cagacattcc     300

agaatacaca acaacccaaa cccaaggaaa agggggccag gtgttgtccc caagaagact     360

cctagaccaa agatggcagg caagtcagcc tcatatagtg acgagggcaa ctactcttta     420

ggcgaaggcc atcagcagtt ttacggcagt gatgacgctt cctctttccc gttggtgtcg     480

attccaactg cagcagcaac taccacggtg ggaaaaccaa caaccccaac tccgagctca     540

aagtcgtctc agagccagac agctgaggcc aagttcaacc ctctaagaag tgcgtctact     600

ctgagcatca acttgctggc tactgctgcc tctcaggaac tacaagagtt aagggctgca     660

gaggaaaact cttcaagatt gcaacaagta aaatctctac cttcgttaac tcaatacttc     720

attgcttcgg aagactcctc tcatggtgga aaccctccgt tatctcatcc gaagccattc     780

agcagtctaa gcggacttaa aagaatgacc ccaataaacc cttcttcttc ttcctcttcg     840

tccggaggtg tttcaatcaa caaatcaata tctgttactt cgttgactcg aaccttttcc     900

aacacagaga ttgctgacga attcactact cctccgacaa tgttgaaaaa atcccgacca     960

aattcgcctg tgctcacagg acgatctcca acgacttttc aacaatacca acaatcacag    1020

catacatcta acttggcaca gcagcaatct aagggtaact ttcctccatc ccatattgat    1080

tccaaggttt catcagcggc tctgcatctt ttaggacttg ggctgaacca tgccactcct    1140

gaagtcaccc ctttgcaaac ccctgcagtg tctcccaaac tctttccaaa atccgtttcc    1200

aataatagct tggagacact tcacaaagct ttggatgaga ccactgaagc agagaacctc    1260

caaagcacag cactaccttc tctgagctct ctaaatttac cttcaacctc tctggaaaat    1320

caagaaaaga aatga                                                     1335

<210>4

<211>444

<212>PRT

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>peptide

<222>(1)…(444)

<223>毕赤酵母菌株中的PpMIG1基因编码的蛋白

 

<400>4

Met Thr Thr Ala Tyr Pro Asn Ala Arg Val Ala Ser Val Arg Ser Ser

 1               5                  10                  15

Gly Asp Ser Val Gly Asp Ile Lys Val Gly Ser Arg Lys Ser Ala Glu

            20                  25                  30

Ser Ser Asn Ala Asn Ser Ser Ser Ser Ser Lys Lys Ser Glu Leu Ser

        35                  40                  45

Arg Pro Tyr Gln Cys Pro Met Cys Glu Lys Ala Phe His Arg Leu Glu

    50                  55                  60

His Gln Thr Arg His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro His His

65                  70                  75                  80

Cys Asn Tyr Pro Gly Cys Phe Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu

                85                  90                  95

Thr Arg His Ser Arg Ile His Asn Asn Pro Asn Pro Arg Lys Arg Gly

            100                 105                 110

Pro Gly Val Val Pro Lys Lys Thr Pro Arg Pro Lys Met Ala Gly Lys

        115                 120                 125

Ser Ala Ser Tyr Ser Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Leu Gly Glu Gly His

    130                 135                 140

Gln Gln Phe Tyr Gly Ser Asp Asp Ala Ser Ser Phe Pro Leu Val Ser

145                 150                 155                 160

Ile Pro Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Val Gly Lys Pro Thr Thr Pro

                165                 170                 175

Thr Pro Ser Ser Lys Ser Ser Gln Ser Gln Thr Ala Glu Ala Lys Phe

            180                 185                 190

Asn Pro Leu Arg Ser Ala Ser Thr Leu Ser Ile Asn Leu Leu Ala Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Ser Gln Glu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Ala Glu Glu Asn Ser

    210                 215                 220

Ser Arg Leu Gln Gln Val Lys Ser Leu Pro Ser Leu Thr Gln Tyr Phe

225                 230                 235                 240

Ile Ala Ser Glu Asp Ser Ser His Gly Gly Asn Pro Pro Leu Ser His

                245                 250                 255

Pro Lys Pro Phe Ser Ser Leu Ser Gly Leu Lys Arg Met Thr Pro Ile

            260                 265                 270

Asn Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Val Ser Ile Asn Lys

        275                 280                 285

Ser Ile Ser Val Thr Ser Leu Thr Arg Thr Phe Ser Asn Thr Glu Ile

    290                 295                 300

Ala Asp Glu Phe Thr Thr Pro Pro Thr Met Leu Lys Lys Ser Arg Pro

305                 310                 315                 320

Asn Ser Pro Val Leu Thr Gly Arg Ser Pro Thr Thr Phe Gln Gln Tyr

                325                 330                 335

Gln Gln Ser Gln His Thr Ser Asn Leu Ala Gln Gln Gln Ser Lys Gly

            340                 345                 350

Asn Phe Pro Pro Ser His Ile Asp Ser Lys Val Ser Ser Ala Ala Leu

        355                 360                 365

His Leu Leu Gly Leu Gly Leu Asn His Ala Thr Pro Glu Val Thr Pro

    370                 375                 380

Leu Gln Thr Pro Ala Val Ser Pro Lys Leu Phe Pro Lys Ser Val Ser

385                 390                 395                 400

Asn Asn Ser Leu Glu Thr Leu His Lys Ala Leu Asp Glu Thr Thr Glu

                405                 410                 415

Ala Glu Asn Leu Gln Ser Thr Ala Leu Pro Ser Leu Ser Ser Leu Asn

            420                 425                 430

Leu Pro Ser Thr Ser Leu Glu Asn Gln Glu Lys Lys

        435                 440

 

<210>5

<211>1365

<212>DNA

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1365)

<223>毕赤酵母菌株中的PpMIG2基因

 

<400>5

atgactactg ctcccccaac gaagcccaat gataggccct accagtgccc catgtgcgac      60

aaggccttcc accggttgga acatcaaaca agacacatta gaacacacac aggggaaaaa     120

cctcaccctt gcacgttccc tggatgccca aagaagtttt ccaggtctga tgaattgacc     180

agacacttga ggatacacac aaacccaact gtgagaaagg gcagaaagaa gaagcggaag     240

gacgaagaac aagctgtgga gttgccacct cagaataacg aggtacatct cgttcccatg     300

gggaacgatc aaatgggaca accaatatac acgcaggcgg ttcctgttta ttgggttcca     360

tctggtgctg caaacggcga acaaggccag tatttgatgc ctccgctttt ttccttacaa     420

ccaagacagg tgatggcagg gacttctcaa accagtttga atggtgtaga tgctcaacaa     480

cagcagcagc agcagcagca gcagcaacaa caacaacaac aacaacaaca acaaccacag     540

caacaaccac agcaacaacc gccactgcaa ccacaaccac ttcaaccaca accacaggcc     600

cagcaacaat ttggatttgc tcaagatcaa agaaacctgg cacccgctaa tcagcaacag     660

cacagattct ccccaccatt ttctgcatct tcaaggaccc attcagccaa ttcattgttt     720

tctctcaact caaatggatc cacgccttca gggtcatatc aacagttgaa ctctttatct     780

cttttacaca gaatcactcc aatcaggact ccaagcagta atagcctgtt gacaaaatct     840

aataaccagt cgatgacatc aatagtcacg ttgagcgacc aacaacagga ttttgtttcc     900

agaaaaaagt caagacccaa ctcaccaaca gttccaaact ctccaacaat ttcaaacttg     960

gtctcgcccg ctgatacgcc tttaactact ccgttgcaat cgcctacact gaagcccgca    1020

atgcccagca acgtacaact tccaccaata agatcactgt taaatttgga agaacttccc    1080

tcggaaccat tgcagcaacc agccaatgtc tctactgaca ataaagtgaa gacaatgttg    1140

aacaaatctt cgtccaacgt cactttgagt aaatcgtttt cttcacaaga cattcgtctg    1200

gggaccaaga gaaagtctga taccaacctc tctgcattag attctaccaa tgctattcgc    1260

aagcctgccc tatcaccgtt ggctcctctg tcagtctcat cagatcgatt taccaagaga    1320

aagaacaact tcacgatagg caatatcatg aactcggact cttga                    1365

 

<210>6

<211>454

<212>PRT

<213>Pichia pastoris

 

<220>

<221>peptide

<222>(1)…(454)

<223>毕赤酵母菌株中的PpMIG2基因编码的蛋白

 

<400>6

Met Thr Thr Ala Pro Pro Thr Lys Pro Asn Asp Arg Pro Tyr Gln Cys

1                5                  10                  15

Pro Met Cys Asp Lys Ala Phe His Arg Leu Glu His Gln Thr Arg His

            20                  25                  30

Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro His Pro Cys Thr Phe Pro Gly

        35                  40                  45

Cys Pro Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Leu Arg

    50                  55                  60

Ile His Thr Asn Pro Thr Val Arg Lys Gly Arg Lys Lys Lys Arg Lys

65                  70                  75                  80

Asp Glu Glu Gln Ala Val Glu Leu Pro Pro Gln Asn Asn Glu Val His

                85                  90                  95

Leu Val Pro Met Gly Asn Asp Gln Met Gly Gln Pro Ile Tyr Thr Gln

            100                 105                 110

Ala Val Pro Val Tyr Trp Val Pro Ser Gly Ala Ala Asn Gly Glu Gln

        115                 120                 125

Gly Gln Tyr Leu Met Pro Pro Leu Phe Ser Leu Gln Pro Arg Gln Val

    130                 135                 140

Met Ala Gly Thr Ser Gln Thr Ser Leu Asn Gly Val Asp Ala Gln Gln

145                 150                 155                 160

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

                165                 170                 175

Gln Gln Pro Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Pro Pro Leu Gln Pro Gln

            180                 185                 190

Pro Leu Gln Pro Gln Pro Gln Ala Gln Gln Gln Phe Gly Phe Ala Gln

        195                 200                 205

Asp Gln Arg Asn Leu Ala Pro Ala Asn Gln Gln Gln His Arg Phe Ser

    210                 215                 220

Pro Pro Phe Ser Ala Ser Ser Arg Thr His Ser Ala Asn Ser Leu Phe

225                 230                 235                 240

Ser Leu Asn Ser Asn Gly Ser Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Gln Gln Leu

                245                 250                 255

Asn Ser Leu Ser Leu Leu His Arg Ile Thr Pro Ile Arg Thr Pro Ser

            260                 265                 270

Ser Asn Ser Leu Leu Thr Lys Ser Asn Asn Gln Ser Met Thr Ser Ile

        275                 280                 285

Val Thr Leu Ser Asp Gln Gln Gln Asp Phe Val Ser Arg Lys Lys Ser

    290                 295                 300

Arg Pro Asn Ser Pro Thr Val Pro Asn Ser Pro Thr Ile Ser Asn Leu

305                 310                 315                 320

Val Ser Pro Ala Asp Thr Pro Leu Thr Thr Pro Leu Gln Ser Pro Thr

                325                 330                 335

Leu Lys Pro Ala Met Pro Ser Asn Val Gln Leu Pro Pro Ile Arg Ser

            340                 345                 350

Leu Leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Ser Glu Pro Leu Gln Gln Pro Ala

        355                 360                 365

Asn Val Ser Thr Asp Asn Lys Val Lys Thr Met Leu Asn Lys Ser Ser

    370                 375                 380

Ser Asn Val Thr Leu Ser Lys Ser Phe Ser Ser Gln Asp Ile Arg Leu

385                 390                 395                 400

Gly Thr Lys Arg Lys Ser Asp Thr Asn Leu Ser Ala Leu Asp Ser Thr

                405                 410                 415

Asn Ala Ile Arg Lys Pro Ala Leu Ser Pro Leu Ala Pro Leu Ser Val

            420                 425                 430

Ser Ser Asp Arg Phe Thr Lys Arg Lys Asn Asn Phe Thr Ile Gly Asn

        435                 440                 445

Ile Met Asn Ser Asp Ser

    450

Claims (17)

1.一种可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中PpHXT1基因发生第一突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

2.根据权利要求1所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述第一突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。

3.根据权利要求1所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpHXT1基因的序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

4.根据权利要求1所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpHXT1基因编码的蛋白为SEQ ID NO：2所示的序列。

5.根据权利要求1所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpHXT1基因的GenBank登录号为GU479989，编码一个己糖运载体蛋白，是酿酒酵母HXT基因的类似物。

6.根据权利要求1所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中自噬基因PpATG30发生第二突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

7.根据权利要求6所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述第二突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。

8.一种可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中PpMIG1基因发生第三突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

9.根据权利要求8述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述第三突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。

10.根据权利要求8所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG1基因的序列为SEQ ID NO：3所示的序列。

11.根据权利要求8所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG1基因编码的蛋白为SEQ ID NO：4所示的序列。

12.根据权利要求8所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG1基因是酿酒酵母MIG1基因的类似物。

13.根据权利要求8所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中PpMIG2基因发生第四突变，从而不能编码蛋白或编码的蛋白没有活性。

14.根据权利要求13述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述第四突变为点突变、插入突变和/或缺失突变。

15.根据权利要求13所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG2基因的序列为SEQ ID NO：5所示的序列。

16.根据权利要求13所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG2基因编码的蛋白为SEQ ID NO：6所示的序列。

17.根据权利要求13所述的可利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述PpMIG2基因也是酿酒酵母Mig1基因的类似物。

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